BR122017022359B1 - método para fermentar uma mistura de glicose e xilose a etanol - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a biomassa (por exemplo, biomassa de planta, biomassa animal e biomassa de resíduos municipais) é processada para uso na produção de produtos úteis, tais como combustíveis. Por exemplo, sistemas podem usar materiais de biomassa, tais como materiais celulósicos e/ou lignocelulósicos, para intensificar a produção de um produto, por exemplo, a produção de etanol e/ou butanol por meio de fermentação.

Description

MÉTODO PARA FERMENTAR UMA MISTURA DE GLICOSE E XILOSE A ETANOL

[001] Dividido do PI1010672-3, depositado em 18.05.2010.

PEDIDOS RELACIONADOS

[002] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório U.S. No. de Série 12/417.840, depositado em 4 de Abril de 2009, Pedido Provisório U.S. No. de Série 61/180.032, depositado em 20 de Maio de 2009 e Pedido Provisório U.S. No. de Série 61/252.293, depositado em 16 de Outubro de 2009. A divulgação completa de cada um desses pedidos provisórios é aqui incorporada por referência.

ANTECEDENTES

[003] Materiais celulósicos e lignocelulósicos são produzidos, processados e usados em grandes quantidades em uma série de aplicações. Frequentemente, tais materiais são usados uma vez e, então, descartados como resíduo ou são simplesmente considerados como sendo materiais residuais, por exemplo, águas servidas, bagaço, pó de serragem e palha.

[004] Vários materiais celulósicos e lignocelulósicos, seus usos e aplicações foram descritos nas Patentes U.S. Nos. 7.074.918, 6.448.307, 6.258.876, 6.207.729, 5.973.035 e 5.952.105; e em vários pedidos de patente, incluindo "FIBROUS MATERIALS AND COMPOSITES," PCT/US2006/010648, depositado em 23 de Março de 2006 e "FIBROUS MATERIALS AND COMPOSITES", Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2007/0045456.

SUMÁRIO

[005] Em alguns casos, a presença de biomassa em um processo, por exemplo, fermentação, facilita a conversão de um açúcar de baixo peso molecular a um intermediário ou um produto. Os inventores descobriram que inclusão de biomassa em uma mistura com um açúcar de baixo peso molecular, um meio, por exemplo, um solvente ou sistema de solvente e um micro-organismo podem melhorar o rendimento e taxa de produção de um intermediário ou um produto obtido por meio de conversão do açúcar, por exemplo, um álcool, tal como etanol ou butanol. Inclusão da biomassa pode também impedir conversão de produto incompleta, lenta ou "comprometida", por exemplo, por meio de fermentação.

[006] A biomassa pode, em si, não ser convertida ao produto (tal como um álcool) ou pode ser parcial ou totalmente convertida ao produto junto com o açúcar de baixo peso molecular.

[007] Em casos onde a biomassa é parcialmente convertida, a área de superfície e porosidade da biomassa são aumentadas em relação à área de superfície e porosidade da biomassa inicial o que pode, vantajosamente, aumentar a taxa de conversão do açúcar de baixo peso molecular ao produto.

[008] Em alguns casos, a biomassa pode ser os restos de um material celulósico ou lignocelulósico que tenha sido sacarificado, por exemplo, lignina e/ou outros materiais que sobram após celulose ter sido convertida em açúcar.

[009] Em um aspecto, a invenção se caracteriza por um método que inclui utilização de um micro-organismo e/ou enzima que é imobilizada sobre um material de biomassa, por exemplo, fibras de biomassa funcionalizada, para converter um carboidrato, por exemplo, um açúcar de baixo peso molecular, a um produto. Por "imobilizado" entendase que o micro-organismo e/ou enzima é ligada, direta ou indiretamente (por exemplo, através de um ligante químico) às fibras por meio de ligação covalente, de hidrogênio, iônica e/ou equivalente e/ou através de interação mecânica, por exemplo, entre o micro-organismo e poros do material de biomassa, por exemplo, fibras. Ligação pode ser criada, por exemplo, através de polarização elétrica do material de biomassa. A interação pode ser permanente, semi-permanente ou transitória. Interação mecânica pode incluir o micro-organismo ou enzima estando em ou se fixando aos poros ou outros locais do material de biomassa.

[0010] Algumas implementações incluem uma ou mais das seguintes características.

[0011] Conversão pode incluir permitir que o micro-organismo converta pelo menos uma parte do açúcar de baixo peso molecular a um álcool, por exemplo, etanol ou butanol ou a um hidrocarboneto ou hidrogênio. Conversão pode incluir fermentação. O micro-organismo pode compreender uma levedura, por exemplo, S. cerevisiae e/ou P. stipitis ou uma bactéria, por exemplo, Zymomonas mobilis. O método pode ainda incluir irradiação das fibras de biomassa, por exemplo, com radiação ionizante, por exemplo, usando um feixe de partículas. As fibras de biomassa podem ter uma área de superfície BET de mais de 0,25 m2 /g e/ou uma porosidade de pelo menos 70%. As fibras de biomassa podem ser derivadas de um material de biomassa que tem fibras internas e que tenha sido cisalhado até um ponto em que suas fibras internas sejam substancialmente expostas.

[0012] Em outro aspecto, a invenção se caracteriza por uma mistura que inclui um material de biomassa tendo grupos funcionais polares, um micro-organismo tendo grupos funcionais atrativos e um meio líquido.

[0013] Em um outro aspecto, a invenção se caracteriza por uma composição compreendendo fibras de biomassa tendo grupos funcionais e um micro-organismo tendo grupos funcionais atrativos complementares, o micro-organismo sendo imobilizado sobre as fibras de biomassa.

[0014] A invenção também se caracteriza por um método que inclui conversão de um açúcar de baixo peso molecular ou um material que inclui um açúcar de baixo peso molecular, em uma mistura com uma biomassa, um micro-organismo e um solvente ou um sistema de solvente, por exemplo, água ou uma mistura de água e um solvente orgânico, a um produto. Exemplos de solventes ou sistemas de solvente incluem água, hexano, hexadecano, glicerol, clorofórmio, tolueno, acetato de etila, éter de petróleo, gás de petróleo liquefeito (Liquefied Petroleum Gas - LPG), líquidos iônicos e misturas dos mesmos. O solvente ou sistema de solvente pode estar na forma de uma única fase ou duas ou mais fases. A biomassa pode estar, por exemplo, na forma fibrosa.

[0015] Em alguns casos, ter um material de biomassa (por exemplo, tratado através de qualquer método descrito aqui ou não tratado) presente durante produção de um produto, pode intensificar a taxa de produção do produto. Sem desejar estar preso por qualquer teoria em particular, acredita-se que ter um sólido presente, tal como um sólido com alta área de superfície e/ou alta porosidade, pode aumentar as taxas de reação mediante aumento da concentração efetiva de solutos e constituindo um substrato sobre o qual as reações podem ocorrer.

[0016] Em algumas modalidades, um material de biomassa que tenha sido irradiado, oxidado, quimicamente tratado, mecanicamente tratado, submetido a ultra-som, explosão de vapor e/ou pirólise, pode ser adicionado a um processo de fermentação de açúcar de baixo peso molecular, por exemplo, para intensificar a taxa e produção de fermentação.

[0017] Por exemplo, um material de biomassa irradiado ou não irradiado, por exemplo, uma fibra de papel, pode ser adicionado a um processo de fermentação, tal como durante uma fermentação de milho-etanol ou uma fermentação de extrato de cana-de-açúcar, para aumentar a taxa de produção em pelo menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100 por cento ou mais, por exemplo, pelo menos 150 por cento ou mesmo até 1000 por cento. Conversão, por exemplo, fermentação, pode exibir um desempenho percentual, conforme definido nos Exemplos aqui, de pelo menos 140%, em alguns casos pelo menos 170%.

[0018] O material de biomassa pode ter uma alta área de superfície, alta porosidade e/ou baixa densidade volumétrica. Em algumas modalidades, a biomassa está presente na mistura de cerca de 0,5 por cento a cerca de 50 por cento em peso, tal como entre cerca de 1 por cento e cerca de 25 por cento em peso ou entre cerca de 2 por cento e cerca de 12,5 por cento em peso. Em outras modalidades, a biomassa está presente em quantidades maiores do que cerca de 0,5 por cento em peso, tal como mais de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mesmo mais de cerca de 10 por cento em peso.

[0019] Em virtude do fato de o material de biomassa em si não ser consumido durante o processo de conversão, o material de biomassa pode ser reutilizado em múltiplos processos em batelada ou podem ser usados continuamente para a produção de um volume relativamente grande do produto.

[0020] Algumas implementações incluem uma ou mais das seguintes características.

[0021] O método pode incluir irradiação da biomassa fibrosa antes de mistura, por exemplo, com radiação ionizante, por exemplo, em uma dosagem total de pelo menos 5 Mrad. Irradiação pode ser realizada usando um feixe de partículas. Irradiação pode ser conduzida sob condições selecionadas para reduzir o peso molecular da biomassa. Irradiação pode ser realizada usando múltiplas aplicações de radiação. A radiação ionizante pode incluir radiação de feixe de elétrons. Por exemplo, a radiação pode ser aplicada em uma dose total de entre cerca de 10 Mrad e cerca de 150 Mrad, tal como em uma taxa de dose de cerca de 0,5 a cerca de 10 Mrad/dia ou 1 Mrad/s a cerca de 10 Mrad/s. Em algumas modalidades, irradiação inclui aplicação de duas ou mais fontes de radiação, tais como raios gama e um feixe de elétrons.

[0022] Em algumas modalidades, irradiação é realizada sobre o estoque de alimentação de biomassa enquanto o estoque de alimentação de biomassa está exposto ao ar, nitrogênio, oxigênio, hélio ou argônio. Em algumas modalidades, pré-tratamento pode incluir prétratamento do estoque de alimentação de biomassa com explosão de vapor.

[0023] Em algumas modalidades, o método inclui tratamento mecânico da biomassa, por exemplo, mediante redução de uma ou mais dimensões de partes individuais da biomassa, por exemplo, por meio de cisalhamento, usando uma pedra de esmeril, corte ou dilaceramento mecânico, trituração por pino, trituração a úmido ou a seco, moagem por atrito com ar, corte, aperto, compressão ou combinações de qualquer um desses processos. Em alguns casos, após tratamento mecânico, a biomassa inclui fibras tendo uma proporção média de comprimento-para-diâmetro de mais de 5/1. Em algumas modalidades, a biomassa preparada pode ter uma área de superfície BET de mais de 0,25 m2 /g. A biomassa mecanicamente tratada pode ter uma densidade volumétrica de menos de cerca de 0,5 g/cm3 , por exemplo, menos de 0,35 g/cm3 .

[0024] Em qualquer um dos métodos divulgados aqui, radiação pode ser aplicada a partir de um dispositivo que está em uma abóbada.

[0025] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por aqueles versados no campo ao qual a presente invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outra referências mencionadas aqui ou em anexo ao mesmo, são incorporados por referência na íntegra por tudo que eles contêm. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não se destinam a ser limitativos.

[0026] Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir e das reivindicações.

DESCRIÇÃO DE DESENHOS

[0027] A FIG. 1 é um diagrama de bloco ilustrando o tratamento de biomassa e o uso da biomassa tratada em um processo de fermentação.

[0028] A FIG. 2 é uma representação esquemática de biomassa funcionalizada que interage com um micro-organismo.

[0029] A FIG. 3 é um espectro por infravermelho de papel Kraft cisalhado sobre um cortador de faca giratória.

[0030] A FIG. 4 é um espectro por infravermelho do papel Kraft da FIG. 3 após irradiação com 100 Mrad de gama radiação.

[0031] As FIGS. 5A-5I são espectros por 1H-RMN de amostras P132, P132-10, P132-100, P-1e, P-5e, P-10e, P-30e, P-70e e P-100e no Exemplo 13. A FIG. 5J é uma comparação do próton permutável a ~16 ppm das FIGS. 5A-5I. A FIG. 5K é um 13C-RMN da amostra P100e. As FIGS. 5L-5M são 13C-RMN da amostra P-100e com um tempo de retardo de 10 segundos. A FIG. 5N é um 1H-RMN em uma concentração de 10% em peso/peso da amostra P-100e.

[0032] A Figura 6 é um gráfico da concentração de glicose (g/L) por tempo (hora) dos 4 melhores produtores.

[0033] A Figura 7A é um gráfico das concentrações de células (x 108 células por mL) para Z. mobilis em 24 ou 36 horas.

[0034] A Figura 7B é um gráfico das concentrações de etanol (g/L) para Z. mobilis em 24, 30 ou 36 horas.

[0035] A Figura 7C é um gráfico do crescimento percentual e produção de etanol para Z. mobilis.

[0036] A Figura 8A é um gráfico das concentrações de células (x 108 células por mL) para P. stipitis em 24 ou 48 horas.

[0037] A Figura 8B é um gráfico das concentrações de etanol (g/L) para P. stipitis em 24, 36 ou 48 horas.

[0038] A Figura 9C é um gráfico do crescimento percentual e produção de etanol para P. stipitis.

[0039] A Figura 9A é um gráfico das concentrações de células (x 108 células por mL) para S. cerevisiae em 24 ou 36 horas.

[0040] A Figura 9B é um gráfico das concentrações de etanol (g/L) para S. cerevisiae em 24, 30 ou 36 horas.

[0041] A Figura 9C é um gráfico do crescimento percentual e produção de etanol para S. cerevisiae.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0042] Materiais de biomassa funcionalizados tendo tipos e quantidades desejadas de funcionalidade, tais como grupos ácido carboxílico, grupos enol, grupos aldeído, grupos cetona, grupos nitrilo, grupos nitro ou grupos nitroso, podem ser preparados usando os métodos descritos aqui. Tais materiais funcionalizados podem facilitar a conversão de açúcar de baixo peso molecular a um produto, por exemplo, durante um processo de fermentação.

TIPOS DE BIOMASSA

[0043] Materiais de biomassa preferidos para uso no processo descrito aqui contêm fibras as quais podem ser funcionalizadas com grupos funcionais que são complementares com grupos funcionais sobre um agente a ser usado em conversão do açúcar, por exemplo, um micro-organismo, tal como levedura.

[0044] Fontes de fibra incluem fontes de fibra celulósica, incluindo papel e produtos de papel (por exemplo, papel poli-revestido e papel Kraft) e fontes de fibra lignocelulósicas, incluindo madeira e materiais relacionados à madeira, por exemplo, papelão em partícula. Outras fontes de fibra adequadas incluem fontes de fibra natural, por exemplo, gramíneas, casca de arroz, bagaço, algodão, juta, cânhamo, linho, bambu, sisal, abacá, palha, sabugos de milho, cascas de arroz, pêlo de coco; fontes de fibra com alto teor de α-celulose, por exemplo, algodão; e fontes de fibra sintética, por exemplo, fio extrudado (fio orientado ou fio não orientado). Fontes de fibra natural ou sintética podem ser obtidas de recortes de materiais têxteis virgens, por exemplo, materiais têxteis remanescentes ou eles podem ser um resíduo pósconsumidor, por exemplo, trapos. Quando os produtos de papel são usados como fonte de fibra, eles podem ser matérias virgens, por exemplo, recortes de materiais virgens ou eles podem ser um resíduo pós-consumidor. Além de matérias primas virgens, resíduo pósconsumidor, industrial (por exemplo, refugo) e de processamento (por exemplo, efluente de processamento de papel) pode também ser usado como fontes de fibra. Também, a fonte de fibra pode ser obtida ou derivada de resíduos de um ser humano (por exemplo, esgoto), animal ou planta. Fontes de fibra adicionais foram descritas nas Patentes U.S. Nos. 6.448.307, 6.258.876, 6.207.729, 5.973.035 e 5.952.105.

[0045] Em algumas modalidades, o material de biomassa inclui um carboidrato que é ou inclui um material tendo uma ou mais β-1,4- ligações e tendo um peso molecular numérico médio entre cerca de 3.000 e 50.000. Tal carboidrato é ou inclui celulose (I), a qual é derivada de (β-glicose 1) através de condensação de ligações β(1 → 4)- glicosídicas. Essa ligação contrasta, em si, com aquela para ligações α(1 → 4)-glicosídicas presentes em amido e outros carboidratos.

[0046] Materiais de amido incluem amido em si, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido ou amido de arroz, um derivado de amido, ou um material que inclui amido, tal como um produto alimentício comestível ou uma safra. Por exemplo, o material de amido pode ser arracacha, trigo silvestre, banana, cevada, cassava, kudzu, oca, sagu, sorgo, batatas domésticas regulares, batata doce, taro, inhame ou um ou mais feijões, tais como favas, lentilhas ou ervilhas. Misturas de quaisquer dois ou mais materiais de amido também são materiais de amido.

[0047] Em alguns casos, a biomassa é um material microbiano. Fontes microbianas incluem, mas não estão limitadas a, qualquer micro-organismo ou organismo que ocorre naturalmente ou geneticamente modificado que contém ou é capaz de proporcionar uma fonte de carboidratos (por exemplo, celulose), por exemplo, animais protistas (por exemplo, protozoários, tais como flagelados, amebóides, ciliados e esporozoários) e plantas protistas (por exemplo, algas tais como alveolados, cloraracniófitos, criptófitos, euglenóides, glaucófitos, haptófitos, algas vermelhas, estramenópilos e viridaeplantae). Outros exemplos incluem algas marinhas, plâncton (por exemplo, macroplâncton, mesoplâncton, microplâncton, nanoplâncton, picoplâncton e femptoplâncton), fitoplâncton, bactérias (por exemplo, bactérias gram positivas, bactérias gram negativas e extremófilos), leveduras e/ou misturas dos mesmos. Em alguns casos, a biomassa microbiana pode ser obtida de fontes naturais, por exemplo, oceanos, lagos, corpos de água, por exemplo, água salgada ou água doce ou em terra. Alternativamente ou alem disso, a biomassa microbiana pode ser obtida de sistemas de cultura, por exemplo, sistemas de cultura em larga escala a seco e a úmido.

[0048] Misturas de quaisquer materiais de biomassa descritos aqui podem ser utilizadas para produção de qualquer um dos intermediários ou produtos descritos aqui. Por exemplo, misturas de materiais celulósicos e materiais de amido podem ser utilizadas para a produção de qualquer produto descrito aqui.

SISTEMAS PARA TRATAMENTO DE BIOMASSA E USO DA BIOMASSA TRATADA EM FERMENTAÇÃO

[0049] A figura1 mostra um sistema 100 para conversão de biomassa, particularmente biomassa fibrosa e, então, uso da biomassa tratada para intensificar um processo de fermentação. O sistema 100 inclui um módulo 102 no qual um estoque de alimentação de biomassa é mecanicamente tratado, por exemplo, expondo as fibras internas do estoque de alimentação. Exemplos de tratamentos mecânicos serão descritos em detalhes abaixo. O sistema 100 também inclui um módulo 104 no qual o estoque de alimentação mecanicamente tratado é funcionalizado, por exemplo, por meio de irradiação. Após funcionalização, as fibras funcionalizadas são distribuídas a um sistema de fermentação 106 através de um módulo de distribuição 108.

[0050] As fibras funcionalizadas estão, então, presentes durante fermentação e intensificam o processo de fermentação ao proporcionar um substrato que pode interagir com os micro-organismos usados em fermentação, por exemplo, células de levedura. Essa interação é mostrada esquematicamente na figura 2, a qual representa uma fibra polar 10 funcionalizada e uma célula de levedura 12 tendo um grupo funcional polar complementar. Em virtude da polaridade das fibras e da célula de levedura, a célula pode se tornar imobilizada sobre uma ou mais das fibras. Ligação da célula de levedura (ou outro microorganismo) às fibras pode ser através de ligação de hidrogênio ou através de ligação covalente ou iônica. Em alguns casos, os grupos funcionais sobre as fibras podem reagir com aqueles sobre o microorganismo, formando uma ligação covalente. A área de superfície e porosidade aumentadas do material de biomassa que resulta de tratamento mecânico (por exemplo, no módulo 102) constitui uma maior área de superfície para interação da fibra e micro-organismo e, assim, intensificam essa interação. As células imobilizadas são mais produtivas, aumentando a eficiência e rendimento do processo de fermentação e impedindo que o processo se torne prematuramente "comprometido".

