CN110396489A - 一种黄酒人工酒药发酵剂及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种黄酒人工酒药发酵剂，其特征在于，包含酿酒酵母、食窦魏斯氏菌、融合魏斯氏菌、戊糖片球菌、扣囊复膜孢酵母以及小孢根霉。采用酵母菌‑霉菌‑乳酸菌联合发酵方式，与传统酒药发酵时间及发酵活力指标相当。通过比较人工酒药发酵剂、传统绍兴酒药和商业发酵剂安琪酒曲制得的黄酒，发现人工酒药发酵酒与传统绍兴酒药发酵酒香气化合物种类相当，远远高于商业发酵剂制备的发酵酒；人工酒药发酵酒与传统绍兴酒药发酵酒整体的香气轮廓大体一致。

Description

一种黄酒人工酒药发酵剂及其应用方法
技术领域
本发明涉及一种黄酒人工酒药发酵剂的制备方法及其在绍兴黄酒酿造中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
中国黄酒是世界三大古酒之一，距今已有四千多年的历史。在国内众多的区域品牌中，绍兴黄酒由于它特殊的地理位置、独特的原料和工艺，而具有独一无二的风味，因而最受国内消费者喜爱。因此它享有“中国地理标志保护产品”这一美誉。
用“麦曲”和“酒药”酿造是绍兴黄酒生产中广泛使用的一种典型技术。一般来说，该过程包括两个阶段：首先是使用“小麦曲”和“酒药”在28℃(3-5天)进行初步发酵，然后在开放环境下在10-15℃(10-20天)进行二次发酵以丰富其风味。发酵伴随着化学和生态转换过程，这是典型的微生物活动，而酒药中的微生物在绍兴黄酒的独特风味形成中起着关键作用。酒药是以糯米粉和辣醪草为主要原料制成的。当加入发酵时，它具有糖化和发酵的双重作用。它可以产生多功能和复杂的化合物，从而形成米酒的独特香气，风味和发酵活力。酒药富含宝贵的酿酒微生物资源，包括霉菌、细菌和酵母，对黄酒风味起到重要作用。然而，到目前为止，对绍兴黄酒酒药的微生物群落仍然缺乏认识。此外，绍兴黄酒酿造的大部分都是基于以往的经验知识，而且这都是在非无菌和不受控制的发酵条件下。这种情况导致发酵过程的不可控制性以及不同批次黄酒之间在味道和风味方面存在不一致。这些研究表明，虽然酒药微生物资源丰富多样，但目前对酒药中的核心微生物并没有统一的结论。
传统酒药的使用也面临多种缺陷，包括批次的不稳定性和潜在的安全风险。近年来，商业发酵剂已应用于工业酿酒。然而，与传统的酒药发酵黄酒相比，用商业发酵剂生产的黄酒的风味较差。因此，建立人工酒药发酵剂作为绍兴黄酒中传统酒药的替代品，为消费者提供优质，安全的产品至关重要，而且更为工业化大批量制备黄酒提供了参考。
发明内容
本发明目的是针对现有传统绍兴酒药存在批次不稳定而造成的微生物不一致，以及可能因存在致病菌而造成安全隐患的问题，提供一种黄酒人工酒药发酵剂以及应用该发酵剂发酵黄酒的方法，其组分包含几种完全以绍兴酒药为来源，并对绍兴酒风味起到重要作用的菌株，使之发酵黄酒能达到与传统酒药发酵黄酒相一致的效果，并以此来弥补商业发酵剂制酒在风味上的不足。
为了达到上述目的，本发明提供了一种黄酒人工酒药发酵剂，其特征在于，包含酿酒酵母、食窦魏斯氏菌、融合魏斯氏菌、戊糖片球菌、扣囊复膜孢酵母以及小孢根霉。
较佳地，所述的酿酒酵母为NKCCMR NK 3.00156。
较佳地，所述的食窦魏斯氏菌为BNCC206838。
较佳地，所述的融合魏斯氏菌为CICC23465。
较佳地，所述的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)为CCTCC M 2019323。于2019年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心。
较佳地，所述的扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)为CCTCC M2019324，于2019年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心。
较佳地，所述的小孢根霉(Rhizopus microsporus)为CCTCC M 2019325。于2019年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心。
较佳地，按每克米的接种浓度计，戊糖片球菌的用量为8.0～8.9×103CFU/g，食窦魏斯氏菌的用量为1.8～2.6×103CFU/g，融合魏斯氏菌的用量为1.8～2.6×103 CFU/g，扣囊复膜孢酵母的用量为8.7～9.6×103CFU/g，小孢根霉的用量为9.8～ 10.6×102CFU/g，酿酒酵母的用量为6.3～6.8×103CFU/g。
本发明还提供了上述的黄酒人工酒药发酵剂在黄酒发酵中的应用。
本发明还提供了一种黄酒发酵方法，其特征在于，包括：
步骤1:浸米蒸饭：先将糯米用水浸泡一晚上，再用电饭煲蒸熟；
步骤2:补水降温：将蒸熟的米饭用水淋，将饭温控制在25-30℃，沥水；
步骤3:前发酵：在步骤2所得的沥水后的米饭中加入所述的黄酒人工酒药发酵剂，拌匀后，加入发酵瓶中，瓶口用八层纱布封口，放至30℃培养箱发酵 30个小时；
步骤4:后发酵：在步骤3所得的发酵产物中放入米重1.2倍的水，并将培养温度降低至16℃，前三天每天搅拌两次，发酵两星期；
步骤5:压榨过滤：压榨使酒液与酒糟分离，酒液流出，过滤；
步骤6:澄清、灭菌：将酒液放于4-6℃自然澄清1-2天，上清液于75-90℃灭菌15-25min，制得黄酒。
