CN102459618A - 加工生物量 - Google Patents

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Abstract

加工生物量(例如，植物生物量、动物生物量和城市废物生物量)用于在有用产物例如燃料的生产中使用。例如，系统可以使用生物量材料例如纤维素和/或木质纤维素材料，以增强产物生产，例如通过发酵的乙醇和/或丁醇生产。

Description

加工生物量
相关申请
本申请要求于2009年4月4日提交的美国序列号12/417,840，于2009年5月20日提交的美国临时申请序列号61/180,032，和于2009年10月16日提交的美国临时申请序列号61/252,293的优先权。这些临时申请各自的完全公开内容通过引用在此合并入本文。
背景
纤维素和木质纤维素材料在许多应用中大量产生、加工并使用。通常此类材料使用一次，并随后作为废物抛弃，或仅视为废物材料，例如污水、甘蔗渣、锯屑和秸秆。
多种纤维素和木质纤维素材料、其用途和应用已在美国专利号7,307,108、7,074,918、6,448,307、6,258,876、6,207,729、5,973,035和5,952,105中；以及在多种专利申请中描述，包括于2006年3月23日提交的“FIBROUS MATERIALS AND COMPOSITES，”PCT/US2006/010648，和“FIBROUS MATERIALS ANDCOMPOSITES”，美国专利申请公开号2007/0045456。
概述
在某些情况下，在加工过程例如发酵中生物量的存在促进低分子量糖转变成中间产物或产物。本发明人已发现在具有低分子量糖、介质例如溶剂或溶剂系统和微生物的混合物中包括生物量可以改善通过糖例如醇例如乙醇或丁醇转变获得的中间产物或产物得率和生产率。包括生物量还可以预防例如通过发酵的不完全、迟缓或“粘滞”产物转变。
生物量自身可能不转变成产物(例如醇)，或可以连同低分子量糖一起部分或完全转变成产物。
在其中生物量部分转变的情况下，相对于起始生物量的表面积和多孔性，生物量的表面积和多孔性增加，这可以有利地增加低分子量糖至产物的转变速率。
在某些情况下，生物量可以是已经糖化的纤维素或木质纤维素材料的残留部分，例如在纤维素已转变成糖后留下的木质素和/或其他材料。
在一个方面，本发明的特征在于这样的方法，其包括使用固定化在生物量材料例如官能化的生物量纤维上的微生物和/或酶，将碳水化合物例如低分子量糖转变成产物。“固定化”意指微生物和/或酶通过共价、氢、离子或等价连接和/或通过机械相互作用，例如在微生物和生物量材料例如纤维的孔之间，直接或间接(例如通过化学接头)与纤维连接。连接可以例如通过电极化生物量材料来产生。相互作用可以是永久、半永久或短暂的。机械相互作用可以包括与生物量材料的孔或其他位点嵌套或粘住的微生物或酶。
某些实现包括一个或多个下述特征。
转变可以包括允许微生物将至少部分低分子量糖转换为醇例如乙醇或丁醇，或转变成烃或氢。转变可以包括发酵。微生物可以包括酵母例如酿酒酵母(S.cerevisiae)和/或树干毕赤酵母(P.stipitis)，或细菌例如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。该方法可以进一步包括例如用电离辐射例如使用粒子束照射生物量纤维。生物量纤维可以具有大于0.25m2/g的BET表面积和/或大于70％的多孔性。生物量纤维可以衍生自这样的生物量材料，其具有内部纤维并且已剪切至其内部纤维基本上暴露的程度。
在另一个方面，本发明的特征在于包括具有极性官能团的生物量材料、具有互补吸引性官能团的微生物和液体介质的混合物。
在一个进一步的方面，本发明的特征在于包括具有官能团的生物量纤维、和具有互补吸引性官能团的微生物的组合物，所述微生物固定化在生物量纤维上。
本发明的特征还在于这样的方法，其包括使具有生物量、微生物和溶剂或溶剂系统(例如水或水和有机溶剂的混合物)的混合物中的低分子量糖或包括低分子量糖的材料转变为产物。溶剂或溶剂系统的例子包括水、己烷、十六烷、甘油、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、石油醚、液化石油气(LPG)、离子液体及其混合物。溶剂或溶剂系统可以以单相或2个或更多个相的形式。生物量可以例如以纤维形式。
在某些情况下，在产物的生产过程中具有生物量材料(例如，通过本文描述的任何方法处理或未经处理的)的存在可以增强产物的生产率。不希望受任何具体理论束缚，认为通过增加溶质的有效浓度且提供反应可以在其上发生的基质，具有固体存在例如高表面积和/或高多孔性固体可以增加反应速率。
在某些实施方案中，已照射、氧化、化学处理、机械处理、超声处理、蒸汽爆炸和/或热解的生物量材料可以加入低分子量糖发酵加工过程中，例如以增强发酵速率和输出。
例如，经照射或未经照射的纤维素材料，例如纸纤维，可以加入发酵加工过程中，例如在玉米-乙醇发酵或甘蔗提取物发酵加工过程中，以使生产率增加至少10、15、20、30、40、50、75、100％或更多，例如至少150％或甚至高达1000％。转变例如发酵可以显示出如本文实施例中限定的至少140％，在某些情况下至少170％的性能百分比。
生物量材料可以具有高表面积、高多孔性和/或低堆密度。在某些实施方案中，生物量以约0.5重量％-约50重量％存在于混合物中，例如约1重量％-约25重量％，或约2重量％-约12.5重量％。在其他实施方案中，生物量以大于约0.5重量％的量存在，例如大于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或甚至大于约10重量％。
因为生物量材料其自身在转变加工过程期间不消耗，所以生物量材料可以在多次分批加工过程中再使用，或可以连续使用用于生产相对大体积的产物。
某些实现包括下述特征中的一种或多种。
该方法可以包括在混合前例如用电离辐射例如以至少5Mrad的总用量照射纤维生物量。照射可以使用粒子束执行。照射可以在选择为减少生物量的分子量的条件下进行。照射可以使用辐射的多重应用来执行。电离辐射可以包括电子束辐射。例如，辐射可以以约10Mrad-约150Mrad的总剂量，例如以约0.5-约10Mrad/天、或1Mrad/s-约10Mrad/s的剂量率应用。在某些实施方案中，照射包括应用2种或更多种辐射源，例如γ射线和电子束。
在某些实施方案中，在生物量原料暴露于空气、氮、氧、氦或氩时，对生物量原料执行照射。在某些实施方案中，预处理可以包括用蒸汽爆炸预处理生物量原料。
在某些实施方案中，该方法包括机械处理生物量，例如通过剪切、石研磨、机械撕开或撕裂、针研磨、湿或干磨、空气碾磨、切割、挤压、压缩或这些加工过程中的任何的组合，减少生物量的单个小片的一个或多个维度。在某些情况下，在机械处理后，生物量包括具有大于5/1的平均长度直径比的纤维。在某些实施方案中，所制备的生物量可以具有大于0.25m2/g的BET表面积。机械处理的生物量可以具有小于约0.5g/cm3例如小于0.35g/cm3的堆密度。
在本文公开的方法的任何中，辐射可以从在地下室(vault)中的装置应用。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管下文描述了合适方法和材料，但与本文描述那些相似或等价的方法与材料可以用于本发明的实践或测试。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体合并。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅是举例说明性的，并且不预期是限制性的。
本发明的其他特征和优点由于下述详述和权利要求将是显而易见的。
附图描述
图1是举例说明生物量的处理和经处理的生物量在发酵加工过程中的用途的方框图。
图2是与微生物相互作用的官能化的生物量的图示。
图3是在旋转切割机上剪切的牛皮纸板纸的红外光谱。
图4是在用100Mrad的γ辐射照射后图3的牛皮纸的红外光谱。
图5A-5I是实施例13中的样品P132、P132-10、P132-100、P-1e、P-5e、P-10e、P-30e、P-70e和P-100e的1H-NMR光谱。图5J是来自图5A-5I在～16ppm下的可交换光子的比较。图5K是样品P-100e的13C-NMR。图5L-5M是具有10秒延迟时间的样品P-100e的13C-NMR。图5N是在样品P-100e的10％wt./wt.浓度下的1H-NMR。
详述
具有所需功能性类型和量的官能化的生物量材料，例如羧酸基团、烯醇基团、醛基、酮基、腈基、硝基或亚硝基，可以使用本文描述的方法进行制备。此类官能化材料可以例如在发酵加工过程期间促进低分子量糖转换成产物。
生物量类型
用于在本文描述的加工过程中使用的优选生物量材料包含可以用官能团进行官能化的纤维，所述官能团与在转变糖中使用的试剂例如微生物例如酵母上的官能团是互补的。
纤维来源包括纤维素纤维来源，包括纸和纸制品(例如，聚涂层纸和牛皮纸)，和木质纤维素纤维来源，包括木材和木材相关材料，例如刨花板。其他合适的纤维来源包括天然纤维来源，例如草、稻壳、甘蔗渣、黄麻、大麻、亚麻、竹、剑麻、马尼拉麻、稻草、柳枝稷、苜蓿、干草、玉米轴、玉米秆、椰子毛；α-纤维素含量很高的纤维来源，例如棉花；和合成纤维来源，例如拉出的丝(yarn)(取向丝或无取向丝)。天然或合成纤维来源可以得自未用过的废弃纺织品材料例如碎布，或它们可以是消费后的废物例如破布。当纸制品用作纤维来源时，它们可以是未用过的材料，例如废弃的未用过的材料，或它们可以是消费后的废物。除未用过的原始材料外，消费后、工业(例如，废料)和加工废物(例如，来自纸加工的流出物)也可以用作纤维来源。此外，纤维来源可以得自或衍生自人(例如，污水)、动物或植物废物。另外的纤维来源已在美国专利号6,448,307、6,258,876、6,207,729、5,973,035和5,952,105中得到描述。
在某些实施方案中，生物量材料包括这样的碳水化合物，其是或包括具有一个或多个β-1，4-连接且具有约3,000-50,000的数量平均分子量的材料。此类碳水化合物是或包括纤维素(I)，其通过β(1，4)-糖苷键的缩合而衍生自(β-葡萄糖1)。这个连接使其自身与关于淀粉和其他碳水化合物中存在的α(1，4)-糖苷键的那种形成对比。
Figure BDA0000122285460000061
淀粉质材料包括淀粉其自身例如玉米淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉或米淀粉，淀粉衍生物，或包括淀粉的材料例如可食用食物产物或农作物。例如，淀粉质材料可以是秘鲁胡萝卜、荞麦、香蕉、大麦、木薯、野葛、酢浆草、西米、高粱、常规普通马铃薯、甘薯、芋头、山药或一种或多种豆例如蚕豆、小扁豆或豌豆。任何2种或更多种淀粉质材料的掺和物也是淀粉质材料。
在某些情况下，生物量是微生物材料。微生物来源包括但不限于任何天然存在或遗传修饰的微生物或生物体，其包含或能够提供碳水化合物(例如，纤维素)的来源，例如原生生物(例如动物原生生物(例如原生动物，例如鞭毛虫、变形虫、纤毛虫和孢子虫)和植物原生生物(例如藻类，例如alveolates、chlorarachniophytes、隐藻、裸藻、灰绿藻、定鞭藻、红藻、stramenopiles和viridaeplantae))。其他例子包括海藻、浮游生物(例如大型浮游生物、中型浮游生物、小型浮游生物、微型浮游生物、超微型浮游生物和超微微型浮游生物)、浮游植物、细菌(例如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和极端微生物)、酵母和/或这些的混合物。在某些情况下，微生物生物量可以得自天然来源，例如海洋、湖泊、水体例如盐水或淡水、或在陆地上。备选地或另外地，微生物生物量可以得自培养系统，例如大规模干和湿培养系统。
本文描述的任何生物量材料的掺和物可以用于制备本文描述的任何中间产物或产物。例如，纤维素材料和淀粉质材料的掺和物可以用于制备本文描述的任何产物。
用于在发酵中处理生物量和使用经处理的生物量的系统
图1显示用于处理生物量特别是纤维生物量，并且随后使用经处理的生物量以增强发酵加工过程的系统100。系统100包括生物量原料在其中进行机械处理例如暴露原料的内部纤维的模块102。机械处理的例子将在下文详细描述。系统100还包括经机械处理的原料在其中例如通过照射进行官能化的模块104。在官能化后，官能化的纤维通过递送模块108递送至发酵系统106。
官能化的纤维随后存在于发酵过程中，并且通过提供基质增强发酵加工过程，所述基质可以与发酵中使用的微生物例如酵母细胞相互作用。这种相互作用在图2中示意性显示，所述图2描述了官能化的极性纤维10和具有互补极性官能团的酵母细胞12。由于纤维和酵母细胞的极性，细胞可以变得固定化在一种或多种纤维上。酵母细胞(或其他微生物)与纤维的连接可以通过氢键合或通过共价或离子键合。在某些情况下，纤维上的官能团可以与微生物上的那些反应，形成共价键。起因于机械处理(例如在模块102中)的生物量材料增加的表面积和多孔性提供了用于纤维和微生物的相互作用的更大表面积，并且从而增强这种相互作用。固定化的细胞更高生产性，增加发酵加工过程的效率和得率，并且阻止该过程变得过早“粘滞”。
应当指出如果混合在发酵过程中执行，那么混合是优选相对温和的(低剪切)，以便使微生物和纤维之间的相互作用的破坏降到最低。在某些实施方案中，使用喷射混合，如其完整公开内容通过引用合并入本文的USSN 61/218,832和USSN 61/179,995中描述的。
再次参考图1，发酵产生粗乙醇混合物，这流动到容纳槽110内。水或其他溶剂和其他非乙醇组分使用反萃取柱112从粗乙醇混合物中剥离，并且乙醇随后使用蒸馏单元114例如精馏器进行蒸馏。最后，乙醇可以使用分子筛116进行干燥，需要时进行变性，并且输出至所需运送方法。
在某些情况下，本文描述的系统或其组分可以是手提式的，从而使得该系统可以从一个位置转运(例如通过轨道、货车或海洋船只)到另一个。本文描述的方法步骤可以在一个或多个位置执行，并且在某些情况下，一个或多个步骤可以在运输中执行。此类移动加工在美国序列号12/374,549和国际申请号WO 2008/011598中描述，其完整公开内容通过引用合并入本文。
本文描述的任何或所有方法步骤可以在环境温度下执行。需要时，冷却和/或加热可以在某些步骤过程中采用。例如，原料可以在机械处理过程中冷却，以增加其脆性。在某些实施方案中，冷却在最初机械处理和/或后续机械处理之前、过程中或之后采用。冷却可以如12/502,629中所述执行，其完全公开内容通过引用合并入本文。此外，可以控制发酵系统106中的温度以增强发酵。
物理处理
可以用于改变生物量材料的形态和/或官能化材料的物理处理过程可以包括本文描述的那些中的任何一种或多种，例如机械处理、化学处理、照射、超声处理、氧化、热解或蒸汽爆炸。处理方法可以以这些技术中的2、3、4种或甚至所有的组合使用(以任何次序)。当使用超过一种处理方法时，方法可以同时或不同时应用。还可以使用官能化生物量原料和/或改变其形态的其他过程，单独或与本文公开的过程组合。
机械处理
在某些情况下，方法可以包括机械处理生物量原料。机械处理包括例如切割、研磨、压制、磨碎、剪切和剁碎。研磨可以包括例如球磨、锤磨、转子/定子干或湿磨、或其他类型的研磨。其他机械处理包括例如石研磨、裂化、机械撕开或撕裂、针研磨或空气碾磨。