[0051] Deve ser notado que, se mistura é realizada durante fermentação, a mistura é, de preferência, relativamente suave (baixo cisalhamento) de modo a minimizar a ruptura da interação entre os micro-organismos e fibras. Em algumas modalidades, mistura a jato é usada, conforme descrito nos documentos USSN 61/218.832 e USSN 61/179.995, as divulgações completas dos quais são incorporadas aqui por referência.

[0052] Fazendo referência novamente à figura 1, fermentação produz uma mistura de etanol bruta, a qual flui para um tanque de contenção 110. Água ou outro solvente e outros componentes não etanólicos são extraídos da mistura de etanol bruta usando uma coluna de extração 112 e o etanol é, então, destilado usando uma unidade de destilação 114, por exemplo, um retificador. Finalmente, o etanol pode ser seco usando uma peneira molecular 116, desnaturada se necessário e enviado a um método de transporte desejado.

[0053] Em alguns casos, os sistemas descritos aqui ou componentes dos mesmos podem ser portáteis, de modo que o sistema pode ser transportado (por exemplo, por trem, caminhão ou navio) de um local para o outro. As etapas de método descritas aqui podem ser realizadas em um ou mais locais e, em alguns casos, uma ou mais das etapas podem ser realizadas em trânsito. Tal processamento móvel é descrito no documento U.S. No. de Série 12/374.549 e Pedido Internacional No. WO 2008/011598, as divulgações completas dos quais são incorporadas aqui por referência.

[0054] Qualquer uma ou todas as etapas do método descrito aqui podem ser realizadas em temperatura ambiente. Se desejado, resfriamento e/ou aquecimento pode ser empregado durante determinadas etapas. Por exemplo, o estoque de alimentação pode ser esfriado durante tratamento mecânico para aumentar sua fragilidade. Em algumas modalidades, resfriamento é empregado antes, durante ou após o tratamento mecânico inicial e/ou subsequente tratamento mecânico. Resfriamento pode ser realizado conforme descrito no documento U.S. No. de Série 12/502.629, a divulgação completa do qual é incorporada aqui por referência. Além disso, a temperatura no sistema de fermentação 106 pode ser controlada para intensificar a fermentação.

TRATAMENTO FÍSICO

[0055] Processos de tratamento físico que podem ser usados para alterar a morfologia do material de biomassa e/ou funcionalizar o material podem incluir um ou mais de qualquer um daqueles descritos aqui, tais como tratamento mecânico, tratamento químico, irradiação, ultrasom, oxidação, pirólise ou explosão de vapor. Métodos de tratamento podem ser usados em combinações de dois, três, quatro ou mesmo todas essas tecnologias (em qualquer ordem). Quando mais de um método de tratamento é usado, os métodos podem ser aplicados ao mesmo tempo ou em momentos diferentes. Outros processos que funcionalizam um estoque de alimentação de biomassa e/ou alteram sua morfologia também podem ser usados, isoladamente ou em combinação com os processos divulgados aqui.

TRATAMENTOS MECÂNICOS

[0056] Em alguns casos, métodos podem incluir tratamento mecânico do estoque de alimentação de biomassa. Tratamentos mecânicos incluem, por exemplo, corte, moagem, compressão, trituração, cisalhamento e picar. Moagem pode incluir, por exemplo, moagem a esferas, moagem a martelo, moagem a seco ou úmido com um rotor/estator ou outros tipos de moagem. Outros tratamentos mecânicos incluem, por exemplo, trituração em pedra de esmeril, fratura, corte ou dilaceramento mecânico, trituração a pino ou moagem por atrito com o ar.

[0057] Tratamento mecânico pode ser vantajoso para "abertura", "tensionamento", ruptura e dispersão dos materiais celulósicos ou lignocelulósicos, tornando a celulose dos materiais mais suscetível à cisão de cadeia e/ou redução de cristalinidade. Os materiais abertos podem também ser mais suscetíveis à oxidação quando irradiados.

[0058] Em alguns casos, o tratamento mecânico pode incluir um preparo inicial do estoque de alimentação conforme recebido, por exemplo, redução de tamanho dos materiais, tal como através de corte, trituração, cisalhamento, pulverização ou picando. Por exemplo, em alguns casos, estoque de alimentação frouxo (por exemplo, papel reciclado, materiais de amido ou switchgrass) é preparado através de cisalhamento ou picando.

[0059] Alternativamente ou além disso, o material de estoque de alimentação pode primeiro ser fisicamente tratado através de um ou mais dos outros métodos de tratamento físico, por exemplo, tratamento químico, radiação, ultra-som, oxidação, pirólise ou explosão de vapor e, então, mecanicamente tratado. Essa sequência pode ser vantajosa, uma vez que materiais tratados por um ou mais dos outros tratamentos, por exemplo, irradiação ou pirólise, tendem a ser mais frágeis e, portanto, pode ser mais fácil alterar adicionalmente a estrutura molecular do material por meio de tratamento mecânico.

[0060] Em algumas modalidades, o material de biomassa é fibroso e tratamento mecânico inclui cisalhamento para expor as fibras do material fibroso. Cisalhamento pode ser realizado, por exemplo, usando um cortador de faca giratória. Outros métodos de tratamento mecânico da biomassa incluem, por exemplo, moagem ou trituração. Moagem pode ser realizada usando, por exemplo, um moinho a martelo, moinho de esferas, moinho coloidal, moinho de cone ou cônico, moinho a disco, moinho de cunha, moinho de Wiley ou moinho de grão. Trituração pode ser realizada usando, por exemplo, um triturador com pedra de esmeril, triturador a pino, triturador de café ou triturador de borra. Trituração pode ser conferida, por exemplo, por um pino de movimento recíproco ou outro elemento, conforme é o caso em um moinho de pino. Outros métodos de tratamento mecânico incluem corte ou dilaceramento mecânico, outros métodos que aplicam pressão ao material e moagem por atrito com o ar. Tratamentos mecânicos adequados incluem ainda qualquer outra técnica que altera a estrutura molecular ou morfologia do material de biomassa.

[0061] Se desejado, o material mecanicamente tratado pode ser passado através de uma peneira, por exemplo, tendo um tamanho médio de abertura de 1,59 mm ou menos (1/16 polegadas, 0,0625 polegadas). Em algumas modalidades, cisalhamento ou outro tratamento mecânico e peneiramento são realizados concorrentemente. Por exemplo, um cortador de faca giratória pode ser usado para cortar e peneiras concorrentemente o material de biomassa. A biomassa é cisalhada entre pás estacionárias e pás giratórias para proporcionar um material cisalhado que passa através de uma peneira e é capturado em um recipiente.

[0062] O material de biomassa pode ser mecanicamente tratado em um estado seco (por exemplo, tendo pouca ou nenhuma água livre sobre sua superfície), um estado hidratado (por exemplo, tendo até dez por cento em peso de água absorvida) ou em um estado úmido, por exemplo, tendo entre cerca de 10 por cento e cerca de 75 por cento em peso de água. O material de biomassa pode mesmo ser mecanicamente tratado enquanto parcial ou totalmente submerso sob um líquido, tal como água, etanol ou isopropanol. O material de biomassa também pode ser mecanicamente tratado sob um gás (tal como uma corrente ou atmosfera de outro gás que não ar), por exemplo, oxigênio ou nitrogênio ou vapor.

[0063] Sistemas de tratamento mecânico podem ser configurados para produzir correntes com características morfológicas específicas tais como, por exemplo, área de superfície, porosidade, densidade volumétrica e, no caso de estoques de alimentação fibrosos, características de fibra, tal como proporção de comprimento-para-largura.

[0064] Em algumas modalidades, uma área de superfície BET do material mecanicamente tratado é maior do que 0,1 m2 /g, por exemplo, maior do que 0,25 m2 /g, maior do que 0,5 m2 /g, maior do que 1,0 m2 /g, maior do que 1,5 m2 /g, maior do que 1,75 m2 /g, maior do que 5,0 m2 /g, maior do que 10 m2 /g, maior do que 25 m2 /g, maior do que 35 m2 /g, maior do que 50 m2 /g, maior do que 60 m2 /g, maior do que 75 m2 /g, maior do que 100 m2 /g, maior do que 150 m2 /g, maior do que 200 m2 /g ou mesmo maior do que 250 m2 /g.

[0065] Uma porosidade do material mecanicamente tratado pode ser, por exemplo, maior do que 20 por cento, maior do que 25 por cento, maior do que 35 por cento, maior do que 50 por cento, maior do que 60 por cento, maior do que 70 por cento, maior do que 80 por cento, maior do que 85 por cento, maior do que 90 por cento, maior do que 92 por cento, maior do que 94 por cento, maior do que 95 por cento, maior do que 97,5 por cento, maior do que 99 por cento ou mesmo maior do que 99,5 por cento.

[0066] Em algumas modalidades, após tratamento mecânico, o material tem uma densidade volumétrica de menos de 0,25 g/cm3 , por exemplo, 0,20 g/cm3 , 0,15 g/cm3 , 0,10 g/cm3 , 0,05 g/cm3 ou menos, por exemplo, 0,025 g/cm3 . A densidade volumétrica é determinada usando a ASTM D1895B. Resumidamente, o método envolve enchimento de um cilindro de medição de volume conhecido com uma amostra e obtenção de um peso da amostra. A densidade volumétrica é calculada dividindo-se o peso da amostra, em gramas, pelo volume conhecido do cilindro em centímetros cúbicos.

[0067] Se a biomassa é um material fibroso, as fibras do material mecanicamente tratado podem ter uma proporção comprimento-paradiâmetro média relativamente grande (por exemplo, maior do que 20- para-1), mesmo se elas foram cisalhadas mais de uma vez. Além disso, as fibras dos materiais fibrosos descritos aqui podem ter uma distribuição de proporção de comprimento-para-diâmetro e/ou comprimento relativamente limitada.

[0068] Conforme usado aqui, larguras médias de fibra (por exemplo, diâmetros) são aquelas determinadas opticamente através de seleção aleatória de aproximadamente 5.000 fibras. Comprimentos médios de fibra são comprimentos médios ponderados corrigidos. Áreas de superfície BET (Brunauer, Emmet e Teller) são áreas de superfície de múltiplos pontos e porosidades são aquelas determinadas por meio de porosimetria de mercúrio.

[0069] Se a biomassa é um material fibroso, a proporção comprimento-para-diâmetro média das fibras do material mecanicamente tratado pode ser, por exemplo, maior do que 8/1, Por exemplo, maior do que 10/1, maior do que 15/1, maior do que 20/1, maior do que 25/1 ou maior do que 50/1. Um comprimento médio de fibra do material mecanicamente tratado pode estar, por exemplo, entre cerca de 0,5 mm e 2,5 mm, por exemplo, entre cerca de 0,75 mm e 1,0 mm e uma largura média (por exemplo, diâmetro) do segundo material fibroso 14 pode estar, por exemplo, entre cerca de 5 µm e 50 µm, por exemplo, entre cerca de 10 µm e 30 µm.

[0070] Em algumas modalidades, se a biomassa é um material fibroso, o desvio padrão do comprimento da fibra do material mecanicamente tratado pode ser menos de 60 por cento de um comprimento médio de fibra do material mecanicamente tratado, por exemplo, menos de 50 por cento do comprimento médio, menos de 40 por cento do comprimento médio, menos de 25 por cento do comprimento médio, menos de 10 por cento do comprimento médio, menos de 5 por cento do comprimento médio ou mesmo menos de 1 por cento do comprimento médio.

[0071] Em algumas situações, pode ser desejável preparar um material de baixa densidade volumétrica, densificar o material (por exemplo, torná-lo mais fácil e menos caro de transportar para outro local) e, então, reverter o material para um estado de menor densidade volumétrica. Materiais densificados podem ser processados através de qualquer um dos métodos descritos aqui ou qualquer material processado através de qualquer um dos métodos descritos aqui pode ser subsequentemente densificado, por exemplo, conforme divulgado nos documentos U.S. No. de Série 12/429.045 e WO 2008/073186, as divulgações completas dos quais são incorporadas aqui por referência.

TRATAMENTO DE RADIAÇÃO

[0072] Uma ou mais sequências de processamento de irradiação podem ser usadas pra processar a biomassa, por exemplo, para funcionalizar o material. Radiação pode também esterilizar os materiais ou quaisquer meios necessários para bioprocessar o material.

[0073] Em algumas modalidades, a energia depositada em um material que libera um elétron de seu orbital atômico é usada para irradiar os materiais. A radiação pode ser proporcionada por 1 ) partículas pesadamente carregadas, tais como partículas alfa ou prótons, 2) elétrons produzidos, por exemplo, em aceleradores de feixe de elétrons ou beta declínio ou 3) radiação eletromagnética, por exemplo, raios gama, raios x ou raios ultra-violeta. Em uma abordagem, radiação produzida por substancias radioativas pode ser usada para irradiar o estoque de alimentação. Em algumas modalidades, qualquer combinação em qualquer ordem ou concorrentemente (1) a (3) pode ser utilizada. As doses aplicadas dependem do efeito desejado e do estoque de alimentação em particular.

[0074] Em alguns casos, quando cisão de cadeia é desejável e/ou funcionalização de cadeia polimérica é desejável, partículas mais pesadas do que elétrons, tais como prótons, núcleos de hélio, íons de argônio, íons de silício, íons de néon, íons de carbono, íons de fósforo, íons de oxigênio ou íons de nitrogênio podem ser utilizados. Quando cisão de cadeia por abertura de anel é desejada, partículas positivamente carregadas podem ser utilizadas por suas propriedades de ácido de Lewis para cisão de cadeia por abertura de anel intensificada. Por exemplo, quando oxidação máxima é desejada, íons de oxigênio podem ser utilizados e, quando nitração máxima é desejada, íons de nitrogênio podem ser utilizados. O uso de partículas pesadas e partículas positivamente carregadas é descrito no Documento U.S. No. de Série 12/417.699, a divulgação integral do qual é incorporada aqui por referência.

[0075] Em um método, um primeiro material que é ou inclui celulose tendo um primeiro peso molecular numérico médio (MN1) é irradiado, por exemplo, mediante tratamento com radiação ionizante (por exemplo, na forma de radiação gama, radiação por raios x, luz ultravioleta (UV) de 100 nm a 280 nm, um feixe de elétrons ou outras partículas carregadas) para proporcionar um segundo material que inclui celulose tendo um segundo peso molecular numérico médio (MN2) menor do que o primeiro peso molecular numérico médio. O segundo material (ou os primeiro e segundo materiais) pode ser combinado com um micro-organismo (com ou sem tratamento enzimático) que pode utilizar o segundo e/ou o primeiro material ou seus açúcares constituintes ou lignina para produzir um produto ou intermediário, tal como aqueles descritos aqui.

[0076] Uma vez que o segundo material inclui celulose tendo um peso molecular reduzido com relação ao primeiro material e, em alguns casos, uma cristalinidade reduzida também, o segundo material é, em geral, mais dispersível, intumescível e/ou solúvel, por exemplo, em uma solução contendo um micro-organismo e/ou uma enzima. Essas propriedades tornam o segundo material mais fácil de processar e mais suscetível a ataque químico, enzimático e/ou biológico com relação ao primeiro material, o que pode aprimorar grandemente a taxa de produção e/ou nível de produção de um produto desejado, por exemplo, etanol.

[0077] Em algumas modalidades, o segundo peso molecular numérico médio (MN2) é menor do que o primeiro peso molecular numérico médio (MN1) em mais de cerca de 10 por cento , por exemplo, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 por cento , 60 por cento ou ainda mais do que cerca de 75 por cento.

[0078] Em alguns casos, o segundo material tem celulose que tem uma cristalinidade (C2) que é menor do que a cristalinidade (C1) da celulose do primeiro material. Por exemplo, (C2) pode ser menor do que (C1) em mais de cerca de 10 por cento, por exemplo, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou mesmo mais de cerca de 50 por cento.

[0079] Em algumas modalidades, o índice de cristalinidade inicial (antes de irradiação) é de cerca de 40 a cerca de 87,5 por cento, por exemplo, de cerca de 50 a cerca de 75 por cento ou de cerca de 60 a cerca de 70 por cento e o índice de cristalinidade após irradiação é de cerca de 10 a cerca de 50 por cento, por exemplo, de cerca de 15 a cerca de 45 por cento ou de cerca de 20 a cerca de 40 por cento. Contudo, em algumas modalidades, por exemplo, após irradiação extensiva, é possível ter um índice de cristalinidade de menos de 5 por cento. Em algumas modalidades, o material após irradiação é substancialmente amorfo.

[0080] Em algumas modalidades, o peso molecular numérico médio inicial (antes de irradiação) é de cerca de 200.000 a cerca de 3.200.000, por exemplo, de cerca de 250.000 a cerca de 1,000.000 ou de cerca de 250.000 a cerca de 700.000 e o peso molecular numérico médio após irradiação é de cerca de 50.000 a cerca de 200.000, por exemplo, de cerca de 60.000 a cerca de 150.000 ou de cerca de 70.000 a cerca de 125.000. Contudo, em algumas modalidades, por exemplo, após irradiação extensiva, é possível ter um peso molecular numérico médio de menos de cerca de 10.000 ou mesmo menos de cerca de 5.000.

[0081] Em algumas modalidades, o segundo material pode ter um nível de oxidação (O2) que é maior do que o nível de oxidação (O1) do primeiro material. Um maior nível de oxidação do material pode auxiliar em sua dispersibilidade, capacidade de intumescimento e/ou solubilidade, intensificando adicionalmente a suscetibilidade do material a ataque químico, enzimático ou biológico. Em algumas modalidades, para aumentar o nível da oxidação do segundo material com relação ao primeiro material, a irradiação é realizada sob um ambiente de oxidação, por exemplo, sob uma corrente de ar ou oxigênio, produzindo um segundo material que é mais oxidado do que o primeiro material. Por exemplo, esse segundo material pode ter mais grupos hidroxila, grupos aldeído, grupos cetona, grupos éster ou grupos ácido carboxílico, os quais podem aumentar sua hidrofilicidade.

RADIAÇÃO IONIZANTE

[0082] Cada forma de radiação ioniza o material contendo carbono via interações particulares, conforme determinado pela energia da radiação. Partículas pesadamente carregadas ionizam primariamente a matéria via dispersão de Coulomb; além disso, essas interações produzem elétrons energéticos que podem ainda ionizar a matéria. Partículas alfa são idênticas ao núcleo de um átomo de hélio e são produzidas pelo alfa declínio de diversos núcleos radioativos, tais como isótopos de bismuto, polônio, astatina, radônio, frâncio, radio, diversos actinídeos, tais como actínio, tório, urânio, netúnio, cúrio, califórnio, amerício e plutônio.

[0083] Quando partículas são utilizadas, elas podem ser neutras (não carregadas), positivamente carregadas ou negativamente carregadas. Quando carregadas, as partículas carregadas podem trazer uma única carga positiva ou negativa ou múltiplas cargas, por exemplo, uma, duas, três ou mesmo quatro ou mais cargas. Em casos nos quais cisão de cadeia é desejada, partículas positivamente carregadas podem ser desejáveis, em parte, em virtude de sua natureza ácida. Quando partículas são utilizadas, as partículas podem ter a massa de um elétron em repouso ou maior, por exemplo, 500, 1000, 1500 ou 2000 ou mesmo mais vezes a massa de um elétron em repouso. Por exemplo, as partículas podem ter uma massa de cerca de 1 unidade atômica a cerca de 150 unidades atômicas, por exemplo, de cerca de 1 unidade atômica a cerca de 50 unidades atômicas ou de cerca de 1 a cerca de 25, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12 ou 15 amu. Aceleração usada para acelerar as partículas pode ser DC eletrostática, DC eletrodinâmica, RF linear, onda linear ou contínua de indução magnética. Por exemplo, aceleradores do tipo cyclotron estão disponíveis da IBA, Bélgica, tal como o sistema Rhodotron®, enquanto que aceleradores do tipo DC estão disponíveis da RDI, agora IBA Industrial, tal como o Dynamitron®. Íons e aceleradores de íons são discutidos em Introductory Nuclear Physics, Kenneth S. Krane, John Wiley & Sons, Inc. (1988), Krsto Prelec, FIZIKA B 6 (1997) 4, 177–206, Chu, William T., "Overview of Light-Ion Beam Therapy" Columbus-Ohio, ICRU-IAEA Meeting, 18-20 de Março de 2006, Iwata, Y. et al., "Alternating-PhaseFocused IH-DTL for Heavy-Ion Medical Accelerators" Proceedings of EPAC 2006, Edimburgo, Escócia e Leaner, C.M. et al., "Status of the Superconducting ECR Ion Source Venus" Proceedings of EPAC 2000, Viena, Áustria.