本发明通过高通量测序的技术对来自六个绍兴酒厂酒药(塔牌、小酒厂、东方、咸享、福全和绍兴县第三酒厂)的微生物进行了测序分析，得到六种绍兴酒药中共有的丰度含量大于1％的优势细菌分别是戊糖片球菌Pediococcus (39.20％)，肠球菌Enterobacter(16.06％)，魏斯氏菌Weissella(8.83％)，克雷伯氏菌Klebsiella(5.04％)，大肠埃氏菌属-志贺氏菌属Escherichia-Shigella(3.64％)，假单胞菌属Pelomonas(1.65％)，克洛诺菌属Cronobacter(1.53％)，苍白杆菌属Ochrobactrum(1.35％)和青枯菌属Ralstonia(1.04％)；丰度含量大于1％的优势真菌分别是根霉菌属Rhizopus，扣囊复膜孢酵母属Saccharomycopsis，曲霉属 Aspergillus，Simplicillium，赤霉属Gibberella，镰刀菌属Fusarium，毛壳菌属Chaetomium，威克汉姆西弗酵母Wickerhamomyces，马拉色菌属Malassezia和链格孢属Alternaria。测定六种酒药的糖化力，并将六种酒药进行黄酒发酵，在黄酒发酵期间监测其酒精度和酸度。用SPME-GCMS测定六种酒药发酵黄酒的挥发性香气组分，经分析对香气有贡献的化合物(OAV≥1)一共有15种，包括 8种酯类，4种醇类，2种酸类和1种醛类物质。用R语言Spearman’s相关系数分析建立起酒药核心菌群与酒精度、酸度和糖化力三者之间的相关性。结果表明，在九种核心细菌中，片球菌与三者都存在正相关性，魏斯氏菌主要与酸度存在正相关性。在十种核心真菌中，根霉菌与三者都存在正相关性，扣囊复膜孢酵母与糖化力存在正相关性。利用PLS-DA算法研究了6种酒药样品中15种主要挥发性成分，9种代表性细菌类群和10种代表性真菌类群的关系，并利用R软件进行了可视化。其中，扣囊复膜孢酵母与糖化力、苯乙醇和丁酸乙酯呈正相关性。小孢根霉菌与酒精度、酸度、糖化力、丙酸乙酯，乙酸异戊酯和乙酸乙酯呈正相关性。戊糖片球菌与酒精度、酸度、糖化力、月桂酸乙酯和乙酸呈正相关性。魏斯氏菌与酸度、癸酸和异戊醇呈正相关。由以上可以推断，只有少数微生物在绍兴黄酒挥发性化合物的形成中起关键作用。通过对微生物多样性及代表性微生物，发酵活力和挥发性化合物的相关性分析，确定了包括戊糖片球菌，魏斯氏菌，根霉菌和扣囊复膜孢酵母在内的四种核心微生物并组合制备了人工酒药发酵剂。通过酒药在酿酒中的添加量、酒药中细菌和真菌的菌落总数以及酒药中核心菌群属水平的丰度来确定制备人工酒药的核心微生物的接种浓度。预实验表明这四种核心菌群产酒精能力不足，我们加入在酿酒工业中广泛应用的酿酒酵母。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明的人工酒药发酵剂可采用与传统绍兴酒药相同的发酵工艺，发酵时间及发酵活力指标相当，采用电子鼻的技术手段比较新制备的人工酒药发酵剂与传统绍兴酒药制得的黄酒的香气轮廓，发现二者大体一致，并无太大差异；
(2)用SPME-GCMS比较本发明与传统绍兴酒药发酵酒和商业发酵剂安琪酒曲发酵酒的挥发性香气种类，发现本发明的人工酒药发酵剂制备的发酵酒与传统绍兴酒药发酵酒的香气种类大体一致且远远高于商业发酵剂安琪酒曲发酵酒。
(3)本发明为工业化大批量高效制备黄酒提供了一个参考。人工酒药发酵剂通过选择合适的发酵菌株，以及确定核心发酵菌株的比例，有效解决了现有的传统黄酒酒药生产中的由于批次不稳定所造成的发酵过程的不可控性以及风味的不一致性，同时也有效避免了传统酒药中因含有致病菌而存在的安全隐患，使得所述的人工酒药发酵剂能够发酵制备黄酒。本发明所述的人工酒药发酵剂能够制备黄酒，其所制得的黄酒在电子鼻风味轮廓上与传统酒药制得的黄酒相差无几，且在挥发性香气种类上远远高于商业发酵剂制得的黄酒。此外，所述的制备方法简便易行，能够大规模地批量应用于绍兴黄酒实际生产中。
保藏信息
戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏日期为2019年5月5日，保藏编号： CCTCC M 2019323。
扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)，保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏日期为2019年5月5日，保藏编号：CCTCC M2019324；
小孢根霉(Rhizopus microsporus)，保藏于中国典型培养物保藏中心，湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏日期为2019年5月5日，保藏编号：CCTCC M 2019325。
附图说明
图1显示了六种酒药样品中丰度含量大于1％的核心真菌和细菌；
图2显示了酒药核心菌群与黄酒挥发性香气组分(OAV≥1)之间的相关性；
图3显示了七种黄酒的电子鼻香气轮廓分析；
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
以下实施例中使用的各菌株如下：
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，NKCCMR NK 3.00156，购自中国典型培养物保藏中心；