机械处理对于“打开”、“压紧”、破坏和破碎纤维素或木质纤维素材料可以是有利的，使得材料的纤维素对断链和/或结晶度减少更敏感。当被照射时，开放材料也可以对氧化更敏感。
在某些情况下，机械处理可以包括如接受的原料的最初制备，例如材料的粉碎，例如通过切割、磨碎、剪切、磨粉或剁碎。例如，在某些情况下，松散原料(例如再循环纸、淀粉质材料或柳枝稷)通过剪切或切碎进行制备。
可替代地或另外地，原料材料可以通过一种或多种其他物理处理方法首先进行物理处理，所述物理处理方法例如化学处理、辐射、超声处理、氧化、热解或蒸汽爆炸，并且随后进行机械处理。这个顺序可以是有利的，因为通过一种或多种其他处理例如照射或热解处理的材料趋于更易碎，并且因此更易于通过机械处理进一步改变材料的分子结构。
在某些实施方案中，生物量材料是纤维的，并且机械处理包括剪切以暴露纤维材料的纤维。剪切可以例如使用旋转切割机执行。机械处理生物量的其他方法包括例如研磨或磨碎。研磨可以使用例如下述来执行：锤磨机、球磨机、胶体磨、圆锥形或锥形磨、盘磨机、碾碎机、维利磨粉机(Wiley mill)或磨粉机。磨碎可以使用例如石研磨机、针研磨机、咖啡磨机或磨盘式磨机(burr grinder)执行。磨碎可以例如通过往复式运动的针或其他元件来提供，如在针磨机的情况下。其他机械处理方法包括机械撕开或撕裂、对材料施加压力的其他方法、和空气研磨。合适的机械处理进一步包括改变生物量材料的分子结构或形态的其他技术。
需要时，经机械处理的材料可以经过例如具有1.59mm或更少(1/16英寸，0.0625英寸)的平均开口尺寸的筛子。在某些实施方案中，同时执行剪切或其他机械处理和筛选。例如，旋转切割机可以用于同时剪切和筛选生物量材料。生物量在固定叶片和旋转叶片之间进行剪切，以提供经过筛子且捕获在箱中的剪切材料。
生物量材料可以以干燥状态(例如在其表面上具有很少的游离水或无游离水)、水合状态(例如，具有高至10重量％的吸收水)、或湿润状态例如具有约10重量％-约75重量％的水进行机械处理。生物量材料甚至可以在部分或全部没入液体下时进行机械处理，所述液体例如水、乙醇、异丙醇。生物量材料还可以在气体(例如除空气外的气体流或气氛)例如氧或氮或蒸汽中进行机械处理。
机械处理系统可以经配置以产生具有特定形态特征的流，例如表面积、多孔性、堆密度，并且在纤维原料的情况下，纤维特征例如长宽比。
在某些实施方案中，经机械处理的材料的BET表面积大于0.1m2/g，例如大于0.25m2/g、大于0.5m2/g、大于1.0m2/g、大于1.5m2/g、大于1.75m2/g、大于5.0m2/g、大于10m2/g、大于25m2/g、大于35m2/g、大于50m2/g、大于60m2/g、大于75m2/g、大于100m2/g、大于150m2/g、大于200m2/g、或甚至大于250m2/g。
经机械处理的材料的多孔性可以是例如大于20％、大于25％、大于35％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于85％、大于90％、大于92％、大于94％、大于95％、大于97.5％、大于99％、或甚至大于99.5％。
在某些实施方案中，在机械处理后，材料具有小于0.25g/cm3的堆密度，例如0.20g/cm3、0.15g/cm3、0.10g/cm3、0.05g/cm3或更少，例如0.025g/cm3。堆密度使用ASTM D1895B进行测定。简言之，该方法涉及用样品填充已知体积的量筒，并且获得样品的重量。通过用以克表示的样品重量除以以立方公分表示的圆筒的已知体积来计算堆密度。
如果原料是纤维材料，那么经机械处理的材料的纤维可以具有相对大的平均长度直径比(例如大于20比1)，即使它们已剪切超过一次。此外，本文描述的纤维材料的纤维可以具有相对窄的长度和/或长度直径比分布。
如本文使用的，平均纤维宽度(例如直径)是通过随机选择约5,000根纤维在光学上测定的那些。平均纤维长度是校正长度-加权长度。BET(Brunauer，Emmet和Teller)表面积是多点表面积，并且多孔性是通过水银孔率法测定的那些。
如果生物量是纤维材料，那么经机械处理的材料的纤维的平均长度直径比可以例如大于8/1、例如大于10/1、大于15/1、大于20/1、大于25/1或大于50/1。经机械处理的材料的平均纤维长度可以是例如约0.5mm-2.5mm、例如约0.75mm-1.0mm，并且第二种纤维材料14的平均宽度(例如直径)可以是例如约5μm-50μm，例如约10μm-30μm。
在某些实施方案中，如果原料是纤维材料，那么经机械处理的材料的纤维长度的标准差可以小于经机械处理的材料的平均纤维长度的60％，例如小于平均长度的50％、小于平均长度的40％、小于平均长度的25％、小于平均长度的10％、小于平均长度的5％、或甚至小于平均长度的1％。
在某些情况下，可能希望制备低堆密度材料，使材料致密(例如使得转运至另一个地点更容易和成本更少)，并且随后使材料恢复较低堆密度状态。致密化材料可以通过本文描述的任何方法进行加工，或通过本文描述的任何方法加工的任何材料可以随后致密化，例如如美国序列号12/429,045和WO 2008/073186中公开的，其完全公开内容通过引用合并入本文。
辐射处理
一个或多个照射加工顺序可以用于加工生物量，例如以官能化材料。辐射还可以灭菌材料或生物加工材料所需的任何介质。
在某些实施方案中，从其原子轨道中释放电子的材料中沉积的能量用于照射材料。辐射可以通过下述提供：(1)重带电粒子，例如α粒子或质子，(2)例如在β衰变或电子束加速器中产生的电子，或(3)电磁辐射，例如γ射线、x射线或紫外射线。在一种方法中，通过放射性物质材料的辐射可以用于照射原料。在另一种方法中，电磁辐射(例如，使用电子束发射器产生的)可以用于照射原料。在某些实施方案中，可以利用以(1)到(3)的任何次序或同时的任何组合。所应用的剂量依赖于所需效应和具体原料。
在某些情况下，当希望断链和/或希望聚合链官能化时，可以利用比电子重的粒子，例如质子、氦核、氩离子、硅离子、氖离子、碳离子、磷离子、氧离子或氮离子。当需要开环断链时，由于其路易斯(Lewis)酸性质，带正电的粒子可以用于增强的开环断链。例如，当需要最大限度氧化时，可以利用氧离子，并且当需要最大限度硝化时，可以利用氮离子。重粒子和带正电的粒子的使用在美国序列号12/417,699中描述，其完全公开内容通过引用合并入本文。
在一种方法中，例如通过用电离辐射(例如，以γ辐射、X射线辐射、100nm-280nm紫外(UV)线、电子束或其他带电粒子的形式)处理，照射第一种材料，其是或包括具有第一数量平均分子量(MN1)的纤维素，以提供第二种材料，其包括具有比第一数量平均分子量低的第二数量平均分子量(MN2)的纤维素。第二种材料(或第一种和第二种材料)可以与微生物(含或不含酶处理)相组合，所述微生物可以利用第二种和/或第一种材料或其组成成分糖或木质素，以产生中间产物或产物，例如本文描述的那些。
因为第二种材料包括相对于第一种材料具有减少的分子量、和在某些情况下以及减少的结晶度的纤维素，所以第二种材料例如在包含微生物和/或酶的溶液中一般更分散、膨胀和/或可溶。这些性质使得相对于第一种材料，第二种材料更易于加工且对化学、酶促和/或生物攻击更敏感，这可以极大改善所需产物例如乙醇的生产率和/或生产水平。
在某些实施方案中，第二数量平均分子量(MN2)比第一数量平均分子量(MN1)低超过约10％，例如超过约15、20、25、30、35、40、50％、60％或甚至超过约75％。
在某些情况下，第二种材料包括这样的纤维素，其具有比第一种材料的纤维素的结晶度(C1)低的结晶度(C2)。例如，(C2)可以比(C1)低超过约10％，例如超过约15、20、25、30、35、40或甚至超过约50％。
在某些实施方案中，起始结晶度指数(在照射前)是约40-约87.5％，例如约50-约75％或约60-约70％，并且在照射后的结晶度指数是约10-约50％，例如约15-约45％或约20-约40％。然而，在某些实施方案中，例如在广泛照射后，它可以具有低于5％的结晶度指数。在某些实施方案中，在照射后的材料是基本上无定形的。
在某些实施方案中，起始数量平均分子量(在照射前)是约200,000-约3,200,000，例如约250,000-约1,000,000或约250,000-约700,000，并且在超声处理后的数量平均分子量是约50,000-约200,000，例如约60,000-约150,000或约70,000-约125,000。然而，在某些实施方案中，例如在广泛照射后，它可以具有小于约10,000或甚至小于约5,000的数量平均分子量。
在某些实施方案中，第二种材料可以具有比第一种材料的氧化水平(O1)高的氧化水平(O2)。材料的更高氧化水平可以帮助其分散性、膨胀性和/或可溶性，进一步增强材料对化学、酶促或微生物攻击的敏感性。在某些实施方案中，为了增加第二种材料相对于第一种材料的氧化水平，照射在氧化环境下例如在空气或氧覆盖层下执行，产生比第一种材料更氧化的第二种材料。例如，第二种材料可以具有更多羟基、醛基、酮基、酯基、或羧酸基团，这可以增加其亲水性。
电离辐射
每种形式的辐射经由特定相互作用使含碳材料电离，如通过辐射的能量测定的。重带电粒子主要经由库仑(Coulomb)散射使物质电离；此外，这些相互作用产生可以进一步使物质电离的高能电子。α粒子与氦原子的核等同，并且通过各种放射性核的α衰变产生，例如铋、钋、砹、氡、钫、镭、几种锕系元素例如锕、钍、铀、镎、锔、锎、镅和钚的同位素。
当利用粒子时，它们可以是中性(不带电)、带正电或带负电的。当带电时，带电粒子可以具有单个正或负电荷，或多个电荷，例如1、2、3或甚至4个或更多个电荷。在其中需要断链的情况下，部分由于其酸性性质，带正电的粒子可以是所希望的。当利用粒子时，粒子可以具有静止电子的质量或更大，例如是静止电子质量的500、1000、1500、2000、10,000或甚至100,000倍。例如，粒子可以具有约1个原子单位-约150个原子单位的质量，例如约1个原子单位-约50个原子单位，或约1-约25，例如1、2、3、4、5、10、12或15amu。用于加速粒子的加速器可以是静电DC、电动力学DC、RF线性、磁感应线性或连续波。例如，回旋加速器型加速器可从IBA，比利时获得，例如
Figure BDA0000122285460000141
系统，而DC型加速器可从RDI现在的IBAIndustrial获得，例如
Figure BDA0000122285460000142
离子和离子加速器在下述中讨论：Introductory Nuclear Physics，Kenneth S.Krane，John Wiley &Sons，Inc.(1988)，Krsto Prelec，FIZIKA B 6(1997)4，177-206，Chu，William T.，“Overview of Light-Ion Beam Therapy”，Columbus-Ohio，ICRU-IAEA Meeting，18-20 March 2006，Iwata，Y.等人，“Alternating-Phase-Focused IH-DTL for Heavy-Ion MedicalAccelerators”，Proceedings of EPAC 2006，Edinburgh，Scotland和Leaner，C.M.等人，“Status of the Superconducting ECR Ion SourceVenus”，Proceedings of EPAC 2000，Vienna，奥地利。
γ辐射具有进入多种材料内的显著穿透深度的优点。γ射线的来源包括放射性核，例如钴、钙、锝、铬、镓、铟、碘、铁、氪、钐、硒、钠、铊和氙。
x射线的来源包括与金属靶(例如钨或钼或合金)或致密光源(例如由Lyncean商业生产的那些)的电子束碰撞。
用于紫外线辐射的来源包括氘或镉光灯。
用于红外线辐射的来源包括蓝宝石、锌或硒化物窗陶瓷灯。
用于微波的来源包括速调管，Slevin型RF来源，或采用氢、氧或氮气的原子束来源。
在某些实施方案中，电子束用作辐射源。电子束具有高剂量率(例如，1、5或甚至10Mrad/秒)、高流通量、较少防范(containment)和较少限制(confinement)设备的优点。电子还可以在引起断链方面更有效。此外，具有4-10MeV能量的电子可以具有5-30mm或更多例如40mm的穿透深度。
例如通过静电发生器、级联发生器、感应变频机、具有扫描系统的低能加速器、具有线性阴极的低能加速器、线性加速器和脉冲加速器，可以产生电子束。电子作为电离辐射源是有用的，例如用于相对薄切片的材料，例如小于0.5英寸，例如小于0.4英寸、0.3英寸、0.2英寸、或小于0.1英寸。在某些实施方案中，电子束的每个电子的能量是约0.3MeV-约2.0MeV(百万电子伏特)，例如约0.5MeV-约1.5MeV，或约0.7MeV-约1.25MeV。
电子束照射装置可以由Ion Beam Applications、Louvain-la-Neuve、比利时或Titan Corporation、San Diego、CA商购获得。一般的电子能可以是1MeV、2MeV、4.5MeV、7.5MeV或10MeV。一般的电子束照射装置功率可以是1kW、5kW、10kW、20kW、50kW、100kW、250kW或500kW。原料解聚的水平依赖于所使用的电子能和所应用的剂量，而暴露时间依赖于功率和剂量。一般的剂量可以采取1kGy、5kGy、10kGy、20kGy、50kGy、100kGy或200kGy的值。
离子粒子束
比电子重的粒子可以用于照射本文描述的任何生物量材料。例如，可以利用质子、氦核、氩离子、硅离子、氖离子、碳离子、磷离子、氧离子或氮离子。在某些实施方案中，比电子重的粒子可以诱导更高量的断链(相对于更轻的粒子)。在某些情况下，由于其酸性，带正电的粒子可以诱导比带负电的粒子更高量的断链。
例如使用线性加速器或回旋加速器，可以产生更重的粒子束。在某些实施方案中，束的每个粒子的能量是约1.0MeV/原子单位-约6,000MeV/原子单位，例如约3MeV/原子单位-约4,800MeV/原子单位，或约10MeV/原子单位-约1,000MeV/原子单位。
在特定实施方案中，用于照射含碳材料例如生物量材料的离子束可以包括超过一种类型的离子。例如，离子束可以包括2种或更多种(例如3、4种或更多种)不同类型离子的混合物。示例性混合物可以包括碳离子和质子、碳离子和氧离子、氮离子和质子、以及铁离子和质子。更一般地，上文讨论的任何离子(或任何其他离子)的混合物可以用于形成照射离子束。特别地，相对轻和相对更重的离子的混合物可以在单一离子束中使用。
在某些实施方案中，用于照射材料的离子束包括带正电的离子。带正电的离子可以包括例如带正电的氢离子(例如质子)、稀有气体离子(例如氦、氖、氩)、碳离子、氮离子、氧离子、硅离子、磷离子，以及金属离子例如钠离子、钙离子和/或铁离子。不希望受任何理论束缚，认为当暴露于材料时，此类带正电的离子在化学上表现与路易斯酸部分一样，在氧化环境中起始且支持阳离子开环链断裂反应。
在特定实施方案中，用于照射材料的离子束包括带负电的离子。带负电的离子可以包括例如带负电的氢离子(例如氢阴离子)和多种相对负电性核的带负电的离子(例如氧离子、氮离子、碳离子、硅离子和磷离子)。不希望受任何理论束缚，认为当暴露于材料时，此类带负电的离子在化学上表现与路易斯碱部分一样，在还原环境中引起阴离子开环链断裂反应。
在某些实施方案中，用于照射材料的束可以包括中性原子。例如，氢原子、氦原子、碳原子、氮原子、氧原子、氖原子、硅原子、磷原子、氩原子和铁原子中的任何一种或多种可以包括在用于照射生物量材料的束中。一般而言，上述类型原子中的任何2种或更多种(例如3种或更多种、4种或更多种或甚至更多种)的混合物可以存在于束中。