[0084] Radiação gama tem a vantagem de uma profundidade de penetração significativa em uma variedade de materiais. Fontes de raios gama incluem núcleos radioativos, tais como isótopos de cobalto, cálcio, tecnécio, cromo, gálio, índio, iodo, ferro, criptônio, samário, selênio, sódio, talho e xenônio.

[0085] Fontes de raios x incluem colisão de feixe de elétrons com alvos metálicos, tais como tungstênio ou molibdênio ou ligas ou fontes de luz compactas, tais como aquelas produzidas comercialmente pela Lyncean.

[0086] Fontes para radiação ultravioleta incluem lâmpadas de deutério ou cádmio.

[0087] Fontes para radiação infravermelha incluem lâmpadas de safira, zinco ou cerâmica com elementos de selenídeo.

[0088] Fontes para micro-ondas incluem fontes RF do tipo Slevin, Klystrons ou fontes de feixe de átomo que empregam gases hidrogênio, oxigênio ou nitrogênio.

[0089] Em algumas modalidades, um feixe de elétrons é usado como a fonte de radiação. Um feixe de elétrons tem a vantagem de altas taxas de dose (por exemplo, 1, 5 ou ainda 10 Mrad por segundo), alto rendimento, menos contenção e menos equipamento de confinamento. Elétrons também podem ser mais eficientes ao causar cisão de cadeia. Além disso, elétrons tendo energias de 4-10 MeV podem ter uma profundidade de penetração de 5 a 30 mm ou mais, tal como 40 mm.

[0090] Feixes de elétrons podem ser gerados, por exemplo, através de geradores eletrostáticos, geradores em cascata, geradores transformadores, aceleradores de baixa energia com um sistema de varredura, aceleradores de baixa energia com um catodo linear, aceleradores lineares e aceleradores pulsados. Elétrons como uma fonte de radiação ionizante podem ser úteis, por exemplo, para pilhas relativamente finas de materiais, por exemplo, de menos de 0,5 polegadas, por exemplo, menos de 0,4 polegadas, 0,3 polegadas, 0,2 polegadas ou menos de 0,1 polegada. Em algumas modalidades, a energia de cada elétron do feixe de elétrons é de cerca de 0,3 MeV a cerca de 2,0 MeV (milhões de volts de elétrons), por exemplo, de cerca de 0,5 MeV a cerca de 1,5 MeV ou de cerca de 0,7 MeV a cerca de 1,25 MeV.

[0091] Dispositivos de irradiação de feixe de elétrons podem ser procurados comercialmente da Ion Beam Applications, Louvain-laNeuve, Bélgica ou da Titan Corporation, San Diego, CA. Energias de elétrons típicas podem ser de 1 MeV, 2 MeV, 4,5 MeV, 7,5 MeV ou 10 MeV. A energia típica do dispositivo de irradiação de feixe de elétrons pode ser 1 kW, 5 kW, 10 kW, 20 kW, 50 kW, 100 kW, 250 kW ou 500 kW. A eficácia de despolimerização da pasta de estoque de alimentação depende da energia de elétrons usada e da dose aplicada, enquanto que o tempo de exposição depende da energia e dose. Doses típicas podem ter valores de 1 kGy, 5 kGy, 10 kGy, 20 kGy, 50 kGy, 100 kGy ou 200 kGy.

FEIXES DE PARTÍCULAS IÔNICAS

[0092] Partículas mais pesadas do que elétrons podem ser utilizadas para irradiar os materiais de biomassa descritos aqui. Por exemplo, prótons, núcleos de hélio, íons de argônio, íons de silício, íons de neon, íons de carbono, íons de fósforo, íons de oxigênio ou íons de nitrogênio podem ser utilizados. Em algumas modalidades, partículas mais pesadas do que elétrons podem induzir a maiores quantidades de cisão de cadeia (com relação à partículas mais leves). Em alguns casos, partículas positivamente carregadas podem induzir a maiores quantidades de cisão de cadeia do que partículas negativamente carregadas em virtude de sua acidez.

[0093] Feixes de partículas mais pesadas podem ser gerados, por exemplo, usando aceleradores lineares ou cyclotrons. Em algumas modalidades, a energia de cada partícula do feixe é de cerca de 1,0 MeV/unidade atômica a cerca de 6.000 MeV/unidade atômica, por exemplo, de cerca de 3 MeV/unidade atômica a cerca de 4.800 MeV/unidade atômica ou de cerca de 10 MeV/unidade atômica a cerca de 1,000 MeV/unidade atômica.

[0094] Em determinadas modalidades, feixes de íons usados para irradiar materiais contendo carbono, por exemplo, materiais de biomassa, podem incluir mais de um tipo diferente de íons. Por exemplo, feixes de íons podem incluir misturas de dois ou mais (por exemplo, três ou quatro ou mais) diferentes tipos de íons. Misturas exemplificativas podem incluir íons de carbono e prótons, íons de carbono e íons de oxigênio, íons de nitrogênio e prótons e íons de ferro e prótons. Mais geralmente, misturas de qualquer um dos íons discutidos acima (ou quaisquer outros íons) podem ser usadas para formar feixes de íons de irradiação. Em particular, misturas de íons relativamente leves e relativamente mais pesados podem ser usadas em um único feixe de íons.

[0095] Em algumas modalidades, feixes de íons para irradiação de materiais incluem íons positivamente carregados. Os íons positivamente carregados podem incluir, por exemplo, íons de hidrogênio positivamente carregados (por exemplo, prótons), íons de gás nobre (por exemplo, hélio, neon, argônio), íons de carbono, íons de nitrogênio, íons de oxigênio, átomos de silício, íons de fósforo e íons de metal, tais como íons de sódio, íons de cálcio e/ou íons de ferro. Sem desejar estar preso por qualquer teoria, acredita-se que tais íons positivamente carregados se comportam quimicamente como porções de ácido de Lewis quando expostos a materiais, iniciando e sustentando reações de cisão de cadeia para abertura de anel catiônico em um ambiente oxidativo.

[0096] Em determinadas modalidades, feixes de íons para irradiação de materiais incluem íons negativamente carregados. Íons negativamente carregados podem incluir, por exemplo, íons de hidrogênio negativamente carregados (por exemplo, íons de hidreto) e íons negativamente carregado de vários núcleos relativamente eletronegativos (por exemplo, íons de oxigênio, íons de nitrogênio, íons de carbono, íons de silício e íons de fósforo). Sem desejar estar preso por qualquer teoria, acredita-se que tais íons negativamente carregados se comportam como porções de base de Lewis quando expostos a materiais, causando reações de cisão de cadeia para abertura de anel aniônico em um ambiente de redução.

[0097] Em algumas modalidades, feixes para irradiação de materiais podem incluir átomos neutros. Por exemplo, qualquer um ou mais de átomos de hidrogênio, átomos de hélio, átomos de carbono, átomos de nitrogênio, átomos de oxigênio, átomos de neon, átomos de silício, átomos de fósforo e átomos de ferro podem ser incluídos em feixes que são usados para irradiação de materiais de biomassa. Em geral, misturas de quaisquer dois ou mais dos tipos de átomos acima (por exemplo, três ou mais, quatro ou mais ou ainda mais) podem estar presentes nos feixes.

[0098] Em determinadas modalidades, feixes de íons usados para irradiar materiais de biomassa incluem íons simplesmente carregados, tais como um ou mais de H+ , H- , He+ , Ne+ , Ar+ , C+ , C- , O+ , O- , N+ , N- , Si+ , Si- , P+ , P- , Na+ , Ca+ e Fe+ . Em algumas modalidades, feixes de íons podem incluir íons multiplamente carregados, tais como um ou mais de C2+ , C 3+, C4+, N3+, N5+, N3-, O2+, O2-, O2 2-, Si2+, Si4+, Si2- e Si4- . Em geral, os feixes de íons podem também incluir íons polinucleares mais complexos que trazem múltiplas cargas positivas ou negativas. Em determinadas modalidades, em virtude da estrutura do íon polinuclear, as cargas positivas ou negativas podem ser eficazmente distribuídas sobre substancialmente toda a estrutura dos íons. Em algumas modalidades, as cargas positivas ou negativas podem estar um pouco localizadas sobre porções da estrutura dos íons.

RADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA

[0099] Em modalidades nas quais a irradiação é realizada com radiação eletromagnética, a radiação eletromagnética pode ter, por exemplo, energia por fótons (em volts de elétrons) de mais do que 102 eV, por exemplo, mais do que 103 , 104 , 105 , 106 ou ainda mais do que 107 eV. Em algumas modalidades, a radiação eletromagnética tem uma energia por fótons de entre 104 e 107 , por exemplo, entre 105 e 106 eV. A radiação eletromagnética pode ter a frequência, por exemplo, maior do que 1016 hz, maior do que 1017 hz, 1018, 1019, 1020 ou ainda maior do que 1021 hz. Em algumas modalidades, a radiação eletromagnética tem uma frequência de entre 1018 e 1022 hz, por exemplo, entre 1019 a 1021 hz.

DISSIPAÇÃO E FUNCIONALIZAÇÃO CONTROLADA DE BIOMASSA

[00100] Após tratamento com radiação ionizante, qualquer um dos materiais ou misturas descritas aqui se tornam ionizadas; isto é, elas incluem radicais em níveis que são detectáveis com um espectrômetro de ressonância com orbital de elétrons. Se a biomassa ionizada permanece na atmosfera, ela será oxidada, tal como até um ponto em que os grupos ácido carboxílico são gerados pela reação com o oxigênio atmosférico. Em alguns casos, com alguns materiais, tal oxidação é desejada porque ela pode auxiliar na decomposição extra do peso molecular da biomassa contendo carboidrato e grupos de oxidação, por exemplo, grupos ácido carboxílico, podem ser úteis para solubilidade e utilização de micro-organismo em alguns casos. Contudo, uma vez que os radicais podem "viver" durante algum tempo após irradiação, por exemplo, mais de 1 dia, 5 dias, 30 dias, 3 meses, 6 meses ou mesmo mais de 1 ano, as propriedades dos materiais podem continuar a mudar com o tempo o que, em alguns casos, pode ser indesejável. Assim, pode ser desejável dissipar o material ionizado.

[00101] Após ionização, qualquer material de biomassa que tenha sido ionizado pode ser dissipado para reduzir o nível de radicais na biomassa ionizada, por exemplo, de modo que os radicais não sejam mais detectáveis com o espectrômetro de ressonância por orbital de elétrons. Por exemplo, os radicais podem ser dissipados mediante aplicação de uma pressão suficiente à biomassa e/ou utilizando um fluido em contato com a biomassa ionizada, tal como um gás ou líquido, que reage com (dissipa) os radicais. Uso de um gás ou líquido para pelo menos auxiliar na dissipação dos radicais pode ser feito para funcionalizar a biomassa ionizada com uma quantidade e tipo desejado de grupos funcionais, tais como grupos ácido carboxílico, grupos enol, grupos aldeído, grupos nitro, grupos nitrilo, grupos amino, grupos alquil amino, grupos alquila, grupos cloroalquila ou grupos clorofluoroalquila.

[00102] Em alguns casos, tal dissipação pode aprimorar a estabilidade de alguns dos materiais de biomassa ionizados. Por exemplo, dissipação pode aprimorar a resistência da biomassa à oxidação. Funcionalização através de dissipação pode também aprimorar a solubilidade de qualquer biomassa descrita aqui, pode aprimorar sua estabilidade térmica e pode aprimorar a utilização do material por vários microorganismos. Por exemplo, os grupos funcionais conferidos ao material de biomassa pela dissipação podem atuar como sítios receptores para fixação por micro-organismos, por exemplo, para intensificar a hidrólise de celulose por vários micro-organismos.

[00103] Em algumas modalidades, a dissipação inclui uma aplicação de pressão à biomassa, tal como por meio de deformação mecânica da biomassa, por exemplo, compressão mecânica direta d biomassa em uma, duas ou três dimensões ou aplicação de pressão a um fluido no qual a biomassa está imersa, por exemplo, compressão isostática. Em tais casos, a deformação do material em si mantém os radicais, os quais estão frequentemente encerrados em domínios cristalinos, em proximidade o bastante para que os radicais possam se recombinar ou reagir com outro grupo. Em alguns casos, a pressão é aplicada junto com a aplicação de calor, tal como uma quantidade suficiente de calor para elevar a temperatura da biomassa para acima de um ponto de fusão ou ponto de amolecimento de um componente da biomassa, tal como lignina, celulose ou hemicelulose. Calor pode aprimorar a mobilidade molecular no material polimérico, o qual pode auxiliar na dissipação dos radicais. Quando pressão é utilizada para dissipar, a pressão pode ser maior do que cerca de 1000 psi, tal como maior do que cerca de 1250 psi, 1450 psi, 3625 psi, 5075 psi, 7250 psi, 10000 psi ou mesmo maior do que 15000 psi.

[00104] Em algumas modalidades, dissipação inclui contato da biomassa com um fluido, tal como um líquido ou gás, por exemplo, um gás capaz de reação com os radicais, tal como acetileno ou uma mistura de acetileno em nitrogênio, etileno, etilenos clorados ou clorofluoroetilenos, propileno ou misturas desses gases. Em outras modalidades particulares, dissipação inclui contato da biomassa com um líquido, por exemplo, um líquido solúvel ou pelo menos capaz de penetrar na biomassa e reação com os radicais, tal como um dieno, tal como 1,5-ciclooctadieno. Em algumas modalidades específicas, a dissipação inclui contato da biomassa com um antioxidante, tal como Vitamina E. Se desejado, o estoque de alimentação de biomassa pode incluir um antioxidante disperso no mesmo e a dissipação pode se originar de contato do antioxidante disperso no estoque de alimentação de biomassa com os radicais.

[00105] Funcionalização pode ser intensificada utilizando íons pesados carregados, tais como qualquer um dos íons mais pesados descritos aqui. Por exemplo, se é desejado intensificar a oxidação, íons de oxigênio carregados podem ser utilizados para a irradiação. Se grupos funcionais nitrogênio são desejados, íons de nitrogênio ou íons que incluem nitrogênio podem ser utilizados. Da mesma forma, se grupos enxofre ou fósforo são desejados, íons de enxofre ou fósforo podem ser usados na irradiação.

DOSES

[00106] Em alguns casos, a irradiação é realizada em uma taxa de dosagem maior do que cerca de 0,25 Mrad por segundo, por exemplo, mais de cerca de 0,5, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0 ou mesmo mais de cerca de 2,5 Mrad por segundo. Em algumas modalidades, a irradiação é realizada em uma taxa de dose de entre 5,0 e 1500,0 quilorads/hora, por exemplo, entre 10,0 e 750,0 quilorads/hora ou entre 50,0 e 350,0 quilorads/horas.

[00107] Em algumas modalidades, a irradiação (com qualquer fonte de radiação ou uma combinação de fontes) é realizada até que o material receba uma dose de pelo menos 0,1 Mrad, pelo menos 0,25, por exemplo, pelo menos 1,0 Mrad, pelo menos 2,5 Mrad, pelo menos 5,0 Mrad, pelo menos 10,0 Mrad, pelo menos 60 Mrad ou pelo menos 100 Mrad. Em algumas modalidades, a irradiação é realizada até que o material receba uma dose de cerca de 1,0 Mrad a cerca de 500 Mrad, de cerca de 0,5 Mrad a cerca de 200 Mrad, de cerca de 1 Mrad a cerca de 100 Mrad ou de cerca de 5 Mrad a cerca de 60 Mrad. Em algumas modalidades, uma dose relativamente baixa de radiação é aplicada, por exemplo, menos de 60 Mrad.

ULTRA-SOM

[00108] Ultra-som pode reduzir o peso molecular e/ou cristalinidade de materiais, tais como um ou mais de qualquer um dos materiais descritos aqui, por exemplo, uma ou mais fontes de carboidrato, tais como materiais celulósicos ou lignocelulósicos ou materiais de amido. Ultrasom pode também ser usado para esterilizar os materiais.

[00109] Em um método, um primeiro material que inclui celulose tendo um primeiro peso molecular numérico médio (MN1) é disperso em um meio, tal como água e submetido a ultra-som e/ou de outro modo cavitado, a fim de proporcionar um segundo material que inclui celulose tendo um segundo peso molecular numérico médio (MN2) menor do que o primeiro peso molecular numérico médio. O segundo material (ou os primeiro e segundo materiais em determinadas modalidades) pode ser combinado com um micro-organismo (com ou sem tratamento enzimático) que pode utilizar o segundo e/ou primeiro material para produzir um produto ou intermediário.

[00110] Uma vez que o segundo material inclui celulose tendo um peso molecular reduzido com relação ao primeiro material e, em alguns casos, uma cristalinidade reduzida também, o segundo material é, em geral, mais dispersível, intumescível e/ou solúvel em uma solução contendo o micro-organismo.

[00111] Em algumas modalidades, o segundo peso molecular numérico médio (MN2) é menor do que o primeiro peso molecular numérico médio (MN1) em mais de cerca de 10 por cento, por exemplo, mais de cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 por cento, 60 por cento ou mesmo mais de cerca de 75 por cento.

[00112] Em alguns casos, o segundo material tem celulose que tem uma cristalinidade (C2) que é menor do que a cristalinidade (C1) da celulose do primeiro material. Por exemplo, (C2) pode ser menor do que (C1) em mais de cerca de 10 por cento, por exemplo, mais de cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou mesmo mais de cerca de 50 por cento.

[00113] Em algumas modalidades, o índice de cristalinidade inicial (antes de ultra-som) é de cerca de 40 a cerca de 87,5 por cento, por exemplo, de cerca de 50 a cerca de 75 por cento ou de cerca de 60 a cerca de 70 por cento e um índice de cristalinidade após ultra-som é de cerca de 10 a cerca de 50 por cento, por exemplo, de cerca de 15 a cerca de 45 por cento ou de cerca de 20 a cerca de 40 por cento. Contudo, em determinadas modalidades, por exemplo, após ultra-som extensivo, é possível ter um índice de cristalinidade de menos de 5 por cento. Em algumas modalidades, o material, após ultra-som, é substancialmente amorfo.

[00114] Em algumas modalidades, o peso molecular numérico médio inicial (antes de ultra-som) é de cerca de 200.000 a cerca de 3.200.000, por exemplo, de cerca de 250.000 a cerca de 1,000.000 ou de cerca de 250.000 a cerca de 700.000 e o peso molecular numérico médio após ultra-som é de cerca de 50.000 a cerca de 200.000, por exemplo, de cerca de 60.000 a cerca de 150.000 ou de cerca de 70.000 a cerca de 125.000, Contudo, em algumas modalidades, por exemplo, após ultra-som extensivo, é possível ter um peso molecular numérico médio de menos de cerca de 10.000 ou mesmo menos de cerca de 5.000.

[00115] Em algumas modalidades, o segundo material pode ter um nível de oxidação (O2) que é maior do que o nível de oxidação (O1) do primeiro material. Um maior nível de oxidação do material pode auxiliar em sua dispersibilidade, capacidade de intumescimento e/ou solubilidade, intensificando adicionalmente a suscetibilidade do material a ataque químico, enzimático ou microbiano. Em algumas modalidades, para aumentar o nível da oxidação do segundo material com relação ao primeiro material, o ultra-som é realizado em um meio de oxidação, produzindo um segundo material que é mais oxidado do que o primeiro material. Por exemplo, o segundo material pode ter mais grupos hidroxila, grupos aldeído, grupos cetona, grupos éster ou grupos ácido carboxílico, o que pode aumentar sua hidrofilicidade.

[00116] Em algumas modalidades, o meio de ultra-som é um meio aquoso. Se desejado, o meio pode incluir um oxidante, tal como um peróxido (por exemplo, peróxido de hidrogênio), um agente dispersante e/ou um tampão. Exemplos de agentes dispersantes incluem agentes dispersantes iônicos, por exemplo, lauril sulfato de sódio e agentes dispersantes não-iônicos, por exemplo, (poli)etileno glicol.

