UA120831C2

UA120831C2 - Обробка біомаси

Info

Publication number: UA120831C2
Application number: UAA201501626A
Authority: UA
Inventors: Маршалл Медофф; Томас Мастерман; Харрісон Медофф
Original assignee: Ксілеко, Інк.; Ксилеко, Инк.
Priority date: 2009-05-20
Filing date: 2010-05-18
Publication date: 2020-02-25
Also published as: MX2011012354A; IL216172A0; NZ705401A; AP2011006027A0; EA021190B1; CN102459618B; CN105255729A; SG176157A1; IL216172A; EA033363B1; MX347797B; IL246482A0; NZ618954A; AU2010249661A1; US20160046965A1; EP2432888A1; IL240282A0; NZ740023A; US20100297720A1; WO2010135347A1

Abstract

Винахід стосується способу ферментації низькомолекулярного цукру, який включає контакт низькомолекулярного цукру в середовищі з листом, що містить окислені волокна біомаси і ферментуючий мікроорганізм, іммобілізований на волокнах; і ферментацію низькомолекулярного цукру в умовах, придатних для конверсії вказаного цукру в органічну кислоту ферментуючим мікроорганізмом; причому волокна біомаси окислені в окислювальному середовищі способом окислення, вибраним з групи, яка складається з опромінення дозою, що становить від 5 до 60 Мрад, хімічного окислення при рівні рН нижче приблизно 5,5, ультразвукової обробки і піролізу.

Description

(54) ОБРОБКА БІОМАСИ (57) Реферат:

Дана заявка встановлює пріоритет тимчасової патентної заявка США Мо 12/417840, поданої 04 квітня 2009 р., тимчасової патентної заявки США Мо 61/180032, поданої 20 травня 2009 р., і тимчасової патентної заявки США Мо 61/252293, поданої 16 жовтня 2009 р. Повний опис кожної з даних тимчасових заявок включений за допомогою посилання в даний документ.

Рівень техніки

Целюлозні і лігноцелюлозні матеріали виробляють, переробляють і використовують в численних застосуваннях. Часто ці матеріали використовують однократно і потім викидають у вигляді сміття або просто розглядають як відходи, включаючи, наприклад, стоки, вичавки, тирсу і солому.

Різноманітні целюлозні і лігноцелюлозні матеріали, їх використання і застосування описані в патентах США МоМо 7307108, 7074918, 6448307, 6258876, 6207729, 5973035 і 5952105, а також в різних патентних заявках, включаючи опубліковані патентні заявки США Мо 2006/010648 "Волокнисті матеріали і композити" (поданої 23 березня 2006 р.) і Мо 2007/0045456 "Волокнисті матеріали і композити".

Суть винаходу

У деяких випадках присутність біомаси в процесі, наприклад, ферментації, сприяє перетворенню низькомолекулярного цукру в проміжний або кінцевий продукт. Автори даного винаходу виявили, що включення біомаси в суміші з низькомолекулярним цукром в середовищі, наприклад, розчинника або системи розчинників і мікроорганізмами може підвищити вихід і швидкість виробництва проміжного або кінцевого продукту, що отримується шляхом конверсії цукру, наприклад, спирту, в тому числі етанолу або бутанолу. Включення біомаси може також запобігати неповній, повільній або "застиглій" конверсії продукту, наприклад, шляхом ферментації.

Біомаса може сама не перетворюватися в продукт (наприклад, спирт) або може частково або повністю перетворюватися в продукт разом з низькомолекулярним цукром.

У тих випадках, де біомаса частково конвертується, питома поверхня, і пористість біомаси збільшуються, відповідно, відносно питомої поверхні і пористості вихідної біомаси, що може вигідно збільшувати швидкість перетворення низькомолекулярного цукру в продукт.

У деяких випадках біомаса може являти собою залишки целюлозного або лігноцелюлозного

Зо матеріалу, який був оцукрений, наприклад, лігнін і/або інші матеріали, які залишаються після того, як целюлоза була конвертована в цукор.

У одному аспекті даний винахід стосується способу, який включає використання мікроорганізму і/або ферменту, який іммобілізований на матеріалі біомаси, включаючи, наприклад, функціоналізовані волокна біомаси, щоб конвертувати вуглевод, наприклад, низькомолекулярний цукор, в продукт. Термін "іммобілізований" означає, що мікроорганізм і/або фермент пов'язаний з волокнами безпосередньо або опосередковано (наприклад, через хімічний лінкер), ковалентними, водневими, іонними або еквівалентними зв'язками, і/або механічною взаємодією, наприклад, між мікроорганізмом і порами матеріалу біомаси, наприклад, волокон. Зв'язок можна створювати, наприклад, електричною поляризацією матеріалу біомаси. Дана взаємодія може бути постійною, напівпостійною або короткочасною.

Механічна взаємодія може включати поміщення або прикріплення мікроорганізму або ферменту н порах або інших місцях матеріалу біомаси.

Деякі варіанти здійснення включають одну або більше з наступних відмітних особливостей.

Конверсія може включати можливість мікроорганізму конвертувати щонайменше частину низькомолекулярного цукру в спирт, наприклад, етанол або бутанол, або у вуглеводень або водень. Конверсія може включати ферментацію. Мікроорганізм може включати дріжджі, наприклад, Засспаготусеб5 сегемізіае (пекарські дріжджі) і/або Ріспіа віірйі5, або бактерії, наприклад, 7утотопах тобіїї5. Спосіб може додатково включати опромінення волокон біомаси, наприклад, іонізуючим випромінюванням, наприклад, з використанням пучка частинок. Волокна біомаси можуть мати питому поверхню по методу Брунауера-Еммета-Теллера (ВЕТ), що складає більше ніж 0,25 мг/г, і/або пористість, що становить щонайменше 70 95. Волокна біомаси можна стримувати з матеріалу біомаси, який містить внутрішні волокна і який нарізаний до такого стану, що його внутрішні волокна відкриваються в істотній мірі.

У іншому аспекті даний винахід стосується суміші, яка включає матеріал біомаси, який має полярні функціональні групи, мікроорганізм, що має комплементарні притягуючі функціональні групи, і рідке середовище.

У наступному аспекті даний винахід стосується композиції, що включає волокна біомаси, які мають функціональні групи, і мікроорганізм, що має комплементарні притягуючі функціональні групи, причому мікроорганізм є іммобілізованим на волокнах біомаси.

Даний винахід також стосується способу, який включає конверсію низькомолекулярного цукру або матеріалу, який включає низькомолекулярний цукор в суміші з біомасою, мікроорганізмом і розчинником або системою розчинників, наприклад, водою або сумішшю води і органічного розчинника, в продукт. Приклади розчинників або систем розчинників включають веду, гексан, гексадекан, гліцерин, хлороформ, толуол, етилацетат, петролейний ефір, зріджений нафтовий газ (ЗНГ), іонні рідини і їх суміші. Розчинник або система розчинників може знаходитися у вигляді однієї фази, двох або більше фаз. Біомаса може існувати, наприклад, у волокнистій формі.

У деяких випадках, наявність матеріалу біомаси (наприклад, обробленої яким-небудь способом, описаним в даному документі, або необробленим) в процесі виробництва продукту може підвищити швидкість виробництва даного продукту. Без наміру слідувати якій-небудь певній теорії, вважають, що наявність твердої речовини, наприклад, що має високу питому поверхню і/або високу пористість, може збільшувати швидкості реакцій шляхом збільшення ефективної концентрації розчинених речовин і створення субстрату, на якому можуть відбуватися реакції.

У деяких варіантах здійснення матеріал біомаси, який був опромінений, окиснений, хімічно оброблений, механічно оброблений, оброблений ультразвуком, оброблений паровим вибухом іабо підданий піролізу, можна вводити в процес ферментації низькомолекулярного цукру, наприклад, щоб підвищити швидкість і вихід ферментації.

Наприклад, опромінений або неопромінений матеріал біомаси, наприклад, паперове волокно, можна вводити в процес ферментації, наприклад в процес ферментації кукурудзи з утворенням етанолу або в процес ферментації екстракту цукрової тростини, щоб підвищити швидкість виробництва щонайменше на 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100 95 або більше, наприклад, щонайменше на 15095 або навіть до 1000 95. Конверсія, наприклад, ферментація, може виявляти процентну ефективність, як визначено в розділі "Приклади" даного документа, яка складає, наприклад, щонайменше 140 95, в деяких випадках щонайменше 170 95.