在特定实施方案中，用于照射材料的离子束包括单一荷电离子，例如H+、H-、He+、Ne+、Ar+、C+、C-、O+、O-、N+、N-、Si+、Si-、P+、P-、Na+、Ca+和Fe+中的一种或多种。在某些实施方案中，离子束可以包括多重荷电离子，例如C2+、C3+、C4+、N3+、N5+、N3-、O2+、O2-、O2 2-、Si2+、Si4+、Si2-和Si4-中的一种或多种。一般而言，离子束还可以包括更复杂的多核离子，其具有多重正或负电荷。在特定实施方案中，由于多核离子的结构，正或负电荷可以有效分布在离子的基本上完整结构上。在某些实施方案中，正或负电荷可以略微定位在离子结构的部分上。
电磁辐射
在其中用电磁辐射执行照射的实施方案中，电磁辐射可以具有例如大于102eV的能量/光子(以电子伏特)，例如大于103、104、105、106、或甚至大于107eV。在某些实施方案中，电磁辐射具有104-107的能量/光子、例如105-106eV。电磁辐射可以具有例如大于1016hz的频率，大于1017hz、1018、1019、1020或甚至大于1021hz。在某些实施方案中，电磁辐射具有1018-1022hz的频率，例如1019-1021hz。
生物量的猝灭和受控官能化
在用电离辐射处理后，本文描述的材料或混合物中的任何可以变得电离；即，经处理的材料可以包括在用电子自旋共振光谱仪可检测的水平上的原子团。如果经电离的生物量保留在大气中，那么它将氧化例如至通过与大气氧反应产生羧酸基团的程度。在对于某些材料的某些情况下，此类氧化是需要的，因为它可以帮助含碳水化合物的生物量的分子量中的进一步下降，并且在某些情况下，氧化基团例如羧酸基团对于可溶性和微生物利用可以是有帮助的。然而，因为原子团可以在照射后“存活”一定时间，例如长于1天、5天、30天、3个月、6个月或甚至长于1年，所以材料性质可以继续随着时间过去改变，这在某些情况下，可以是不希望有的。因此，可以希望猝灭经电离的材料。
在电离后，可以猝灭已电离的任何生物量材料，以减少经电离的生物量中的原子团水平，例如从而使得原子团不再用电子自旋共振光谱仪可检测。例如，通过给生物量应用足够压力和/或通过利用与经电离的生物量接触的流体，所述流体例如气体或液体，与原子团反应(猝灭)，可以使原子团猝灭。使用至少帮助原子团猝灭的气体或液体可以用于以所需量和种类的官能团来官能化经电离的生物量，所述官能团例如羧酸基团、烯醇基团、醛基、硝基、腈基、氨基、烷基氨基、烷基、氯烷基或氯氟烷基。
在某些情况下，此类淬灭可以改善某些经电离的生物量材料的稳定性。例如，淬灭可以改善生物量对氧化的抗性。通过淬灭的官能化也可以改善本文描述的任何生物量的可溶性，可以改善其热稳定性，并且可以改善通过多种微生物的材料利用。例如，通过淬灭赋予生物量材料的官能团可以充当用于通过微生物附着的受体位点，例如以增强通过多种微生物的纤维素水解。
在某些实施方案中，淬灭包括给生物量应用压力，例如通过使生物量机械变形，例如在1、2或3个维度直接机械压缩生物量，或对其中浸入生物量的流体应用压力，例如等静压制。在此类情况下，材料其自身的变形使通常在结晶结构域中捕获的原子团处于足够紧密的接近中，从而使得原子团可以重组或与另一个基团反应。在某些情况下，压力连同热的应用例如足够量的热一起应用，以使生物量的温度升高超过生物量组分的熔点或软化点，所述生物量组分例如木质素、纤维素或半纤维素。热可以改善材料中的分子流动性，这可以帮助原子团的淬灭。当压力用于淬灭时，压力可以大于约1000psi，例如大于约1250psi、1450psi、3625psi、5075psi、7250psi、10000psi或甚至大于15000psi。
在某些实施方案中，淬灭包括使生物量与流体例如液体或气体相接触，所述流体例如能够与原子团反应的气体，例如乙炔或乙炔在氮、乙烯、氯化乙烯或氯氟乙烯中的混合物，丙烯或这些气体的混合物。在其他具体实施方案中，淬灭包括使生物量与液体相接触，所述液体例如在生物量中可溶或至少能够穿透到生物量内且与原子团反应的液体，例如二烯，例如1，5-环辛二烯。在某些具体实施方案中，淬灭包括使生物量与抗氧化试剂例如维生素E相接触。需要时，生物量原料可以包括在其中分散的抗氧化试剂，并且淬灭可以来自使生物量原料中分散的抗氧化试剂与原子团相接触。
通过利用重带电离子例如本文描述的较重离子中的任何，可以增强官能化。例如，如果需要增强氧化，那么带电的氧离子可以用于照射。如果需要氮官能团，那么可以利用氮离子或包括氮的阴离子。同样地，如果需要硫或磷基团，那么在照射中可以使用硫或磷离子。
剂量
在某些情况下，以大于约0.25Mrad/秒的剂量率执行照射，例如大于约0.5、0.75、1.0、1.5、2.0，或甚至大于约2.5Mrad/秒。在某些实施方案中，以5.0-1500.0千拉德/小时的剂量率执行照射，例如10.0-750.0千拉德/小时，或50.0-350.0千拉德/小时。
在某些实施方案中，执行照射(用任何辐射源或源的组合)直至材料接受至少0.1Mrad、至少0.25Mrad的剂量，例如至少1.0Mrad、至少2.5Mrad、至少5.0Mrad、至少10.0Mrad、至少60Mrad或至少100Mrad。在某些实施方案中，执行照射直至材料接受约0.1Mrad-约500Mrad，约0.5Mrad-约200Mrad、约1Mrad-约100Mrad、或约5Mrad-约60Mrad的剂量。在某些实施方案中，应用相对低剂量的照射，例如小于60Mrad。
超声处理
超声处理可以减少材料的分子量和/或结晶度，所述材料例如本文描述的材料中的任何中的一种或多种，例如一种或多种碳水化合物来源，例如纤维素或木质纤维素材料、或淀粉质材料。超声处理还可以用于对材料进行灭菌。
在一种方法中，使包括具有第一数量平均分子量(MN1)的纤维素的第一种材料分散在介质例如水中，并且进行超声处理和/或以其他方式形成空穴，以提供第二种材料，其包括具有比第一数量平均分子量低的第二数量平均分子量(MN2)的纤维素。第二种材料(或在特定实施方案中，第一种和第二种材料)可以与微生物(含或不含酶处理)相组合，所述微生物可以利用第二种和/或第一种材料以产生中间产物或产物。
因为第二种材料包括相对于第一种材料具有减少的分子量、和在某些情况下，同样减少的结晶度的纤维素，所以第二种材料例如在包含微生物的溶液中一般更分散、膨胀和/或可溶。
在某些实施方案中，第二数量平均分子量(MN2)比第一数量平均分子量(MN1)低超过约10％，例如超过约15、20、25、30、35、40、50％、60％或甚至超过约75％。
在某些情况下，第二种材料包括这样的纤维素，其具有比第一种材料的纤维素的结晶度(C1)低的结晶度(C2)。例如，(C2)可以比(C1)低超过约10％，例如超过约15、20、25、30、35、40或甚至超过约50％。
在某些实施方案中，起始结晶度指数(在超声处理之前)是约40-约87.5％，例如约50-约75％或约60-约70％，并且在超声处理后的结晶度指数是约10-约50％，例如约15-约45％或约20-约40％。然而，在特定实施方案中，例如在广泛超声处理后，它可以具有低于5％的结晶度指数。在某些实施方案中，在超声处理后的材料是基本上无定形的。
在某些实施方案中，起始数量平均分子量(在超声处理之前)是约200,000-约3,200,000，例如约250,000-约1,000,000或约250,000-约700,000，并且在超声处理后的数量平均分子量是约50,000-约200,000，例如约60,000-约150,000或约70,000-约125,000。然而，在某些实施方案中，例如在广泛超声处理后，它可以具有小于约10,000或甚至小于约5,000的数量平均分子量。
在某些实施方案中，第二种材料可以具有比第一种材料的氧化水平(O1)高的氧化水平(O2)。材料的更高氧化水平可以有助于其分散性、膨胀性和/或可溶性，进一步增强材料对化学、酶促或微生物攻击的敏感性。在某些实施方案中，为了增加第二种材料相对于第一种材料的氧化水平，超声处理在氧化介质中执行，产生比第一种材料更氧化的第二种材料。例如，第二种材料可以具有更多羟基、醛基、酮基、酯基、或羧酸基团，这可以增加其亲水性。
在某些实施方案中，超声处理介质是水介质。需要时，介质可以包括氧化试剂例如过氧化物(例如过氧化氢)、分散剂和/或缓冲剂。分散剂的例子包括离子型分散剂例如十二烷基硫酸钠和非离子型分散剂例如聚(乙二醇)。
在其他实施方案中，超声处理介质是非水的。例如，超声处理可以在烃例如甲苯或庚烷、醚例如二乙醚或四氢呋喃中，或甚至在液化气体例如氩、氙或氮中执行。
热解
一个或多个热解加工顺序可以用于在物理上处理生物量材料。热解还可以用于灭菌材料。
在一个例子中，通过使第一种材料在管式炉(在氧的存在或不存在下)中加热，使包括具有第一数量平均分子量(MN1)的纤维素的第一种材料热解，以提供第二种生物量材料，其包括具有比第一数量平均分子量低的第二数量平均分子量(MN2)的纤维素。
因为第二种材料包括相对于第一种材料具有减少的分子量、和在某些情况下，同样减少的结晶度的纤维素，所以第二种材料例如在包含微生物的溶液中一般更分散、膨胀和/或可溶。
在某些实施方案中，第二数量平均分子量(MN2)比第一数量平均分子量(MN1)低超过约10％，例如超过约15、20、25、30、35、40、50％、60％或甚至超过约75％。
在某些情况下，第二种材料包括这样的纤维素，其具有比第一种材料的纤维素的结晶度(C1)低的结晶度(C2)。例如，(C2)可以比(C1)低超过约10％，例如超过约15、20、25、30、35、40或甚至超过约50％。
在某些实施方案中，起始结晶度指数(在热解之前)是约40-约87.5％，例如约50-约75％或约60-约70％，并且在热解后的结晶度指数是约10-约50％，例如约15-约45％或约20-约40％。然而，在特定实施方案中，例如在广泛热解后，它可以具有低于5％的结晶度指数。在某些实施方案中，在热解后的材料是基本上无定形的。
在某些实施方案中，起始数量平均分子量(在热解之前)是约200,000-约3,200,000，例如约250,000-约1,000,000或约250,000-约700,000，并且在热解后的数量平均分子量是约50,000-约200,000，例如约60,000-约150,000或约70,000-约125,000。然而，在某些实施方案中，例如在广泛热解后，它可以具有小于约10,000或甚至小于约5,000的数量平均分子量。
在某些实施方案中，第二种材料可以具有比第一种材料的氧化水平(O1)高的氧化水平(O2)。材料的更高氧化水平可以有助于其分散性、膨胀性和/或可溶性，进一步增强材料对化学、酶促或微生物攻击的敏感性。在某些实施方案中，为了增加第二种材料相对于第一种材料的氧化水平，热解在氧化环境中执行，产生比第一种材料更氧化的第二种材料。例如，第二种材料可以具有比第一种材料更多的羟基、醛基、酮基、酯基、或羧酸基团，从而增加材料的亲水性。
在某些实施方案中，材料的热解是连续的。在其他实施方案中，使材料热解预定时间，并且随后在再次热解前允许冷却第二个预定时间。
氧化
一个或多个氧化处理顺序可以用于在物理上处理生物量材料。氧化条件可以例如取决于原料的木质素含量而改变，其中更高程度的氧化一般是更高木质素含量原料所需的。
在一种方法中，例如通过在空气或富氧空气的流中在管形炉中加热第一种材料，使包括具有第一数量平均分子量(MN1)和具有第一含氧量(O1)的纤维素的第一种材料氧化，以提供第二种生物量材料，其包括具有比第一数量平均分子量低的第二数量平均分子量(MN2)和具有比第一含氧量(O1)高的第二含氧量(O2)的纤维素。
第二种材料的第二数量平均分子量一般低于第一种材料的第一数量平均分子量。例如，分子量可以减少至与上文就其他物理处理而言讨论的相同的程度。第二种材料的结晶度也可以减少至与上文就其他物理处理而言讨论的相同的程度。
在某些实施方案中，第二含氧量比第一含氧量高至少约5％，例如高7.5％、高10.0％、高12.5％、高15.0％或高17.5％。在某些优选实施方案中，第二含氧量比第一种材料的第一含氧量高至少约20.0％。通过元素分析通过在1300℃或以上操作的炉中热解样品来测量氧含量。合适的元素分析仪是具有VTF-900高温热解炉的LECOCHNS-932分析仪。
一般地，材料的氧化在氧化环境中发生。例如，通过在氧化环境中热解可以实现或帮助氧化，例如在空气或富氩空气中。为了帮助氧化，在氧化之前或在氧化过程中，各种化学试剂例如氧化试剂、酸或碱可以加入材料中。例如，在氧化之前可以加入过氧化物(例如，过氧苯甲酰)。
减少生物量原料中的不顺应的某些氧化方法采用芬顿型化学。此类方法公开于美国序列号12/639,289中，其完整公开内容通过引用合并入本文。
示例性氧化剂包括过氧化物例如过氧化氢和过氧化苯甲酰、过硫酸盐例如过硫酸铵、激活型氧例如臭氧、高锰酸盐例如高锰酸钾、高氯酸盐例如高氯酸钠、和次氯酸盐例如次氯酸钠(家用漂白剂)。
在某些情况下，pH在接触过程中维持在或低于约5.5，例如1-5、2-5、2.5-5或约3-5。氧化条件还可以包括例如2-12小时、例如4-10小时或5-8小时的接触时期。在某些情况下，温度维持在或低于300℃，例如在或低于250、200、150、100或50℃。在某些情况下，温度保持基本上环境的，例如在或约20-25℃。
在某些实施方案中，一种或多种氧化剂作为气体应用，例如通过经由用粒子束例如电子通过空气照射材料原位生成臭氧。
在某些实施方案中，混合物进一步包括一种或多种氢醌例如2，5-二甲氧基氢醌(DMHQ)，和/或一种或多种苯醌例如2，5-二甲氧基-1，4-苯醌(DMBQ)，其可以帮助电子传递反应。
在某些实施方案中，一种或多种氧化剂电化学地原位生成。例如，过氧化氢和/或臭氧可以在接触或反应器内电化学地产生。
官能化的其他加工过程
这个段落的任何加工过程可以无需本文描述的任何加工过程单独使用，或与本文描述的任何加工过程组合使用(以任何次序)：蒸汽爆炸、化学处理(例如酸处理(包括用矿物酸例如硫酸、盐酸和有机酸例如三氟乙酸的浓和稀酸处理)和/或碱处理(例如用石灰或氢氧化钠处理))、UV处理、螺旋挤出处理(参见例如于2008年11月17日提交的美国专利申请序列号61/115,398、溶剂处理(例如用离子液体处理)和冷冻研磨(参见例如美国序列号12/502,629)。
发酵
微生物可以产生许多有用的中间产物和产物，例如本文描述的那些，通过在官能化的生物量材料的存在下发酵低分子量糖。例如，发酵或其他生物过程可以产生醇、有机酸、烃、氢、蛋白质或这些材料中的任何的混合物。
微生物可以是天然微生物或经改造的微生物。例如，微生物可以是细菌例如分解纤维素的细菌，真菌例如酵母，植物或原生生物例如藻类，原生动物或真菌样原生生物例如粘菌。当生物相容时，可以利用生物的混合物。