[00117] Em outras modalidades, o meio de ultra-som é não aquoso. Por exemplo, o ultra-som pode ser realizado em um hidrocarboneto, por exemplo, tolueno ou heptano, um éter, por exemplo, dietil éter ou tetrahidrofurano ou mesmo em um gás liquefeito, tal como argônio, xenônio ou nitrogênio.

PIRÓLISE

[00118] Uma ou mais sequências de processamento por pirólise podem ser usadas para tratar fisicamente o material de biomassa. Pirólise pode também ser usada para esterilizar o material.

[00119] Em um exemplo, um primeiro material que inclui celulose tendo um primeiro peso molecular numérico médio (MN1), sofre pirólise, por exemplo, mediante aquecimento do primeiro material em um forno tubular (na presença ou ausência de oxigênio), a fim de proporcionar um segundo material que inclui celulose tendo um segundo peso molecular numérico médio (MN2) menor do que o primeiro peso molecular numérico médio.

[00120] Uma vez que o segundo material inclui celulose tendo um peso molecular reduzido com relação ao primeiro material e, em alguns casos, uma cristalinidade reduzida também, o segundo material é, em geral, mais dispersível, intumescível e/ou solúvel em uma solução contendo um micro-organismo.

[00121] Em algumas modalidades, o segundo peso molecular numérico médio (MN2) é menor do que o primeiro peso molecular numérico médio (MN1) em mais de cerca de 10 por cento, por exemplo, mais de cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 por cento, 60 por cento ou mesmo mais de cerca de 75 por cento.

[00122] Em alguns casos, o segundo material tem celulose que tem uma cristalinidade (C2) que é menor do que a cristalinidade (C1) da celulose do primeiro material. Por exemplo, (C2) pode ser menor do que (C1) em mais de cerca de 10 por cento, por exemplo, mais de cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou mesmo mais de cerca de 50 por cento.

[00123] Em algumas modalidades, a cristalinidade inicial (antes de pirólise) é de cerca de 40 a cerca de 87,5 por cento, por exemplo, de cerca de 50 a cerca de 75 por cento ou de cerca de 60 a cerca de 70 por cento e o índice de cristalinidade, após pirólise, é de cerca de 10 a cerca de 50 por cento, por exemplo, de cerca de 15 a cerca de 45 por cento ou de cerca de 20 a cerca de 40 por cento. Contudo, em determinadas modalidades, por exemplo, após pirólise extensiva, é possível ter um índice de cristalinidade de menos de 5 por cento. Em algumas modalidades, o material, após pirólise, é substancialmente amorfo.

[00124] Em algumas modalidades, o peso molecular numérico médio inicial (antes de pirólise) é de cerca de 200.000 a cerca de 3.200.000, por exemplo, de cerca de 250.000 a cerca de 1,000.000 ou de cerca de 250.000 a cerca de 700.000 e o peso molecular numérico médio, após pirólise, é de cerca de 50.000 a cerca de 200.000, por exemplo, de cerca de 60.000 a cerca de 150.000 ou de cerca de 70.000 a cerca de 125.000, Contudo, em algumas modalidades, por exemplo, após pirólise extensiva, é possível ter um peso molecular numérico médio de menos de cerca de 10.000 ou mesmo menos de cerca de 5.000.

[00125] Em algumas modalidades, o segundo material pode ter um nível de oxidação (O2) que é maior do que o nível de oxidação (O1) do primeiro material. Um maior nível de oxidação do material pode auxiliar em sua dispersibilidade, capacidade de intumescimento e/ou solução, intensificando adicionalmente a suscetibilidade do material a ataque químico, enzimático ou microbiano. Em algumas modalidades, para aumentar o nível de oxidação do segundo material com relação ao primeiro material, a pirólise é realizada em um ambiente de oxidação, produzindo um segundo material que é mais oxidado do que o primeiro material. Por exemplo, o segundo material pode ter mais grupos hidroxila, grupos aldeído, grupos cetona, grupos éster ou grupos ácido carboxílico, do que o primeiro material, desse modo, aumentando a hidrofilicidade do material.

[00126] Em algumas modalidades, a pirólise dos materiais é contínua. Em outras modalidades, o material sofre pirólise durante um tempo predeterminado e, então, é deixado esfriar durante um segundo tempo predeterminado antes de pirólise mais uma vez.

OXIDAÇÃO

[00127] Uma ou mais sequências de processamento oxidativo podem ser usadas para tratar fisicamente o material de biomassa. As condições de oxidação podem ser variadas dependendo, por exemplo, do teor de lignina do estoque de alimentação, com um maior grau de oxidação sendo, em geral, desejado para estoques de alimentação com maior teor de lignina.

[00128] Em um método, um primeiro material que inclui celulose tendo um primeiro peso molecular numérico médio (MN1) e tendo um primeiro teor de oxigênio (O1) é oxidado, por exemplo, através de aquecimento do primeiro material em um forno tubular em uma corrente de ar ou ar enriquecido em oxigênio, a fim de proporcionar um segundo material que inclui celulose tendo um segundo peso molecular numérico médio (MN2) e tendo um segundo teor de oxigênio (O2) maior do que o primeiro teor de oxigênio (O1).

[00129] O segundo peso molecular numérico médico do segundo material é, em geral, menor do que o primeiro peso molecular numérico médio do primeiro material. Por exemplo, o peso molecular pode ser reduzido até o mesmo ponto conforme discutido acima com relação aos outros tratamentos físicos. A cristalinidade do segundo material também pode ser reduzida até o mesmo ponto conforme discutido acima com relação aos outros tratamentos físicos.

[00130] Em algumas modalidades, o segundo teor de oxigênio é pelo menos cerca de cinco por cento maior do que o primeiro teor de oxigênio, por exemplo, 7,5 por cento maior, 10,0 por cento maior, 12,5 por cento maior, 15,0 por cento maior ou 17,5 por cento maior. Em algumas modalidades preferidas, o segundo teor oxigênio é pelo menos cerca de 20,0 por cento maior do que o teor de oxigênio do primeiro material. O teor de oxigênio é medido através de análise elemental através de pirólise da amostra em um forno operando 1300 ºC ou maior. Um equipamento de análise elemental adequado é o analisador LECO CHNS-932 com um forno de pirólise de alta temperatura VTF900.

[00131] Em geral, oxidação do primeiro material ocorre em um ambiente de oxidação. Por exemplo, a oxidação pode ser realizada ou auxiliada por pirólise em um ambiente de oxidação, tal como em ar ou argônio enriquecido em ar. Para auxiliar na oxidação, vários agentes químicos, tais como oxidantes, ácidos ou bases, podem ser adicionados ao material antes de ou durante oxidação. Por exemplo,um peróxido (por exemplo, peróxido de benzoíla), pode ser adicionado antes de oxidação.

[00132] Alguns métodos oxidativos de redução de recalcitrância em um estoque de alimentação de biomassa empregam química do tipo Fenton. Tais métodos são divulgados, por exemplo, no documento U.S. No. de Série 12/639.289, a divulgação completa do qual é incorporada aqui por referência.

[00133] Oxidantes exemplificativos incluem peróxidos, tais como peróxido de hidrogênio e peróxido de benzoíla, perssulfatos, tal como perssulfato de amônio, formas ativadas de oxigênio, tal como ozônio, permanganatos, tal como permanganato de potássio, percloratos, tal como perclorato de sódio e hipocloritos, tal como hipoclorito de sódio (alvejante doméstico).

[00134] Em algumas situações, o pH é mantido em ou abaixo de cerca de 5,5 durante contato, tal como entre 1 e 5, entre 2 e 5, entre 2,5 e 5 ou entre cerca de 3 e 5. Condições de oxidação também podem incluir um período de contato de entre 2 e 12 horas, por exemplo, entre 4 e 10 horas ou entre 5 e 8 horas. Em alguns casos, a temperatura é mantida em ou abaixo de 300 °C, por exemplo, em ou abaixo de 250, 200, 150, 100 ou 50 °C. Em alguns casos, a temperatura permanece substancialmente ambiente, por exemplo, em ou em torno de 20- 25 °C.

[00135] Em algumas modalidades, o um ou mais oxidantes são aplicados como um gás, tal como mediante geração de ozônio in situ por meio de irradiação do material através de ar com um feixe de partículas, tais como elétrons.

[00136] Em algumas modalidades, a mistura ainda inclui uma ou mais hidroquinonas, tal como 2,5-dimetóxihidroquinona (DMHQ) e/ou uma ou mais benzoquinonas, tal como 2,5-dimetóxi-1,4-benzoquinona (DMBQ), as quais podem auxiliar em reações de transferência de elétrons.

[00137] Em algumas modalidades, o um ou mais oxidantes são eletroquimicamente gerados in situ. Por exemplo, peróxido de hidrogênio e/ou ozônio podem ser eletroquimicamente produzidos dentro de um recipiente de reação ou contato.

OUTROS PROCESSOS PARA FUNCIONALIZAR

[00138] Qualquer um dos processos desse parágrafo pode ser usado isoladamente sem qualquer um dos processos descritos aqui ou em combinação com qualquer um dos processos descritos aqui (em qualquer ordem): explosão de vapor, tratamento químico (por exemplo, tratamento com ácido (incluindo tratamento com ácido concentrado e diluído com ácidos minerais, tais como ácido sulfúrico, ácido clorídrico e ácidos orgânicos, tal como ácido trifluoroacético) e/ou tratamento com base (por exemplo, tratamento com cal ou hidróxido de sódio), tratamento por UV, tratamento em extrusora de rosca (vide, por exemplo, Pedido de Patente U.S. No. de Série 61/115.398, depositado em 17 de Novembro de 2008), tratamento com solvente (por exemplo, tratamento com líquidos iônicos) e moagem por congelamento (vide, por exemplo, documento U.S. No. de Série 12/502.629).

FERMENTAÇÃO

[00139] Micro-organismos podem produzir uma série de intermediários e produtos úteis, tais como aqueles descritos aqui, por meio de fermentação de um açúcar de baixo peso molecular na presença dos materiais de biomassa funcionalizados. Por exemplo, fermentação ou outros bioprocessos podem produzir álcoois, ácidos orgânicos, hidrocarbonetos, hidrogênio, proteínas ou misturas de qualquer um desses materiais.

[00140] O micro-organismo pode ser um micro-organismo natural ou um micro-organismo manipulado. Por exemplo, o micro-organismo pode ser uma bactéria, por exemplo, uma bactéria celulolítica, um fungo, por exemplo, um levedo, uma planta ou um protista, por exemplo, uma alga, um protozoário ou um protista semelhante a fungo, por exemplo, um mofo de lama. Quando os organismos são compatíveis, misturas de organismos podem ser utilizadas.

[00141] Micro-organismos de fermentação adequados têm a capacidade de converter carboidratos, tais como glicose, xilose, arabinose, manose, galactose, oligossacarídeos ou polissacarídeos, em produtos de fermentação. Micro-organismos de fermentação incluem cepas dos gêneros Sacchromyces spp., por exemplo, Sacchromyces cerevisiae (levedura de padaria), Saccharomyces distaticus, Saccharomyces uvarum; o gênero Kluyveromyces, por exemplo, espécies Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces fragilis; o gênero Candida, por exemplo, Candida pseudotropicalis e Candida brassicae, Pichia stipitis (um parente de Candida shehatae), o gênero Clavispora, por exemplo, espécies Clavispora lusitaniae e Clavispora opuntiae, o gênero Pachysolen, por exemplo, espécies Pachysolen tannophilus, o gênero Bretannomyces, por exemplo, espécies Bretannomyces clausenii (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose Bioconversion Technology em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C.E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212).

[00142] Leveduras comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, Red Star®/Lesaffre Ethanol Red (disponível da Red Star/Lesaffre, EUA), FALI® (disponível da Fleischmann’s Yeast, uma divisão da Burns Philip Food Inc., EUA); SUPERSTART® (disponível da Alltech, agora Lallemand), GERT STRAND® (disponível da Gert Strand AB, Suécia); e FERMOL® (disponível da DSM Specialties).

[00143] Bactérias podem também ser usadas em fermentação, por exemplo, Zymomonas mobilis e Clostridium thermocellum (Philippidis, 1996, supra).

[00144] O pH ótimo para levedura é um pH de cerca de 4 a 5, enquanto que o pH ótimo para Zymomonas é um pH de cerca de 5 a 6. Tempos típicos de fermentação são cerca de 24 a 96 horas, com temperaturas na faixa de 26°C a 40°C, contudo micro-or ganismos termofílicos preferem maiores temperaturas.

[00145] Em algumas modalidades, todo ou uma parte do processo de fermentação pode ser interrompido antes que o açúcar de baixo peso molecular seja completamente convertido em etanol. Os produtos de fermentação intermediários incluem altas concentrações de açúcar e carboidratos. Esses produtos de fermentação intermediários podem ser usados no preparo de alimentos para consumo humano ou por animais. Adicional ou alternativamente, os produtos de fermentação intermediários podem ser triturados até um tamanho de oc fino em um moedor de laboratório de aço inoxidável para produzir uma substância semelhante à farinha.

[00146] Fermentadores móveis podem ser utilizados, conforme descrito no Pedido de Patente Provisório U.S. No. de Série 60/832.735, agora Pedido Internacional Publicado No. WO 2008/011598.

PÓS-PROCESSAMENTO DESTILAÇÃO

[00147] Após fermentação, os fluidos resultantes podem ser destilados usando, por exemplo, uma "coluna de levedura" para separar o etanol e outros álcoois da maioria da água e sólidos residuais. O vapor que sai da coluna de levedura pode ser, por exemplo, 35% em peso de etanol e pode ser alimentado a uma coluna de retificação. Uma mistura de etanol (92,5%) e água quase azeotrópica da coluna de retificação pode ser purificada ao etanol (99,5%) puro usando peneiras moleculares de fase vapor. As partes inferiores da coluna de levedura pode ser enviada ao primeiro estágio de um evaporador de três estágios. O condensador de refluxo da coluna de retificação pode fornecer calor para esse primeiro estágio. Após o primeiro estágio, sólidos podem ser separados usando uma centrífuga e secos em um secador giratório. Uma porção (25%) do efluente da centrífuga pode ser reciclada para fermentação e o resto enviado para os segundo e terceiros estágios do evaporador. A maioria do condensado do evaporador pode ser retornada para o processo como um condensado razoavelmente limpo, com uma pequena porção da água tratada desviada para impedir o desenvolvimento de compostos de baixo ponto de ebulição.

INTERMEDIÁRIOS E PRODUTOS

[00148] Os processos descritos aqui podem ser usados para produzir um ou mais intermediários ou produtos, tais como energia, combustíveis, alimentos e materiais. Exemplos específicos de produtos incluem, mas não estão limitados a, hidrogênio, álcoois (por exemplo, álcoois monoídricos ou álcoois diídricos, tais como etanol, n-propanol ou nbutanol), álcoois hidratados ou hídricos, por exemplo, contendo mais de 10%, 20%, 30% ou mesmo mais de 40% de água, xilitol, açúcares, biodiesel, ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético e/ou ácido láctico), hidrocarbonetos, co-produtos (por exemplo, proteínas, tais como proteínas celulolíticas (enzimas) ou proteínas com uma única célula) e misturas de qualquer um desses em combinação ou concentração relativa e opcionalmente em combinação com quaisquer aditivos, por exemplo, aditivos combustíveis. Outros exemplos incluem ácidos carboxílicos, tais como ácido acético ou ácido butírico, sais de um ácido carboxílico, uma mistura de ácidos carboxílicos e sais de ácidos carboxílicos e ésteres de ácidos carboxílicos (por exemplo, metil, etil e npropil ésteres), cetonas (por exemplo, acetona), aldeídos (por exemplo, acetaldeído), ácidos alfa, beta insaturados, tal como ácido acrílico e olefinas, tal como etileno. Outros álcoois e derivados de álcool incluem propanol, propileno glicol, 1,4-butanodiol, 1,3-propanodiol, metil ou etil ésteres de qualquer um desses álcoois. Outros produtos incluem metil acrilato, metil metacrilato, ácido láctico, ácido propiônico, ácido butírico, ácido succínico, ácido 3-hidróxipropiônico, um sal de qualquer um dos ácidos e uma mistura de qualquer um dos ácidos e respectivos sais.

[00149] Outros intermediários e produtos, incluindo alimentos e produtos farmacêuticos, são descritos no documento U.S. No. de Série 12/417.900, a divulgação completa do qual é aqui incorporada por referência.

EXEMPLOS

[00150] Os Exemplos a seguir destinam-se a ilustrar e não limitar os ensinamentos da presente divulgação.

EXEMPLO 1 – PREPARO DE MATERIAL FIBROSO A PARTIR DE PAPEL POLI-REVESTIDO

[00151] Uma carga de 680,39 kilogramas (1500 libras) de embalagens virgens de suco de meio galão feitas de papelão Kraft branco poli-revestido não impresso tendo uma densidade volumétrica de 320,37 kg/m3 (20 libra/pé3 ) foi obtida da International Paper. Cada embalagem foi dobrada e, então, alimentada a um picador Flinch Baugh de 3 hp em uma taxa de aproximadamente 6,80 a 9,07 kilogramas por horas (15 a 20 libras por hora). O picador era equipado com duas pás giratórias de 30,48 centímetros (12 polegadas), duas pás fixas e uma peneira de descarga de 0,762 centímetro (0,30 polegadas). O vão entre as pás giratórias e fixas foi ajustado para 0,254 centímetro (0,10 polegadas). O produto do picador se assemelhava a confete tendo uma largura de entre 0,254 centímetro (0,1 polegada) e 1,27 centímetro (0,5 polegada), um comprimento de entre 0,635 centímetro (0,25 polegada) e 2,54 centímetros (1 polegada) e uma espessura equivalente àquela do material de iniciação (cerca de 0,19 centímetro (0,075 polegada)).

[00152] O material semelhante a confete foi alimentado a um cortador de faca giratória Munson, Modelo SC30. O Modelo SC30 é equipado com quatro pás giratórias, quatro pás fixas e uma peneira de descarrega tendo aberturas de 1/8 polegadas. O vão entre as pás giratórias e fixas foi configurado para aproximadamente 0,020 polegadas. O cortador de faca giratória cisalhada os pedaços semelhantes a confete através das bordas das facas, dilacerando os pedaços e liberando um material fibroso em uma taxa de cerca de uma libra por hora. O material fibroso tinha uma área de superfície BET de 0,9748 m2 /g +/- 0,0167 m2 /g, uma porosidade de 89,0437 por cento e uma densidade volumétrica (@3,65 kPa manométricos (0,53 psia)) de 0,1260 g/mL. O comprimento médio das fibras era de 1,141 mm e a largura média das fibras era de 0,027 mm, proporcionando uma L/D média de 42:1.

EXEMPLO 2 – PREPARO DE MATERIAL FIBROSO A PARTIR DE PAPEL KRAFT BRANQUEADO

[00153] Uma carga de 680,39 kilogramas (1500 libras) de papel Kraft branco virgem branqueado tendo uma densidade volumétrica de 480,55 kg/m3 (30 libra/pé3 ) foi obtida da International Paper. O material foi dobrado e, então, alimentado a um picador Flinch Baugh de 3 hp em uma taxa de aproximadamente 6,80 a 9,07 kilogramas por horas (15 a 20 libras por hora). O picador era equipado com duas pás giratórias de 30,48 centímetros (12 polegadas), duas pás fixas e uma peneira de descarga de 0,762 centímetro (0,30 polegadas). O vão entre as pás giratórias e fixas foi ajustado para 0,254 centímetro (0,10 polegadas). O produto do picador se assemelhava a confete tendo uma largura de entre 0,254 centímetro (0,1 polegada) e 1,27 centímetro (0,5 polegada), um comprimento de entre 0,635 centímetro (0,25 polegada) e 2,54 centímetros (1 polegada) e uma espessura equivalente àquela do material de iniciação (cerca de 0,19 centímetro (0,075 polegada)). O material semelhante a confete foi alimentado a um cortador de faca giratória Munson, Modelo SC30. A peneira de descarga tinha aberturas de 0,32 centímetro (1/8 polegadas). O vão entre as pás giratórias e fixas foi configurado para aproximadamente 0,05 centímetro (0,020 polegadas). O cortador de faca giratória cisalhada os pedaços semelhantes a confete, liberando um material fibroso em uma taxa de cerca de uma libra por hora. O material fibroso tinha uma área de superfície BET de 1,1316 m2 /g +/- 0,0103 m2 /g, uma porosidade de 88,3285 por cento e uma densidade volumétrica (@,65 kPa manométricos (0,53 psia)) de 0,1497 g/mL. O comprimento médio das fibras era de 1,063 mm e a largura média das fibras era de 0,0245 mm, proporcionando uma L/D média de 43:1.