Матеріал біомаси може мати високу питому поверхню, високу пористість і/або низьку об'ємну густину. У деяких варіантах здійснення біомаса присутня в суміші в кількості, що складає від приблизно 0,5 мас. 95 до приблизно 50 мас. 95, наприклад, від приблизно 1 мас. 95

Ко) до приблизно 25 мас.95 або від приблизно 2 мас. 9о до приблизно 12,5 мас. 95. У інших варіантах здійснення біомаса присутня в кількостях, що складають більше ніж приблизно 0,5 мас. 96, наприклад, більше ніж приблизно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або навіть більше ніж приблизно 10 мас. 9».

Оскільки сам матеріал біомаси не витрачається в процесі конверсії, матеріал біомаси можна повторно використовувати в багаторазових періодичних процесах або можна використовувати безперервно у виробництві вели сих об'ємів продукту.

Спосіб може включати опромінення волокнистої біомаси перед змішуванням, наприклад, за допомогою іонізуючого випромінювання, повна доза якого складає, наприклад, щонайменше 5

Мрад. Опромінення можна здійснювати з використанням пучка частинок. Опромінення можна провести в умовах, вибраних для зменшення молекулярної маси біомаси. Опромінення можна здійснювати з багаторазовим застосуванням випромінювання. Іонізуюче випромінювання може включати випромінювання електронного пучка. Наприклад, випромінювання можна застосовувати при повній дозі, що складає від приблизно 10 Мрад до приблизно 150 Мрад, наприклад, при потужності дози, що складає від приблизно 0,5 до приблизно 10 Мрад/добу або від 1 Мрад/с до приблизно 10 Мрад/с. У деяких варіантах здійснення опромінення включає застосування двох або більше джерел випромінювання, включаючи гамма-випромінювання і пучок електронів.

У деяких варіантах здійснення опроміненню піддають вихідний матеріал біомаси, в той час як вихідний матеріал біомаси знаходиться в атмосфері повітря, азоту, кисню, гелію або аргону.

У деяких варіантах здійснення попередня обробка може включати попередню обробку вихідного матеріалу біомаси паровим вибухом.

У деяких варіантах здійснення спосіб включає механічну обробку біомаси, наприклад, шляхом зменшення одного або більше розмірів окремих шматків біомаси, наприклад, нарізанням, помелом жорнами, механічним різанням або розриванням, стрижневим подрібненням, мокрим або сухим помелом, повітряним дисковим помелом, рубанням, пресуванням, ущільненням або поєднаннями будь-яких даних способів. У деяких випадках після механічної обробки біомаса включає волокна, що мають середнє відношення довжини до діаметра, що складає більше ніж 5/1. У деяких варіантах здійснення приготована біомаса може 60 мати питому поверхню по методу ВЕТ, що складає більше ніж 0,25 мг/г. Механічно оброблена біомаса може мати об'ємну густину, що складає менше ніж приблизно 0,5 г/см3, наприклад, менше ніж 0,35 г/см3.

У будь-якому із способів, описаних в даному документі, можна використовувати випромінювання із склепінчастого пристрою.

Якщо не визначена інша умова, всі технічні і наукові терміни, що використовуються в даному документі, мають такі ж значення, які звичайно розуміє фахівець в галузі техніки, до якої належить даний винахід. Хоча способи і матеріали, які аналогічні або еквівалентні тим, які описані в даному документі, можна використовувати в практичному здійсненні або випробуванні даного винаходу, прийнятні способи і матеріали описані нижче. Всі публікації, патентні заявки, патенти і інші матеріали, посилання на які приведені в даному документі, у всій своїй повноті включені в нього за допомогою посилання. У разі суперечності переважаюча дія має даний опис, включаючи визначення. Крім того, матеріали, способи і приклади є тільки ілюстративними і не призначені як обмежувальні.

Інші відмітні особливості і переваги даного винаходу стануть очевидними з наступного докладного опису і з формули винаходу.

Опис креслень.

Фіг. 1 представляє блок-схему, що ілюструє обробку біомаси і використання обробленої біомаси в процесі ферментації.

Фіг. 2 представляє схематичне зображення функціоналізованої біомаси, яка взаємодіє з мікроорганізмом.

Фіг. З представляє інфрачервоний спектр крафт-картону, нарізаного різальною машиною з обертовим ножем.

Фіг. 4 представляє інфрачервоний спектр крафт-картону згідно з фіг. З після опромінення дозою 100 Мрад гамма-випромінювання.

Фіг. 5БА-5І представляють спектри ЯМР "Н зразків Р132, Р132-10, Р132-100, Р-1е, Р-5е, Р- 1бе, Р-ЗОе, Р-7Ое і Р-100е в прикладі 13. Фіг. 5) представляє порівняння обмінюваного протона при «16 м. ч. згідно з фіг. 5А-5І. Фіг. ЗК представляє спектр ЯМР С зразка Р-100е. Фіг. 5І-5М представляють спектр ЯМР "ЗС зразка Р-100е, в якому затримки становлять 10 секунд. Фіг. 5М представляє ЯМР "Н зразка Р-100е при концентрації 10 мас. 95.

Докладний опис

Функціоналізований матеріал біомаси, що має бажані типи і кількості функціональних груп, включаючи карбоксильні групи, енольні групи, альдегідні групи, кетонні групи, нітрильні групи, нітрогрупи, або нітрозогрупи, можна отримати, використовуючи способи, описані в даному документі. Такі функціоналізовані матеріали можуть сприяти конверсії низькомолекулярного цукру в продукт, наприклад, в процесі ферментації.

Типи біомаси

Переважні матеріали біомаси для використання в процесах, описаних в даному документі, містять волокна, які можуть функціоналізувати з функціональними групами, що є комплементарними для функціональних груп агентів, які будуть використані в конверсії цукру, наприклад, мікроорганізмів, в тому числі дріжджів.

Джерела волокна включають джерела целюлозного волокна, включаючи папір і паперові вироби (наприклад, папір з багатошаровим покритим і крафт-папір), і джерела лігноцелюлозного волокна, включаючи деревину і матеріали, що містять деревину, наприклад, деревностружкові плити. Інші прийнятні джерела волокна включають джерела натурального волокна, наприклад, трави, рисове лушпиння, вижимки, джут, коноплі, льон, бамбук, мексиканська агава, манільське прядиво, солома, просо лозиноподібне, люцерна, сіно, стрижні кукурудзяних качанів, кукурудзяна солома, кокосові волокна; джерела волокна з високим вмістом а-целюлози, наприклад, бавовна; і джерела синтетичного волокна, наприклад, екструдована пряжа (орієнтована пряжа або неорієнтована пряжа). Джерела натурального або синтетичного волокна можна отримати з обривків, невживаних текстильних матеріалів, наприклад, залишків, або вони можуть являти собою вживані відходи, наприклад, дрантя. Коли паперові вироби використовують як джерела волокна, вони можуть являти собою, невживані матеріали, наприклад, обривки невживаних матеріалів, або вони можуть являти собою вживані відходи. Крім невживаних вихідних матеріалів, вживані, промислові (наприклад, побічні продукти переробки) і технології відходи (наприклад, стоки від переробки паперу) можна також використовувати як джерела волокна. Крім того, джерела волокна можна отримувати або витягувати з відходів життєдіяльності людини (наприклад, стоків) і відходів тваринного або рослинного походження. Додаткові джерела волокна описані в патентах США МоМо 6448307, 6258876, 6207729, 5973035 і 5952105.

У деяких варіантах здійснення матеріал біомаси включає вуглевод, який являє собою або включає матеріал, що містить один або більше Д-1,4-зв'язків і має середньочисельну молекулярну масу, що складає приблизно від 3000 до 50000. Такий вуглевод являє собою або включає целюлозу (І), яка отримана з рД-глюкози (1) за допомогою конденсації В(1,4)-глікозидних зв'язків. Цей зв'язок відрізняється від «(1,4)-глікозидних зв'язків, присутніх в крохмалі і інших вуглеводах. но 2 но он но он 1 он но он о (о; - (в) но он он

Крохмальні матеріали включають сам крохмаль, наприклад, кукурудзяний крохмаль, пшеничний крохмаль, картопляний крохмаль або рисовий крохмаль, похідне крохмалю, або матеріал, який включає крохмаль, в тому числі їстівний харчовий продукт або сільськогосподарський продукт. Наприклад, крохмальним матеріалом може бути аракача, гречка, банан, ячмінь, маніока, кудзу, квасениця бульбова, саго, сорго, звичайна картопля, солодка картопля, таро, ямс або одне, або більше з бобових рослин, в тому числі боби, сочевиця або горох. Суміші будь-яких двох або більше крохмальних матеріалів також являють собою крохмальні матеріали.