合适的发酵微生物具有将碳水化合物(例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、寡糖或多糖)转变成发酵产物的能力。发酵微生物包括酵母属物种(Sacchromyces spp.)，例如酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)(面包酵母)、糖化酵母(Saccharomycesdistaticus)和葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如物种马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)和脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)；假丝酵母属(Candida)，例如假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)和芸苔假丝酵母(Candida brassicae)；树干毕赤酵母(Pichia stipitis)(Candida shehatae的近亲；棒孢酵母属(Clavispora)，例如物种葡萄牙棒孢(Clavispora lusitaniae)和Clavispora opuntiae；管囊酵母属(Pachysolen)，例如物种嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)；酒香酵母属(Bretannomyces)，例如物种克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)的菌株(Philippidis，G.P.，1996，“CelluloseBioconversion Technology”，in Handbook on Bioethanol：Productionand Utilization，Wyman，C.E.，编辑，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212)。
商购可得的酵母包括例如Red
Figure BDA0000122285460000251
/Lesaffre Ethanol Red(可从Red Star/Lesaffre，美国获得)，
Figure BDA0000122285460000252
(可从Fleischmann’s Yeast，Burns Philip Food Inc.的分部，美国获得)，
Figure BDA0000122285460000253
(可从Alltech，现在的Lalemand获得)，GERT
Figure BDA0000122285460000254
(可从Gert StrandAB，瑞典获得)，和(可从DSM Specialties获得)。
细菌也可以用于发酵中，例如运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)和热纤梭菌(Clostridium thermocellum)(Philippidis，1996，同上)。
关于酵母的最佳pH是约pH 4-5，而关于发酵单胞菌属的最佳pH是约pH 5-6。一般发酵时间是在26℃-40℃下约24-96小时，然而，嗜热微生物更喜欢较高的温度。
在某些实施方案中，所有或部分发酵加工过程可以在低分子量糖完全转变成乙醇前中断。中间发酵产物包括高浓度的糖和碳水化合物。这些中间发酵产物可以用于制备用于人或动物消费的食物。另外地或备选地，中间发酵产物可以在不锈钢研磨机中磨成细粒大小以产生粉样物质。
可以利用移动发酵罐，如美国临时专利申请序号60/832,735，现在的公开国际申请号WO 2008/011598中所述。
后加工
蒸馏
在发酵后，所得到的流体可以使用例如“啤酒柱(beer column)”进行蒸馏，以使乙醇和其他醇类与大多数水和残留固体分离。离开啤酒柱的蒸气可以是例如35重量％的乙醇，并且可以供应给精馏柱。使用蒸气相分子筛，来自精馏柱的近共沸(92.5％)乙醇和水的混合物可以纯化至纯(99.5％)乙醇。啤酒柱底部可以送至三效蒸发器的第一个效应。精馏柱回流冷凝器可以提供用于这个第一个效应的热。在第一个效应后，固体可以使用离心机进行分离且在旋转干燥器中进行干燥。部分(25％)离心机流出物可以再循环至发酵，并且其余送至第二个和第三个蒸发器效应。大部分蒸发器冷凝物可以作为相当清洁的冷凝物返回过程，其中小部分分裂出来至废水处理以预防低沸化合物的积累。
中间产物和产物
本文描述的加工过程可以用于产生一种或多种中间产物或产物，例如能量、燃料、食物和材料。产物的具体例子包括但不限于氢，醇(一元醇或二元醇，例如乙醇、正丙醇或正丁醇)，例如包含大于10％、20％、30％或甚至大于40％水的水合或含水醇，木糖醇，糖，生物柴油，有机酸(例如乙酸和/或乳酸)，烃，共同产物(例如蛋白质，例如分解纤维素的蛋白质(酶)或单细胞蛋白质)，和以任何组合或相对浓度的这些中的任何的混合物，和任选与任何添加剂例如燃料添加剂组合。其他例子包括羧酸例如乙酸或丁酸，羧酸的盐，羧酸和羧酸的盐和羧酸的酯(例如甲、乙和正丙酯)的混合物，酮(例如乙酮)，醛(例如乙醛)，α，β不饱和酸，例如丙烯酸和烯烃例如乙烯。其他醇和醇衍生物包括丙醇、丙二醇、1，4-丁二醇、1，3-丙二醇、这些醇中的任何的甲或乙酯。其他产物包括丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、乳酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、3-羟基丙酸、酸中的任何的盐以及酸和分别盐中的任何的混合物。
其他中间产物和产物包括食物和药剂在美国序列号12/417,900中描述，其完整公开内容通过引用在此合并入本文。
实施例
下述实施例预期举例说明而不是限制本公开内容的教导。
实施例1-由聚涂层纸制备纤维材料
1500磅未用过的滑材(skid)、具有20lb/ft3的堆密度由未印刷的聚涂层白色牛皮纸板制成的半加仑果汁纸板盒得自InternationalPaper。将每个纸板盒平坦折叠，并且随后以约15-20磅/小时的速率注入3hp Flinch Baugh切碎机内。切碎机装备2个12英寸旋转刀片、2个固定刀片和0.30英寸排放筛。将旋转和固定刀片之间的缺口调节至0.10英寸。来自切碎机的输出类似五彩纸屑，其具有0.1英寸-0.5英寸的宽度、0.25英寸-1英寸的长度和与原材料那种等价的厚度(约0.075英寸)。
将五彩纸屑样材料供应给Munson旋转切割机，型号SC30。型号SC30装备4个旋转刀片、4个固定刀片和具有1/8英寸开口的排放筛。将旋转和固定刀片之间的缺口设为约0.020英寸。旋转切割机剪切越过刀刃的五彩纸屑样小片，将小片撕开并且以约1磅/小时的速率释放纤维材料。纤维材料具有0.9748m2/g+/-0.0167m2/g的BET表面积、89.0437％的多孔性和0.1260g/mL的堆密度(0.53psia)。纤维的平均长度是1.141mm，并且纤维的平均宽度是0.027mm，产生42∶1的平均L/D。
实施例2-由漂白的牛皮纸板制备纤维材料
1500磅未用过的滑材、具有30lb/ft3的堆密度漂白的白色牛皮纸板得自International Paper。将材料平坦折叠，并且随后以约15-20磅/小时的速率注入3hp Flinch Baugh切碎机内。切碎机装备2个12英寸旋转刀片、2个固定刀片和0.30英寸排放筛。将旋转和固定刀片之间的缺口调节至0.10英寸。来自切碎机的输出类似五彩纸屑，其具有0.1英寸-0.5英寸的宽度、0.25英寸-1英寸的长度和与原材料那种等价的厚度(约0.075英寸)。将五彩纸屑样材料供应给Munson旋转切割机，型号SC30。排放筛具有1/8英寸开口。将旋转和固定刀片之间的缺口设为约0.020英寸。旋转切割机剪切五彩纸屑样小片，以约1磅/小时的速率释放纤维材料。纤维材料具有1.1316m2/g+/-0.0103m2/g的BET表面积、88.3285％的多孔性和0.1497g/mL的堆密度(0.53psia)。纤维的平均长度是1.063mm，并且纤维的平均宽度是0.0245mm，产生43∶1的平均L/D。
实施例3-由漂白的牛皮纸板制备2次剪切的纤维材料
1500磅未用过的滑材、具有30lb/ft3的堆密度漂白的白色牛皮纸板得自International Paper。将材料平坦折叠，并且随后以约15-20磅/小时的速率注入3hp Flinch Baugh切碎机内。切碎机装备2个12英寸旋转刀片、2个固定刀片和0.30英寸排放筛。将旋转和固定刀片之间的缺口调节至0.10英寸。来自切碎机的输出类似五彩纸屑(如上)。将五彩纸屑样材料供应给Munson旋转切割机，型号SC30。排放筛具有1/16英寸开口。将旋转和固定刀片之间的缺口设为约0.020英寸。旋转切割机剪切五彩纸屑样小片，以约1磅/小时的速率释放纤维材料。将产生于第一次剪切的材料供应回到上文描述的相同设置内并且再次剪切。所得到的纤维材料具有1.4408m2/g+/-0.0156m2/g的BET表面积、90.8998％的多孔性和0.1298g/mL的堆密度(0.53psia)。纤维的平均长度是0.891mm，并且纤维的平均宽度是0.026mm，产生34∶1的平均L/D。
实施例4-由漂白的牛皮纸板制备3次剪切的纤维材料
1500磅未用过的滑材、具有30lb/ft3的堆密度漂白的白色牛皮纸板得自International Paper。将材料平坦折叠，并且随后以约15-20磅/小时的速率注入3hp Flinch Baugh切碎机内。切碎机装备2个12英寸旋转刀片、2个固定刀片和0.30英寸排放筛。将旋转和固定刀片之间的缺口调节至0.10英寸。来自切碎机的输出类似五彩纸屑(如上)。将五彩纸屑样材料供应给Munson旋转切割机，型号SC30。排放筛具有1/8英寸开口。将旋转和固定刀片之间的缺口设为约0.020英寸。旋转切割机剪切越过刀刃五彩纸屑样小片。将产生于第一次剪切的材料供应回到上文描述的相同设置内，并且将筛子替换为1/16英寸筛子。使这种材料剪切。将产生于第二次剪切的材料供应回到上文描述的相同设置内，并且将筛子替换为1/32英寸筛子。使这种材料剪切。所得到的纤维材料具有1.6897m2/g+/-0.0155m2/g的BET表面积、87.7163％的多孔性和0.1448g/mL的堆密度(0.53psia)。纤维的平均长度是0.824mm，并且纤维的平均宽度是0.0262mm，产生32∶1的平均L/D。
实施例5-电子束加工
使用在80kW的输出功率下递送5MeV电子的拱形TT200连续波加速器，用电子束处理样品。表1描述了所使用的参数。表2报告了对于样品ID使用的额定剂量(以Mrad)和递送给样品的相对应剂量(以kgy)。
表
Figure BDA0000122285460000292
TT 200参数
Figure BDA0000122285460000293
表2.递送给样品的剂量
Figure BDA0000122285460000294
Figure BDA0000122285460000301
1例如，9.9kgy在5mA的束电流和12.9英尺/分钟的线速度下在11秒内递送。处理之间的冷却时间是约2分钟。
实施例6-通过凝胶渗透色谱法测定纤维素和木质纤维素材料的 分子量的方法
用于分析的纤维素和木质纤维素材料根据实施例4进行处理。下表中呈现的样品材料包括牛皮纸(P)、麦秆(WS)、苜蓿(A)、纤维素(C)、柳枝稷(SG)、草(G)、以及淀粉(ST)和蔗糖(S)。样品ID的数目“132”指在剪切通过1/32英寸筛子后的材料的颗粒大小。在虚线后的数目指辐射剂量(MRad)，并且“US”指超声波处理。例如，样品ID“P132-10”指已剪切至132网目的颗粒大小且已用10MRad照射的牛皮纸。
对于用电子束照射的样品，在虚线后的数目指递送给样品的能量的量。例如，样品ID“P-100e”指已递送约100MRad或约1000kgy的能量剂量的牛皮纸(表2)。
表3.经照射的牛皮纸的峰平均分子量
Figure BDA0000122285460000302
＊＊低剂量的辐射看起来增加某些材料的分子量
1用量比率＝1MRad/小时
2对于在水中分散的材料在再循环条件下使用1000W悬臂用20kHz超声处理30分钟
表4.用电子束照射的牛皮纸的峰平均分子量
表5.γ照射的材料的峰平均分子量
Figure BDA0000122285460000312
＊在处理后的峰合并
＊＊低剂量的辐射看起来增加某些材料的分子量
1剂量比率＝1MRad/小时
2对于在水中分散的材料在再循环条件下使用1000W悬臂用20kHz超声处理30分钟
表6.用电子束照射的材料的峰平均分子量
Figure BDA0000122285460000321
凝胶渗透色谱法(GPC)用于测定聚合物的分子量分布。在GPC分析过程中，使聚合物样品的溶液经过装满捕获小分子的多孔凝胶的柱。样品基于分子大小进行分离，其中较大的分子比较小的分子更快地洗脱。每种组分的保留时间最通常通过折射率(RI)、蒸发光散射(ELS)或紫外线(UV)进行检测，并且与校正曲线相比较。所得到的数据随后用于计算关于样品的分子量分布。
使用分子量分布而不是独特的分子量表征合成聚合物。为了表征这种分布，利用统计平均。最常见的这些平均是“数量平均分子量”(Mn)和“重量平均分子量”(Mw)。
计算这些值的方法在本领域中例如在WO 2008/073186的实施例9中描述。
多分散性指数或PI定义为Mw/Mn的比。PI越大，分布越广泛或更分散。PI可以具有的最低值是1。这代表单分散样品；即，其中分布中的所有分子是相同分子量的聚合物。
峰分子量值(MP)是定义为分子量分布模式的另一个叙词。它表明在分布中最丰富的分子量。这个值还给出关于分子量分布的了解。
大多数GPC测量相对于不同聚合物标准进行。结果的准确度依赖于待分析的聚合物的特征如何紧密地匹配所使用标准的那些。分开校正的、不同系列测定之间重现性中的预期误差是约5-10％，并且是关于GPC测定的有限精确性的特征。因此，当在相同系列测定过程中进行不同样品的分子量分布之间的比较时，GPC结果是最有用的。
在GPC分析前，木质纤维素样品需要样品制备。首先，在二甲基乙酰胺(DMAc)中制备氯化锂(LiCl)的饱和溶液(8.4重量％)。将约100mg样品加入约10g新鲜制备的LiCl/DMAc饱和溶液中，并且使混合物伴随搅拌加热至约150℃-170℃共1小时。所得到的溶液在颜色中一般是浅至深黄色。使溶液的温度降低至约100℃，并且加热另外2小时。随后使溶液的温度降低至约50℃，并且使样品溶液加热约48-60小时。值得注意的是，与其未经处理的配对物相比较，在100MRad下照射的样品更容易增溶。另外，与未经切割的样品相比较，经剪切的样品(由数目132指示)具有略微更低的平均分子量。
所得到的样品溶液使用DMAc作为溶剂进行1∶1稀释，并且通过0.45μm PTFE滤器进行过滤。经过滤的样品溶液随后通过GPC使用表7中描述的参数进行分析。如通过凝胶渗透色谱法(GPC)测定的，样品峰平均分子量(Mp)概括于表3-6中。每种样品一式两份地制备，并且样品的每个制剂一式两份地(2次进样)分析，每个样品总共4次进样。
Figure BDA0000122285460000331
聚苯乙烯标准PS1A和PS1B用于产生用于约580-7,500,00道尔顿的分子量数值范围的校正曲线。
表7.GPC分析条件
Figure BDA0000122285460000341
实施例7.飞行时间二次离子质谱法(ToF-SIMS)表面分析
飞行时间二次离子质谱法(ToF-SIMS)是表面敏感性光谱法，其使用脉冲离子束(Cs或微聚焦Ga)以去除来自样品最外面表面的分子。从表面上的原子单层中去除粒子(二级离子)。这些粒子随后加速到“飞行管”内，并且它们的质量通过测量它们到达检测器的确切时间(即，飞行时间)进行测定。ToF-SIMS提供了关于样品的表面、薄层、界面的详细元素和分子信息，并且给出全面的三维分析。用途是广泛的，包括半导体、聚合物、涂料、涂层、玻璃、草、纸、金属、陶瓷、生物材料、药物和有机组织。因为ToF-SIMS是观察技术，所以检测出在周期表中的所有元素，包括H。ToF-SIMS数据呈现于表8-11中。所使用的参数在表12中报告。