食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)，BNCC206838，购自北纳生物；
融合魏斯氏菌(Weissella confusa)CICC23465购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；
戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)CCTCC M 2019323保藏于中国典型培养物保藏中心；
扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)CCTCC M 2019324保藏于中国典型培养物保藏中心；
小孢根霉(Rhizopus microsporus)CCTCC M 2019325保藏于中国典型培养物保藏中心。
实施例1.绍兴酒药的核心菌群
对来自六个绍兴酒厂(塔牌、小酒厂、东方、咸享、福全和绍兴县第三酒厂) 的酒药样品常温运输至实验室，用研钵将样品捣碎，并称取10g研磨成粉末的样品放入90mL无菌生理盐水(0.85g/100mL)中，混合均匀，备用。将混匀后的酒药粉末和生理盐水以5000r/min离心2min,收集离心后的菌体并放置于冰盒中。利用TIANamp Stool DNA Kit粪便基因组DNA提取试剂盒对收集的菌体进行DNA的提取。提取出的DNA置于-20℃条件下保存。将提取得到的DNA分别用引物NL1:GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG、NL4: GGTCCGTGTTTCAAGACGG和引物27F:GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG、 1492r:TACGGCTACCTTGTTACGAC进行PCR反应，PCR反应体系为50.0μL, 包括2μL DNA,25μL 2×GoldStar Best MasterMix，2μL正向引物(100μM)，2μL反向引物(100μM)，用ddH2O补足50.0μL。PCR反应程序为(引物为NL1和 NL4):(1)95℃10min,(2)94℃30s，(3)55℃30s，(4)72℃20s(引物为27F和1492r 时，为1.5min),步骤(2)～(4)重复30个循环,(5)72℃5min,(6)4℃保存。然后将 PCR产物用1.0％琼脂糖进行凝胶电泳检测，在100V电压下0.5×TBE电泳液中电泳20min，然后在凝胶成像仪上对提取效果进行检测，若可见到清晰的条带，并且无明显非特异性扩增，即可判断PCR成功。利用细菌16SrDNA引物338F(5' -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3')，真菌ITS引物ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3') 和ITS2R(5'-GCTGCGTTCATCGATGC-3')进行目标片段PCR扩增。PCR反应体系为20.0μL(引物为338F和806R),包括2μL 2.5mMdNTPs,4μL 5×FastPfu Buffer(引物为ITS1F和ITS2R时，为2μL 10×Buffer),0.8μLForward Primer(5 μM),0.8μL Reverse Primer(5μM),0.4μL FastPfu Polymerase(引物为ITS1F和 ITS2R时，为0.2μL rTaq Polymerase),0.2μL BSA,10ng Template DNA,用ddH2O补足20.0μL。PCR反应程序为(引物为338F和806R,ITS1F和ITS2R): (1)95℃3min,(2)95℃30s，(3)55℃30s，(4)72℃45s,步骤(2)～(4)重复35个循环,(5)72℃10min,(6)10℃直到停止。产物经胶回收后，参照电泳初步定量结果，将PCR扩增回收产物进行荧光定量，荧光试剂为Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量仪器为Microplate reader(BioTek，FLx800)。根据荧光定量结果，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合。最后使用Miseq 平台进行宏基因组测序。
通过高通量测序的技术对来自六个绍兴酒厂酒药(塔牌、小酒厂、东方、咸享、福全和绍兴县第三酒厂)的微生物进行了测序分析，结果如图1所示。得到六种绍兴酒药中共有的丰度含量大于1％的优势细菌分别是Pediococcus (39.20％)，Enterobacter(16.06％)，Weissella(8.83％)，Klebsiella(5.04％)， Escherichia-Shigella(3.64％)，Pelomonas(1.65％)，Cronobacter(1.53％)，Ochrobactrum(1.35％)and Ralstonia(1.04％)；丰度含量大于1％的优势真菌分别是 Rhizopus，Saccharomycopsis，Aspergillus，Simplicillium，Gibberella， Fusarium，Chaetomium，Wickerhamomyces，Maiassezia andAlternaria.