У деяких випадках біомаса являє собою мікробний матеріал. Мікробні джерела включають, але не обмежуються цим, що будь-який мікроорганізм або організм, що зустрічається в природі або генетично модифікований, який містить або здатний забезпечувати джерело вуглеводів (наприклад, целюлоза), наприклад, протисти (одноклітинні), наприклад, тваринні протисти (наприклад, найпростіші, в тому числі джгутикові, амебоподібні, інфузорії і споровики) і рослинні протисти (наприклад, водорості, в тому числі комірчасті, хлорарахіофіти, криптомонади, евгленіди, глаукофіти, гаптофітн, червоні водорості, страменофіли і зелені рослини). Інші приклади включають морські водорості, планктон (наприклад, макропланктон, мезопланктон, мікропланктон, нанопланктон, пікопланктон, і фемптопланктон), фітопланктон, бактерії (наприклад, грампозитивні бактерії, грамнегативні бактерії і екстремофіли), дріжджі і/або їх суміші. У деяких випадках мікробну біомасу можна отримати з натуральних джерел, наприклад, океанів, озер, інших водоймищ, що містять, наприклад, солону воду або прісну воду, або на суші. Як альтернатива або додатково, мікробну біомасу можна отримати з систем культур, наприклад, крупномасштабний сухих і вологих систем культур.

Зо Суміші будь-яких матеріалів біомаси, описаних в даному документі, можна використовувати для виготовлення проміжних або кінцевих продуктів, описаних в даному документі. Наприклад, суміші целюлозних матеріалів і крохмальних матеріалів можна використовувати для виготовлення будь-якого продукту, описаного в даному документі.

Системи для обробки біомаси і використання обробленої біомаси в ферментації

Фіг. 1 представляє систему 100 для обробки біомаси, зокрема, волокнистої біомаси, і подальшого використання обробленої біомаси для прискорення процесу ферментації. Система 100 включає модуль 102, в якому вихідний матеріал біомаси механічно обробляють, наприклад, відкриваючи внутрішні волокна вихідного матеріалу. Далі приклади видів механічної обробки будуть детально описані. Система 100 також включає модуль 104, в якому механічно оброблений вихідний матеріал функціоналізують, наприклад, за допомогою опромінення. Після функціоналізації функціоналізовані волокна спрямовують в систему ферментації 106 транспортним модулем 108.

Функціоналізовані волокна потім присутні в процесі ферментації і прискорюють процес ферментації, забезпечуючи субстрат, який може взаємодіяти з мікроорганізмами, що використовуються в ферментації, наприклад, клітинами дріжджів. Ця взаємодія схематично представлена на фіг. 2, яка зображує функціоналізоване полярне волокно 10 і клітину дріжджів 12, що має комплементарну полярну функціональну групу. Внаслідок полярності волокон і клітини дріжджів, клітина може виявитися іммобілізованою на одному або більшому числі волокон. Зв'язування клітини дріжджів (або іншого мікроорганізму) з волокнами може здійснюватися за допомогою водневого зв'язку, ковалентного або іонного зв'язку. У деяких випадках функціональні групи на волокнах можуть реагувати з групами на мікроорганізмі, утворюючи ковалентний зв'язок. Підвищена питома поверхня і пористість матеріалу біомаси, які виникають в результаті механічної обробки (наприклад, в модулі 102), забезпечують збільшення питомої поверхні для взаємодії волокна і мікроорганізму і, таким чином, посилюючи цю взаємодію. Іммобілізовані клітини є більш продуктивними, збільшуючи ефективність і вихід процесу ферментації і запобігаючи передчасному "застиганню" процесу.

Потрібно зазначити, що якщо перемішування здійснюють в процесі ферментації, перемішування переважно є відносно м'яким (з низький зусиллям зсуву), щоб зводити до мінімуму порушення взаємодії між мікроорганізмами і волокнами. У деяких варіантах здійснення використовують струминне перемішування, як описано в патентних заявках СШП Мо 61/218832 і

Мо 61/179995, повні описи яких включені в даний документ за допомогою посилання.

При повторному розгляді фіг. 1, видно, що при ферментації утворюється неочищена суміш на основі етанолу, яка втікає в резервуар для зберігання 110. Вода або інший розчинник, а також інші неетанольні компоненти відганяють з неочищеної суміші етанолу, використовуючи відгінну колону 112, і етанол потім переганяють, використовуючи дистиляційний блок 114, наприклад, ректифікаційну колону. Нарешті, етанол можна сушити, використовуючи молекулярне сито 116, денатурувати по мірі необхідності і спрямовувати на транспортування бажаним способом.

У деяких випадках системи, описані в даному документі, або їх компоненти, можуть бути портативними, щоб систему можна було перевозити (наприклад, залізничним, автомобільним або водним транспортом) з одного місця в інше. Стадії способу, описаного в даному документі, можна здійснювати в одному або декількох місцях, і в деяких випадках одну або більше стадій можна здійснювати в процесі транспортування. Така мобільна обробка описана в патентній

Зо заявці США Мо 12/374549 і в міжнародній патентній заявці Ме УМО 2008/011598, повні описи яких включені в даний документ за допомогою посилання.

Будь-які або всі стадії способу, описаного в даному документі, можна здійснювати при температурі навколишнього середовища. При бажанні охолоджування і/або нагрівання можна використовувати протягом певних стадій. Наприклад, вихідний матеріал можна охолоджувати в процесі механічної обробки, щоб збільшити його крихкість. У деяких варіантах здійснення охолоджування використовують до, під час або після початкової механічної обробки і/або подальшої механічної обробки. Охолоджування можна здійснювати згідно з описом в патентній заявці США Мо 12/502,629, повний опис якої включений в даний документ за допомогою посилання. Крім того, температуру в системі ферментації 106 можна регулювати, щоб прискорити ферментацію.

Фізична обробка

Процеси фізичної обробки, які можна використовувати для зміни морфології матеріалу біомаси і/або функціоналізації матеріалу, можуть включати один або більше з тих, які описані в даному документі, в тому числі механічну обробку, хімічну обробку, опромінення, ультразвуков) обробку, окиснення, піроліз або паровий вибух. Способи обробки можна використовувати у вигляді поєднання двох, трьох, чотирьох навіть всіх даних технологій (в будь-якому порядку).

Коли використовують більше ніж один спосіб обробки, ці способи можна використовувати в один і той же час або в різні терміни. Інші способи, які функціоналізують вихідний матеріал біомаси і/або змінюють його морфологію, можна також використовувати як індивідуально, так і в поєднанні зі способами, описаними в даному документі.

Механічна обробка

У деяких випадках, способи можуть включати механічну обробку вихідного матеріалу біомаси. Види механічної обробки включають, наприклад, різання, подрібнення, пресування, дроблення, деформування і рубання. Подрібнення може включати, наприклад, кульовий, молотковий, роторний/статорний сухий або мокрий помел, або інші види подрібнення. Інші види механічної обробки включають, наприклад, подрібнення жорнами, розтріскування, механічне різання або розривання, стрижневе шліфування або повітряний дисковий помел.

Механічна обробка може мати перевагу для "підготовки", "розтягнення", подрібнення і дроблення целюлозних або лігноцелюлозних матеріалів, роблячи целюлозу матеріалів більш сприйнятливою до розщеплення ланцюга і/або зменшення ступеня кристалічності. Підготовлені матеріали можуть також бути більш сприйнятливими до окиснення у випадку опромінення.

У деяких випадках, механічна обробка може включати початкову підготовку отриманого вихідного матеріалу, наприклад, подрібнення матеріалів, в тому числі за допомогою різання, дроблення, помелу, розпилення або рубання. Наприклад, в деяких випадках, пухкий вихідний матеріал (наприклад, вторинний папір, крохмальні матеріали або просо лозиноподібне) готують різанням або подрібненням.

Як альтернатива або додатково, вихідний матеріал можна спочатку фізично обробляти одним або декількома з числа інших фізичних способів обробки, включаючи, наприклад, хімічну обробку, випромінювання, ультразвукову обробку, окиснення, піроліз або паровий вибух, і потім механічно обробляти. Така послідовність може мати перевагу, оскільки матеріали, оброблені одним або більше способами, включаючи, наприклад, опромінення або піроліз, схильні до більшої крихкості і, отже, може виявитися більш легким внесення подальших змін в молекулярну структуру матеріалу за допомогою механічної обробки.

У деяких варіантах здійснення матеріал біомаси є волокнистим, і механічна обробка включає різання, щоб відкрити волокна волокнистого матеріалу. Різання можна здійснювати, наприклад, використовуючи пристрій для різання з дисковими лезами. Інші способи механічної обробка біомаси включають, наприклад, помел або дроблення. Помел можна здійснювати, використовуючи, наприклад, молотковий млин, кульовий млин, колоїдний млин, конічний або конусний млин, дисковий млин, бігувковий млин, млин марки УМіеу або зерновий млин.