表8.多种目的阳离子的标准化平均强度
(相对于总离子计数标准化x10000)
Figure BDA0000122285460000342
Figure BDA0000122285460000351
表9.多种目的阴离子的标准化平均强度
(相对于总离子计数标准化x10000)
Figure BDA0000122285460000352
表10.多种目的阳离子的标准化平均强度
(相对于总离子计数标准化x10000)
Figure BDA0000122285460000353
表11.各种目的阴离子的标准化平均强度
(相对于总离子计数标准化x10000)
Figure BDA0000122285460000361
表12.ToF-SIMS参数
Figure BDA0000122285460000362
ToF-SIMS使用经聚焦的脉冲的粒子束(一般是Cs或Ga)，以移去材料表面上的化学种类。更接近于撞击位点产生的粒子趋于是经解离的离子(阳性或阴性)。更远离撞击位点产生的次级粒子趋于是分子化合物，一般是大得多的有机大分子的碎片。粒子随后在其朝向检测器的途中加速到分析路径内。因为可以在纳秒的规模上测量粒子从撞击时到检测器的“飞行时间”，所以可以产生精细至0.00X原子质量单位(即质子质量的千分之一份)的质量分辨率。在一般的操作条件下，ToF-SIMS分析的结果包括：观察在0-10,000amu范围上的所有原子质量的质谱图，光栅束产生在亚微米的规模上的任何目的质量的图，并且深度谱通过在离子束下喷射通过去除表面层产生。阴离子分析显示聚合物具有增加量的CNO、CN和NO2基团。
实施例8-经照射的材料的孔率法分析
水银孔径和孔体积分析(表21)基于在紧密控制的压力下将水银(非润湿液体)压入多孔结构内。因为水银不润湿大多数物质，并且将不会通过毛细管作用自发渗透孔，所以它必须通过应用外部压力而压入样品的空隙内。填充空隙所需的压力与孔的大小成反比。仅需要少量力或压力以填充大空隙，然而需要大得多的压力以填充非常小孔的空隙。
表21.通过水银孔率法的孔径和体积分布
Figure BDA0000122285460000371
Figure BDA0000122285460000381
AutoPore 9520可以达到414MPa或60,000psia的最大限度压力。存在用于样品分离和大孔数据收集的从0.2psia到50psia的4个低压站。存在收集从25psia到60,000psia的数据的2个高压室。将样品置于称为透度计的碗样仪器中，这与具有金属涂层的玻璃毛细杆连接。当水银侵入样品中和周围的空隙时，它使毛细杆往下移动。水银从毛细杆中的丧失导致电容量中的改变。通过已知所使用的透度计的杆体积，将在实验过程中电容中的改变转变成水银的体积。具有不同碗(样品)大小和毛细管的各种透度计是可获得的，以适应大多数样品大小和配置。下表22定义了对于每种样品计算的某些关键参数。
表22.参数的定义
Figure BDA0000122285460000382
实施例9-经照射的材料的颗粒大小分析
通过静态光散射区分颗粒大小的技术基于米氏(Mie)理论(这也包括夫琅和费(Fraunhofer)理论)。米氏理论根据球形散射颗粒的大小预测强度与角度关系比较，前提是其他系统变量是已知的且保持恒定。这些变量是入射光的波长和样品材料的相对折射率。米氏理论的应用提供了详细的颗粒大小信息。表23概括了使用中位直径、平均直径和众数直径作为参数的颗粒大小。
表23.通过激光散射的颗粒大小(干燥样品分散)
使用下述条件使用Malvern Mastersizer 2000通过激光散射(干燥样品分散)测定颗粒大小：
补料速率：35％
分散器压力：4巴
光学模式：(2.610，1.000i)，1.000
将合适量的样品引入振动托盘上。调节补料速率和空气压力以确保颗粒适当分散。关键组分是选择空气压力，其将打碎结块，但不危害样品完整性。所需样品的量依赖于颗粒的大小而改变。一般而言，具有细颗粒的样品需要比具有粗颗粒的样品更少的材料。
实施例10-经照射的材料的表面积分析
使用Micromeritics ASAP 2420 Accelerated Surface Area andPorosimetry System分析每种样品的表面积。通过首先在40℃下除气16小时制备样品。接下来，计算具有氦的自由空间(温和冷的)，并且随后再次使样品管抽真空以去除氦。数据收集在这个第二次抽真空后开始，并且由控制多少气体投入样品上的限定靶压力组成。在每个靶压力下，测定且记录所吸附的气体数量和实际压力。样品管内的样品用压力传感器进行测量。另外剂量的气体将继续直至达到靶压力且允许平衡时。通过合计在样品上的多重剂量测定所吸附的气体数量。压力和数量限定气体吸附等温线，并且用于计算许多参数，包括BET表面积(表24)。
表24.通过气体吸附的表面积概括
Figure BDA0000122285460000401
用于等温线的BET模型是用于计算特定表面积的广泛使用的理论。分析涉及测定样品表面的单层容量，通过计算用单个致密填充的氪层覆盖整个表面所需的量。将单层容量乘以探头气体分子的横断面积，以测定总表面积。特定表面积是样品等分试样的表面积除以样品的质量。
实施例11-经照射的材料的纤维长度测定
使用Techpap MorFi LB01系统对提交的样品一式三份地执行纤维长度分布测试。平均纤维长度和宽度在表25中报告。
表25.木质纤维素纤维长度和宽度数据的概括
Figure BDA0000122285460000412
实施例12-经照射和未经照射的牛皮纸的傅里叶变换红外(FT-IR) 光谱
在Nicolet/Impact 400上执行FT-IR分析。结果指出样品P132、P132-10、P132-100、P-1e、P-5e、P-10e、P-30e、P-70e和P-100e与基于纤维素的材料相一致。
图3是根据实施例4剪切的牛皮纸板的红外光谱，而图4是用100Mradγ辐射照射后，图3的牛皮纸的红外光谱。经照射的样品显示在区域A中的另外峰(集中约1730cm-1)，这在未经照射的材料中未发现。值得注意的是，当从P132到P132-10到P132-100时，检测出在～1650cm-1处的碳酰吸收量中的增加。对于样品P-1e、P-5e、P-10e、P-30e、P-70e和P-100e观察到相似结果。
实施例13-经照射和未经照射的牛皮纸的质子和碳-13核磁共振 ( 1 H-NMR和 13 C-NMR)谱
样品制备
通过用含2％四丁基氟化铵三水合物的DMSO-d6溶解，制备样品P132、P132-10、P132-100、P-1e、P-5e、P-10e、P-30e、P-70e和P-100e用于分析。已经历更低水平照射的样品比具有更高辐射的样品明显更不可溶。未经照射的样品在这个溶剂混合物中形成凝胶，但加热至60℃溶解在NMR谱中的峰。已经历更高水平照射的样品在10％wt/wt的浓度下是可溶的。
分析
在15mg/mL下的样品的1H-NMR谱显示在16ppm处集中的独特的极宽共振峰(图5A-5J)。这个峰是关于烯醇的可交换-OH质子的特征，并且通过“d2O振荡”加以证实。分析模型化合物(乙酰丙酮、葡糖醛酸和酮古洛糖酸)，并且得到这个峰事实上是可交换的烯醇质子的令人信服的情况。这个所提出的烯醇峰对于浓度效应非常敏感，并且我们无法得出结论这个共振是由于烯醇还是由于可能地羧酸。
模型化合物的羧酸质子共振类似于对于经处理的纤维素样品观察到的那种。这些模型化合物使场向上移位至～5-6ppm。在更高浓度(～10％wt/wt)下制备P-100e导致急剧下降的场移位至其中发现模型化合物的羧酸共振之处(～6ppm)(图5N)。这些结果导致这个共振对于表征这种官能团不可靠的结论，然而，数据暗示可交换氢数目伴随增加的样品辐射而增加。此外，未检测出乙烯基质子。
样品的13C NMR谱证实羧酸或羧酸衍生物的碳酰基的存在。这个新峰(在168ppm处)在未经处理的样品中不存在(图5K)。具有长延迟的13C NMR谱允许定量关于P-100e的信号(图5L-5M)。碳酰基共振与在约100ppm处的共振(C1信号)的整合的比较暗示碳酰基碳与C1的比率是1∶13.8，或对于每14个葡萄糖单位大致1个碳酰基。在100ppm处的化学位移与葡糖醛酸良好相关。
滴定
使样品P-100e和P132-100(1g)悬浮于去离子水(25mL)中。伴随搅拌将指示剂茜素黄加入每种样品中。P-100e更难以润湿。2种样品用0.2M NaOH溶液进行滴定。端点都是非常敏锐的，并且通过使用pH试纸加以证实。样品的起始pH对于2种样品是～4。P132-100需要0.4毫克当量的氢氧化物，这给出关于2500amu羧酸的分子量。如果180amu用于单体，那么这暗示存在关于13.9个单体单位1个羧酸基团。同样地，P-100e需要3.2毫克当量的氢氧化物，这计算为关于每17.4个单体单位1个羧酸基团。
结论
看起来在这种氧化中被氧化成羧酸(葡糖醛酸衍生物)纤维素的C-6碳是令人惊讶地特异性的。这种氧化与用以～1740cm-1的辐射产生的IR条带一致，所述IR条带与脂肪族羧酸相对应。滴定结果与定量13C NMR一致。具有更高水平照射的样品增加的可溶性与增加的羧酸质子数目良好相关。所提出的关于“C-6氧化的纤维素”的降解机制在下文方案1中提供。
方案1
Figure BDA0000122285460000431
实施例14-经预处理的生物量的微生物测试
如本文所述预处理的特定木质纤维素材料就对于常见酵母和细菌菌株的毒性进行分析，所述常见酵母和细菌菌株在生物燃料工业中用于乙醇生产中的发酵步骤。此外，检查含糖量和与纤维素酶的相容性以测定处理过程的活力。经预处理的材料的测试如下在2个阶段中执行。
1期：毒性和含糖量
在酵母酿酒酵母(葡萄酒酵母)和树干毕赤酵母(ATCC 66278)以及细菌运动发酵单胞菌(ATCC 31821)和热纤梭菌(ATCC 31924)中测量经预处理的草和纸原料的毒性。用生物中的每一种执行生长研究，以测定温育和取样的最佳时间。
随后使每种原料一式两份地与酿酒酵母、树干毕赤酵母、运动发酵单胞菌和热纤梭菌一起在用于每种生物的标准微生物培养基中温育。YM肉汤用于2种酵母菌株，酿酒酵母和树干毕赤酵母。RM培养基用于运动发酵单胞菌，并且CM4培养基用于热纤梭菌。添加有纯糖但没有原料的阳性对照用于比较。在温育过程中，在时间0、3、6、9和12小时时经过12小时时期获得总共5份样品，并且就活力(关于运动发酵单胞菌的平板计数和关于酿酒酵母的直接计数)和乙醇浓度进行分析。
使用装备ShodexTM糖SP0810或Biorad
Figure BDA0000122285460000441
HPX-87P柱的高效液相色谱法(HPLC)测量原料的含糖量。原料(约5g)各自与反渗透(RO)水相混合1小时。取出液体的液体部分，并且就葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖和纤维二糖含量进行分析。分析根据美国国家生物能源中心(National Bioenergy Center)方案Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass执行。
2期：纤维素酶相容性
在Erlenmeyer烧瓶中在推荐温度和浓度下，原料用商购可得的1000一式两份地进行测试，所述
Figure BDA0000122285460000443
1000包含使木质纤维素生物量还原成可发酵糖的酶的复合物。使烧瓶伴随在约200rpm下的中等振荡下温育12小时。在该时间过程中，在时间0、3、6、9和12小时时每3小时获得样品，以测定在烧瓶的液体部分中还原糖的浓度(Hope和Dean，Biotech J.，1974，144：403)。
实施例15-使用HPLC的糖浓度分析
13种样品就糖浓度(HPLC)和针对3种微生物(树干毕赤酵母、酿酒酵母和运动发酵单胞菌)的毒性进行分析。表26列出了用于这些实验的设备。表27和28分别提供了用于制备HPLC标准的糖列表(包括厂家和批号)和用于制备HPLC标准的方案。
表26.在实验中利用的设备
Figure BDA0000122285460000451
表27.在HPLC分析中使用的糖
Figure BDA0000122285460000452
表28.HPLC标准的制备
Figure BDA0000122285460000453
分析
使每种样品(1克)与反渗水在200rpm和50℃下混合过夜。使样品的pH调整至5-6，并且通过0.2μm注射器式滤器过滤。在分析前将样品贮存于-20℃，以维持样品的完整性。在样品制备过程中进行的观察在表29中呈现。
表29.在HPLC样品制备过程中的观察
Figure BDA0000122285460000461
＊这些样品的pH使用1N NaOH调整至pH
由6种经组合的糖——葡萄糖、木糖、纤维二糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖的4mg/mL母液新鲜制备标准。通过使0.400克每种糖溶解于75mL超纯水(0.3微米过滤)内制备母液。溶解后，使用容量瓶使母液稀释至100mL，并且贮存于-20℃。通过用超纯水连续稀释母液制备0.1、0.5、1、2和4mg/mL的工作标准溶液。此外，还由母液制备1.5mg/mL的验证标准。
根据方案Determination of Structural Carbohydrates in Biomass(NREL Biomass Program，2006)分析糖浓度，并且这个方案通过引用整体合并入本文。使用具有蒸发激光散射检测器(EvaporativeLight Scattering Detector)的SHODEX SUGAR SP0810 COLUMN。每8次注射分析验证标准(1.5mg/mL标准)，以确保柱和检测器的完整性在实验过程中得到维持。标准曲线变异系数(R2值)是至少0.989，并且验证标准的浓度在实际浓度的10％内。HPLC条件如下：
表30.HPLC参数
Figure BDA0000122285460000471
＊ 最初测试指出在移动相中使用超纯水时观察到比15/85乙腈∶水更佳的分离(对于这种柱制造商未推荐使用超过20％乙腈)。
结果
HPLC分析的结果呈现于表31、32和33中。
表31.糖浓度表示为mg/mL和mg/g提取物
Figure BDA0000122285460000472
Figure BDA0000122285460000481
表32.糖浓度以纸的％表示
表33.糖浓度以总样品％表示
Figure BDA0000122285460000483
实施例16-毒性研究
12种样品就针对3种乙醇生产培养物的实验对象组的毒性进行分析。在这项研究中，将葡萄糖加入样品中，以便区别培养物的饥饿和样品的毒性。第13种样品就针对树干毕赤酵母的毒性进行测试。所使用的方案概括在表32中列出。在毒性测试中使用的化学制品和设备描述在表34-36中报告。
表34.用于毒性测试的条件
Figure BDA0000122285460000491
表35.用于毒性测试的试剂
Figure BDA0000122285460000492
表36.在摇瓶研究中使用的YSI组分
Figure BDA0000122285460000493
测试使用3种微生物如下所述进行。
酿酒酵母ATCC 24858(美国典型培养物中心)