实施例2.绍兴酒药核心菌群与发酵活力的相关性
利用淀粉在一定条件下受糖化酶的作用，生成葡萄糖的量来计算糖化力的大小。测定六种酒药的糖化力，首先进行酶液的制备，即称取5g酒药样品，加水90mL和醋酸-醋酸钠缓冲剂(pH＝(4.6))10mL于30℃浸泡1h(每隔15min 搅拌一次)，用滤纸过滤，取滤液为酶液。再进行酒药糖化液的制备，首先吸取 25mL的2％可溶性淀粉溶液于50mL容量瓶中于30℃恒温水浴保温10min,2％可溶性淀粉制备即称2.0g经100～105℃烘2h的可溶性淀粉，加10mL水调匀, 倒入60mL沸水中，用10mL水洗净烧杯，洗液并入沸水中，搅匀，煮沸至透明，冷却后加水定容至100mL,即为2％可溶性淀粉溶液。加入5mL的酶液于30℃恒温糖化1h,时间到达后迅速加入0.1mol/L的NaOH溶液15mL终止酶的作用，取出冷却并加水至刻度摇匀。通过计算1g酒药在30℃下糖化1h所产生的葡萄糖量进行酒药糖化力的测定。步骤如下：
1.吸取费林溶液甲、乙各5mL于250mL三角瓶中并加水30mL，准确加入 5mL糖化液。用滴定管加入适量的0.25％葡萄糖标准溶液(使滴定时消耗0.25％葡萄糖标准溶液在1mL以内)。0.25％葡萄糖标准溶液的制备，即将葡萄糖放入称量瓶内，于100～105℃干燥箱中烘2h,取出于干燥器中冷却30min,准确称2.5g, 用水溶解，加5mL浓盐酸(12mol/L)以防腐，水定容至1000mL，即为0.25％葡萄糖标准溶液。在电炉上加热至沸并保持2min，加两滴1％亚甲基蓝指示剂，继续用0.25％葡萄糖标准溶液滴定之蓝色消失，总消耗0.25％葡萄糖标准溶液为 V1(mL)。
2.吸取25mL2％可溶性淀粉溶液于50mL容量瓶中，加入0.1moL/L的NaOH 溶液15mL，再加入5mL酶液，加水定容至刻度摇匀并以此作为空白液。用5mL 空白液代替糖化溶液定糖，方法同上，总消耗0.25％葡萄糖标准溶液为V0(mL)。
3.将以上所得结果进行糖化力的测定，即1g酒药在30℃下糖化1h所产生的葡萄糖量。计算公式为：
将六种酒药进行黄酒发酵，在黄酒发酵期间监测其酒精度和酸度。
酒精度利用蒸馏的方法，首先搭建好蒸馏装置，在烧瓶中倒入50mL待测液加50mL蒸馏水，并加入6至8颗小玻璃珠作为沸石，防止爆沸。将烧瓶放在加热装套上加热至沸腾，使用100mL干净的量筒作为收集装置。直至蒸馏出的馏出液达到50mL后停止加热，用酒精比重计来测量待测液的酒精含量，测量时将馏出液放入大试管中，将酒精计小心取出，用去离子水冲洗后，用干净的纸巾将酒精计擦干净，浸没于馏出液内，等酒精计停止上浮，读取液面在酒精计上的读数并记录数据。
酸度利用NaOH滴定的方法进行测定，吸取发酵黄酒的待测液若干，加入酚酞指示剂两滴，用0.1mol/LNaOH标准溶液至呈微红色，30s内不褪色为止。
测定完上述三项指标后，再用R软件的Spearman，s相关系数分析建立起酒药核心菌群与酒精度、酸度和糖化力三者之间的相关性，结果如表1所示。结果表明，在九种核心细菌中，片球菌与三者都存在正相关性，魏斯氏菌主要与酸度存在正相关性。在十种核心真菌中，根霉菌与三者都存在正相关性，扣囊复膜孢酵母与糖化力存在正相关性。
实施例3.绍兴酒药核心菌群与挥发性香气组分(OAV≥1)的相关性
用SPME-GCMS测定六种酒药发酵黄酒的挥发性香气组分。具体方法如下：首先进行固相微萃取，取5g黄酒样品置于20mL顶空瓶中，加入10μL内标 2-辛醇(70mg/L)，用聚四氟乙烯硅胶垫密封，将顶空瓶放入60℃水浴锅中，平衡10min，然后将老化后的SPME萃取头插入顶空瓶萃取发酵样品30min。GC 条件:色谱柱:DB-5(60m×0.25mm，0.25μm)；进样口温度:250℃；升温程序: 初始温度40℃保持6min，以3℃/min升至100℃保持0min，再以5℃/min升至230℃，保持10min；载气为氦气，流速3mL/min；进样方式:不分流进样。