Дроблення можна здійснювати, використовуючи, наприклад, жорнову дробарку, стрижневу дробарку, кавову дробарку або жорновий млин. Дроблення можна здійснювати, наприклад, за допомогою зворотно-поступального стрижня або іншого елемента, як у випадку стрижневого млина. Інші механічні способи обробки включають механічне різання або розривання, інші способи, в яких до матеріалу прикладають тиск, і повітряний дисковий помел. Прийнятні види механічної обробки додатково включають будь-які інші способи, які змінюють молекулярну структуру або морфологію матеріалу біомаси.

При бажанні механічно оброблений матеріал можна пропускати через сито, наприклад, яке має середній розмір отворів, що становить 1,59 мм або менше (1/16 дюйма, 0,0625 дюйма). У деяких варіантах здійснення різання або іншу механічну обробку і просіювання здійснюють одночасно. Наприклад, різак з дисковими лезами можна використовувати для одночасного різання і просіювання матеріалу біомаси. Біомаса ріжеться між нерухомим: і лезами і обертовими лезами, виробляючи подрібнений матеріал, який проходить крізь сито і збирається в бункері.

Матеріал біомаси можна механічно обробляти в сухому стані (наприклад, при невеликому або нульовому вмісті води на його поверхні), гідратованому стані (наприклад, при вмісті до 10 мас. 95 абсорбованої води) або у вологому стані, наприклад, при вмісті від приблизно 10 мас. 95 до приблизно 75 мас. 95 води. Матеріал біомаси можна навіть механічно обробляти в стані часткового або повного занурення в рідину, включаючи воду, етанол або ізопропанол. Матеріал біомаси можна також механічно обробляти в середовищі газу (наприклад, в потоці або атмосфері газу, який не є повітрям), наприклад, кисню або азоту, або пари.

Механічна обробка системи може бути пристосована для утворення потоків 3 певними морфологічними характеристиками, включаючи, наприклад, питому поверхню, пористість, об'ємну густину і, у випадку волокнистих вихідних матеріалів, характеристики волокна, в тому числі відношень я довжини до ширини.

У деяких варіантах здійснення питома поверхня по методу ВЕТ механічно обробленого матеріалу складає більше ніж 0,1 м2/г, наприклад, більше ніж 0,25 м2/г, більше ніж 0,5 мг/г, більше ніж 1,0 м2/г, більше ніж 1,5 м2/г, більше ніж 1,75 м2/г, більше ніж 5,0 м2/г, більше ніж 10 м2/г, більше ніж 25 м2/г, більше ніж 35 м2/г, більше ніж 50 м2/г, більше ніж 60 м2/г, більше ніж 75

БО м2/г, більше ніж 100 м2/г, більше ніж 150 м2/г, більше ніж 200 м2/г, або навіть більше ніж 250 ма2/г.

Пористість механічно обробленого матеріалу може складати, наприклад, більше ніж 20 95, більше ніж 25 95, більше ніж 35 95, більше ніж 50 95, більше ніж 60 95, більше ніж 70 95, більше ніж 80 95, більше ніж 85 95, більше ніж 90 95, більше ніж 92 95, більше ніж 94 95, більше ніж 95 95, більше ніж 97,5 95, більше ніж 99 95 або навіть більше ніж 99,5 95.

У деяких варіантах здійснення після механічної обробки матеріал має об'ємну густину, що складає менше ніж 0,25 г/см3, наприклад, 0,20 г/см3, 0,15 г/см3, 0,10 г/см3, 0,05 г/см3 або менше, наприклад, 0,025 г/см3. Об'ємну густину визначають, використовуючи американський стандартний метод випробувань А5ТМ 018958. Коротко, цей спосіб включає наповнення бо зразком мірного циліндра відомого об'єму і вимірювання маси даного зразка. Об'ємну густину обчислюють розподілом маси зразка в грамах на відомий об'єм циліндра в кубічних сантиметрах.

Якщо біомаса являє собою волокнистий матеріал, волокна механічно обробленого матеріалу можуть мати відносно велике середнє відношення довжини до діаметра (наприклад, більше ніж 20/1), навіть якщо їх різали більше ніж однократно. Крім того, волокна волокнистих матеріалів, описаних в даному документі, можуть мати відносно вузький розподіл довжини і/або відношення довжини до діаметра.

При використанні в даному документі середні значення ширини волокна (наприклад, діаметри) являють собою значення, визначені оптичним способом при випадковому виборі приблизно 5000 волокон. Середні значенні довжини волокна являють собою виправлені значення зваженої по довжині довжини. Значення питомої поверхні по методу ВЕТ являють собою багатоточкові значення питомої поверхні, і значення пористості являють собою значення, визначені методом ртутної порометрії.

Якщо біомаса являє собою волокнистий матеріал, середнє відношення довжини до діаметра волокон механічно обробленого матеріалу може складати, наприклад, більше ніж 8/1, наприклад, більше ніж 10/1, більше ніж 15/1, більше ніж 20/1, більше ніж 25/1 або більше ніж 50/11. Середня довжина волокна механічно обробленого матеріалу може складати, наприклад, приблизно від 0,5 мм до 2,5 мм, наприклад, приблизно від 0,75 мм до 1,0 мм, і середня ширина (наприклад, діаметр) другого волокнистого матеріалу 14 може складати, наприклад, приблизно від 5 мкм до 50 мкм, наприклад, приблизно від 10 мкм до 30 мкм.

У деяких варіантах здійснення, якщо біомаса являє собою волокнистий матеріал, стандартне відхилення довжини волокна механічно обробленого матеріалу може складати менше ніж 60 95 середньої довжини волокна механічно обробленого матеріалу, наприклад, менше ніж 50 95 середньої довжини, менше ніж 40 95 середньої довжини, менше ніж 25 95 середньої довжини, менше ніж 10 95 середньої довжини, менше ніж 5 95 середньої довжини, або навіть менше ніж 1 процент середньої довжини.

У деяких ситуаціях може виявитися бажаним приготування матеріалу з низькою об'ємною густиною, ущільнення матеріалу (наприклад, щ(б зробити його транспортування в інше місце простішим і таким, що менше коштує) і подальше повернення матеріалу в стан із зниженою

Зо об'ємною густиною. Ущільнені матеріали можна обробляти будь-яким зі способів, описаних в даному документі, або будь-який матеріал, оброблений будь-яким із способів, описаних в даному документі, можна потім ущільнювати, наприклад, як описано в патентній заявці США Мо 12/429045 і в міжнародній патентній заявці Ме МО 2008/073186, повні описи яких включені в даний документ за допомогою посилання.

Обробка випромінюванням

Одну або більше методик обробки випромінюванням можна використовувати для обробки біомаси, наприклад, для функціоналізації матеріалу. Випромінюванням можна також стерилізувати матеріали або будь-яке середовище, необхідне для біологічної обробки матеріалу.

У деяких варіантах здійснення на матеріал впливає енергія, яса вибиває електрон з його атомної орбіталі і використовується для опромінення матеріалів. Випромінювання можуть створювати (1) важкі заряджені частинки, в тому числі альфа-частинки або протони, (2) електрони, що утворюються, наприклад, при бета-розпаді або в прискорювачах електронного пучка, або (3) електромагнітне випромінювання, наприклад, гамма-випромінювання, рентгенівське випромінювання або ультрафіолетове випромінювання. У одному підході випромінювання, що виробляється радіоактивними речовинами, можна використовувати для опромінення вихідного матеріалу. У іншому підході електромагнітне випромінювання (наприклад, отримане за допомогою генераторів електронного пучка) можна використовувати для опромінення вихідного матеріалу. У деяких варіантах здійснення можна використовувати будь-яке поєднання способів (1)-(3), що застосовуються в будь-якому порядку або одночасно.

Використовувані дози опромінення залежать від необхідного ефекту і конкретного вихідного матеріалу.

У деяких випадках, коли бажано розщеплення ланцюга і/або бажана функціоналізація ланцюга полімеру, можна використовувати більш важкі частинки, ніж електрони, в тому числі протони, ядра гелію, іони аргону, іони кремнію, іони неону, іони вуглецю, іони фосфору, іони кисню або они азоту. Коли бажано розщеплення ланцюга з розкриттям циклу, можна використовувати позитивно заряджені частинки внаслідок їх властивостей кислоти Льюїса для прискорення розщеплення ланцюга з розкриттям циклу. Наприклад, коли потрібне максимальне окиснення, можна використовувати іони кисню, і коли потрібно максимальне нітрування, можна 60 використовувати іони азоту. Використання важких частинок і позитивно заряджених частинок описане в патентній заявці США Мо 12/417699, повний опис якої включения в даний документ за допомогою посилання.