由得自ATCC的再水合冻干培养物制备酿酒酵母的斜面培养。将斜面培养材料的部分划线到YM肉汤+20g/L琼脂(pH 5.0)上，并且在30℃下温育2天。用来自YM平板的1个菌落接种包含50mL培养基(20g/L葡萄糖、3g/L酵母提取物和5.0g/L蛋白胨，pH 5.0)的250mL Erlenmeyer烧瓶，并且在25℃和200rpm下温育24小时。在生长23小时后，获取样品并且分析光密度(在UV分光光度计中600nm)和纯度(革兰氏染色)。基于这些结果，选择具有OD 14.8和干净的革兰氏染色的1个烧瓶(被称为种子烧瓶)以接种所有测试烧瓶。
测试器皿是包含100mL上述无菌培养基的500mL Erlenmeyer烧瓶瓶。在加入测试材料前，所有烧瓶在121℃和15psi下进行高压灭菌。测试材料不进行灭菌，因为高压灭菌将改变样品的内容物。测试样品在接种时(而不是之前)加入，以减少污染的可能性。除测试样品外，还将1mL(1％v/v)种子烧瓶材料加入每个烧瓶中。使烧瓶如上所述温育36小时。
树干毕赤酵母NRRL Y-7124(ARS培养物保藏中心)
由得自ARS培养物保藏中心的再水合冻干培养物制备树干毕赤酵母的斜面培养。将斜面培养材料的部分划线到YM肉汤+20g/L琼脂(pH 5.0)上，并且在30℃下温育2天。用少量平板材料接种包含100mL培养基(40g/L葡萄糖、1.7g/L酵母氮源、2.27g/L尿素、6.56g/L蛋白胨、40g/L木糖，pH 5.0)的250mL Erlenmeyer烧瓶，并且在25℃和125rpm下温育24小时。在生长23小时后，获取样品并且分析光密度(在UV分光光度计中600nm)和纯度(革兰氏染色)。基于这些结果，选择具有光密度5.23和干净的革兰氏染色的1个烧瓶(被称为种子烧瓶)以接种所有测试烧瓶。
测试器皿是包含100mL上述无菌培养基的250mL Erlenmeyer烧瓶。在加入测试材料前，所有烧瓶在121℃和15psi下进行空高压灭菌，并且将过滤(0.22μm滤器)灭菌的培养基加入烧瓶中。测试材料不进行灭菌，因为高压灭菌将改变样品的内容物，并且过滤灭菌不适合于固体灭菌。测试样品在接种时(而不是之前)加入，以减少污染的可能性。除测试样品外，还将1mL(1％v/v)种子烧瓶材料加入每个烧瓶中。使烧瓶如上所述温育48小时。
运动发酵单胞菌ATCC 31821(美国典型培养物中心)
由得自ATCC的再水合冻干培养物制备运动发酵单胞菌的斜面培养。将斜面培养材料的部分划线到DYE平板(葡萄糖20g/L、酵母提取物10g/L、琼脂20g/L，pH 5.4)上，并且在30℃和5％CO2下温育2天。用1个菌落接种包含15mL培养基(25g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、1g/L MgSO4·7H2O、1g/L(NH4)2SO4、2g/L KH2PO4，pH 5.4)的20mL螺口试管，并且在30℃下不伴随振荡温育24小时。在生长23小时后，获取样品并且分析光密度(在UV分光光度计中600nm)和纯度(革兰氏染色)。基于这些结果，选择1个管(OD 1.96)以接种第二个种子烧瓶。第二个种子烧瓶是包含70mL上述培养基的125ml烧瓶，并且用700μL(1％v/v)接种且在30℃下不伴随振荡温育24小时。在生长23小时后，获取样品并且分析光密度(在UV分光光度计中600nm)和纯度(革兰氏染色)。基于这些结果，选择具有OD 3.72的1个烧瓶(被称为种子烧瓶)以接种所有测试烧瓶。
测试器皿是包含100mL上述无菌培养基(除以5g/L的酵母提取物外)的250mL Erlenmeyer烧瓶。在加入测试材料前，所有烧瓶在121℃和15psi下进行空高压灭菌，并且将过滤(0.22μm滤器)灭菌的培养基加入烧瓶中。测试材料不进行灭菌，因为高压灭菌将改变样品的内容物，并且过滤灭菌不适合于固体灭菌。测试样品在接种时加入，以减少污染的可能性。除测试样品外，还将1mL(1％v/v)种子烧瓶材料加入每个烧瓶中。使烧瓶如上所述温育36小时。
分析
2种样品就细胞浓度进行分析(使用平板涂布法用于运动发酵单胞菌和直接计数(血球计和显微镜用于酿酒酵母和树干毕赤酵母)。在Dextrose Yeast Extract(葡萄糖20g/L、酵母提取物10g/L、琼脂20g/L，pH 5.4)平板上涂布适当稀释的运动发酵单胞菌样品，在30℃和5％CO2下温育2天，并且计数菌落数目。使适当稀释的酿酒酵母和树干毕赤酵母样品与0.05％台盼蓝相混合，装载到Neubauer血球计内。细胞在40X放大率下进行计数。
使用YSI Biochem分析仪基于醇脱氢酶测定法(YSI，Interscience)，就乙醇浓度分析3种样品。样品在14,000rpm下离心20分钟，并且将上清液贮存于-20℃以保存完整性。在分析前使样品稀释至0-3.2g/L乙醇。约每30份样品分析3.2g/L乙醇标准，以确保膜的完整性在分析过程中得到维持。未报告样品的光密度(600nm)，因为固体测试样品通过增加样品浊度而干扰吸光度测量并且是不准确的。
乙醇分析结果
对于每种微生物，性能用于使每种样品与对照相比较(表37-39)。然而，性能％无法用于在菌株之间比较。当比较菌株时，应使用乙醇的总浓度。当分析数据时，当伴随低细胞数目时，小于80％的性能％可以指示毒性。用于测定性能％的等式是：
性能％＝(样品中的乙醇/对照中的乙醇)x100
表37.使用酿酒酵母的乙醇浓度和性能％
表38.使用树干毕赤酵母的乙醇浓度和性能％
Figure BDA0000122285460000532
以粗体的样品是最高乙醇生产者，超过20g/L并且类似于木材水解物中的浓度(H.K.Sreenath和T.W.Jeffries Bioresource Technology 72(2000)253-260)。
＊在随后摇瓶实验中分析。
表39.使用运动发酵单胞菌的乙醇浓度和性能％
Figure BDA0000122285460000533
Figure BDA0000122285460000541
来自细胞浓度分析的结果
对于每种生物，细胞％用于使每种样品与对照相比较(表40-42)。然而，细胞％无法用于在菌株之间比较。当比较菌株时，应使用细胞的总浓度。当分析数据时，当伴随低乙醇浓度时，小于70％的性能％可以指示毒性。用于测定性能％的等式是：
细胞％＝(样品中的细胞数目/对照中的细胞数目)x100
表40.关于酿酒酵母来自细胞浓度分析的结果
Figure BDA0000122285460000542
表41.关于树干毕赤酵母来自细胞浓度分析的结果
Figure BDA0000122285460000543
表42.关于运动发酵单胞菌来自细胞浓度分析的结果
Figure BDA0000122285460000552
实施例17-纤维素样品使用树干毕赤酵母的摇瓶发酵
概述
就不添加糖的树干毕赤酵母培养物中的乙醇生产测试13种样品。它们在纤维素酶(Accellerase
Figure BDA0000122285460000553
酶复合物，Genencor)的存在和不存在下进行测试。用于该实验的设备和试剂在下文表43-45中列出。
表43.设备和维修频率
Figure BDA0000122285460000561
表44.在摇瓶研究中使用的YSI组分
Figure BDA0000122285460000562
表45.用于摇瓶发酵的化学制品
Figure BDA0000122285460000563
由得自ARS培养物保藏中心的再水合冻干培养物制备树干毕赤酵母NRRL Y-7124的斜面培养。将斜面培养材料的部分划线到YeastMold(YM)肉汤+20g/L琼脂(pH 5.0)上，并且在30℃下温育2天。用1个菌落接种包含100mL培养基(40g/L葡萄糖、1.7g/L酵母氮源、2.27g/L尿素、6.56g/L蛋白胨、40g/L木糖，pH 5.0)的250mL Erlenmeyer烧瓶，并且在25℃和100rpm下温育24小时。在生长23小时后，获取样品并且分析光密度(在UV分光光度计中600nm)和纯度(革兰氏染色)。基于这些结果，选择具有光密度6.79和干净的革兰氏染色的1个烧瓶(被称为种子烧瓶)以接种所有测试烧瓶。
测试器皿是包含100mL培养基(1.7g/L酵母氮源、2.27g/L尿素和6.56g/L蛋白胨)的250mL Erlenmeyer烧瓶。在生长烧瓶培养基中不加入糖(葡萄糖或木糖)。在加入测试材料前，所有烧瓶在121℃和15psi下进行空高压灭菌，并且将过滤(0.22μm滤器)灭菌的培养基加入烧瓶中。测试材料不进行灭菌，因为高压灭菌将改变样品的内容物，并且过滤灭菌不适合于固体灭菌。测试样品(在表46中列出)在接种时(而不是之前)加入，以减少污染的可能性。除测试样品外，还将1mL(1％v/v)种子烧瓶材料加入每个烧瓶中。包含样品P132-100的烧瓶需要添加0.4mL 1M NaOH，以使pH达到5.0。使烧瓶在上述30℃和150rpm下温育96小时。
一组一式两份烧瓶/原料包含
Figure BDA0000122285460000571
酶复合物(1.25mL/烧瓶，最高推荐剂量是0.25mL/克生物量，Genencor)，以尝试同时糖化和发酵(SSF)。另一组一式两份烧瓶不包含
Figure BDA0000122285460000572
酶复合物。分析总共52个烧瓶。
还分析6个对照烧瓶。阳性对照烧瓶包含以2.5克/100mL烧瓶(25克/L)浓度的SolkaFloc 200NF Powdered Cellulose(批次#UA158072，International Fiber Corporation)，伴随和不伴随
Figure BDA0000122285460000573
酶复合物的添加。此外，使用仅包含糖(葡萄糖和木糖)的对照。
表46.加入每个烧瓶的每种原料的量
Figure BDA0000122285460000574
分析
使用YSI Biochem分析仪基于醇脱氢酶测定法(YSI，Interscience)，就乙醇浓度分析样品(表47、48和49)。样品在14,000rpm下离心20分钟，并且将上清液贮存于-20℃。在分析前使样品稀释至0-3.2g/L乙醇。约每30份样品分析2.0g/L  醇标准，以确保膜的完整性在分析过程中得到维持。
结果
表47.对照烧瓶的结果
Figure BDA0000122285460000581
表48.不含
Figure BDA0000122285460000582
1000酶复合物的摇瓶的结果
Figure BDA0000122285460000583
表49.含
Figure BDA0000122285460000584
1000酶复合物的摇瓶的结果
Figure BDA0000122285460000585
Figure BDA0000122285460000591
实施例18-纤维素酶测定法
概述
使用工业纤维素酶(
Figure BDA0000122285460000592
1000，Genencor)在最佳温度和pH条件下就纤维素酶敏感性测试13种样品。
方案
该方案是NREL“Laboratory Analytical Procedure LAP-009Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass”的修改。将材料的样品一式两份地加入50mL管中的10mL 0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH 4.8)和40mg/mL四环素(以预防细菌生长)中。加入每个管的样品量在表50中列出。某些样品难以混合(P132、P132-10、P132-100)，所以以较低浓度加入。还包括0.2克SolkaFloc 200 NFPowdered Cellulose(批次# UA158072，International FiberCorporation)的阳性对照和阴性对照(无样品)。将使体积达到总共20mL的足够反渗(RO)水加入管中。在使用前使柠檬酸钠缓冲液和水都加热至50℃。
将
Figure BDA0000122285460000593
1000酶以0.25mL/克生物量的剂量(由Genencor推荐的最高剂量)加入每个管中。使管以45°角在150rpm和50℃下(由Genencor推荐)温育72小时。在0、3、6、9、12、18、24、48和72小时时获取样品(表52和53)，在14,000rpm下离心20分钟，并且使上清液冷冻于-20℃下。使用YSI Biochem分析仪(Interscience)，使用表51中描述的条件，分析样品中的葡萄糖浓度。通过使2.500克葡萄糖(Sigma目录#G7528-5KG，批次#：107H0245)溶解于蒸馏水中，制备2.5g/L葡萄糖标准溶液。溶解后，在容量瓶中用蒸馏水使总体积达到1L。标准新鲜制备且贮存于4℃。
表50.加入的每种样品的量
  Xyleco编号   加入管中的量(g/20mL)
  P132   0.5
  P132-10   0.5
  P132-100   0.5
  A132   0.75
  A132-10   0.75
  A132-100   0.75
  G132   0.75
  G132-10   0.75
  G132-100   0.75
  WS132   0.75
  WS132-10   0.75
  WS132-100   0.75
  样品A   0.75
  SolkaFloc 200NF(对照)   0.2
  Negative对照   0
表51.在摇瓶研究中使用的YSI组分
Figure BDA0000122285460000601
结果
表52.纤维素酶测定法结果
Figure BDA0000122285460000602
Figure BDA0000122285460000611
图表1.葡萄糖浓度(最高的4个生产者)
Figure BDA0000122285460000612
如下计算在管中消化的纤维素量：
g/mL葡萄糖x20mL(样品体积)x0.9(以校正在纤维素水解后添加的水分子)
如下计算作为葡萄糖释放的总样品百分比(在下表53中)：
经消化的纤维素g/加入的样品g(关于细节参见表5)＊100
表53.纤维素酶测定法结果
Figure BDA0000122285460000613
Figure BDA0000122285460000621
实施例19-使用树干毕赤酵母的摇瓶发酵
概述
使用来自表36具有最高性能％的4种纤维素材料执行使用树干毕赤酵母的摇瓶发酵。
方案
实验在表54-56中概述的参数下运行。
表54.设备和维修频率
Figure BDA0000122285460000622
表55.在摇瓶研究中使用的YSI组分
Figure BDA0000122285460000623
表56.用于摇瓶发酵的化学制品
  培养基组分   制造商   参考#   批次#
  尿素   ScholAR Chemistry   9472706   AD-7284-43
  酵母氮源   Becton Dickinson   291940   7128171
  蛋白胨   Becton Dickinson   211677   4303198
  YM肉汤   Becton Dickinson   271120   6278265
  木糖   Alfa Aesar   A10643   10130919
  葡萄糖   Fisher Scientific   BP350-1   030064
种子发育