EXEMPLO 3 – PREPARO DE MATERIAL FIBROSO CISALHADO DUAS VEZES A PARTIR DE PAPEL KRAFT BRANQUEADO

[00154] Uma carga de 680, 39 kilogramas (1500libras) de papel Kraft branco virgem branqueado tendo uma densidade volumétrica de 480,55 kg/m3 (30 libra/pé3 ) foi obtida da International Paper. O material foi dobrado e, então, alimentado a um picador Flinch Baugh de 3 hp em uma taxa de aproximadamente 6,80 a 9,07 kilogramas por horas (15 a 20 libras por hora). O picador era equipado com duas pás giratórias de 30,48 centímetros (12 polegadas), duas pás fixas e uma peneira de descarga de 0,762 centímetro (0,30 polegadas). O vão entre as pás giratórias e fixas foi ajustado para 0,254 centímetro (0,10 polegadas). O produto do picador se assemelhava a confete (as acima). O material semelhante a confete foi alimentado a um cortador de faca giratória Munson, Modelo SC30. A peneira de descarga tinha aberturas de 0,16 centímetro (1/16 polegadas). O vão entre as pás giratórias e fixas foi configurado para aproximadamente 0,05 centímetro (0,020 polegadas). O cortador de faca giratória os pedaços semelhantes a confete, liberando um material fibroso em uma taxa de cerca de uma libra por hora. O material resultante do primeiro cisalhamento foi realimentado na mesma configuração descrita acima e cisalhado mais uma vez. O material resultante fibroso tinha uma área de superfície BET de 1,4408 m2 /g +/- 0,0156 m2 /g, uma porosidade de 90,8998 por cento e uma densidade volumétrica (@ 65 kPa manométricos (0,53 psia)) de 0,1298 g/mL. O comprimento médio das fibras era de 0,891 mm e a largura média das fibras era de 0,026 mm, proporcionando uma L/D média de 34:1.

EXEMPLO 4 – PREPARO DE MATERIAL FIBROSO CISALHADO TRÊS VEZES A PARTIR DE PAPEL KRAFT BRANQUEADO

[00155] Uma carga de 680, 39 kilogramas (1500libras) de papel Kraft branco virgem branqueado tendo uma densidade volumétrica de 480,55 kg/m3 (30 libra/pé3 ) foi obtida da International Paper. O material foi dobrado e, então, alimentado a um picador Flinch Baugh de 3 hp em uma taxa de aproximadamente 6,80 a 9,07 kilogramas por horas (15 a 20 libras por hora). O picador era equipado com duas pás giratórias de 30,48 centímetros (12 polegadas), duas pás fixas e uma peneira de descarga de 0,762 centímetro (0,30 polegadas). O vão entre as pás giratórias e fixas foi ajustado para 0,254 centímetro (0,10 polegadas). O produto do picador se assemelhava a confete (as acima). O material semelhante a confete foi alimentado a um cortador de faca giratória Munson, Modelo SC30. A peneira de descarga tinha aberturas de 0,32 centímetro (1/8 polegadas) O vão entre as pás giratórias e fixas foi configurado para aproximadamente 0,05 centímetro (0,020 polegadas). O cortador de faca giratória cisalhada os pedaços semelhantes a confete através das bordas das facas. O material resultante do primeiro cisalhamento foi re-alimentado na mesma configuração e a peneira foi substituída por uma peneira de 0,16 centímetro (1/16 polegadas). Esse material foi cisalhado. O material resultante do segundo cisalhamento foi re-alimentado na mesma configuração e a peneira foi substituída por uma peneira de 0,08 centímetro (1/32 polegadas). Esse material foi cisalhado. O material resultante fibroso tinha uma área de superfície BET de 1,6897 m2 /g +/- 0,0155 m2 /g, uma porosidade de 87,7163 por cento e uma densidade volumétrica (@0,53 psia) de 0,1448 g/mL. O comprimento médio das fibras era de 0,824 mm e a largura média das fibras era de 0,0262 mm, proporcionando uma L/D média de 32:1.

EXEMPLO 5 - PROCESSAMENTO POR FEIXE DE ELÉTRONS

[00156] As amostras foram tratadas com um feixe de elétrons usando um acelerador de ondas contínuas Rhodotron® TT200 sob uma abóbada que distribui elétrons de 5 MeV a 80 kW de potência de saída. A Tabela 1 descreve os parâmetros usados. A Tabela 2 reporta a dose nominal usada para a ID de amostra (em Mrad) e a dose correspondente distribuída à amostra (em kgy).

1Por exemplo, 9,9 kgy foram distribuídos em 11 segundos em uma corrente de feixe de 5 mA e uma velocidade de linha de 12,9 pé/minuto. O tempo para esfriar entre os tratamentos estava em torno de 2 minutos.

EXEMPLO 6 - MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DO PESO MOLECULAR DE MATERIAIS CELULÓSICOS E LIGNOCELULÓSICOS ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA POR PERMEAÇÃO DE GEL

[00157] Materiais celulósicos e lignocelulósicos para análise foram tratados de acordo com o Exemplo 4. Materiais de amostra apresentados nas tabelas a seguir incluem papel Kraft (P), palha de trigo (WS), alfafa (A), celulose (C), switchgrass (SG), gramíneas (G) e amido (ST) e sacarose (S). O número "132" da ID de Amostra refere-se ao tamanho de partícula do material após cisalhamento através de uma peneira de 1/32 polegadas. O número após o traço refere-se à dosagem de radiação (MRad) e "US" refere-se a tratamento ultra-sônico. Por exemplo, uma ID de amostra "P132-10" refere-se ao papel Kraft que tenha sido cisalhado para um tamanho de partícula de 132 mesh e tenha sido irradiado com 10 MRad.

[00158] Para amostras que foram irradiadas com e-feixe, o número após o traço refere-se à quantidade de energia distribuída à amostra. Por exemplo, uma ID de amostra "P-100e" refere-se ao papel Kraft ao qual foi distribuída uma dose de energia de cerca de 100 MRad ou cerca de 1000 kgy (Tabela 2).

*Picos coalescem após tratamento
**Baixas doses de radiação parecem aumentar o peso molecular de alguns materiais
1Taxa de dosagem = 1MRad/hora
2Tratamento durante 30 minutos com ultra-som a 20 kHz usando uma antena em forma de chifre de 1000W sob condições de recirculação com o material disperso em água.

TABELA 5. Peso molecular médio de pico de materiais gama irradiados

*Picos coalescem após tratamento
**Baixas doses de radiação parecem aumentar o peso molecular de alguns materiais
1Taxa de dosagem = 1MRad/hora
2Tratamento durante 30 minutos com ultra-som a 20 kHz usando uma antena em forma de chifre de 1000W sob condições de recirculação com o material disperso em água.
TABELA 6. Peso molecular médio de material irradiado com Efeixe

[00159] Cromatografia por Permeação de Gel (Gel Permeation Chromatography - GPC) é usada para determinar a distribuição de peso molecular de polímeros. Durante análise por GPC, uma solução da amostra polimérica é passada através de uma coluna empacotada com pequenas moléculas de contenção de gel poroso. A amostra é separada baseado no tamanho molecular, com moléculas maiores eluindo antes de moléculas pequenas. O tempo de retenção de cada componente é, mais frequentemente, detectado pelo índice de refração (Refractive Index - RI), dispersão de luz evaporativa (Evaporative Light Scattering - ELS) ou Ultravioleta (UV) e comparado com uma curva de calibração. Os dados resultantes são, então, usados para calcular a distribuição de peso molecular para a amostra.

[00160] Uma distribuição de pesos moleculares, ao invés de um único peso molecular, é usada para caracterizar polímeros sintéticos. Para caracterizar essa distribuição, médias estatísticas são utilizadas. As mais comuns dessas médias são o "peso molecular numérico médio" (Mn) e o "peso molecular gravimétrico médio" (Mw).

[00161] Métodos para calcular esses valores são descritos no Exemplo 9 do documento WO 2008/073186.

[00162] O índice de polidispersividade ou PI (Polydispersivity Index) é definido como a proporção Mw/Mn. Quanto maior o PI, mais ampla ou mais dispersa a distribuição. O menos valor que um PI pode ter é 1. Isso representa uma amostra monodispersa; isto é, um polímero com todas as moléculas na distribuição tendo o mesmo peso molecular.

[00163] O valor de peso molecular de pico (MP) é outro descritor definido como o modo de distribuição de peso molecular. Ele significa o peso molecular que é mais abundante na distribuição. Esse valor também fornece um "insight" a respeito da distribuição de peso molecular.

[00164] A maioria das medições por GPC são feitas com relação a um padrão polimérico diferente. A precisão dos resultados depende de quão próximas as características do polímero que está sendo analisada estão daquelas do padrão usado. O erro esperado na reprodutibilidade entre diferentes séries de determinações, calibradas separadamente, é de aproximadamente 5-10% e é característico da precisão limitada de determinações por GPC. Portanto, os resultados de GPC são úteis principalmente quando a comparação entre as distribuições de peso molecular de diferentes amostras é feita durante a mesma série de determinações.

[00165] As amostras lignocelulósicas requererem preparo de amostras antes de análise por GPC. Primeiro, uma solução saturada (8,4% em peso) de cloreto de lítio (LiCl) foi preparada em dimetil acetamida (DMAc). Aproximadamente 100 mg de cada amostra foram adicionados a aproximadamente 10 g de uma solução saturada de LiCl/DMAc recentemente preparada e cada mistura foi aquecida para aproximadamente 150°C-170°C com agitação durante 1 hora. As soluções resultantes tinham, em geral, uma cor amarela clara a escura. A temperatura das soluções foi diminuída para aproximadamente 100°C e as soluções foram aquecidas durante mais 2 horas. A temperatura das soluções foi, então, diminuída para aproximadamente 50°C e cada solução de amostra foi aquecidas durante aproximadamente 48 a 60 horas. De nota, as amostras irradiadas a 100 MRad foram mais facilmente solubilizadas quando comparado com sua contra-parte não tratada. Adicionalmente, as amostras cisalhadas (denotadas pelo número 132) tinham pesos moleculares médios ligeiramente menores quando comparado com as amostras não cortadas.

[00166] As soluções de amostra resultantes foram diluídas a 1:1 usando DMAc como solvente e foram filtradas através de um filtro de PTFE de 0,45 µm. As soluções de amostra filtradas foram, então, analisadas através de GPC usando os parâmetros descritos na Tabela 7. O peso molecular médio de pico (Mp) das amostras, conforme determinado através de Cromatografia por Permeação de Gel (GPC), é resumido nas Tabelas 3-6. Cada amostra foi preparada em duplicata e cada preparado de amostra foi analisado em duplicata (duas injeções) para um total de quatro injeções por amostra. Os padrões de poliestireno EasiCal PS1A e PS1B foram usados para gerar uma curva de calibração para a escala de peso molecular de cerca de 580 a 7.500.00 Daltons.

EXEMPLO 7. ANÁLISE DE SUPERFÍCIE POR ESPECTROMETRIA DE MASSA DE ÍONS SECUNDÁRIOS POR "TIME-OF-FLIGHT" (TOFSIMS)

[00167] Espectrometria de Massa de Íons Secundários por "TimeOf-Flight" (ToF-SIMS) é uma espectroscopia superfície-sensível que usa um feixe de íons pulsado (Cs ou Ga microfocalizado) para remover moléculas da superfície mais externa da amostra. As partículas são removidas de monocamadas atômicas sobre a superfície (íons secundários). Essas partículas são, então, aceleradas em um "flight tube" e sua massa é determinada medindo-se o tempo exato no qual elas atingem o detector (isto é, "time-of-flight"). ToF-SIMS fornece informação elemental e molecular detalhada sobre a superfície, camadas finas, interfaces da amostra e constitui uma análise tridimensional completa. O uso é difundido, incluindo em semicondutores, polímeros, tinta, revestimentos, vidro, papel, metais, cerâmicas, biomateriais, produtos farmacêuticos e tecido orgânico. Uma vez que ToF-SIMS é uma técnica de inspeção, todos os elementos na tabela periódica, incluindo H, são detectados. Dados de ToF-SIMS são apresentados nas Tabelas 8-11. Parâmetros usados são reportados na Tabela 12.
TABELA 8. Intensidades médias de vários íons positivos de interesse (contagens de íons normalizadas com relação ao total x 10000)

[00168] ToF-SIMS usa um feixe de partículas pulsado, focalizado (tipicamente Cs ou Ga) para deslocar espécies químicas sobre a superfície de materiais. Partículas produzidas mais próximo do local de impacto tendem a ser íons dissociados (positivos ou negativos). Partículas secundárias geradas mais distantes do local de impacto tendem a ser compostos moleculares, tipicamente fragmentos de macromoléculas orgânicas muito maiores. As partículas são, então, aceleradas em um trajeto de vôo em seu caminho em direção a um detector. Em virtude do fato de ser possível medir o "time-of-flight" das partículas a partir do momento de impacto até o detector em uma escala de nanosegundos, é possível produzir uma resolução de massa tão refinada quanto 0,00X unidades de massa atômica (isto é, uma parte em um milhão da massa de um próton). Sob condições de operação típicas, os resultados de análise por ToF-SIMS incluem: um espectro de massa que inspeciona todas as massas atômicas sobre uma faixa de 0- 10.000 amu, o feixe rastreado produz mapas de qualquer massa de interesse em uma escala de submícrons e perfis de profundidade são produzidos mediante remoção de camadas de superfície por meio de deposição sob o feixe iônico. Análise de íons negativos mostrou que o polímero tinha quantidades crescentes de grupos CNO, CN e NO2.

EXEMPLO 8 - ANÁLISE DE POROSIMETRIA DE MATERIAIS IRRA DIADOS

[00169] Análise de volume de poro e tamanho de poro por mercúrio (Tabela 21) é baseada em forçar mercúrio (um líquido de não umedecimento) em uma estrutura porosa sob pressões hermeticamente controladas. Uma vez que o mercúrio não umedece a maioria das substâncias e não penetrará espontaneamente os poros através de ação capilar, ele deve ser forçado nos vazios da amostra mediante aplicação de pressão externa. A pressão requerida para encher os vazios é inversamente proporcionar ao tamanho dos poros. Apenas uma pequena quantidade de força ou pressão é requerida para encher grandes vazios, enquanto que uma maior pressão é requerida para encher os vazios de poros muito pequenos.

[00170] O AutoPore® 9520 pode atingir uma pressão máxima de 414 MPa ou 413, 69 Mpa manométricos (60.000 psia). Existiam quatro estações de baixa pressão para preparo de amostra e coleta de dados de macroporo de 1,38 kPa manométricos (0,2 psia) a 344,74 MPa manométricos (50 psia) converter. Existiam duas câmaras de alta pressão as quais coletam dados de 172,37 kPa manométricos (25 psia) a 413, 69 Mpa manométricos (60.000 psia). A amostra é colocada em um aparelho semelhante à cuba denominado um penetrômetro, o qual é ligado a uma haste capilar de vidro com um revestimento de metal. À medida que o mercúrio invade os vazios em e em torno da amostra, ele se move para baixo na haste capilar. A perda de mercúrio da haste capilar resulta em uma alteração na capacitância elétrica. A alteração na capacitância durante o experimento é convertida em um volume de mercúrio conhecendo o volume da haste do penetrômetro em uso. Uma variedade de penetrômetros com diferentes tamanhos de cuba (amostra) e capilares estão disponíveis para acomodar a maioria dos tamanhos e configurações de amostra. A Tabela 22 abaixo define alguns dos parâmetros chave calculados para cada amostra.

EXEMPLO 9 - ANÁLISE DE TAMANHO DE PARTÍCULA DE MATERIAIS IRRADIADOS

[00171] A técnica de dimensionamento de partícula através de dispersão de luz estática é baseada na teoria de Mie (a qual também abrange a teoria de Fraunhofer). A teoria de Mie prevê a relação de intensidade vs. Ângulo como uma função do tamanho para partículas de dispersão esféricas, contanto que outras variáveis de sistema sejam conhecidas e mantidas constantes. Essas variáveis são do comprimento de onda da luz incidente e do índice de refração relativo do material da amostra. Aplicação da teoria de Mie fornece informação detalhada sobre o tamanho de partícula. A Tabela 23 resume o tamanho de partícula usando o diâmetro mediano, diâmetro médio e diâmetro modal como parâmetros.

[00172] O tamanho de partícula foi determinado através de Dispersão de Luz a Laser (Dispersão da Amostra Seca) usando um Malvern Mastersizer 2000 usando as condições a seguir:
Taxa de alimentação: 35%
Pressão do dispersor: 400 kPa (4 Bar)
Modelo óptico: (2,610, 1,000i), 1,000

[00173] Uma quantidade apropriada de amostra foi introduzida sobre uma bandeja vibratória. A taxa de alimentação e pressão do ar foi ajustada para assegurar que as partículas estavam apropriadamente dispersas. O componente chave é selecionar uma pressão do ar que romperá aglomerações, mas não comprometerá a integridade da amostra. A quantidade de amostra necessária varia, dependendo do tamanho das partículas. Em geral, amostras com partículas finas requerem menos material do que amostras com partículas espessas.

EXEMPLO 10 - ANÁLISE DE ÁREA DE SUPERFÍCIE DE MATERIAIS IRRADIADOS

[00174] A área superfície de cada amostra foi analisada usando um sistema Micromeritics ASAP 2420 Acelerated Surface Area and Porosimetry. As amostras foram preparadas primeiro desgaseificando durante 16 horas a 40 °C. Em seguida, o espaço livre (quente e frio) com hélio é calculado e, então, o tubo de amostra é evacuado mais uma vez para remover o hélio. Coleta de dados começa após essa segunda evacuação e consiste de definição de pressões alvo, a qual controla quanto gás é dosado sobre a amostra. Em cada pressão alvo, a quantidade de gás adsorvido e a pressão real são determinadas e registradas. A pressão dentro do tubo de amostra é medida com um transdutor de pressão. Doses adicionais de gás continuarão até que a pressão alvo seja obtida e deixada equilibrar. A quantidade de gás adsorvido é determinada somando múltiplas doses sobre a amostra. A pressão e quantidade definem um isoterma de adsorção de gás e são usadas para calcular uma série de parâmetros, incluindo área superfície BET

[00175] O Modelo BET para isotermas é uma teoria amplamente usada para cálculo da área de superfície específica. A análise envolve determinação da capacidade de monocamada de superfície da amostra calculando-se a quantidade requerida para cobrir toda a superfície com uma única camada densamente empacotada de criptônio. A capacidade de monocamada é multiplicada pela área seccional transversal da molécula de gás de sonda para determinar a área de superfície total. A área de superfície específica é a área superfície da alíquota de amostra dividida pela massa da amostra.

EXEMPLO 11 - DETERMINAÇÃO DE COMPRIMENTO DA FIBRA DE MATERIAIS IRRADIADOS

[00176] Testagem de distribuição de comprimento da fibra foi realizada em triplicata sobre as amostras enviadas usando o sistema Techpap MorFi LB01. O comprimento médio e largura de fibra são reportados na Tabela 25.
TABELA 25. Sumário de dados de largura e comprimento da fibra lignocelulósica

EXEMPLO 12 - ESPECTRO POR INFRAVERMELHO POR TRANSFORMAÇÃO DE FOURIER (FT-IR) DE PAPEL KRAFT IRRADIADO E NÃO IRRADIADO

[00177] Análise por FT-IR foi realizada sobre um Nicolet/Impact 400. Os resultados indicam que as amostras P132, P132-10, P132- 100, P-1e, P-5e, P-10e, P-30e, P-70e e P-100e são consistentes com um material baseado em celulose.