У одному способі перший матеріал, який являє собою або включає целюлозу, що має середньочисельну молекулярну масу (ММ1), опромінюють, наприклад, шляхом впливу іонізуючого випромінювання (наприклад, у вигляді гамма-випромінювання, рентгенівського випромінювання, ультрафіолетового (УФ) світла з довжиною хвилі від 100 нм до 280 нм, пучка електронів або інших заряджених частинок), щоб отримати другий матеріал, який включає целюлозу, що має другу середньочисельну молекулярну масу (ММ2), яка складає менше ніж перша середньочисельна молекулярна маса. Другий матеріал (або перший і другий матеріали) можна поєднувати з мікроорганізмом (із застосуванням або без застосування ферментативної обробки), який може використовувати другий і/або перший матеріал або цукор, що міститься в йому або лігнін для отримання проміжного або кінцевого продукту, в тому числі тих, які описані в даному документі.

Оскільки другий матеріал включає целюлозу, що має меншу молекулярну масу в порівнянні з першим матеріалом, і в деяких випадках, також і менший ступінь кристалічності, другий матеріал звичайно краще диспергується, набухає і/або розчиняється, наприклад, в розчині, що містить мікроорганізм і/або фермент. Ці властивості роблять другий матеріал легше оброблюваним і більш сприйнятливим до хімічного, ферментативного і/або біологічного впливу в порівнянні з першим матеріалом, що може значно підвищувати швидкість виробництва і/або рівень виробництва цільового продукту, наприклад, етанолу.

У деяких варіантах здійснення друга середньочисельна молекулярна маса (ММ2) нижча, ніж перша середньочисельна молекулярна маса (ММ) більше ніж на приблизно 10 95, наприклад, більше ніж на приблизно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 95, 60 95 або навіть більше ніж на приблизно 75 90.

У деяких випадках другий матеріал включає целюлозу, яка має кристалічність (С2), яка нижча, ніж кристалічність (С1) целюлозі першого матеріалу. Наприклад, значення С2 може бути нижчим, ніж значення С1 більше ніж на приблизно 10 95, наприклад, більше ніж на приблизно 15, 20, 25, 30, 35, 40 або навіть більше ніж на приблизно 50 95.

У деяких варіантах здійснення вихідний індекс кристалічності (до опромінення) складає від

Ко) приблизно 40 до приблизно 87,5 95, наприклад, від приблизно 50 до приблизно 75 95 або від приблизно 60 до 70 95, і індекс кристалічності після опромінення складає від приблизно 10 до 50 95, наприклад, від приблизно 15 до приблизно 45 95 або від приблизно 20 до приблизно 40 95.

Однак в деяких варіантах здійснення, наприклад, після високої дози опромінення, можна отримати індекс кристалічності, що складає менше ніж 595. У деяких варіантах здійснення матеріал після опромінення є практично аморфним.

У деяких варіантах здійснення вихідна середньочисельна молекулярна маса (до опромінення) складає від приблизно 200000 до приблизно 3200000, наприклад, від приблизно 250000 до приблизно 1000000 або від приблизно 250000 до приблизно 700000, і середньочисельна молекулярна маса після опромінення складає від приблизно 50000 до приблизно 200000, наприклад, від приблизно 60000 до приблизно 150000 або від приблизно 70000 до приблизно 125000. Однак в деяких варіантах здійснення, наприклад, після високої дози опромінення, можна отримати середньочисельну молекулярну масу, що складає менше ніж приблизно 10000 або навіть менше ніж приблизно 5000.

У деяких варіантах здійснення другий матеріал може мати рівень окиснення (02), який вищий, ніж рівень окиснення (01) першого матеріалу. Вищий рівень окиснення матеріалу може сприяти можливості його диспергування, набухання і/або розчинення, додатково підвищуючи сприйнятливість матеріалу до хімічного, ферментативного або біологічного впливу. У деяких варіантах здійснення для збільшення рівня окиснення другого матеріалу в порівнянні з першим матеріалом опромінення здійснюють в окиснювальному середовищі, наприклад, в атмосфері повітря або кисню, отримуючи другий матеріал, який є більш окисненим, ніж перший матеріал.

Наприклад, другий матеріал може мати більше гідроксильних груп, альдегідних груп, кетонних груп, складноефірних груп або карбоксильних груп, що може підвищити його гідрофільність.

Іонізуюче випромінювання

Кожний вид випромінювання іонізує вуглецьвмісний матеріал за допомогою певної взаємодії, яку визначає енергія випромінювання. Важкі заряджені частинки іонізують речовину, головним чином, за допомогою кулонівського розсіювання; крім того, в цих взаємодіях утворюються високоенергетичні електрони, які можуть додатково іонізувати речовину. Альфа- частинки являють собою ядра атомів гелію і утворюються при альфі-розпаді ядер різних радіоактивних елементів, включаючи ізотопи вісмуту, полонію, астату, радону, францію, радію, бо ряду актинідів, включаючи актиній, торій, уран, нептуній, кюрій, каліфорній, америцій і плутоній.

Коли використовують частинки, вони можуть бути нейтральними (незарядженими), позитивно зарядженими або негативно зарядженими. Коли частинки є зарядженими, вони можуть нести одиничний позитивний або негативний заряд, кратні заряди, наприклад, одиничний, подвійний, потрійний або навіть четверний або вищі заряди. У тих випадках, де бажано розщеплення ланцюга, можуть виявитися бажаними позитивно заряджені частинки, частково внаслідок своєї кислотної природи. Коли використовують частинки, ці частинки можуть мати масу спокою електрона або вищу масу, яка, наприклад, в 500, 1000, 1500, 2000, 10000 або навіть 100000 разів перевищує масу спокою електрона. Наприклад, частинки можуть мати масу, що складає від приблизно 1 атомної одиниці до приблизно 150 атомних одиниць, наприклад, від приблизно 1 атомної одиниці до приблизно 50 атомних одиниць, або від приблизно 1 до приблизно 25, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12 або 15 атомних одиниць. Прискорювачі, що використовуються для прискорення частинок, можуть являти собою електростатичні прискорювачі постійного струму, електродинамічні прискорювачі постійного струму, радіочастотні лінійні, магнітно-індукційні лінійні або безперервно-хвильові пристрої. Наприклад, прискорювачі типу циклотрона постачає фірма ІВА (Бельгія), включаючи систему КподоїгопФ), в той час як прискорювачі постійного струму постачає фірма КОЇ (в данкй час ІВА Іпаивігіаї), включаючи ОупатійгопФ). Іони і іонні прискорювачі обговорюються в роботах Іпігодисіогу Мисієаг

Ріпузісз (Введення в ядерну фізику), автор Кеппеїй 5. Кгапе, видавництво Чопп УМіеу 5 5Оп5,

Іпс., 1988 р.; Кгео Ргеїес, Ріліка Вб, 1997 р., т. 4, с. 177-206; Спи, УМШат Т., "Омегміем/ ОЇ Сідпеіоп

Веат Тпегару" (Огляд по терапії пучком легких іонів), конференція ІСКО-ІАЕА, Колумбус, штат

Огайо, 18-20 березня 2006 р.; Імаїа, У. та ін., "АКегпайпд-Рпазе-Росизейд ІН-ОТІ. ог Неаму-іоп

Меадіса! Ассеїегатгє" (Сфокусований прогінно-трубчастий лінійний прискорювач типу Н з фазами, що чергуються, для медичних прискорювачів важких іонів), матеріали ЕРАС 2006 р.,

Единбург (Шотландія); і Іеаг ег, С. М. ї інш., "Майш5 ої Ше Зирегсопдисіїпд ЕСЕ Іоп боигсе

Мепив" (Стан надпровідного електронного циклотронного резонансного джерела іонів Мепив), матеріали ЕРАС 2000 р., Відень (Австрія).

Гамма-випромінювання має перевагу значної глибини проникнення в різноманітні матеріали.

Джерела гамма-випромінювання включають ядра радіоактивних елементів, в тому числі ізотопи кобальту, кальцію, технецію, хрому, галію, індію, йоду, заліза, криптону, самарію, селену,

Зо натрію, талію і ксенону.

Джерела рентгенівського випромінювання включають зіткнення електронного пучка з металевими мішенями, виготовленими, в тому числі, з вольфраму або молібдену або сплавів, або компактні джерела світла, в тому числі ті, які виробляє фірма І упсеап.

Джерела ультрафіолетового випромінювання включають дейтерієві або кадмієві лампи.

Джерела інфрачервоного випромінювання включають керамічні лампи з вікном з сапфіру, цинку або селеніду.

Джерела мікрохвильового випромінювання включають клістрони, радіочастотні джерела типу Слевіна (Зіеміп) або джерела атомних пучків, які використовують гази, в тому числі водень, кисень або азот.