MS条件:电子轰击离子源；电子能量70eV；传输线温度:280℃；离子源温度: 230℃；质量扫描范围:10～450u。最后经过定性定量分析对香气有贡献的化合物 (OAV≥1)一共有15种，包括8种酯类，4种醇类，2种酸类和1种醛类物质。利用PLS-DA算法研究了6种酒药样品中15种主要挥发性成分，9种代表性细菌类群和10种代表性真菌类群的关系，并利用R软件进行了可视化，结果如图 2所示。研究结果表明，扣囊复膜孢酵母与苯乙醇和丁酸乙酯呈正相关；根霉与丙酸乙酯呈正相关；戊糖片球菌与月桂酸乙酯和乙酸呈正相关。魏斯氏菌与癸酸和异戊醇呈正相关。月桂酸乙酯与戊糖片球菌和扣囊复膜孢酵母呈正相关。
结合实施例2的相关性研究，可以得出结论：在黄酒发酵过程中，只有少数核心微生物对黄酒的风味形成和发酵活力起到重要作用，分别是扣囊复膜孢酵母为酵母菌代表，小孢根霉菌株为霉菌代表，食窦魏斯氏菌、融合魏斯氏菌和戊糖片球菌为乳酸菌代表的酒药中的核心菌群微生物。
实施例4.人工酒药核心菌群的制备及黄酒发酵
一种黄酒人工酒药发酵剂组成(按接种浓度)：戊糖片球菌8.0×103CFU/g，食窦魏斯氏菌1.8×103CFU/g，融合魏斯氏菌1.8×103CFU/g，扣囊复膜孢酵母 8.7×103CFU/g，小孢根霉菌9.8×102CFU/g，另外加入酿酒酵母6.3×103CFU/g。接种浓度根据酒药在酿酒中的添加量、酒药中细菌和真菌的菌落总数以及酒药中核心菌群属水平的丰度来确定，具体数据结果如表2所示。例如戊糖片球菌的接种浓度(8.0×103CFU/g)＝酒药中细菌的菌落总数(1.02×107)×酒药细菌中戊糖片球菌的丰度比例(39.2％)×酒药在酿酒中的添加量(0.2g/100g米)。最终菌种的实际接种浓度还是要以酿酒过程中的发酵活力和香气产生能力再进行调整。
黄酒发酵方法，具体步骤如下：
(1)浸米蒸饭，先将糯米用水浸泡一晚上，再用电饭煲蒸熟。
(2)补水降温，将蒸熟的米饭用(25℃)冷水快速淋饭，并将饭温控制在 25-30℃，要注意饭温的上下差，测温时需要拌匀，沥水至少到基本不滴。
(3)前发酵：在所得的沥水后的米饭中加入本实施例的黄酒人工酒药发酵剂拌匀后加入发酵瓶中，然后在中间挖大小适中的倒喇叭状空洞，以保持适当的溶氧量，瓶口用八层纱布封口，放至30℃培养箱发酵30个小时，培养至底部有窝水出现，香味浓郁。
(4)后发酵：在所得的发酵产物中放入米重1.2倍的水，并将培养温度降低至16℃，前三天每天搅拌两次，之后可以不搅拌，发酵两星期结束。
(5)压榨过滤:压榨使酒液与酒糟分离，酒液流出，过滤。
(6)澄清、灭菌:将酒液放于4-6℃自然澄清2天，上清液于80℃灭菌20min，制得黄酒。
实施例5.人工酒药核心菌群的制备及黄酒发酵
根据实施例4的接种浓度进行调整，实际接种浓度为：戊糖片球菌 8.4×103CFU/g，食窦魏斯氏菌2.3×103CFU/g，融合魏斯氏菌2.3×103CFU/g，扣囊复膜孢酵母9.2×103CFU/g，小孢根霉菌10.1×102CFU/g，另外加入酿酒酵母 6.3×103CFU/g。
黄酒发酵方法，具体步骤如下：
(1)浸米蒸饭，先将糯米用水浸泡一晚上，再用电饭煲蒸熟。
(2)补水降温，将蒸熟的米饭用(25℃)冷水快速淋饭，并将饭温控制在 25-30℃，要注意饭温的上下差，测温时需要拌匀，沥水至少到基本不滴。
(3)前发酵：加入本实施例的黄酒人工酒药发酵剂拌匀后加入发酵瓶中，然后在中间挖大小适中的倒喇叭状空洞，以保持适当的溶氧量，瓶口用八层纱布封口，放至30℃培养箱30个小时左右，培养至底部有窝水出现，香味浓郁。
(4)后发酵：放水，放入米重1.2倍的水，并将培养温度降低至16℃，前三天每天搅拌两次，之后可以不搅拌，发酵两星期结束。
(5)压榨过滤:压榨使酒液与酒糟分离，酒液流出，过滤。
(6)澄清、灭菌:将酒液放于4-6℃自然澄清2天，上清液于80℃灭菌20min，制得黄酒。
实施例6.人工酒药核心菌群的制备及黄酒发酵
根据实施例5的接种浓度进行调整，实际接种浓度为：戊糖片球菌 8.9×103CFU/g，食窦魏斯氏菌2.6×103CFU/g，融合魏斯氏菌2.6×103CFU/g，扣囊复膜孢酵母9.5×103CFU/g，小孢根霉菌10.4×102CFU/g，另外加入酿酒酵母 6.3×103CFU/g。