[00178] A figura 3 é um espectro por infravermelho de papel Kraft cisalhado de acordo com o Exemplo 4, enquanto que a figura 4 é um espectro por infravermelho do papel Kraft da figura 3 após irradiação com 100 Mrad de gama radiação. A amostra irradiada mostra um pico adicional na região A (centralizado em torno de 1730 cm-1) que não é encontrado no material não irradiado. De nota, um aumento na quantidade de uma absorção de carbonila a ~1650 cm-1 foi detectado quando indo de P132 para P132-10 para P132-100. Resultados similares foram observados para as amostras P-1e, P-5e, P-10e, P-30e, P-70e e P-100e.

EXEMPLO 13 - ESPECTROS POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE PRÓTONS E CARBONO-13 (1H-RMN E 13C-RMN) DE PAPEL KRAFT IRRADIADO E NÃO IRRADIADO Preparo de Amostra

[00179] As amostras P132, P132-10, P132-100, P-1e, P-5e, P-10e, P-30e, P-70e e P-100e foram preparadas para análise através de dissolução com DMSO-d6 com trihidrato de fluoreto de tetrabutil amônio a 2%. As amostras que tinham sofrido menores níveis de irradiação eram significativamente menos solúveis do que as amostras com maior irradiação. Amostras não irradiadas formaram um gel nessa mistura de solvente, mas aquecimento para 60 °C decompôs os picos nos espectros de RMN. As amostras que sofreram maiores níveis de irradiação eram solúveis em uma concentração de 10% peso/peso.

Análise

[00180] Espectros de 1H-RMN das amostras a 15 mg/mL mostrou um pico de ressonância muito amplo distinto centralizado a 16 ppm (FIGS. 5A-5J). Esse pico é caracterizado de um próton -OH permutável por um enol e foi confirmado por "d2O shake." Compostos modelo (acetilacetona, ácido glucurônico e ácido ceto-gulônico) foram analisados e se tornaram um caso convicto de que esse pico era, na verdade, um próton de enol permutável. Esse pico de enol proposto era muito sensível aos efeitos da concentração e nós fomos incapazes de concluir se essa ressonância era em virtude de um enol ou possivelmente um ácido carboxílico.

[00181] As ressonâncias de próton de ácido carboxílico dos compostos modelo foram similares àquelas observadas para as amostras de celulose tratadas. Esses compostos modelo sofreram desvio de campo para ~5-6 ppm. Preparo de P-100e em maiores concentrações (~10% peso/peso) levou a um desvio de campo dramático onde as ressonâncias de ácido carboxílico dos compostos modelo se encontravam (~6 ppm) (FIG. 5N). Esses resultados levaram à conclusão de que essa ressonância não é confiável para caracterização desse grupo funcional, contudo, os dados sugerem que o número de hidrogênios permutáveis aumenta com aumento da irradiação da amostra. Também, nenhum próton de vinila foi detectado.

[00182] Os espectros de 13C RMN das amostras confirmam a presença de uma carbonila de um ácido carboxílico ou um derivado de ácido carboxílico. Esse novo pico (a 168 ppm) não está presente nas amostras não tratadas (FIG. 5K). Um espectro de 13C RMN com um declínio longo permitiu a quantificação do sinal para P-100e (FIGS. 5L5M). Comparação da integração da ressonância de carbonila com as ressonâncias a aproximadamente 100 ppm (os sinais C1) sugere que a proporção do carbono de carbonila para C1 é 1:13,8 ou aproximadamente 1 carbonila para cada 14 unidades de glicose. O desvio químico a 100 ppm se correlaciona bem com o ácido glucurônico.

Titulação

[00183] Amostras P-100e e P132-100 (1 g) foram suspensas em água desionizada (25 mL). O indicador amarelo de alizarina foi adicionado a cada amostra com agitação. P-100e foi mais difícil de umedecer. Ambas as amostras foram tituladas com uma solução de NaOH a 0,2M. O endpoint era muito sutil e foi confirmado usando um papel de pH. O pH inicial das amostras era de ~4 para ambas as amostras. P132-100 requereu 0,4 miliequivalentes de hidróxido, o que fornece um peso molecular para o ácido carboxílico de 2500 amu. Se 180 amu são usados para um monômero, isso sugere que há um grupo ácido carboxílico por 3,9 unidades monoméricas. Da mesma forma, P-100e requereu 3,2 miliequivalentes de hidróxido, o qual foi calculado como sendo um grupo ácido carboxílico para cada 17,4 unidades monoméricas.

Conclusões

[00184] O carbono C-6 da celulose parece ser oxidado ao ácido carboxílico (um derivado de ácido glucurônico) nessa oxidação é sur preendentemente específico. Essa oxidação está em concordância com a banda de IR, que cresce com irradiação a ~ 1740 cm-1, a qual corresponde a um ácido carboxílico alifático. Os resultados de titulação estão em concordância com 13C RMN quantitativo. A solubilidade aumentada da amostra com os maiores níveis de irradiação se correlaciona bem com o número crescente de prótons de ácido carboxílico. Um mecanismo proposto para a degradação de "celulose C-6 oxidada" é fornecido abaixo no Esquema 1.

EXEMPLO 14 – TESTAGEM MICROBIANA DE BIOMASSA PRÉTRATADA

[00185] Materiais lignocelulósicos específicos pré-tratados conforme descrito aqui são analisados quanto à toxicidade por cepas comuns de levedo e bactérias usados na indústria de biocombustíveis para a etapa de fermentação na produção de etanol. Adicionalmente, o teor de açúcar e compatibilidade com enzimas celulase são examinados para determinar a viabilidade do processo de tratamento. Testagem dos materiais pré-tratados é realizada em duas fases, como segue.

Fase 1: Toxicidade e Teor de Açúcar

[00188] O teor de açúcar dos estoques de alimentação é medido usando Cromatografia de Líquido de Alto Desempenho (HPLC) equipado com uma coluna de açúcar Shodex® SP0810 ou Biorad Aminax® HPX-87P. Cada um dos estoques de alimentação (aprox. 5 g) é misturado com água submetida à osmose reversa (RO) durante 1 hora. A porção líquida da mistura é removida e analisada quanto ao teor de glicose, galactose, xilose, manose, arabinose e celobiose. A análise é realizada de acordo com o protocolo do National Bioenergy Center Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass.

[00187] Cada um dos estoques de alimentação é, então, incubado, em duplicata, com S. cerevisiae, P. stipitis, Z. mobilis e C. thermocellum em um meio microbiológico padrão para cada organismo. Caldo YM é usado para as duas cepas de levedo, S. cerevisiae e P. stipitis. Meio RM é usado para Z. mobilis e meio CM4 para C. thermocellum. Um controle positivo, com açúcar puro adicionado, mas sem estoque de alimentação, é usado para comparação. Durante a incubação, um total de cinco amostras é tirado a cada 12 horas nos tempos 0, 3, 6, 9 e 12 horas e analisadas quanto à viabilidade (contagens de placa para Z. mobilis e contagens diretas para S. cerevisiae) e concentração de etanol.

[00188] O teor de açúcar dos estoques de alimentação é medido usando Cromatografia de Líquido de Alto Desempenho (HPLC) equipado com uma coluna de açúcar Shodex® SP0810 ou Biorad Aminax® HPX-87P. Cada um dos estoques de alimentação (aprox. 5 g) é misturado com água submetida à osmose reversa (RO) durante 1 hora. A porção líquida da mistura é removida e analisada quanto ao teor de glicose, galactose, xilose, manose, arabinose e celobiose. A análise é realizada de acordo com o protocolo do National Bioenergy Center Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass.

Fase 2. Compatibilidade Com Celulase

[00189] Estoques de alimentação são testados, em duplicata, com complexo enzimático Accellerase® 1000 comercialmente disponível, a qual contém um complexo de enzimas que reduz a biomassa lignocelulósica em açúcares fermentáveis, na temperatura e concentração recomendadas em um frasco de Erlenmeyer. Os frascos são incubados com agitação moderada em torno de 200 rpm durante 12 horas. Durante esse tempo, amostras são tiradas a cada três horas nos tempos 0, 3, 6, 9 e 12 horas para determinar a concentração de açúcares de redução (Hope e Dean, Biotech J., 1974, 144: 403) na porção líquida dos frascos.

EXEMPLO 15 - ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCAR USANDO HPLC

[00190] 13 amostras foram analisadas com relação à concentração de açúcar (HPLC) e toxicidade contra 3 micro-organismos (Pichia stipitis, Saccharomyces cerevisiae e Zymomonas mobilis. A Tabela 26 lista o equipamento usado para esses experimentos. As Tabela 27 e 28 fornecem uma lista dos açúcares (incluindo vendedor e números de lote) usados para preparar o padrão de HPLC e o protocolo usado para preparar o padrão de HPLC, respectivamente.

Análise

[00191] Cada amostra (1 gram) foi misturada com água que sofreu osmose inversa a 200 rpm e 50 °C durante a noite. O pH da amostra foi ajustado para entre 5 e 6 e filtrada através de um filtro para seringa de 0,2 µm. As amostras foram armazenadas a -20 °C antes de análise para manter a integridade das amostras. As observações feitas durante o preparo das amostras são apresentadas na Tabela 29.

*pH dessas amostras foi ajustado para o pH usando NaOH a 1N.

[00192] Padrões foram preparados frescos a partir de uma solução de estoque de 4 mg/mL dos 6 açúcares combinados, glicose, xilose, celobiose, arabinose, manose e galactose. A solução de estoque foi preparada dissolvendo 0,400 gramas de cada açúcar em 75 mL de água nanopura (filtrada em filtro de 0,3 mícrons). Uma vez dissolvida, a solução de estoque foi diluída para 100 mL usando um frasco volumétrico e armazenada a -20 °C. Soluções de trabalho padrões de 0,1, 0,5, 1, 2 e 4 mg/mL foram preparadas através de diluição serial da solução de estoque com água nanopura. Além disso, um padrão de verificação de 1,5 mg/mL também foi preparado a partir da solução de estoque.

[00193] As concentrações de açúcar foram analisadas de acordo com o protocolo Determination of Structural Carbohydrates in Biomass (NREL Biomass Program, 2006) e esse protocolo é incorporado aqui por referência na íntegra. Uma coluna SHODEX SUGAR SP0810 com um detector de Dispersão de Luz Evaporativa foi usado. Um padrão de verificação (1,5 mg/mL de padrão) foi analisado a cada 8 injeções para assegurar que a integridade da coluna e do detector eram mantidas durante o experimento. O coeficiente de curva padrão de variação (valor R2 ) era de pelo menos 0,989 e a concentração dos padrões de verificação estava dentro de 10% da concentração real. As condições de HPLC eram como segue:
TABELA 30. Parâmetros de HPLC

*Testes inicial notaram que melhor separação era observada quando de uso de água nanopura ao invés de acetonitrilo:água a 15/85 na fase móvel (fabricante não recomendou usar acetonitrilo a mais de 20% com essa coluna).

Resultados

[00194] Os resultados da análise por HPLC são apresentados nas Tabelas 31, 32 e 33.

EXEMPLO 16 - ESTUDO DE TOXICIDADE

[00195] Doze amostras foram analisadas com relação à toxicidade contra um painel de culturas que produzem etanol. Nesse estudo, glicose foi adicionada às amostras de forma a distinguir entre privação das culturas e toxicidade das amostras. Uma décima terceira amostra foi testada com relação à toxicidade contra Pichia stipitis. Um sumário do protocolo usado é listado na Tabela 32. Uma descrição dos produtos químicos e equipamento usado na testagem de toxicidade é reportada nas Tabelas 34-36.

[00196] Testagem foi realizada usando os três micro-organismos, conforme descrito abaixo.

Saccharomyces cerevisiae ATCC 24858 (American Type Culture Collection)

[00197] Um meio de cultura inclinado de S. cerevisiae foi preparado a partir de uma cultura liofilizada reidratada obtida da ATCC. Uma parte do material da cultura inclinada foi colocada sobre um Caldo YM + 20 g/L de agar (pH de 5,0) e incubada a 30 °C duran te 2 dias. Um frasco de Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio (20 g/L de glicose, 3 g/L de extrato de levedura e 5,0 g/L de peptona, pH de 5,0) foi inoculado com uma colony da lâmina com YM e incubada durante 24 horas a 25 °C e 200 rpm. Após 23 horas de cresci mento, uma amostra foi tomada e analisada com relação à densidade óptica (600 nm em um espectrofotômetro de UV) e pureza (Gram coloração). Baseado nesses resultados, um frasco (denominado o Frasco de Cultura) com uma OD de 14,8 e Gram coloração clara foi escolhido para inocular todos os frascos de teste.

[00198] Os recipientes de teste foram frascos de Erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL do meio estéril descrito acima. Todos os frascos foram submetidos à autoclave a 121 °C e 103,42 kPa (15psi) antes da adição dos materiais de teste. Os materiais de teste não foram esterilizados, uma vez que sujeição à autoclave alterará o conteúdo das amostras. As amostras de teste foram adicionadas no momento de inoculação (ao invés de antes de) para reduzir a possibilidade de contaminação. Além das amostras de teste, 1 mL (1% v/v) de material do frasco de cultura foi adicionado a cada frasco. Os frascos foram incubados conforme descrito acima durante 36 horas.

Pichia stipitis NRRL Y-7124 (ARS Culture Collection)

[00199] Um meio de cultura inclinado de P. stipitis foi preparado a partir de uma cultura liofilizada reidratada obtida da ARS Culture Collection. Uma parte do material da cultura inclinada foi colocada sobre um Caldo YM + 20 g/L de agar (pH de 5,0) e incubada a 30 °C durante 2 dias. Um frasco de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de meio (40 g/L de glicose, 1,7 g/L de base de nitrogênio para levedura, 2,27 g/L de ureia, 6,56 g/L de peptona, 40 g/L de xilose, pH de 5,0) foi inoculado com uma pequena quantidade de material da lâmina e incubada durante 24 horas a 25 °C e 125 rpm. Após 23 ho ras de crescimento, uma amostra foi tomada e analisada com relação à densidade óptica (600 nm em um espectrofotômetro de UV) e pureza (Gram coloração). Baseado nesses resultados, um frasco (denominado o Frasco de Cultura) em uma densidade óptica de 5,23 e com uma coloração de Gram clara foi escolhido para inocular todos os frascos de teste.

[00200] Os recipientes de teste foram frascos de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL do meio estéril descrito acima. Todos os frascos foram submetidos à autoclave vazios a 121 °C e 103, 42 kPa (15psi) e meio esterilizados em filtro (filtro de 0,22 µm) adicionado aos frascos antes da adição dos materiais de teste. Os materiais de teste não foram esterilizados, uma vez que sujeição à autoclave alterará o conteúdo das amostras e esterilização em filtro não é apropriada para esterilização de sólidos. As amostras de teste foram adicionadas no momento de inoculação (ao invés de antes de) para reduzir a possibilidade de contaminação. Além das amostras de teste, 1 mL (1% v/v) de material do frasco de cultura foi adicionado a cada frasco. Os frascos foram incubados conforme descrito acima durante 48 horas.

Zymomonas mobilis ATCC 31821 (American Type Culture)

[00201] Um meio de cultura inclinado de Z. mobilis foi preparado a partir de uma cultura liofilizada reidratada obtida da ATTC. Uma parte do material da cultura inclinada foi colocada sobre lâminas DYE (glicose 20 g/L, Extrato de Levedura 10 g/L, Agar 20 g/L, pH de 5,4) e incubada a 30 °C e 5% de CO 2 durante 2 dias. Um tubo de ensaio com tampa de rosca de 20 mL contendo 15 mL de meio (25 g/L de glicose, 10 g/L de extrato de levedura, 1 g/L de MgSO4 . 7H2O, 1 g/L de (NH4)2SO4, 2 g/L de KH2PO4, pH de 5,4) foi inoculado com uma colônia e incubado durante 24 horas a 30 °C sem agitação. A pós 23 horas de crescimento, uma amostra foi tomada e analisada com relação à densidade óptica (600 nm em um espectrofotômetro de UV) e pureza (Gram coloração). Baseado nesses resultados, um tubo (OD de 1,96) foi escolhido para inocular o segundo frasco de cultura. O segundo frasco de cultura era um frasco de 125 ml contendo 70 mL do meio descrito acima e foi inoculado com 700 µL (1% v/v) e incubado durante 24 horas a 30 °C sem agitação. Após 23 horas de cre scimento, uma amostra foi tomada e analisada com relação à densidade óptica (600 nm em um espectrofotômetro de UV) e pureza (Gram coloração). Baseado nesses resultados, um frasco (denominado o Frasco de Cultura) com uma OD de 3,72 foi escolhido para inocular todos os frascos de teste.

[00202] Os recipientes de teste foram frascos de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL do meio estéril descrito acima, exceto o extrato de levedura a 5 g/L. Todos os frascos foram submetidos à autoclave vazios a 121 °C e 103,42 kPa (15psi) e meio esteril izado em filtro (filtro de 0,22 µm) adicionado aos frascos antes da adição dos materiais de teste. Os materiais de teste não foram esterilizados, uma vez que sujeição à autoclave alterará o conteúdo das amostras e esterilização em filtro não é apropriada para esterilização de sólidos. As amostras de teste foram adicionadas no momento de inoculação para reduzir a possibilidade de contaminação. Além das amostras de teste, 1 mL (1% v/v) de material do frasco de cultura foi adicionado a cada frasco. Os frascos foram incubados conforme descrito acima durante 36 horas

Análise

[00203] Duas amostras foram analisadas com relação à concentração de células (usando dispersão em lâmina para Z. mobilis e contagens diretas (hemocitômetro e microscópio) para S. cerevisiae e P. stipitis). Amostras apropriadamente diluídas de Z. mobilis foram dispersas sobre lâminas com Extrato para Levedura com Dextrose (glicose 20 g/L, Extrato de Levedura 10 g/L, Agar 20 g/L, pH de 5,4), incubadas a 30 °C e 5% de CO 2 durante 2 dias e o número de colônias contado. Amostras apropriadamente diluídas de S. cerevisiae e P. stipitis foram misturadas com azul de Tripano a 0,05%, carregadas em um hemocitômetro Neubauer. As células foram contadas sob uma ampliação de 40 X.

[00204] Três amostras foram analisadas com relação à concentração de etanol usando o Analisador YSI Biochem baseado no ensaio de dehidrogenase de álcool (YSI, Interscience). As amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm durante 20 minutos e o sobrenadante armazenado a -20 °C para preservar a integridade. As amos tras foram diluídas para entre 0-3,2 g/L de etanol antes de análise. Um padrão de 3,2 g/L de etanol foi analisado aproximadamente a cada 30 amostras para assegurar que a integridade da membrana era mantida durante análise. A densidade óptica (600 nm) das amostras não é reportada porque as amostras de teste sólidas interferiam com a medição de absorbância mediante aumento da turbidez das amostras e são imprecisas.

Resultados da Análise de Etanol

[00205] O desempenho foi usado para comparar cada amostra ao controle para cada micro-organismo (Tabelas 37-39). Contudo, o desempenho % não pode ser usado para comparar entre cepas. Quando de comparação de cepas, a concentração total de etanol deverá ser usada. Quando de análise dos dados, um desempenho % de menos de 80% pode indicar toxicidade quando acompanhado por um baixo número de células. A equação usada para determinar o desempenho % é:

[00206] Amostras em NEGRITO eram os maiores produtores de etanol, mais de 20 g/L e similar às concentrações em hidrolisados de madeira (H.K. Sreenath e T.W. Jeffries, Bioresource Technology 72 (2000) 253-260).
* Analisado no último experimento em frasco de agitação.

Resultados de Análise de concentração celular

[00207] O % de células é usado para comparar cada amostra ao controle para cada organismo (Tabelas 40-42). Contudo, o % de células não pode ser usado para comparar entre cepas. Quando de comparação de cepas, a concentração total de células deverá ser usada. Quando de análise dos dados, um desempenho % de menos de 70% pode indicar toxicidade quando acompanhado por uma baixa concentração de etanol. A equação usada para determinar o desempenho % é:
% de células = (número de células na amostra/número de células no controle) x 100

EXEMPLO 17- FERMENTAÇÃO EM FRASCO DE AGITAÇÃO DE AMOSTRAS DE CELULOSE USANDO P. STIPITIS Sumário

[00208] Treze amostras foram testadas com relação à produção de etanol em cultura de P. stipitis sem açúcar adicionado. Elas foram testadas na presença e ausência de celulase (complexo de enzima Accellerase 1000®, Genencor). O equipamento e reagentes usados para o experimento são listados abaixo nas Tabelas 43-45.