У деяких варіантах здійснення пучок електронів використовують як джерело випромінювання. Пучок електронів має переваги високої потужності дози (наприклад, 1, 5 або навіть 10 Мрад на секунду), високої продуктивності, меншого об'єму і меншого вмісту обладнання. Електрони можуть також виявитися більш ефективними в реакціях розщеплення ланцюга. Крім того, електрони, що мають енергію від 4 до 10 МеВ, можуть маті глибину проникнення від 5 до 30 мм або більше, в тому числі 40 мм.

Електронні пучки можна створювати, використовуючи, наприклад, електростатичні генератори, каскадні генератори, генератори-трансформатори, низькоенергетичні прискорювачі з системою сканування, низькоенергетичні прискорювачі з лінійним катодом, лінійні прискорювачі і імпульсні прискорювачі. Електрони як джерело іонізуючого випромінювання можуть бути корисні, наприклад, для відносно тонких зрізів матеріалу, наприклад, менше ніж 0,5 дюйма, наприклад, менше ніж 0,4 дюйма, 0,3 дюйма, 0,2 дюйма, або менше ніж 0,1 дюйма (12,7, 10,16, 7,62, 5,08 або 2,54 мм, відповідно). У деяких варіантах здійснення енергія кожного електрона в електронному пучку складає від приблизно 0,3 МеВ до приблизно 2,0 МеВ (мільйонів електрон-вольт), наприклад, від приблизно 0,5 МеВ до приблизно 1,5 МеВ або від приблизно 0,7 МеВ до приблизно 1,25 МеВ.

Пристрої для опромінення електронним пучком можуть серійно виробляти фірми оп Веат

Арріїсайоп5, (Луве-ла-Нев, Бельгія) або Тіап Согрогйоп (Сан-Дієго, штат Каліфорнія). Типові енергії електронів можуть становити 1 МеВ, 2 МеВ, 4,5 МеВ, 7,5 МеВ або 10 МеВ. Типова потужність пристрою для опромінення електронним пучком може становити 1 кВт, 5 кВт, 10 кВт, 60 20 кВт, 50 кВт, 100 кВт, 250 кВт або 500 кВт. Рівень де полімеризації вихідного матеріалу залежить від використовуваної енергії електронів і застосовуваної дози, в той час як час опромінення залежить від потужності і дози. Типові дози можуть приймати значення, що становлять 1 кГр (кілогрей), 5 кГр, 10 кГр, 20 кГр, 50 кГр, 100 кГр або 200 кГр.

Пучки іонних частинок

Можна використовувати важчі частинки, ніж електрони, щоб опромінювати будь-який з матеріалів біомаси, описаних в даному документі. Наприклад, можна використовувати протони, ядра гелію, іони аргону, іони кремнію, іони неону, іони вуглецю, іони фосфору, іони кисню або іони азоту. У деяких варіантах здійснення частинки важчі ніж електрони можуть спричиняти більш значне розщеплення ланцюга (в порівнянні з частинками меншої маси). У деяких випадках позитивно заряджені частинки можуть виробляти більш значне розщеплення ланцюга, ніж негативно заряджені частинки, внаслідок своєї кислотності.

Пучок важчих частинок можна створювати, наприклад, використовуючи лінійні прискорювачі або циклотрони. У деяких варіантах здійснення енергія кожної частинки в пучку складає від приблизно 1,0 МевВ/ат. од. до приблизно 6000 МевВ/ат. од., наприклад, від приблизно З МеВ/ат. од. до приблизно 4800 МевВ/ат. од. або від приблизно 10 МеВ/ат. од. до приблизно 1000 МеВ/ат. од. (атомна одиниця).

У певних варіантах здійснення іонні пучки, що використовуються для опромінення вуглецевмісних матеріалів, наприклад, матеріалу біомаси, можуть включати іони більше ніж одного типу. Наприклад, іонні пучки можуть включати суміші іонів двох або більше (наприклад, трьох, чотирьох або більше) різних типів. Зразкові суміші можуть включати іони вуглецю і пре тони, іони вуглецю і іони кисню, іони азоту і протони, і іони заліза і протони. У більш загальному випадку суміші будь-яких вказаних вище іонів (або будь-яких інших іонів) можна використовувати для створення опромінюючих іонних пучків. Зокрема, суміші відносно легких і відносно важких іонів можна використовувати в одному іонному пучку.

У деяких варіантах здійснення іонні пучки для опромінення матеріалів включають позитивно заряджені іони. Позитивно заряджені іони можуть включати, наприклад, позитивно заряджені іони водню (наприклад, протони), іони інертних газів (включаючи, наприклад, гелій, неон, аргон), іони вуглецю, іони азоту, іони кисню, іони кремнію, іони фосфору і іони металів, в тому числі іони натрію, іони кальцію і/або іони заліза. Без наміру слідувати якій-небудь теорії, вважають,

Зо що вказані позитивно заряджені іони виявляють хімічні властивості кислот Льюїса при впливі на матеріали, ініціюючи і підтримуючи реакції катіонного розщеплення ланцюга з розкриттям циклу в окиснювальному середовищі.

У певних варіантах здійснення іонні пучки для опромінення матеріалів включають негативно заряджені іони. Негативно заряджені іони можуть включати, наприклад, негативно заряджені водень іони (наприклад, гідрид-іони) і негативно заряджені іони різних відносно електронегативних ядер (наприклад, іони кисню, іони азоту, іони вуглецю, іони кремнію і іони фосфору). Без наміру слідувати якій-небудь теорії, вважають, що такі негативно заряджені іони виявляють хімічні властивості основ Льюїса при впливі на матеріали, ініціюючи і підтримуючи реакції катіонного розщеплення ланцюга з розкриттям циклу у відновному середовищі.

У деяких варіантах здійснення пучки для опромінення матеріалів можуть включати нейтральні атоми. Наприклад, пучки, що містять будь-який один або більше видів атомів з числа, до яких належать атоми водню, атоми гелію, атоми вуглецю, атоми азоту, атоми кисню, атоми неону, атоми кремнію, атоми фосфору, атоми аргону і атоми заліза, використовують для опромінення матеріалу біомаси. Як правило, в пучках можуть бути присутніми суміші атомів двох або більше типів (наприклад, трьох або більше, чотирьох або більше, або ще більше типів).

У певних варіантах здійснення іонні пучки, що використовуються для опромінення матеріалів, включають іони з одиничним зарядом, в:ому числі один або більше з іонів Не, Н-,

Нехж, Меж, Аг, Ск, С-, Ож, 0-, М, М-, бів, 5і-, Ра, Р-, Маж, Саж і Беж. У деяких варіантах здійснення іонні пучки можуть включати іони з кратними зарядами, в тому числі один або більше з іонів С2ж СЗж, С4ж, МЗ, МБ, М3-, О2ж, 02-, О22-, Бідя, зійя, 5і2- і 5і4-. Як правила, іонні пучки можуть також включати більш складні багатоядерні іони, які несуть кратні позитивні або негативні заряди. У певних варіантах здійснення, внаслідок структури багатоядерного іона, позитивні або негативні заряди можуть ефективно розподілятися по практично всій структурі іонів. У деяких варіантах здійснення позитивні або негативні заряди можуть в деякій мірі локалізуватися на частинах структури іонів.

Електромагнітне випромінювання

У варіантах здійснення, в яких опромінення здійснюють за допомогою електромагнітного випромінювання, електромагнітне випромінювання може мати, наприклад, енергію на фотон (в 60 електрон-вольтах), що складає більше ніж 102 еВ, наприклад, більше ніж 103, 104, 105, 106 або навіть більше ніж 107 еВ. У деяких варіантах здійснення електромагнітне випромінювання має енергію на фотон, що складає від 104 до 107, наприклад, від 105 до 106 еВ. Електромагнітне випромінювання може мати частоту, що складає, наприклад, більше ніж 1016 Гц, більше ніж 1017 Гц, 1018, 1019, 1020 або навіть більше ніж 1021 Гц. У деяких варіантах здійснення електромагнітне випромінювання має частоту, що складає від 1018 до 1022 Гц, наприклад, від 1019до 1021 Гц.

Гасіння і регульована функціоналізація біомаси

Після обробки іонізуючим випромінюванням будь-який з матеріалів або сумішей, описаних в даному документі, можуть ставати іонізованими; тобто оброблений матеріал може включати радикали, які можна виявити за допомогою спектрометра електронного парамагнітного (спінового) резонансу. Якщо іонізована біомаса залишається в атмосфері, вона буде окиснюватися, в тому числі в такій мірі, що карбоксильні групи утворюються в реакції з атмосферним киснем. У деяких випадках для деяких матеріалів таке окиснення (бажаним, тому що воно може сприяти подальшому зменшенню молекулярної маси вуглецьвмісної біомаси, і окиснення груп, наприклад, карбоксильних груп, може бути корисним для розчинності і використання мікроорганізмів в деяких випадках. Однак оскільки радикали можуть "жити" протягом деякого часу після опромінення, наприклад, більше ніж 1 доба, 5 діб, ЗО діб, З місяці, 6 місяців або навіть більше ніж 1 рік, властивості матеріалу можуть продовжувати змінюватися з плином часу, що в деяких випадках може виявитися небажаним. Таким чином, може виявитися бажаним гасіння іонізованого матеріалу.