黄酒发酵方法，具体步骤如下：
(1)浸米蒸饭，先将糯米用水浸泡一晚上，再用电饭煲蒸熟。
(2)补水降温，将蒸熟的米饭用(25℃)冷水快速淋饭，并将饭温控制在 25-30℃，要注意饭温的上下差，测温时需要拌匀，沥水至少到基本不滴。
(3)前发酵：加入本实施例的黄酒人工酒药发酵剂拌匀后加入发酵瓶中，然后在中间挖大小适中的倒喇叭状空洞，以保持适当的溶氧量，瓶口用八层纱布封口，放至30℃培养箱30个小时左右，培养至底部有窝水出现，香味浓郁。
(4)后发酵：放水，放入米重1.2倍的水，并将培养温度降低至16℃，前三天每天搅拌两次，之后可以不搅拌，发酵两星期结束。
(5)压榨过滤:压榨使酒液与酒糟分离，酒液流出，过滤。
(6)澄清、灭菌:将酒液放于4-6℃自然澄清2天，上清液于80℃灭菌20min，制得黄酒。
对比例1传统酒药发酵制备黄酒
传统酒药发酵制备黄酒，具体步骤如下：
(1)浸米蒸饭，先将糯米用水浸泡一晚上，再用电饭煲蒸熟。
(2)补水降温，将蒸熟的米饭用(25℃)冷水快速淋饭，并将饭温控制在 25-30℃，要注意饭温的上下差，测温时需要拌匀，沥水至少到基本不滴。
(3)前发酵：加入酒药粉末(米重的0.2％)拌匀后加入发酵瓶中，然后在中间挖大小适中的倒喇叭状空洞，以保持适当的溶氧量，瓶口用八层纱布封口，放至30℃培养箱30个小时左右，培养至底部有窝水出现，香味浓郁。
(4)后发酵：放水，放入米重1.2倍的水，并将培养温度降低至16℃，前三天每天搅拌两次，之后可以不搅拌，发酵两星期结束。
(5)压榨过滤:压榨使酒液与酒糟分离，酒液流出，过滤。
(6)澄清、灭菌:将酒液放于4-6℃自然澄清2天，上清液于80℃灭菌20min，制得黄酒。
对比例2商业发酵剂安琪酒曲发酵制备黄酒
商业发酵剂安琪酒曲发酵制备黄酒，具体步骤如下：
(1)浸米蒸饭，先将糯米用水浸泡一晚上，再用电饭煲蒸熟。
(2)补水降温，将蒸熟的米饭用(25℃)冷水快速淋饭，并将饭温控制在 25-30℃，要注意饭温的上下差，测温时需要拌匀，沥水至少到基本不滴。
(3)前发酵：加入安琪酒曲(米重的0.2％)拌匀后加入发酵瓶中，然后在中间挖大小适中的倒喇叭状空洞，以保持适当的溶氧量，瓶口用八层纱布封口，放至30℃培养箱30个小时左右，培养至底部有窝水出现，香味浓郁。
(4)后发酵：放水，放入米重1.2倍的水，并将培养温度降低至16℃，前三天每天搅拌两次，之后可以不搅拌，发酵两星期结束。
(5)压榨过滤:压榨使酒液与酒糟分离，酒液流出，过滤。
(6)澄清、灭菌:将酒液放于4-6℃自然澄清2天，上清液于80℃灭菌20min，制得黄酒。
效果例1人工酒药发酵酒与传统绍兴酒药发酵酒香气轮廓比较
使用有14个传感器和Smart Nose智能识别软件系统的电子鼻(Supernose，Isenso Group Corporation，New York，USA)对黄酒香气进行分析。将每个黄酒样品于样品瓶中准确称取15.0g，静置30min后进行电子鼻分析，采用顶空吸气法，手动单样品进样，直接将进样针头插入样品瓶，完成一次检测后系统进行清零和标准化。基于G/GO比(G代表监测样气的14个传感器的电导率，GO代表清洁空气)，所有传感器响应数据都进行了评估。环境室控制如下：室温(25℃)；传感器清洗流量6L/min；自动调零时间10s；内部和入口流速均为600mL/ min。在样品检测时间的60秒内，每秒测量吸收的气体。每个样品分析三次。
将实施例4、5、6与对比例1进行电子鼻香气轮廓的比较，如图3所示。
结果如下：人工酒药发酵剂制得的黄酒在整体的风味轮廓上与传统酒药发酵制得的黄酒相差不大。且三个实施例的香气轮廓基本无变化。
效果例2人工酒药发酵酒与传统绍兴酒药发酵酒发酵活力比较