[00209] Um meio de cultura inclinado de P. stipitis NRRL Y-7124 foi preparado a partir de uma cultura liofilizada reidratada obtida da ARS Culture Collection. Uma parte do material da cultura inclinada foi colocada sobre um Caldo de Mofo de Levedura (Yeast Mold - YM) + 20 g/L de agar (pH de 5,0) e incubada a 30 °C durante 2 di as. Um frasco de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de meio (40 g/L de glicose, 1,7 g/L de base de nitrogênio para levedura, 2,27 g/L de ureia, 6,56 g/L de peptona, 40 g/L de xilose, pH de 5,0) foi inoculado com uma colônia e incubado durante 24 horas a 25 °C e 100 rpm. Após 23 horas de crescimento, uma amostra foi tomada e analisada com relação à densidade óptica (600 nm em um espectrofotômetro de UV) e pureza (Gram coloração). Baseado nesses resultados, um frasco (denominado o Frasco de Cultura) em uma densidade óptica de 6,79 e com uma Gram coloração clara foi escolhido para inocular todos os frascos de teste.

[00210] Os recipientes de teste eram frascos de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de meio (1,7 g/L de base de nitrogênio para levedura, 2,27 g/L de ureia e 6,56 g/L de peptona). Nenhum açúcar (glicose ou xilose) foi adicionado ao meio no frasco de crescimento. Todos os frascos foram submetidos à autoclave vazios a 121 °C e 103,42 kPa (15psi) e meio esterilizado em filtro (filtro de 0,22 µm) adicionado aos frascos antes da adição dos materiais de teste. Os materiais de teste não foram esterilizados, uma vez que sujeição à autoclave alterará o conteúdo das amostras e esterilização em filtro não é apropriada para esterilização de sólidos. As amostras de teste (listadas na Tabela 46) foram adicionadas no momento de inoculação (ao invés de antes de) para reduzir a possibilidade de contaminação. Além das amostras de teste, 1 mL (1% v/v) de material do frasco de cultura foi adicionado a cada frasco. Frascos contendo amostra P132-100 requereram a adição de 0,4 mL de NaOH a 1 M para levar o pH para 5,0. Os frascos foram incubados a 30 °C e 150 rpm durante 96 horas.

[00211] Um conjunto de frascos em duplicata por estoque de alimentação continha complexo de enzima Accellerase® (1,25 mL por frasco, maior dosagem recomendada é 0,25 mL por grama de biomassa, Genencor) para tentar sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). O outro conjunto de frascos em duplicata não contém complexo de enzima Accellerase®. Um total de 52 frascos foi analisado.

[00212] Seis frascos de controle foram também analisados. Frascos de controle positivo continham Celulose em Pó SolkaFloc 200 NF (lote # UA158072, International Fiber Corporation) em uma concentração de 2,5 gramas por frasco de 100 mL (25 gramas por L) com e sem a adição de complexo de enzima Accellerase®. Além disso, um controle contendo açúcares (glicose e xilose) apenas foi usado.

Análise

[00213] As amostras foram analisadas com relação à concentração de etanol (Tabelas 47, 48 e 49) usando o Analisador YSI Biochem baseado no ensaio de dehidrogenase de álcool (YSI, Interscience). Amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm durante 20 minutos e o sobrenadante armazenado a -20 °C. As amostras foram diluídas para entre 0-3,2 g/L de etanol antes de análise. Um padrão de 2,0 g/L de etanol foi analisado aproximadamente a cada 30 amostras para assegurar que a integridade da membrana foi mantida durante análise.

TABELA 49. Resultados de frascos de agitação com complexo de enzima Accellerase® 1000

EXEMPLO 18 - ENSAIO DE CELULASE Sumário

[00214] Treze amostras foram testadas com relação à suscetibilidade à celulose usando uma celulase industrial (Accellerase® 1000, Genencor) sob condições ótimas de temperatura e pH.

Protocolo

[00215] O protocolo é uma modificação do NREL "Laboratory Analytical Procedure LAP-009 Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass". Uma amostra de material foi adicionada a 10 mL de tampão de citrato de sódio a 0,1 M (pH de 4,8) e 40 mg/mL de tetraciclina (para prevenir crescimento de bactérias) em um tubo de 50 mL em duplicata. A quantidade de amostra adicionada a cada tubo é listada na Tabela 50. Algumas amostras foram difíceis de misturar (P132, P132-10, P132-100), de modo que elas foram adicionadas em uma menor concentração. Um controle positivo de 0,2 gramas de Celulose em Pó SolkaFloc 200 NF (lote # UA158072, International Fiber Corporation) e um controle negativo (sem amostra) também foram incluídos. Água submetida à osmose inversa (Reverse Osmosis - RO) leva o volume para um total de 20 mL e foi adicionada aos tubos. O tampão de citrato de sódio e água foram aquecidos para 50 °C antes de uso.

[00216] Enzima Accellerase® 1000 foi adicionada a cada tubo em uma dosagem de 0,25 mL por grama de biomassa (maior dosagem recomendada pela Genencor). Os tubos foram incubados em um ângulo de 45° a 150 rpm e 50 graus C (recomendado pel a Genencor) durante 72 horas. Amostras foram tomadas a 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 48 e 72 horas (Tabelas 52 e 53), centrifugadas a 14.000 rpm durante 20 minutos e o sobrenadante congelado a -20 °C. A conc entração de glicose nas amostras foi analisada usando o Analisador YSI Biochem (Interscience) usando as condições descritas na Tabela 51. Uma solução padrão de glicose de 2,5 g/L foi preparada dissolvendo 2,500 gramas de glicose (Sigma Cat# G7528-5KG, Lote #:107H0245) em água destilada. Uma vez dissolvido, o volume total foi levado para 1 L com água destilada em um frasco volumétrico. O padrão foi preparado fresco semanalmente e armazenado a 4 °C.

[00217] A quantidade de celulose digerida no tubo foi calculada como segue:
1. g/mL de glicose x 20 mL (volume da amostra) x 0,9 (para corrigir a molécula de água adicionada quando de hidrólise de celulose)

[00218] O percentual da amostra total liberada como glicose (na Tabela 53 abaixo) foi calculado como segue:
g de celulose digerida/g de amostra adicionada (vide Tabela 5 para detalhes) * 100

EXEMPLO 19 - FERMENTAÇÃO EM FRASCO DE AGITAÇÃO USANDO PICHIA STIPITIS SUMÁRIO

[00219] Fermentação em frasco de agitação usando Pichia stipitis foi realizada usando quatro materiais celulósicos tendo o maior de sempenho % da Tabela 36.

PROTOCOLO

[00220] Experimentos foram realizados sob os parâmetros esboçados nas Tabelas 54-56.

Desenvolvimento de cultura

[00221] Para todos os experimentos em frasco de agitação a seguir, os frascos de cultura foram preparados usando o procedimento a seguir.

[00222] Um banco de células de trabalho de P. stipitis NRRL Y7124 foi preparado a partir de uma cultura liofilizada reidratada obtida da ARS Culture Collection. Criofrascos contendo cultura de P. stipitis em glicerol a 15% v/v foram armazenados a -75 °C. Uma parte do material do banco de células de trabalho congelado foi colocada sobre um Caldo de Mofo de Levedura (Yeast Mold - YM) + 20 g/L de agar (pH de 5,0) e incubada a 30 °C durante 2 dias. As lâminas foram mantidas durante 2 dias a 4 °C antes de uso. Um frasco de Er lenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de meio (40 g/L de glicose, 1,7 g/L de base de nitrogênio para levedura, 2,27 g/L de ureia, 6,56 g/L de peptona, 40 g/L de xilose, pH de 5,0) foi inoculado com uma colônia e incubado durante 24 horas a 25 °C e 100 rpm. Após 23 horas d e crescimento, uma amostra foi tomada e analisada com relação à densidade óptica (600 nm em um espectrofotômetro de UV) e pureza (Gram coloração). Baseado nesses resultados, um frasco (denominado o Frasco de Cultura) em uma densidade óptica de entre 4 e 8 e com uma Gram coloração clara foi usado para inocular todos os frascos de teste.

[00223] Três experimentos foram realizados usando amostras A132-10, A132-100, G132-10 e G132-100. O Experimento #1 testou essas quatro amostras com relação à concentração de etanol em concentrações variadas de xilose e em concentrações constantes de glicose. O Experimento #2 testou essas quatro amostras com relação à concentração de etanol na concentração dupla de estoque de alimentação usada nos experimentos da Tabela 36. Finalmente, o experimento #3 testou essas quatro amostras com relação à concentração de etanol enquanto se variava as concentrações de xilose e glicose, simultaneamente.

Experimento #1 - Variação da Concentração de xilose

[00224] Quatro amostras celulósicas (A132-10, A132-100, G132-10 e G132-100) foram testadas em concentrações variadas de xilose conforme listado na Tabela 57 abaixo.
TABELA 57. Composição de meio dos frascos no Experimento #1

[00225] Os recipientes de teste (um total de 40 frascos de Erlenmeyer de 250 mL) continham 100 mL de meio. Cinco tipos diferentes de meio foram preparados com a quantidade de xilose e glicose esboçada na Tabela 57. Além disso, o meio continha 1,7 g/L de base de nitrogênio para levedura (Becton Dickinson # 291940) 2,27 g/L de ureia (ScholAR Chemistry #9472706) e 6,56 g/L de peptona (Becton Dickinson #211677). Todos os frascos foram submetidos à autoclave vazios a 121 °C e 103,42 kPa (15psi)) e meio esterilizado em filtro (filtro de 0,22 µm) foi adicionado aos frascos antes da adição dos materiais de teste. Os frascos foram mantidos em temperatura ambiente durante 4 dias e verificados com relação à contaminação (turbidez) antes de uso. Os materiais de teste não foram esterilizados, uma vez que sujeição à autoclave alterará o conteúdo das amostras e esterilização em filtro não é apropriada para esterilização de sólidos. As amostras de teste (A132-10, A132-100, G132-10 e G132-100 a 5 g por 100 mL) foram adicionadas no momento de inoculação (ao invés de antes de) para reduzir a possibilidade de contaminação. Além das amostras de teste, 1 mL (1% v/v) de material do frasco de cultura foi adicionado a cada frasco. Os frascos foram incubados a 30 °C e 150 rp m durante 72 horas.

[00226] Infelizmente, um frasco (amostra A132-100 com xilose a 100%) se quebrou durante a testagem. Portanto, todos os resultados após 24 horas de incubação são reportados como um único frasco. Após 72 horas de incubação, 100% da quantidade original de material celulósico (5,0 g) foram adicionados aos frascos com xilose a 100% (7 frascos no total, um frasco contendo amostra A132-100 se quebrou) e incubado conforme acima durante mais 48 horas.

Análise

[00227] Amostras foram tomadas dos 40 frascos de teste nos tempos de incubação de 0, 6, 12, 24, 36, 48 e 72 horas. Além disso, amostras foram tomadas a 24 e 48 horas pós-adição da segunda quantidade de estoque de alimentação aos frascos com xilose a 100% (vide Tabela 58).

[00228] Um total de 292 amostras foram analisadas com relação à concentração de etanol usando um Analisador YSI Biochem baseado no ensaio de dehidrogenase de álcool (YSI, Interscience). Amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm durante 20 minutos e o sobrenadante armazenado a -20°C. De nota, amostras no tempo 0 requereram filtração através de um filtro para seringa de 0,45 µm. As amostras deverão ser diluídas para entre 0-3,2 g/L de etanol antes de análise. Um padrão de 2,0 g/L de etanol foi analisado aproximadamente a cada 30 amostras para assegurar que a integridade da membrana foi mantida.

[00229] Um total de 47 amostras foi analisado para contagem de células. Amostras serão tomadas no tempo de incubação de 72 horas e 48 horas pós-adição de mais material celulósico. Amostras apropriadamente diluídas foram misturadas com azul de Tripano a 0,05% e carregadas em um hemocitômetro Neubauer. As células foram contadas sob ampliação de 40 X .

Experimento #2 – Análise de2 X Concentração de estoque de alimentação

[00230] Os recipientes de teste (um total de 8 frascos de Erlenmeyer de 250 mL) continham 100 mL de meio. O meio continha 40 g/L de glicose, 40 g/L de xilose, 1,7 g/L de base de nitrogênio para levedura (Becton Dickinson # 291940) 2,27 g/L de ureia (ScholAR Chemistry #9472706) e 6,56 g/L de peptona (Becton Dickinson #211677). Os frascos foram preparados conforme no Experimento #1. As amostras de teste (A132-10, A132-100, G132-10 e G132-100 a 10 g por 100 mL) foram adicionadas no momento de inoculação (ao invés de antes de) para reduzir a possibilidade de contaminação. Além das amostras de teste, 1 mL (1% v/v) de material do frasco de cultura foi adicionado a cada frasco. Os frascos foram incubados a 30°C e 15 0 rpm durante 72 horas.

Análise

[00231] Amostras eram dos 8 frascos de teste em um tempo de incubação de 0, 6, 12, 24, 36, 48 e 72 horas. Análises de etanol das 56 amostras foi realizada conforme para o Experimento #1 e são reportadas na Tabela 59. Uma contagem de células foi realizada na amostra de 72 horas conforme para o Experimento #1 e é apresentada na Tabela 60.

Experimento #3 - Concentrações variadas de xilose e glicose

[00232] Quatro amostras celulósicas (A132-10, A132-100, G132-10 e G132-100) foram testadas em concentrações variadas de xilose e glicose conforme listado na tabela abaixo (Tabela 60).

[00233] Os recipientes de teste (um total de 32, frascos de Erlenmeyer de 250 mL) continham 100 mL de meio. Quatro diferentes tipos de meio foram preparados com a quantidade de xilose e glicose esboçada na Tabela 61. Além disso, o meio continha 1,7 g/L de base de nitrogênio para levedura (Becton Dickinson # 291940) 2,27 g/L de ureia (ScholAR Chemistry #9472706) e 6,56 g/L de peptona (Becton Dickinson #211677). Os frascos foram preparados conforme para o Experimento #1. As amostras de teste (A132-10, A132-100, G132-10 e G132-100) foram adicionadas no momento de inoculação (ao invés de antes de) para reduzir a possibilidade de contaminação. Além das amostras de teste, 1 mL (1% v/v) de material do frasco de cultura foi adicionado a cada frasco. Os frascos foram incubados a 30 °C e 150 rpm durante 72 horas.

Análise

[00234] Amostras foram tomadas dos 32 frascos de teste em um tempo de incubação de 0, 6, 12, 24, 36, 48 e 72 horas (vide Tabelas 62-65). Um total de 224 amostras foram analisadas com relação à concentração de etanol usando o Analisador YSI Biochem baseado no ensaio de dehidrogenase de álcool (YSI, Interscience). Amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm durante 20 minutos e o sobrenadante armazenado a -20 °C. De nota, algumas das amostr as requereram centrifugação e, então, filtração através de um filtro para seringa de 0,45 µm. As amostras foram diluídas para entre 0-3,2 g/L de etanol antes de análise. Um padrão de 2,0 g/L de etanol foi analisado aproximadamente a cada 30 amostras para assegurar que a integridade da membrana de YSI foi mantida.

* Análise do experimento #3.

* Análise do experimento #3.
* * Todos os resultados baseado em análise de um frasco.

* Análise do experimento #3.

[00235] Amostras foram tomadas a 72 horas de incubação para contagens de células (vide Tabelas 66-67). Amostras apropriadamente diluídas foram misturadas com azul de Tripano a 0,05% e carregadas em um hemocitômetro Neubauer. As células foram contadas sob ampliação de 40 X .

Resultados

[00236] Um frasco de cultura foi usado para inocular todos os frascos de teste dos Experimentos #1 e #2. A densidade óptica (600 nm) do frasco de cultura foi medida como sendo 5,14 e a concentração de células era de 4,65 x 108 células/mL (Tabelas 65-66). Portanto, a concentração inicial de células nos frascos de teste era de aproximadamente 4,65 x 106 células/mL.

[00237] Um segundo frasco de cultura foi usado para inocular os frascos do Experimento #3. A densidade óptica (600 nm) do frasco de cultura era de 5,78 e a concentração de células era de 3,75 x 108 células/mL. Portanto, a concentração inicial de células nos frascos de teste era de aproximadamente 3,75 x 106 células/mL.

* Amostras estavam grandemente contaminadas após 72 horas de crescimento. Isso é esperado porque Pichia não cresce bem sem açúcar adicionado e contaminantes (das amostras não estéreis) eram capazes de crescer mais do que Pichia.

EXEMPLO 20 - TESTAGEM DE TOXICIDADE DE AMOSTRAS LIGNOCELULÓSICAS CONTRA P. STIPITIS E S. CEREVISIAE Sumário

[00238] Trinta e sete amostras foram analisadas com relação à toxicidade contra duas culturas que produzem etanol, Saccharomyces cerevesiae e Pichia stipitis. Nesse estudo, glicose foi adicionada às amostras de forma a distinguir entre privação das culturas e toxicidade das amostras.

Protocolo

[00239] Um sumário do protocolo usado é listado na Tabela 68. Uma descrição dos produtos químicos usados em testagem de toxicidade é listada na Tabela 69. Dois frascos de controle (sem amostra adicionada) foram tomados para cada micro-organismo para cada semana de testagem. Um total de 82 frascos foi analisado.

[00240] Durante os experimentos, nenhum etanol ou células apareceram nos frascos com P. stipitis contendo amostras C, C-1e, C-5e e C-10e nas primeiras 24 horas de incubação. De forma a confirmar os resultados, o teste foi repetido. O segundo teste confirmou alguma inibição de crescimento de P. stipitis quando as amostras C, C1E, C5E e C10E foram adicionadas aos frascos.

Amostras de teste

[00241] Sete amostras de teste (todas com a designação C) foram trituradas usando um moedor de café adequado para pequenas amostras. As amostras foram trituradas para um tamanho de partícula consistente (entre amostras) a olho nu. A amostra número C-100e foi facilmente triturada para um pequeno tamanho de partícula.

[00242] Todas as amostras foram adicionadas aos frascos em uma concentração de 50 gramas por litro , exceto quanto às seis amostras P (25 gramas por litro). Essas amostras tinham uma cor branca a acinzentada e eram visualmente fofas e os frascos não misturavam apropriadamente (sem líquido o bastante) na concentração de 50 gramas por litro. Amostras S dissolveram facilmente e puderam, posteriormente, ser adicionadas aos frascos em uma maior concentração. As amostras A e G puderam ser adicionadas a 100 gramas por litro posteriormente.

[00243] Testagem foi realizada usando os dois micro-organismos conforme descrito abaixo.

Saccharomyces cerevisiae ATCC 24858 (American Type Culture Collection)

[00244] Um banco de células de trabalho de S. cerevisiae ATCC 24858 foi preparado a partir de uma cultura liofilizada reidratada obtida da American Type Culture Collection. Criofrascos contendo cultura de S. cerevisiae em glicerol a 15% v/v são armazenados a -75 °C. U ma parte do material do banco de células de trabalho congelado será colocada sobre um Caldo de Mofo de Levedura (Yeast Mold - YM) + 20 g/L de agar (pH de 5,0) e incubada a 30 °C durante 2 dias. Um frasco de Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio (20 g/L de glicose, 3 g/L de extrato de levedura e 5,0 g/L de peptona, pH de 5,0) foi inoculado com uma colônia da lâmina YM e incubado durante 24 horas a 25 °C e 200 rpm. Após 23 horas de crescimento, a amost ra foi tomada e analisada com relação à densidade óptica (600 nm em um espectrofotômetro de UV) e pureza (Gram coloração ). Baseado nesses resultados, um frasco (denominado o Frasco de Cultura) com uma OD de 9-15 e Gram coloração pura foi usado para inoculação dos frascos de crescimento. Após 23 horas de crescimento, o frasco de cultura tinha uma baixa OD (5,14) e contagem de células (1,35 x 10 8 células/mL). De nota, a colônia tomada da lâmina de cultura era menor do que o usual. Portanto, 0,5 mL de material de cultura (em oposição a 0,1 mL planejado) foram adicionados a cada recipiente de teste.