对于所有下述摇瓶实验，使用下述操作制备种子烧瓶。
由得自ARS培养物保藏中心的再水合冻干培养物制备树干毕赤酵母NRRL Y-7124的工作细胞库。使包含在15％v/v甘油中的树干毕赤酵母培养物的冷冻小瓶贮存于-75℃下。将经解冻的工作细胞库材料的部分划线到Yeast Mold(YM)肉汤+20g/L琼脂(pH 5.0)上，并且在30℃下温育2天。在使用前，将平板放置在4℃2天。用1个菌落接种包含100mL培养基(40g/L葡萄糖、1.7g/L酵母氮源、2.27g/L尿素、6.56g/L蛋白胨、40g/L木糖，pH 5.0)的250mL锥形瓶，并且在25℃和100rpm下温育24小时。在生长23小时后，获取样品并且分析光密度(在UV分光光度计中600nm)和纯度(革兰氏染色)。基于这些结果，选择具有光密度4-8和干净的革兰氏染色的1个烧瓶(被称为种子烧瓶)以接种所有测试烧瓶。
使用样品A132-10、A132-100、G132-10和G132-100运行3次试验。实验#1测试在多种浓度的木糖和恒定浓度的葡萄糖下这4种样品的乙醇浓度。实验#2测试在表36的实验中使用的原料的双倍浓度下这4种样品的乙醇浓度。最后，实验#3测试在同时改变木糖和葡萄糖浓度时这4种样品的乙醇浓度。
实验#1-改变木糖浓度
在如下表57中列出的多种木糖浓度下测试4种纤维素样品(A132-10、A132-100、G132-10和G132-100)。
表57.实验#1烧瓶的培养基组成
Figure BDA0000122285460000641
测试器皿(总共40个250mL Erlenmeyer烧瓶)包含100mL培养基。用表57中概述的木糖和葡萄糖的量制备5种不同类型的培养基。此外，培养基包含1.7g/L酵母氮源(Becton Dickinson#291940)、2.27g/L尿素(ScholAR Chemistry#9472706)和6.56g/L蛋白胨(Becton Dickinson#211677)。在加入测试材料前，所有烧瓶在121℃和15psi下进行空高压灭菌，并且将过滤(0.22μm滤器)灭菌的培养基加入烧瓶中。在使用前使烧瓶在室温下保持4天并且检查污染(混浊)。测试材料不进行灭菌，因为高压灭菌将改变样品的内容物，并且过滤灭菌不适合于固体灭菌。测试样品(以5g/100mL的A132-10、A132-100、G132-10和G132-100)在接种时(而不是之前)加入，以减少污染的可能性。除测试样品外，还将1mL(1％v/v)种子烧瓶材料加入每个烧瓶中。使烧瓶在30℃和150rpm下温育72小时。
不幸的是，1个烧瓶(具有100％木糖的样品A132-100)在测试过程中被打破。因此，在温育24小时后的所有结果作为单个烧瓶报告。在温育72小时后，将100％原始量的纤维素材料(5.0g)加入100％木糖烧瓶中(总共7个烧瓶，包含样品A132-100的1个烧瓶被打破)，并且如上温育另外48小时。
表58.在温育时间72小时时将原料加入100％木糖烧瓶中
Figure BDA0000122285460000642
分析
在0、6、12、24、36、48和72小时的温育时间时从40个测试烧瓶获取样品。此外，在100％木糖烧瓶中第二次原料量添加后24和48小时时获取样品(参见表58)。
使用YSI Biochem分析仪基于醇脱氢酶测定法(YSI，Interscience)，就乙醇浓度分析总共292份样品。样品在14,000rpm下离心20分钟，并且将上清液贮存于-20℃。值得注意的是，时间0样品需要通过0.45μm注射器式滤器过滤。在分析前使样品稀释至0-3.2g/L乙醇。约每30份样品分析2.0g/L乙醇标准，以确保膜的完整性得到维持。
对于细胞计数分析总共47份样品。在72小时温育和更多纤维素材料添加后48小时时获取样品。使适当稀释的样品与0.05％台盼蓝相混合，并且装载到Neubauer血球计内。细胞在40X放大率下进行计数。
实验#2-2X原料浓度的分析
测试器皿(总共8个250mL Erlenmeyer烧瓶)包含100mL培养基。培养基包含40g/L葡萄糖、40g/L木糖、1.7g/L酵母氮源(Becton Dickinson#291940)、2.27g/L尿素(ScholAR Chemistry#9472706)和6.56g/L蛋白胨(Becton Dickinson#211677)。烧瓶如实验#1中一样制备。测试样品(以10g/100mL的A132-10、A132-100、G132-10和G132-100)在接种时(而不是之前)加入，以减少污染的可能性。除测试样品外，还将1mL(1％v/v)种子烧瓶材料加入每个烧瓶中。使烧瓶在上文30℃和150rpm下温育72小时。
分析
在0、6、12、24、36、48和72小时的温育时间时从8个测试烧瓶获取样品。56份样品的乙醇分析按照实验#1执行，并且在表59中报告。细胞计数按照实验#1对72小时样品执行，并且在表60中呈现。
表59.在具有双倍原料的烧瓶中的乙醇浓度
Figure BDA0000122285460000651
Figure BDA0000122285460000661
表60.在具有双倍原料的烧瓶中在72小时温育时间时的细胞浓度
Figure BDA0000122285460000662
实验#3-改变木糖和葡萄糖浓度
在如下表(表60)中列出的多种木糖和葡萄糖浓度下测试4种纤维素样品(A132-10、A132-100、G132-10和G132-100)。
表61.实验#3烧瓶的培养基组成
Figure BDA0000122285460000663
测试器皿(总共32个250mL Erlenmeyer烧瓶)包含100mL培养基。用表61中概述的木糖和葡萄糖的量制备4种不同类型的培养基。此外，培养基包含1.7g/L酵母氮源(Becton Dickinson #291940)、2.27g/L尿素(ScholAR Chemistry #9472706)和6.56g/L蛋白胨(Becton Dickinson #211677)。烧瓶按照实验#1制备。测试样品(A132-10、A132-100、G132-10和G132-100)在接种时(而不是之前)加入，以减少污染的可能性。除测试样品外，还将1mL(1％v/v)种子烧瓶材料加入每个烧瓶中。使烧瓶在30℃和150rpm下温育72小时。
分析
在0、6、12、24、36、48和72小时的温育时间时从32个测试烧瓶获取样品(参见表62-65)。使用YSI Biochem分析仪基于醇脱氢酶测定法(YSI，Interscience)，就乙醇浓度分析总共224份样品。样品在14,000rpm下离心20分钟，并且将上清液贮存于-20℃。值得注意的是，某些样品需要离心且通过0.45μm注射器式滤器过滤。在分析前使样品稀释至0-3.2g/L乙醇。约每30份样品分析2.0g/L乙醇标准，以确保YSI膜的完整性得到维持。
表62.样品A132-10乙醇结果
Figure BDA0000122285460000671
＊来自实验#3的分析。
表63.样品A132-100乙醇结果
Figure BDA0000122285460000672
＊来自实验#3的分析。
＊＊所有结果基于1个烧瓶的分析。
表64.样品G132-10乙醇结果
Figure BDA0000122285460000681
＊来自实验#3的分析。
表65.样品G132-100乙醇结果
Figure BDA0000122285460000682
＊来自实验#3的分析。
对于细胞计数在72小时温育时获取样品(参见表66-67)。使适当稀释的样品与0.05％台盼蓝相混合，并且装载到Neubauer血球计内。细胞在40X放大率下进行计数。
结果
1个种子烧瓶用于接种所有实验#1和#2测试烧瓶。种子烧瓶的光密度(600nm)测量为5.14，并且细胞浓度是4.65x108细胞/mL(表65-66)。因此，在测试烧瓶中的细胞起始浓度是约4.65x106细胞/mL。
第二个种子烧瓶用于接种实验#3烧瓶。种子烧瓶的光密度(600nm)测量为5.78，并且细胞浓度是3.75x108细胞/mL。因此，在测试烧瓶中的细胞起始浓度是约3.75x106细胞/mL。
表66.在72小时的温育时间时的细胞计数
Figure BDA0000122285460000691
＊样品在生长72小时后被高度污染。这是预期的，因为毕赤酵母属不添加糖无法良好生长，并且污染物(来自未灭菌样品)能够生长超过毕赤酵母属。
表67.在添加后(100％木糖和葡萄糖)48小时的温育时间时的细胞计数
Figure BDA0000122285460000692
实施例20-木质纤维素样品针对树干毕赤酵母和酿酒酵母的毒性测试
概述
37种样品就针对2种乙醇生产培养物(酿酒酵母和树干毕赤酵母)的毒性进行分析。在这项研究中，将葡萄糖加入样品中，以便区别培养物的饥饿和样品的毒性。
表68.用于毒性测试的条件
Figure BDA0000122285460000701
方案
所使用的方案概括在表68中列出。在毒性测试中使用的化学制品的描述在表69中列出。对于每周测试对于每种微生物执行2个对照烧瓶(不加入样品)。分析总共82个烧瓶。
在实验过程中，在温育前24小时内在包含样品C、C-1e、C-5e和C-10e的树干毕赤酵母烧瓶中未出现乙醇或细胞。为了证实结果，重复测试。第二次测试证实当样品C、C1E、C5E和C10E加入烧瓶时，树干毕赤酵母生长的一定程度抑制。
表69.用于毒性测试的化学制品和材料
Figure BDA0000122285460000702
表70.在毒性研究中使用的YSI组分
测试样品
使用适合于小样品的咖啡磨研磨7种测试样品(全部具有C指名)。使样品研磨至用肉眼一致的颗粒大小(在样品之间)。样品编号C-100e易于研磨至小颗粒大小。
将所有样品以50克/升的浓度加入烧瓶中，除6种P样品(25克/升)外。这些样品在颜色中是白色至灰白色，并且在视觉上是松散的，并且在50克/升的浓度下烧瓶无法适当混合(没有足够的游离液体)。样品S易于溶解并且在将来可以以更高浓度加入烧瓶中。样品A和G在将来可以以100克/升加入。
测试使用2种微生物如下所述执行。
酿酒酵母ATCC 24858(美国典型培养物中心)
由得自美国典型培养物中心的再水合冻干培养物制备酿酒酵母ATCC 24858的工作细胞库。使包含在15％v/v甘油中的酿酒酵母培养物的冷冻小瓶贮存于-75℃下。将经解冻的工作细胞库材料的部分划线到Yeast Mold(YM)肉汤+20g/L琼脂(pH 5.0)上，并且在30℃下温育2天。用来自YM平板的1个菌落接种包含50mL培养基(20g/L葡萄糖、3g/L酵母提取物和5.0g/L蛋白胨，pH 5.0)的250mLErlenmeyer烧瓶，并且在25℃和200rpm下温育24小时。在生长23小时后，获取样品并且分析光密度(在UV分光光度计中600nm)和纯度(革兰氏染色)。基于这些结果，具有OD 9-15和纯革兰氏染色的1个烧瓶(被称为种子烧瓶)用于接种生长烧瓶。在生长23小时后，种子烧瓶具有低OD(5.14)和细胞计数(1.35x108细胞/mL)。值得注意的是，得自种子平板的菌落小于通常的。因此，将0.5mL种子材料(与计划的0.1ml形成对比)加入每个测试器皿中。
测试器皿是包含100mL上述无菌培养基的500mL Erlenmeyer烧瓶。在加入测试材料前，所有烧瓶在121℃和15psi下进行高压灭菌。测试材料不进行灭菌，因为高压灭菌将改变样品的内容物。测试样品在接种时(而不是之前)加入，以减少污染的可能性。除测试样品外，还将0.5-1.0mL(0.5-1.0％v/v)种子烧瓶材料加入每个烧瓶中。使烧瓶如上所述温育72小时。
树干毕赤酵母(ARS培养物保藏中心)
由得自ARS培养物保藏中心的再水合冻干培养物制备树干毕赤酵母NRRL Y-7124的工作细胞库。使包含在15％v/v甘油中的树干毕赤酵母培养物的冷冻小瓶贮存于-75℃下。将经解冻的工作细胞库材料的部分划线到Yeast Mold(YM)肉汤+20g/L琼脂(pH 5.0)上，并且在30℃下温育2天。在使用前使平板在4℃下保持高达5天。用1个菌落接种包含100mL培养基(40g/L葡萄糖、1.7g/L酵母氮源、2.27g/L尿素、6.56g/L蛋白胨、40g/L木糖，pH 5.0)的250mLErlenmeyer烧瓶，并且在25℃和125rpm下温育24小时。在生长23小时后，获取样品并且分析光密度(在UV分光光度计中600nm)和纯度(革兰氏染色)。基于这些结果，选择具有光密度5-9和纯革兰氏染色的1个烧瓶(被称为种子烧瓶)以接种所有测试烧瓶。
测试器皿是包含100mL上述无菌培养基的250mL Erlenmeyer烧瓶。在加入测试材料前，所有烧瓶在121℃和15psi下进行空高压灭菌，并且将过滤(0.22μm滤器)灭菌的培养基加入烧瓶中。测试材料不进行灭菌，因为高压灭菌将改变样品的内容物，并且过滤灭菌不适合于固体灭菌。测试样品在接种时(而不是之前)加入，以减少污染的可能性。除测试样品外，还将1mL(1％v/v)种子烧瓶材料加入每个烧瓶中。使烧瓶如上所述温育72小时。
分析
紧在接种前从种子烧瓶以及在24和72小时时从每个测试烧瓶获取样品，并且使用直接计数分析细胞浓度。使适当稀释的酿酒酵母和树干毕赤酵母样品与0.05％台盼蓝相混合，装载到Neubauer血球计内。细胞在40X放大率下进行计数。
在0、6、12、24、36、48和72小时时从每个烧瓶获取样品，并且使用YSI Biochem分析仪基于醇脱氢酶测定法(YSI，Interscience)分析乙醇浓度。样品在14,000rpm下离心20分钟，并且将上清液贮存于-20℃。在分析前使样品稀释至0-3.2g/L乙醇。约每30份样品分析2.0g/L乙醇标准，以确保膜的完整性在分析过程中得到维持。
计算
下述计算用于使细胞计数和乙醇浓度与对照烧瓶相比较。
性能％＝(测试烧瓶中的乙醇浓度/对照中的乙醇)＊100％
细胞＝(测试烧瓶中的细胞数目/对照烧瓶中的细胞数目)＊100
结果
酿酒酵母种子烧瓶具有5.14的光密度(600nm)和1.35x108细胞/mL的细胞浓度。将0.5mL种子烧瓶材料加入每个测试烧瓶中。因此，每个烧瓶中的起始细胞浓度是6.75x105/mL。在第二周测试过程中，酿酒酵母种子烧瓶具有4.87的光密度(600nm)和3.15x107细胞/mL的细胞浓度。将1mL种子烧瓶材料加入每个测试烧瓶中。因此，每个烧瓶中的起始细胞浓度是6.30x105/mL。在样品时间0小时时酿酒酵母烧瓶的pH在表71中呈现。烧瓶内容物的pH在用于酿酒酵母生长的最佳pH内(pH 4-6)。不需要pH调整。
表71.在样品时间0小时时酿酒酵母烧瓶的pH
Figure BDA0000122285460000731
Figure BDA0000122285460000741
＊“S”指蔗糖
＊“C”指玉米
＊“ST”指淀粉
酿酒酵母烧瓶中的乙醇浓度和性能在表72和73中呈现。最高乙醇浓度由S系列产生。
表72.酿酒酵母烧瓶中的乙醇浓度
Figure BDA0000122285460000742
Figure BDA0000122285460000751
＊第2周分析
关于样品编号关键参见表72
表73.酿酒酵母烧瓶中的性能
Figure BDA0000122285460000761
＊第2周分析
酿酒酵母烧瓶中的细胞浓度和细胞％在表74中呈现。在所有烧瓶中都观察到高细胞计数；然而，并非所有细胞看起来都制备乙醇。
表74.酿酒酵母细胞计数和细胞％
Figure BDA0000122285460000771