Після іонізації будь-який матеріал біомаси, який був іонізований, можна гасити, щоб зменшити рівень радикалів в іонізованій біомасі, наприклад, таким чином, щоб радикали перестали виявлятися за допомогою спектрометра електронного парамагнітного резонансу.

Наприклад, радикали можна гасити шляхом прикладання достатнього тиску до біомаси і/або шляхом використання в контакті з іонізованою біомасою текучого середовища, в тому числі газоподібного або рідкого, що вступає в реакцію (гасіння) з радикалами. Введення газу або рідини, щоб щонайменше сприяти гасінню радикалів, можна використовувати для функціоналізації іонізованої біомаси, шляхом утворення функціональних груп бажаної кількості і виду, включаючи карбоксильні групи, енольні групи, альдегідні групи, нітрогрупи, нітрильні

Зо групи, аміногрупи, алкіламіногрупи, алкільні групи, хлоралкільні групи або хлорфторалкільні групи.

У деяких випадках таке гасіння може поліпшувати стійкість деяких іонізованих матеріалів біомаси. Наприклад, гасіння може підвищувати стійкість біомаси до окиснення. Функціоналізація шляхом гасіння може також поліпшувати розчинність будь-якої біомаси, описаної в даному документі, може підвищувати термічну стійкість і може прискорювати утилізацію матеріалу різноманітними мікроорганізмами. Наприклад, функціональні групи, що утворюються в матеріалі біомаси в процесі гасіння, можуть виступати як місця специфічної адсорбції для прикріплення мікроорганізмів, наприклад, щоб прискорити гідроліз целюлози різними мікроорганізмами.

У деяких варіантах здійснення гасіння включає прикладання тиску до біомаси, в тому числі за допомогою механічної деформації біомаси, наприклад, безпосереднього механічного стиснення біомаси по одному, двох або трьох напрямках, або прикладанням тиску до текучого середовища, в яке занурена біомаса, використовуючи, наприклад, ізостатичне стиснення. У таких випадках сама деформація матеріалу виробляє радикали, які часто захоплюються в доменах кристалічної структури в досить тісній близькості один від одного, в результаті чого радикали можуть рекомбінувати або реагувати з іншою групою.

У деяких випадках тиск прикладають разом з підведенням тепла, в тому числі достатньої кількості тепла для підвищення температури біомаси вище ніж температура плавлення або температуру розм'якшення компонента біомаси, в тому числі лігніну, целюлози або геміцелюлози. Нагрівання може підвищувати рухливість молекул матеріалу, що може сприяти гасінню радикалів. Коли тиск використовують для гасіння, цей тиск може складати більше ніж приблизно 1000 фунтів на кв. дюйм (7 МПа), в тому числі більше ніж приблизно 1250 фунтів на кв. дюйм (8,75 МПа), 1450 фунтів на кв. дюйм (10,15 МПа), 3625 фунтів на кв. дюйм (25,38 МПа), 5075 фунтів на кв. дюйм (35,53 МПа), 7250 фунтів на кв. дюйм (50,75 МПа), 10000 фунтів на кв. дюйм (70 МПа) або навіть більше ніж 15000 фунтів на кв. дюйм (105 МПа).

У деяких варіантах здійснення гасіння включає контакт біомаси з текучим середовищем, в тому числі рідким або газоподібним, наприклад, газом, здатним реагувати з радикалами, в тому числі ацетиленом або сумішшю ацетилену з азотом, етиленом, хлорованими етиленами або хлорфторетиленами, пропіленом або сумішшю цих газів. У інших певних варіантах здійснення гасіння включає контакт біомаси з рідиною, наприклад, рідиною, яка розчиняється, або бо щонайменше здатна проникати в біомасу і реагувати з радикалами, в тому числі дієном, в тому числі 1,5-циклооктадієном. У деяких особливих варіантах здійснення гасіння включає контакт біомаси з антиоксидантом, в тому числі вітаміном Е. За необхідності вихідний матеріал біомаси може включати диспергований в ній антиоксидант, і гасіння може відбуватися при контакті з радикалами антиоксиданту, диспергованого у вихідному матеріалі біомаси.

Функціоналізацію можна посилювати, використовуючи важкі заряджені іони, в тому числі будь-які з важких іонів, описаних в даному документі. Наприклад, якщо бажано прискорити окиснення, для опромінення можна використовувати заряджені іони кисню. Якщо бажані азотні функціональні групи, можна використовувати іони азоту або аніони, які включають азот.

Аналогічним чином, якщо бажані групи, що містять сірку або фосфор, в опроміненні можна використовувати іони сірки або фосфору.

Дози

У деяких випадках опромінення здійснюють при потужності дози, що складає більше ніж приблизно 0,25 Мрад на секунду, наприклад, більше ніж приблизно 0,5, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0 або навіть більше ніж приблизно 2,5 Мрад на секунду. У деяких варіантах здійснення опромінення здійснюють при потужності дози, що складає від 5,0 і 1500,0 кілорад/год., наприклад, від 10,0 до 750,0 кілорад/год. або від 50,0 до 350,0 кілорад/год.

У деяких варіантах здійснення опромінення (при використанні будь-якого джерела випромінювання або поєднання джерел) здійснюють доти, доки матеріал не отримає дозу, що становить щонайменше 0,1 Мрад, щонайменше 0,25 Мрад, наприклад, щонайменше 1,0 Мрад, щонайменше 2,5 Мрад, щонайменше 5,0 Мрад, щонайменше 10,0 Мрад, щонайменше 60 Мрад або щонайменше 100 Мрад. У деяких варіантах здійснення опромінення здійснюють доти, доки матеріал не отримає дозу, що складає від приблизно 0,1 Мрад до приблизно 500 Мрад, від приблизно 0,5 Мрад до приблизно 200 Мрад, від приблизно 1 Мрад до приблизно 100 Мрад або від приблизно 5 Мрад до приблизно 60 Мрад. У деяких варіантах здійснення застосовують відносно низьку дозу опромінення, що складає, наприклад, менше ніж 60 Мрад.

Ультразвукова обробка

Ультразвукова обробка може зменшувати молекулярну масу і/або кристалічність матеріалів, в тому числі одного або більше з будь-яких матеріалів, описаних в даному документі, включаючи, наприклад, один або більше за вуглеводних джерел, в тому числі целюлозні або

Зо лігноцелюлозні матеріали, або крохмальні матеріали. Ультразвукову обробку можна також використовувати для стерилізації матеріалів.

У одному способі, перший матеріал, який включає целюлозу, що має першу середньочисельну молекулярну масу (ММ), диспергований в середовищі, в тому числі воді, і оброблений ультразвуком і/або іншим способом підданий кавітації, щоб отримати другий матеріал, який включає целюлозу, що має другу середньочисельну молекулярну масу (ММ), яка нижча, ніж перша середньочисельна молекулярна маса. Другий матеріал (або перший і другий матеріал в певних варіантах здійснення) можна поєднувати з мікроорганізмом (із застосуванням або без застосування ферментативної обробки), який може використовувати другий і/або перший матеріал, щоб виробляти проміжний або кінцевий продукт.

Оскільки другий матеріал включає целюлозу, що має зменшену молекулярну масу в порівнянні з першим матеріалом, а в деяких випадках також і зменшену кристалічність, другий матеріал, як правило, краще диспергується, набухає і/або розчиняється, наприклад, в розчині, що містить мікроорганізм.

У деяких варіантах здійснення друга середньочисельна молекулярна маса (ММ2) складає менше, ніж перша середньочисельна молекулярна маса (ММ) більше ніж на приблизно 10 95, наприклад, більше ніж на приблизно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 95, 60 95, або навіть більше ніж на приблизно 75 95.

У деяких випадках другий матеріал включає целюлозу, яка має кристалічність (С2), що складає менше, ніж кристалічність (С1) целюлози першого матеріалу. Наприклад, величина С2

БО може бути меншою, ніж величина С1 більше ніж на приблизно 10 95, наприклад, більше ніж на приблизно 15, 20, 25, 30, 35, 40 або навіть більше ніж на приблизно 50 95.