按实施例4、5、6及对比例1的方法将人工酒药发酵剂和六种传统酒药进行黄酒发酵，分别在其在发酵结束后监测其酒精度。酒精度测定利用蒸馏的方法，首先搭建好蒸馏装置，在烧瓶中倒入50mL待测液加50mL蒸馏水，并加入6至8 颗小玻璃珠作为沸石，防止爆沸。将烧瓶放在加热装套上加热至沸腾，使用100mL 干净的量筒作为收集装置。直至蒸馏出的馏出液达到50mL后停止加热，用酒精比重计来测量待测液的酒精含量，测量时将馏出液放入大试管中，将酒精计小心取出，用去离子水冲洗后，用干净的纸巾将酒精计擦干净，浸没于馏出液内，等酒精计停止上浮，读取液面在酒精计上的读数并记录数据。
将实施例4、5、6与对比例1进行发酵时间和发酵活力的比较，如表3所示。
效果例3人工酒药发酵酒与传统绍兴酒药发酵酒挥发性香气种类比较
用SPME-GCMS测定人工酒药发酵酒和六种传统绍兴酒药发酵酒的挥发性香气组分。具体方法如下：首先进行固相微萃取，取5g黄酒样品置于20mL顶空瓶中，加入10μL内标2-辛醇(70mg/L)，用聚四氟乙烯硅胶垫密封，将顶空瓶放入60℃水浴锅中，平衡10min，然后将老化后的SPME萃取头插入顶空瓶萃取发酵样品30min。GC条件:色谱柱:DB-5(60m×0.25mm，0.25μm)；进样口温度:250℃；升温程序:初始温度40℃保持6min，以3℃/min升至100℃后，再以5℃/min升至230℃，保持10min；载气为氦气，流速3mL/min；进样方式:不分流进样。MS条件:电子轰击离子源；电子能量70eV；传输线温度:280℃；离子源温度:230℃；质量扫描范围:10～450u。
将实施例4、5、6与对比例1、2进行挥发性香气种类的比较，如表4所示。
表1酒药核心菌群与发酵活力的相关性
核心菌群 酒精度增长率 糖化力 酸度增长率
Rhizopus 0.54 0.71 0.64
Saccharomycopsis -0.23 0.64 0.15
Aspergillus 0.41 0.41 -0.21
Simplicillium 0.23 -0.31 -0.33
Gibberella 0.39 -0.09 0.33
Fusarium -0.03 -0.43 0.64
Chaetomium 0.06 -0.49 -0.33
Wickerhamomyces 0.32 -0.77 0.46
Malassezia -0.12 -0.60 -0.21
Alternaria 0.43 0.37 0.82
Pediococcus 0.20 0.37 0.64
Enterobacter 0.15 -0.31 -0.15
Weissella 0.03 -0.14 0.49
Klebsiella 0.41 -0.14 -0.39
Escherichia-Shigella -0.09 -0.43 -0.33
Pelomonas -0.12 -0.43 0.39
Cronobacter 0.06 0.26 -0.64
Ochrobactrum -0.52 -0.66 0.27
Ralstonia -0.26 -0.89 0.27
表2.酒药中的分离的核心微生物及在制备人工酒药发酵剂的接种浓度
表3.实施例和对比例发酵活力指标的对比
样品 发酵时间(天) 发酵终点酒精度
实施例4 16 15.2
实施例5 16 14.9
实施例6 16 15.6
(塔牌)对比例1 14 15.4
(小酒厂)对比例1 14 13.2
(东方)对比例1 14 14.1
(咸享)对比例1 14 14.2
(福全)对比例1 14 13.9
(第三)对比例1 14 15
表4.实施例和对比例挥发性香气种类的对比
样品 香气物质 酯类 醇类 酸类 醛类 烃类 其他
实施例4 56 26 13 4 1 2 10
实施例5 60 23 10 3 2 9 13
实施例6 69 32 13 4 3 3 14
(塔牌)对比例1 56 20 8 4 1 11 12
(小酒厂)对比例1 70 28 10 4 3 12 13
(东方)对比例1 76 39 16 4 0 9 8
(咸享)对比例1 66 28 10 4 0 10 14
(福全)对比例1 66 28 11 3 1 9 14
(第三)对比例1 67 15 12 2 1 10 27
(商业发酵酒)对比例2 20 10 3 0 0 2 5
SEQUENCE LISTING