树干毕赤酵母种子烧瓶具有5.01的光密度(600nm)和3.30x108细胞/mL的细胞浓度。将1mL种子烧瓶材料加入每个测试烧瓶中。因此，每个烧瓶中的起始细胞浓度是3.30x106/mL。在第二周测试过程中，树干毕赤酵母种子烧瓶具有5.45的光密度(600nm)和3.83x108细胞/mL的细胞浓度。将1mL种子烧瓶材料加入每个测试烧瓶中。因此，每个烧瓶中的起始细胞浓度是3.83x106/mL。在样品时间0小时时树干毕赤酵母烧瓶的pH在表75中呈现。烧瓶内容物的pH在用于树干毕赤酵母生长的最佳pH内(pH 4-7)。不需要pH调整。
表75.在样品时间0小时时树干毕赤酵母烧瓶的pH
Figure BDA0000122285460000781
树干毕赤酵母烧瓶中的乙醇浓度和性能在表76和77中呈现。最高乙醇浓度是G和A系列。烧瓶C-30e、C-50e和C-100e也包含高乙醇浓度。树干毕赤酵母烧瓶中的细胞浓度和细胞％在表78中呈现。在具有S指名的烧瓶中观察到低细胞浓度。在24小时样品时间时在包含样品C、C1E、C5E和C10E的烧瓶中也观察到低细胞计数。
表76.树干毕赤酵母烧瓶中的乙醇浓度
Figure BDA0000122285460000791
Figure BDA0000122285460000801
＊第2周分析
表77.树干毕赤酵母烧瓶中的性能
Figure BDA0000122285460000811
＊在第2周中分析
表78.树干毕赤酵母细胞计数和细胞％
Figure BDA0000122285460000812
Figure BDA0000122285460000821
＊第2周分析
细胞毒性结果概括
运动发酵单胞菌
如图表1A中所示，在24小时时间点时，在包含P-132-10、G-132-10和WS-132-10的样品中观察到升高的细胞数目(例如，超过对照)。在所有其他样品的存在下的细胞数目与对照可比较。这个观察指出在种植后高达24小时，底物针对运动发酵单胞菌是无毒的。
在36小时时间点时，对于所有样品包括对照观察到细胞数目中的下降(例如，由于细胞丧失或细胞死亡)。对于包含P-132-10、G-132-10的那些样品观察到细胞数目中的最大下降。这个效应的可能原因对于所有样品包括对照是共同的。因此，这个效应的原因不是测试底物，因为这些在每种样品中不同，并且在对照中不存在。关于这个观察的可能解释包括不合适的培养条件(例如，温度、培养基组成)或样品中的乙醇浓度。
图表1A.关于运动发酵单胞菌的细胞浓度
如图表1B中所示，在每个时间点时所有细胞都产生可比较量的乙醇(例如，5-10g/L)，与底物无关。与图表1A中呈现的细胞数目数据一致，每种样品中的乙醇浓度在24小时时间点时达到峰值。与细胞数目数据形成对比，乙醇浓度在后续时间点时不下降。这是预期的，因为乙醇不从系统中取出。此外，这个数据暗示这些样品中的乙醇生产可能已起因于培养基中的葡萄糖发酵。所测试的底物无一看起来增加乙醇生产。
图表1B.关于运动发酵单胞菌的乙醇浓度
Figure BDA0000122285460000832
总之，图表1A和1B暗示高于约6g/L的乙醇浓度对于运动发酵单胞菌可能是有毒的。这个数据还作为针对对照标准化的百分率呈现，如图表1C中所示。
图表1C.关于运动发酵单胞菌的生长％和乙醇生产
Figure BDA0000122285460000841
树干毕赤酵母
如图表2A中所示，细胞数目与对照可比较。此外，尽管在包含G-132和WS-132的样品中存在略微减少的细胞数目，但对于G-132-10、G-132-100、A-132-10或A-132-100未观察到细胞数目减少。因此，不太可能底物G或A是有毒的。相反，对于G-132和WS-132观察到的细胞数目减少可能由实验异常或不知何故阻碍细胞生长的未经加工底物的存在引起。总之，这个数据暗示在对照和实验样品中存在的葡萄糖可能足以促进最佳树干毕赤酵母生长，并且样品中另外底物的存在不增加这个生长率。这些结果还暗示样品无一在树干毕赤酵母中是有毒的。
图表2A.关于树干毕赤酵母的细胞浓度
Figure BDA0000122285460000851
如图表2B中所示，尽管图表2B中报告了相似的细胞数目，但在包含实验底物的所有样品中都观察到极大增加的乙醇生产。对于所测试的3个时间点中的每个，乙醇浓度随着时间过去增加。在48小时时间点时，对于A-132-10观察到最高乙醇浓度(例如，约26.0g/L)。通过使具有最高乙醇生产水平的底物浓度与图表2B中呈现的细胞数目数据相比较，可以看出树干毕赤酵母看起来对于增加的乙醇浓度不敏感。此外，乙醇生产看起来与细胞数目无关，而是看起来与样品中存在的底物类型相关。
图表2B.关于树干毕赤酵母的乙醇浓度
Figure BDA0000122285460000852
总之，图表2A和2B中呈现的结果暗示实验底物不促进增加的树干毕赤酵母生长，然而，它们极大增加通过这个细胞类型生产的乙醇量。这个数据还作为针对对照标准化的百分率呈现，如图表2C中所示。
图表2C.关于树干毕赤酵母的生长％和乙醇生产
酿酒酵母
如图表3A中所示，与对照相比较，G-132-100、A-132、A-132-10、A-132-100和WS-132促进略微升高的细胞数目。对于任何样品未观察到细胞数目中的显著减少。这些结果暗示样品无一在酿酒酵母中是有毒的。
图表3A.关于酿酒酵母的细胞浓度
Figure BDA0000122285460000862
如图表3B中所示，与对照相比较，在用每种细胞类型处理的细胞中观察到增加的乙醇生产。包含最高量乙醇的那些样品与图表3A中呈现的细胞数目数据相比较，暗示超过5g/L的乙醇浓度可能对细胞数目具有不良作用。然而，这个观察不是对于所有样品的情况。
图表3B.关于酿酒酵母的乙醇浓度
Figure BDA0000122285460000871
这个数据还作为针对对照标准化的百分率呈现，如图表3C中所示。
图表3C.关于酿酒酵母的生长％和乙醇生产
Figure BDA0000122285460000872
总之，所测试的样品无一看起来在运动发酵单胞菌、树干毕赤酵母或酿酒酵母中是有毒的。此外，树干毕赤酵母看起来是3种细胞类型中对于由所测试的实验底物生产乙醇最有效的。
其他实施方案
本发明的许多实施方案已得到描述。然而，应当理解可以进行各种修饰而不背离本发明的精神和范围。
例如，纤维可以以任何所需形式，并且可以具有各种不同形态。一般地，希望纤维素材料具有高表面积。在某些情况下，纤维可以掺入单或多层片内，例如纤维可以是HEPA滤纸的部分等。片材料可以具有例如约1-500m2/g的表面积。纤维材料可以以筛子或丝网的形式覆盖例如吹塑(meltblown)、折叠，或以其他几何形状提供。纤维可以是挤出或共挤出的。
纤维可以具有从纳米规模(例如小于约1000nm，例如小于500nm、250nm、100nm、50nm、25nm，或甚至小于1nm)到大颗粒大小(例如大于100微米、200微米、500微米或甚至1000微米)的任何所需颗粒大小，或颗粒的附聚物。
虽然本文已讨论了生物量底物，但此类底物可以与其他底物组合使用，例如于2009年10月16日提交的美国临时申请号61/252,300中公开的无机和合成底物，其完全公开内容通过引用合并入本文。
纤维或包含纤维的纤维材料可以用微生物和/或酶进行预处理，和/或纤维或纤维材料可以在生物过程例如糖化或发酵过程中与微生物和/或酶接触。
如上所述，酶可以固定化在纤维上，而不是固定化在微生物上或加上微生物。
使生物量例如生物量的纤维素和/或木质素部分断裂的酶和生物量破坏生物包含或制备多种纤维素分解酶(纤维素酶)、木质酶或多种小分子生物量破坏代谢产物。这些酶可以是协同作用以降解微晶纤维素或生物量的木质素部分的酶的复合物。纤维素分解酶的例子包括：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和纤维二糖酶(β-葡糖苷酶)。在糖化过程中，纤维素底物最初通过内切葡聚糖酶在随机位置上水解，产生寡聚中间产物。这些中间产物随后是关于外切型葡聚糖酶例如纤维二糖水解酶的底物，以从纤维素聚合物的末端产生纤维二糖。纤维二糖是水溶性1，4-连接的葡萄糖二聚体。最后，纤维二糖酶切割纤维二糖以产生葡萄糖。
纤维素酶能够降解生物量且可以具有真菌或细菌起源。合适的酶包括来自芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、腐质霉属(Humicola)、镰刀菌属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢属(Acremonium)、金孢属(Chrysosporium)和木霉属(Trichoderma)，并且包括腐质霉属、鬼伞属(Coprinus)、梭孢壳属、镰刀菌属、毁丝霉属(Myceliophthora)、枝顶孢属、头孢霉属(Cephalosporium)、柱霉属(Scytalidium)、青霉属(Penicillium)或曲霉菌属(Aspergillus)(参见例如EP 458162)的物种，特别是由选自下述物种的菌株产生的那些：特异腐质霉(Humicola insolens)(再分类为嗜热革节孢(Scytalidium thermophilum)，参见例如美国专利号4,435,307)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、嗜热毁丝菌(Myceliophthora thermophila)、大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)、太瑞斯梭壳孢霉(Thielaviaterrestris)、枝顶孢属物种、桃色顶孢霉(Acremonium persicinum)、Acremonium acremonium、Acremonium brachypenium、Acremoniumdichromosporum、Acremonium obclavatum、Acremonium pinkertoniae、灰粉顶孢霉(Acremonium roseogriseum)、Acremonium incoloratum和棕色枝顶孢(Acremonium furatum)；优选来自物种特异腐质霉DSM1800、尖孢镰刀菌DSM 2672、嗜热毁丝菌CBS 117.65、头孢霉属物种RYM-202、枝顶孢属物种CBS 478.94、枝顶孢属物种CBS 265.95、桃色顶孢CBS 169.65、Acremonium acremonium AHU 9519、头孢霉属物种CBS 535.71、Acremonium brachypenium CBS 866.73，Acremonium dichromosporum CBS 683.73、Acremonium obclavatumCBS 311.74、Acremonium pinkertoniae CBS 157.70，灰粉顶孢霉(Acremonium roseogriseum)CBS 134.56，Acremonium incoloratumCBS 146.62和棕色枝顶孢CBS 299.70H。纤维素分解酶还可以得自金孢属，优选Chrysosporium lucknowense的菌株。此外，可以使用木霉特别是绿色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和康氏木霉(Trichoderma koningii))、嗜碱芽孢杆菌(参见例如，美国专利号3,844,890和EP 458162)和链霉菌属(Streptomyces)(参见例如，EP 458162)。
合适是纤维二糖酶包括在商品名NOVOZYME 188TM下销售的来自黑曲霉的纤维二糖酶。
可以利用酶复合物，例如在商品名下可从Genencor获得的那些，例如
Figure BDA0000122285460000902
1500酶复合物。
Figure BDA0000122285460000903
1500酶复合物包含多重酶活性，主要是外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶(2200-2800CMC U/g)、半纤维素酶和β-葡糖苷酶(525-775 pNPGU/g)，并且具有4.6-5.0的pH。酶复合物的内切葡聚糖酶活性以羧甲基纤维素活性单位(CMC U)表达，而β-葡糖苷酶活性以pNP-葡糖苷活性单位(pNPG U)报道。在一个实施方案中，使用
Figure BDA0000122285460000904
1500酶复合物和NOVOZYMETM 188纤维二糖酶的掺和物。
因此，其他实施方案在下述权利要求的范围内。

Claims (27)

1.方法，其包括：
利用固定化在生物量材料上的微生物和/或酶，将低分子量糖转变成产物。
2.权利要求1的方法，其中所述生物量材料包括官能化的生物量纤维。
3.权利要求1或2的方法，其中转变包括允许所述微生物使至少部分所述低分子量糖转变成烃、醇或氢。
4.权利要求3的方法，其中所述醇包括乙醇。
5.上述权利要求中任一项的方法，其中所述微生物包括酵母。
6.权利要求5的方法，其中所述酵母选自酿酒酵母和树干毕赤酵母。
7.上述权利要求中任一项的方法，其中所述微生物包括细菌。
8.权利要求7的方法，其中所述细菌包括运动发酵单胞菌。
9.权利要求2的方法，其进一步包括照射生物量纤维以产生所述官能化的生物量纤维。
10.权利要求9的方法，其中所述照射包括用电离辐射进行照射。
11.权利要求9的方法，其中照射使用粒子束执行。
12.上述权利要求中任一项的方法，其中所述生物量材料包括纤维素或木质纤维素材料。
13.权利要求2的方法，其中所述生物量纤维具有大于0.25m2/g的BET表面积。
14.上述权利要求中任一项的方法，其中转变包括发酵。
15.权利要求2的方法，其中所述生物量纤维衍生自选自下述的生物量：纸、纸制品、纸废物、木材、刨花板、锯屑、农业废物、污水、青贮饲料、草、稻壳、甘蔗渣、黄麻、大麻、亚麻、竹、剑麻、马尼拉麻、稻草、玉米轴、玉米秸秆、柳枝稷、苜蓿、干草、椰子毛、棉花、海藻、藻类及其混合物。
16.权利要求2的方法，其中所述生物量纤维衍生自这样的生物量原料，其具有内部纤维并且已剪切至其内部纤维基本上暴露的程度。
17.权利要求2的方法，其中所述生物量纤维具有大于70％的多孔性。
18.上述权利要求中任一项的方法，其中所述转变步骤显示出至少140％的性能％。
19.权利要求2的方法，其进一步包括在转变后回收所述生物量纤维，并且在第二个、后续转变加工过程中再使用所述纤维。
20.权利要求2的方法，其中所述生物量纤维以单或多层片的形式提供。
21.权利要求2的方法，其中所述生物量纤维以覆盖、折叠的纤维材料的形式，或以筛子或丝网的形式提供。
22.权利要求2的方法，其中所述生物量纤维是挤出或共挤出的。
23.权利要求2的方法，其中所述纤维具有纳米尺度的平均颗粒大小。
24.上述权利要求中任一项的方法，其中转变包括将所述低分子量糖和生物量引入液体介质中，并且所述方法进一步包括在将所述纤维或材料引入所述介质之前，用微生物和/或酶预处理所述纤维或包含所述纤维的纤维材料。
25.混合物，其包括：
具有极性官能团的生物量材料，
具有互补官能团的微生物和/或酶，和
液体介质。
26.组合物，其包括生物量纤维和固定化在所述生物量纤维上的微生物和/或酶。
27.权利要求26的组合物，其中所述纤维具有官能团，并且所述微生物和/或酶具有互补官能团。
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