[00245] Os recipientes de teste eram frascos de Erlenmeyer de 500 mL contendo 100 mL do meio estéril descrito acima. Todos os frascos foram submetidos à autoclave a 121 °C e 103,42 kPa (15psi) antes da adição dos materiais de teste. Os materiais de teste não foram esterilizados, uma vez que sujeição à autoclave alteraria o conteúdo das amostras. As amostras de teste foram adicionadas no momento de inoculação (ao invés de antes de) para reduzir a possibilidade de contaminação. Além das amostras de teste, 0,5 -1,0 mL (0,5-1,0% v/v) de material do frasco de cultura foi adicionado a cada frasco. Os frascos foram incubados conforme descrito acima durante 72 horas.

Pichia stipitis (ARS Culture Collection)

[00246] Um banco de células de trabalho de P. stipitis NRRL Y7124 foi preparado a partir de uma cultura liofilizada reidratada obtida da ARS Culture Collection. Criofrascos contendo cultura de P. stipitis em glicerol a 15% v/v são armazenados a -75 °C. Um a parte do material do banco de células de trabalho congelado foi colocada sobre um Caldo de Mofo de Levedura (Yeast Mold - YM) + 20 g/L de agar (pH de 5,0) e incubada a 30 °C durante 2 dias. As lâminas foram mantidas durante até 5 dias a 4 °C antes de uso. Um frasco d e Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de meio (40 g/L de glicose, 1,7 g/L de base de nitrogênio para levedura, 2,27 g/L de ureia, 6,56 g/L de peptona, 40 g/L de xilose, pH de 5,0) foi inoculado com uma colônia e incubado durante 24 horas a 25 °C e 125 rpm. Após 23 horas d e crescimento, a amostra foi tomada e analisada com relação à densidade óptica (600 nm em um espectrofotômetro de UV) e pureza (Gram coloração ). Baseado nesses resultados, um frasco (denominado o Frasco de Cultura) em uma densidade óptica de 5-9 e com uma Gram coloração pura foi usado para inocular todos os frascos de teste.

[00247] Os recipientes de teste foram frascos de Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL do meio estéril descrito acima. Todos os frascos foram submetidos à autoclave vazios a 121 °C e 103, 42 kPa (15psi) e meio esterilizado em filtro (filtro de 0,22 µm) adicionado aos frascos antes da adição dos materiais de teste. Os materiais de teste não foram esterilizados, uma vez que sujeição à autoclave alteraria o conteúdo das amostras e esterilização em filtro não é apropriada para esterilização de sólidos. As amostras de teste foram adicionadas no momento de inoculação (ao invés de antes de) para reduzir a possibilidade de contaminação. Além das amostras de teste, 1 mL (1% v/v) de material do frasco de cultura foi adicionado a cada frasco. Os frascos foram incubados conforme descrito acima durante 72 horas.

Análise

[00248] Amostras foram tomadas dos frascos de cultura exatamente antes de inoculação e cada frasco de teste a 24 e 72 horas e analisadas com relação à concentração de células usando contagens diretas. Amostras apropriadamente diluídas de S. cerevisiae e P. stipitis foram misturadas com azul de Tripano a 0,05%, carregadas em um hemocitômetro Neubauer. As células foram contadas sob ampliação de 40 X .

[00249] Amostras foram tomadas de cada frasco a 0, 6, 12, 24, 36, 48 e 72 horas e analisadas com relação à concentração de etanol usando o Analisador YSI Biochem baseado no ensaio de dehidrogenase de álcool (YSI, Interscience). Amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm durante 20 minutos e o sobrenadante armazenado a -20 °C. As amostras deverão ser diluídas para 0-3,2 g/L de etanol antes de análise. Um padrão de 2,0 g/L de etanol foi analisado aproximadamente a cada 30 amostras para assegurar que a integridade da membrana foi mantida durante análise.

Cálculos

[00250] Os cálculos a seguir foram usados para comparar as contagens de células e concentração de etanol com os frascos de controle:
desempenho % = (concentração de etanol no frasco de teste/etanol no controle)*100% células = (número de células no frasco de teste/número de células no frasco de controle)*100

Resultados

[00251] O frasco de cultura com S. cerevisiae tinha uma densidade óptica (600 nm) de 5,14 e uma concentração de células de 1,35 x 108 células/mL. 0,5 mL de material do frasco de cultura foi adicionado a cada um dos frascos de teste. Portanto, a concentração de células inicial em cada frasco era de 6,75 x 105 /mL. Durante a segunda semana de testagem, o frasco de cultura com S. cerevisiae tinha uma densidade óptica (600 nm) de 4,87 e uma concentração de células de 3,15 x 107 células/mL. Um mL de material do frasco de cultura foi adicionado a cada um dos frascos de teste. Portanto, a concentração de células inicial em cada frasco era de 6,30 x 105 /mL. O pH dos frascos com S. cerevisiae em um tempo de amostragem de 0 hora é apresentado na Tabela 71. O pH dos frascos com conteúdos do frasco estava dentro do pH ótimo para crescimento de S. cerevisiae (pH de 4-6). Nenhum ajuste de pH foi requerido.

* "S" refere-se à sacarose
* "C" refere-se a milho
* "ST" refere-se a amido

[00252] A concentração de etanol e desempenho nos frascos com S. cerevisiae são apresentados nas Tabelas 72 e 73. As maiores concentrações de etanol foram produzidas pela série S.

* analisado na semana 2

[00253] Vide Tabela 72 para chave do número de amostra

* analisado na semana 2

[00254] A concentração de células e % de células nos frascos com S. cerevisiae são apresentados na Tabela 74. Altas contagens de células foram observadas em todos os frascos; contudo, nem todas as células parecem produzir etanol.

[00255] O frasco de cultura com P. stipitis tinha uma densidade óptica (600 nm) de 5,01 e uma concentração de células de 3,30 x 108 células/mL. Um mL de material do frasco de cultura foi adicionado a cada um dos frascos de teste. Portanto, a concentração de células inicial em cada frasco era de 3,30 x 106 /mL. Durante a segunda semana de testagem, o frasco de cultura com P. stipitis tinha uma densidade óptica (600 nm) de 5,45 e uma concentração de células de 3,83 x 108 células/mL. Um mL de material do frasco de cultura foi adicionado a cada um dos frascos de teste. Portanto, a concentração de células inicial em cada frasco era de 3,83 x 106 /mL. O pH dos frascos com P. stipitis em um tempo de amostragem de 0 hora é apresentado na Tabela 75. O pH dos frascos com conteúdos do frasco estava dentro do pH ótimo para crescimento de P. stipitis (pH de 4-7). Nenhum ajuste de pH foi requerido.

[00256] A concentração de etanol e desempenho nos frascos com P. stipitis são apresentados nas Tabelas 76 e 77. As maiores concentrações de etanol foram as séries G e A. Frascos C-30e, C-50e e C100e também continham altas concentrações de etanol. A concentração de células e % de células nos frascos com P. stipitis são apresentados na Tabela 78. Baixas concentrações de células foram observadas nos frascos com as designações S. Baixas contagens de células também foram observadas em frascos contendo amostras C, C1E, C5E e C10E no tempo de amostragem de 24 horas.

* analisado na semana 2

*analisado na semana 2

* analisado na semana 2

Sumário dos resultados de toxicidade celular Zymomonas mobilis

[00257] Conforme mostrado no Gráfico 1A, números de células elevados (por exemplo, maior do que o controle) foram observados em amostras contendo P-132-10, G-132-10 e WS-132-10 no ponto de tempo de 24 horas. Os números de células na presença de todas as outras amostras eram comparáveis ao controle. Essa observação indica que os substratos não eram tóxicos para Z. mobilis durante até 24 horas após cultura.

[00258] No ponto de tempo 36 horas, uma diminuição nos números de células (por exemplo, em virtude de uma perda de células ou morte celular) foi observada para todas as amostras, incluindo o controle. A maior diminuição nos números de células foi observada para aquelas amostras contendo P-132-10, G-132-10. A provável causa desse efeito é comum à todas as amostras, incluindo o controle. Assim, a causa desse efeito não é as substâncias de teste, uma vez que essas variam em cada amostra e não estão presentes no controle. Possíveis explicações para essa observação incluem condições de cultura inapropriadas (por exemplo, temperatura, composições de meio) ou concentrações de etanol na amostra.

[00259] Conforme mostrado no Gráfico 1B, todas as células produziram quantidades comparáveis de etanol (por exemplo, 5-10 g/L) em cada ponto de tempo, a despeito do substrato. Consistente com os dados de número de células apresentados no Gráfico 1A, a concentração de etanol em cada amostra atingiu um pico no ponto de tempo de 24 horas. Em contraste aos dados de número de células, a concentração de etanol não diminui em subsequentes pontos de tempo. Isso era esperado, uma vez que etanol não foi removido do sistema. Além disso, esses dados sugerem que a produção de etanol nessas amostras pode ter resultado de fermentação de glicose no meio de cultura. Nenhum dos substratos testados pareceu aumentar a produção de etanol.

Pichia stipitis

[00260] Conforme mostrado no Gráfico 2A, os números de células eram comparáveis ao controle. Além disso, embora números de células ligeiramente reduzidos estivessem presentes em amostras contendo G-132 e WS-132, números de células reduzidos não foram observados para G-132-10, G-132-100, A-132-10 ou A-132-100. Assim, é improvável que substratos G ou A sejam tóxicos. Antes, os números de células reduzidos observados para G-132 e WS-132 provavelmente foram causados por uma anomalia experimental ou pela presença de substrato não processado, impedindo um pouco o crescimento celular. Em geral, esses dados sugerem que é provável que a glicose presente em amostras de controle e experimentais seja suficiente para promover crescimento ótimo de P. stipitis e que a presença de um substrato adicional na amostra não aumenta essa taxa de crescimento. Esses resultados também sugerem que nenhuma das amostras são tóxicas em P. stipitis.

[00261] Conforme mostrado no Gráfico 2B, a despeito dos números de células similares reportados no Gráfico 2B, produção de etanol grandemente aumentada foi observada em todas as amostras contendo um substrato experimental. Concentrações de etanol aumentaram com o tempo para cada um dos três pontos de tempo testados. A maior concentração de etanol foi observada para A-132-10 no ponto de tempo de 48 horas (por exemplo, aproximadamente 26,0 g/L). Em comparação, as concentrações de substrato com os maiores níveis de produção de etanol com os dados de números de célula apresentados no Grafico 2B, pode ser observado que P. stipitis não parece ser sensível à concentrações crescentes de etanol. Além disso, a produção de etanol não parece estar relacionada ao número de células mas, antes, parece estar relacionada ao tipo de substrato presente na amostra.

[00262] Juntos, os resultados apresentados nos Gráficos 2A e 2B sugerem que os substratos experimentais não promovem crescimento aumentado de P. stipitis, contudo, eles aumentam grandemente a quantidade de etanol produzido por esse tipo de célula. Esses dados também são apresentados como um percentual normalizado contra o controle, conforme mostrado no Gráfico 2C.

Saccharomyces cerevisiae

[00263] Conforme mostrado no Gráfico 3A, G-132-100, A-132, A132-10, A-132-100 e WS-132 promoveram números de células ligeiramente elevados comparado com o controle. Nenhuma redução significativa no número de células foi observado para qualquer amostra. Esses resultados sugerem que nenhuma das amostras é tóxica em S. cerevisiae.

[00264] Conforme mostrado no Gráfico 3B, produção aumentada de etanol foi observada em células tratadas com cada tipo de célula comparado com o controle. Comparação daquelas amostras contendo a maior quantidade de etanol com os dados de números de células apresentados no Gráfico 3A sugere que concentrações de etanol acima de 5 g/L podem ter tido um efeito adverso sobre os números de células. Contudo, essa observação não é o caso para todas as amostras.

[00265] Esses dados também são apresentados como um percentual normalizado contra o controle, conforme mostrado no Gráfico 3C.

[00266] Em conclusão, nenhuma das amostras parecia ser tóxica em Z. mobilis, P. stipitis ou S. cerevisiae. Além disso, P. stipitis parecia ser o mais eficiente dos três tipos de células para produção de etanol a partir dos substratos experimentais testados.

OUTRAS MODALIDADES

[00267] Uma série de modalidades da invenção foram descritas. Todavia, deve ser entendido que várias modificações podem ser feitas sem se desviar do espírito e escopo da invenção.

[00268] Por exemplo, as fibras podem estar em qualquer forma desejada e podem ter uma variedade de diferentes morfologias. Em geral, é desejável que o material celulósico tenha uma alta área de superfície. Em alguns casos, as fibras podem ser uma parte de um filtro HEPA ou semelhante. O material em folha pode ter uma área de superfície, por exemplo, de cerca de 1 a 500 m2 /g. O material fibroso pode ser depositado, por exemplo, soprado por fusão, dobrado, na forma de uma tela ou malha ou fornecido em outras geometrias. As fibras podem ser extrudadas ou co-extrudadas.

[00269] As fibras podem ter qualquer tamanho de partícula desejado, a partir da nano-escala, por exemplo, menos de cerca de 1000 nm, por exemplo, menos de 500 nm, 250 nm, 100 nm, 50 nm, 25 nm ou mesmo menos de 1 nm, até grandes tamanhos de partícula, por exemplo, mais de 100 mícrons, 200 mícrons, 500 mícrons ou mesmo 1000 mícrons ou aglomerados de partículas.

[00270] Embora substratos de biomassa tenham sido discutidos aqui, tais substratos podem ser usados em combinação com outros substratos, por exemplo, os substratos inorgânicos e sintéticos divulgados no Pedido Provisório U.S. No. 61/252.300, depositado em 16 de Outubro de 2009, a divulgação completa do qual é incorporada aqui por referência.

[00271] As fibras ou um material fibroso contendo as fibras podem ser pré-tratado com um micro-organismo e/ou enzima e/ou as fibras ou material fibroso pode ser contatado com um micro-organismo e/ou enzima durante um bioprocesso, tal como sacarificação ou fermentação.

[00272] Conforme discutido acima, enzimas podem ser imobilizadas sobre as fibras, ao invés de ou além de micro-organismos.

[00273] Enzimas e organismos que destroem biomassa que decompõem a biomassa, tal como a celulose e/ou as porções de lignina da biomassa, contêm ou fabricam várias enzimas celulolíticas (celulases), ligninases ou vários metabólitos que destroem biomassa de pequena molécula. Essas enzimas podem ser um complexo de enzimas que atuam sinergisticamente para degradar a celulose cristalina ou as porções de lignina da biomassa. Exemplos de enzimas celulolíticas incluem: endoglucanases, celobiohidrolases e celobiases (βglucosidases). Durante sacarificação, um substrato celulósico é inicialmente hidrolisado por endoglucanases em locais aleatórios, produzindo intermediários oligoméricos. Esses intermediários são, então, substratos para glucanases de exo-divisão, tal como celobiohidrolase, que produzem celobiose a partir das extremidades do polímero de celulose. Celobiose é um dímero de glicose 1,4-ligado solúvel em água. Finalmente, a celobiase cliva a celobiose para proporcionar glicose.

[00274] Uma celulase é capaz de degradação de biomassa e pode ser de origem fúngica ou bacteriana. Enzimas adequadas incluem celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, Chrysosporium e Trichoderma e incluem espécies de Humicola, Coprinus, Thielavia, Fusarium, Myceliophthora, Acremonium, Cephalosporium, Scytalidium, Penicillium ou Aspergillus (vide, por exemplo, documento EP 458162), especialmente aquelas produzidas por uma cepa selecionada das espécies Humicola insolens (reclassificada como Scytalidium thermophilum, vide, por exemplo, Patente U.S. No. 4.435.307), Coprinus cinereus, Fusarium oxysporum, Myceliophthora thermophila, Meripilus giganteus, Thielavia terrestris, Acremonium sp., Acremonium persicinum, Acremonium acremonium, Acremonium brachypenium, Acremonium dichromosporum, Acremonium obclavatum, Acremonium pinkertoniae, Acremonium roseogriseum, Acremonium incoloratum e Acremonium furatum; de preferência das espécies Humicola insolens DSM 1800, Fusarium oxysporum DSM 2672, Myceliophthora thermophila CBS 117.65, Cephalosporium sp. RYM-202, Acremonium sp. CBS 478.94, Acremonium sp. CBS 265.95, Acremonium persicinum CBS 169.65, Acremonium acremonium AHU 9519, Cephalosporium sp. CBS 535.71, Acremonium brachypenium CBS 866.73, Acremonium dichromosporum CBS 683.73, Acremonium obclavatum CBS 311.74, Acremonium pinkertoniae CBS 157.70, Acremonium roseogriseum CBS 134.56, Acremonium incoloratum CBS 146.62 e Acremonium furatum CBS 299.70H. Enzimas celulolíticas podem também ser obtidas de Chrysosporium, de preferência uma cepa de Chrysosporium lucknowense. Adicionalmente, Trichoderma (particularmente Trichoderma viride, Trichoderma reesei e Trichoderma koningii), Bacillus alcalofílico (vide, for exemplo, Patente U.S. No. 3.844.890 e documento EP 458162) e Streptomyces (vide, por exemplo, documento EP 458162) podem ser usados.

[00275] Celobiases adequadas incluem uma celobiase de Aspergillus niger vendida sob a marca comercial NOVOZYME 188™.

[00276] Complexos de enzima podem ser utilizados, tais como aqueles disponíveis da Genencor sob a marca comercial ACCELLERASE®, por exemplo, complexo de enzima Accellerase® 1500. O complexo de enzima Accellerase® 1500 contém múltiplas atividades enzimáticas, principalmente exoglucanase, endoglucanase (2200-2800 CMC U/g), hemi-celulase e beta-glucosidase (525-775 pNPG U/g) e tem um pH de 4,6 a 5,0. A atividade de endoglucanase do complexo enzimático é expressa em unidades de atividade de carbóximetil celulose (CMC U), enquanto que a atividade de beta-glucosidase é reportada em unidades de atividade de pNP-glucosídeo (pNPG U). Em uma modalidade, uma mistura de complexo de enzima Accellerase® 1500 e celobiase NOVOZYME™ 188 é usada.

[00277] Consequentemente, outras modalidades estão dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims (10)

1. Método para fermentar uma mistura de glicose e xilose a etanol, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
   contatar a mistura de glicose e xilose, em um meio, com uma camada de fibras de biomassa de planta oxidadas funcionalizadas e um microorganismo fermentador imobilizado sobre as fibras de biomassa funcionalizadas; e
   fermentar a mistura de glicose e xilose para a conversão da dita mistura a etanol pela fermentação do microorganismo;
   em que as fibras de biomassa foram oxidadas em um meio oxidante para funcionalizar as fibras pelo método selecionado do grupo consistindo em oxidação química, sonicação e pirólise,
   em que o microorganismo é Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis ou Zymomonas mobilis,
   em que o método ainda compreende recuperação das fibras de biomassa após fermentação e reutilização das fibras em um segundo processo de fermentação subsequente, e
   em que a referida biomassa funcionalizada em si não é consumida durante a referida fermentação.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o material de biomassa compreende um material celulósico ou lignocelulósico.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as fibras de biomassa têm uma área de superfície BET de mais de 0,25 m2 /g.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as fibras de biomassa são derivadas de biomassa selecionada do grupo consistindo em papel, produtos de papel, resíduos de papel, madeira, papelão em partículas, serragem, resíduos agrícolas, águas servidas, silagem, gramíneas (grasses), cascas de arroz, bagaço, juta, cânhamo, linho, bambu, sisal, abacá, palha, sabugos de milho, palha de milho, grama de ponta (switchgrass), alfafa, feno, pelo de coco, algodão, alga marinha, algas e misturas dos mesmos.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as fibras de biomassa são derivadas de uma matéria prima de biomassa que tem fibras internas e que foi cortado até um ponto em que suas fibras internas são expostas.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as fibras de biomassa têm uma porosidade maior do que 70%.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as fibras de biomassa são fornecidas na forma de uma folha com uma única ou múltiplas camadas.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as fibras de biomassa são fornecidas na forma de um material fibroso que é sobreposto, dobrado ou na forma de uma tela ou malha.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as fibras de biomassa são extrudadas ou coextrudadas.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as fibras têm um tamanho médio de partícula em nanoescala.

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