<110> 上海应用技术大学
<120> 一种黄酒人工酒药发酵剂及其应用方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 通用引物
<400> 1
gcatatcaataagcggaggaaaag 24
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 通用引物
<400> 2
ggtccgtgtttcaagacgg 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 通用引物
<400> 3
gagagtttgatcctggctcag 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 通用引物
<400> 4
tacggctaccttgttacgac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 通用引物
<400> 5
actcctacgggaggcagcag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 通用引物
<400> 6
ggactachvgggtwtctaat 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 通用引物
<400> 7
cttggtcatt tagaggaagtaa 22
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 通用引物
<400> 8
gctgcgttcatcgatgc 17

Claims (10)

1.一种黄酒人工酒药发酵剂，其特征在于，包含酿酒酵母、食窦魏斯氏菌、融合魏斯氏菌、戊糖片球菌、扣囊复膜孢酵母以及小孢根霉。
2.如权利要求1所述的黄酒人工酒药发酵剂，其特征在于，所述的酿酒酵母为NKCCMRNK3.00156。
3.如权利要求1所述的黄酒人工酒药发酵剂，其特征在于，所述的食窦魏斯氏菌为BNCC206838。
4.如权利要求1所述的黄酒人工酒药发酵剂，其特征在于，所述的融合魏斯氏菌为CICC23465。
5.如权利要求1所述的黄酒人工酒药发酵剂，其特征在于，所述的戊糖片球菌为CCTCCM 2019323。
6.如权利要求1所述的黄酒人工酒药发酵剂，其特征在于，所述的扣囊复膜孢酵母为CCTCC M 2019324。
7.如权利要求1所述的黄酒人工酒药发酵剂，其特征在于，所述的小孢根霉为CCTCC M2019325。
8.如权利要求1所述的黄酒人工酒药发酵剂，其特征在于，按每克米的接种浓度计，戊糖片球菌的用量为8.0～8.9×103CFU/g，食窦魏斯氏菌的用量为1.8～2.6×103CFU/g，融合魏斯氏菌的用量为1.8～2.6×103CFU/g，扣囊复膜孢酵母的用量为8.7～9.6×103CFU/g，小孢根霉的用量为9.8～10.6×102CFU/g，酿酒酵母的用量为6.3～6.8×103CFU/g。
9.权利要求1-8中任一项所述的黄酒人工酒药发酵剂在黄酒发酵中的应用。
10.一种黄酒发酵方法，其特征在于，包括：
步骤1:浸米蒸饭：先将糯米用水浸泡一晚上，再用电饭煲蒸熟；
步骤2:补水降温：将蒸熟的米饭用水淋，将饭温控制在25-30℃，沥水；
步骤3:前发酵：在步骤2所得的沥水后的米饭中加入权利要求1-8任一项所述的黄酒人工酒药发酵剂，拌匀后，加入发酵瓶中，瓶口用八层纱布封口，放至30℃培养箱发酵30个小时；
步骤4:后发酵：在步骤3所得的发酵产物中放入米重1.2倍的水，并将培养温度降低至16℃，前三天每天搅拌两次，发酵两星期；
步骤5:压榨过滤：压榨使酒液与酒糟分离，酒液流出，过滤；
步骤6:澄清、灭菌：将酒液放于4-6℃自然澄清1-2天，上清液于75-90℃灭菌15-25min，制得黄酒。
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