У деяких варіантах здійснення вихідний індекс кристалічності (до ультразвукової обробки) складає від приблизно 40 до приблизно 87,5 95, наприклад, від приблизно 50 до приблизно 75 95 або від приблизно 60 до приблизно 70 9б, і індекс кристалічності після ультразвукової обробки складає від приблизно 10 до приблизно 50 95, наприклад, від приблизно 15 до приблизно 45 95 або від приблизно 20 до приблизно 40 95. Однак в певних варіантах здійснення наприклад, після значної ультразвукової обробки, можна отримати індекс кристалічності, що складає менше ніж 595. У деяких варіантах здійснення матеріал після ультразвукової обробки є практично аморфним.

У деяких варіантах здійснення вихідна середньочисельна молекулярна маса (до ультразвукової обробки) складає від приблизно 200000 до приблизно 3200000, наприклад, від приблизно 250000 до приблизно 1000000 або від приблизно 250000 до приблизно 700000, і середньочисельна молекулярна маса після ультразвукової обробки складає від приблизно 50000 до приблизно 200000, наприклад, від приблизно 60000 до приблизно 150000 або від приблизно 70000 до приблизно 125000. Однак в деяких варіантах здійснення, наприклад, після значної ультразвукової обробки, можна отримати середньочисельну молекулярну масу, що складає менше ніж приблизно 10000 або навіть менше ніж приблизно 5000.

У деяких варіантах здійснення другий матеріал може мати рівень окиснення (02), який вищий, ніж рівень окиснення (01) першого матеріалу. Вищий рівень окиснення матеріалу може сприяти можливості його диспергування, набухання і/або розчинення, додатково підвищуючи сприйнятливість матеріалу до хімічного, ферментативного або мікробного впливу. У деяких варіантах здійснення, щоб підвищити рівень окиснення другого матеріалу в порівнянні з першим матеріалом, ультразвукову обробку здійснюють в окиснювальному середовищі, отримуючи другий матеріал, який є в більшій мірі окисненим, ніж перший матеріал. Наприклад, другий матеріал може містити більше гідроксильних груп, альдегідних груп, кетонних груп, складноефірних груп або карбоксильних груп, що може збільшити його гідрофільність,

У деяких варіантах здійснення середовище ультразвукової обробки являє собою водне середовище. При необхідності середовище може включати окисник, в тому числі пероксид (наприклад, пероксид водню), диспергатор і/або буфер. Приклади диспергаторів включають іонні диспергатори, наприклад, лаурилсульфат натрію, і неіонні диспергатори, наприклад, поліетиленгліколь.

У інших варіантах здійснення середовище ультразвукової обробки є неводним. Наприклад, ультразвукову обробку можна здійснювати у вуглеці, включаючи, наприклад, толуол або гептан, простому ефірі, включаючи, наприклад, діетиловий ефір або тетрагідрофуран, або навіть в зрідженому газі, включаючи, наприклад, аргон, ксенон або азот.

Піроліз

Можна використовувати один або більше способів піролітичної обробки, щоб фізично обробляти матеріал біомаси. Піроліз можна також використовувати для стерилізації матеріалу.

Зо У одному прикладі перший матеріал, який включає целюлозу, що має першу середньочисельну молекулярну масу (ММ), піддають піролізу, наприклад, шляхом нагрівання першого матеріалу в трубчастій печі (в присутності або за відсутності кисню), щоб отримати другий матеріал, який включає целюлозу, що має другу середньочисельну молекулярну масу (ММ2), яка нижча, ніж перша середньочисельна молекулярна маса.

У деяких варіантах здійснення друга середньочисельна молекулярна маса (ММ2) є нижчою, ніж перша середньочисельна молекулярна маса (ММ1) більше ніж на приблизно 10 95, наприклад, більше ніж на приблизно 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 95, 60 95 або навіть більше ніж на приблизно 75 95.

У деяких випадках другий матеріал включає целюлозу, яка має кристалічність (С2), меншу ніж кристалічність (С1) целюлози першого матеріалу. Наприклад, значення (С2) може бути нижчим, ніж значення (С1) більше ніж на приблизно 10 95, наприклад, більше ніж на приблизно 15, 20, 25, 30, 35, 40 або навіть більше ніж на приблизно 50 95.

У деяких варіантах здійснення вихідний індекс кристалічності (до піролізу) складає від приблизно 40 до приблизно 87,5 95, наприклад, від приблизно 50 до приблизно 75 95 або від приблизно 60 до приблизно 70 90, і індекс кристалічності після піролізу складає від приблизно 10

БО до приблизно 50 95, наприклад, від приблизно 15 до приблизно 45 95 або від приблизно 20 до приблизно 40 95.

Однак в певних варіантах здійснення, наприклад, після значного піролізу, можна отримати індекс кристалічності, що складає менше ніж 5 95. У деяких варіантах здійснення матеріал після піролізу є практично аморфним.

У деяких варіантах здійснення вихідна середньочисельна молекулярна маса (до піролізу) складає від приблизно 200000 до приблизне 3200000, наприклад, від приблизно 250000 до приблизно 1000000 або від приблизно 250000 до приблизно 700000, і середньочисельна молекулярна маса після піролізу складає від приблизно 50000 до приблизно 200000, наприклад, від приблизно 60000 до приблизно 150000 або від приблизно 70000 до приблизно 125000. 60 Однак в деяких варіантах здійснення, наприклад, після значного піролізу, можна отримати середньочисельну молекулярну масу, що складає менше ніж приблизно 10000 або навіть менше ніж приблизно 5000.

У деяких варіантах здійснення другий матеріал може мети рівень окиснення (02), який є вищим, ніж рівень окиснення (01) першого матеріалу. Вищий рівень окиснення матеріалу може сприяти можливості його диспергування, набухання і/або розчинення, додатково підвищуючи сприйнятливість матеріалу до хімічного, ферментативного або мікробного впливу. У деяких варіантах здійснення, щоб підвищити рівень окиснення другого матеріалу в порівнянні з першим матеріалом, піроліз здійснюють в окиснювальному середовищі, отримуючи другий матеріал, який є окисненим в більшій мірі, ніж перший матеріал. Наприклад, другий матеріал може містити більше гідроксильних груп, альдегідних груп, кетонних груп, складноефірних груп або карбоксильних груп, ніж перший матеріал, в результаті чого збільшується гідрофільність матеріалу.

У деяких варіантах здійснення піроліз матеріалів є безперервним. У інших варіантах здійснення матеріал піддають піролізу протягом заданого періоду часу і потім залишають охолоджуватися протягом другого заданого періоду часу, перш ніж знову піддати його піролізу.

Окиснення

Один або більше способів окиснювальної обробки можна використовувати для фізичної обробки матеріалу біомаси. Умови окиснення можна змінювати, наприклад, залежно від вмісту лігніну у вихідному матеріалі, причому вищий ступінь окиснення, як правило, є бажаним для вищого вмісту лігніну з вихідних матеріалах.

У одному способі перший матеріал, який включає целюлозу, що має першу середньочисельну молекулярну масу (ММІ) і має перший вміст кисню (01), окиснюють, наприклад, нагріванням першого матеріалу в потоці повітря або збагаченого киснем повітря, щоб отримати другий матеріал, який включає целюлозу, що має другу середньочисельну молекулярну масу (ММ2), і має другий вміст кисню (02), що перевищує перший вміст кисню (01).

Друга середньочисельна молекулярна маса другого матеріалу, як правило, складає менше, ніж перша середньочисельна молекулярна маса першого матеріалу. Наприклад, молекулярну масу можна зменшувати в такій же мірі, як обговорювалося вище відносно інших видів фізичної

Зо обробки. Кристалічність другого матеріалу можна також зменшувати в такій же мірі, як обговорювалося вище відносно інших видів фізичної обробки.

У деяких варіантах здійснення другий вміст кисню складає щонайменше на приблизно п'ять процентів вище, ніж перший вміст кисню, наприклад, на 7,5 95 вище, на 10,0 95 вище, на 12,5 95 вище, на 15,0 95 вище або на 17,5 95 вище. У деяких переважних варіантах здійснення другий вміст кисню складає щонайменше на приблизно 20,0 95 вище, ніж перший вміст кисню першого матеріалу. Вміст кисню вимірюють елементним аналізом шляхом піролізу зразка в печі, яка працює при 1300 "С або вищій температурі. Прийнятним пристроєм для елементного аналізу є аналізатор ГЕСО СНМ5-932 з піччю МТЕ-900 для високотемпературного піролізу.

Як правило, окиснення матеріалу відбувається в окиснювальному середовищі. Наприклад, окиснення можна здійснювати або йому можна сприяти шляхом піролізу в окиснювальному середовищі, в тому числі в атмосфері повітря або збагаченого повітрям аргону. Щоб сприяти окисненню, можна додавати різні хімічні реагенти, в тому числі окисники, кислоти або основи до матеріалу до, або під час окиснення. Наприклад, пероксид (наприклад, бензоїлпероксид) можна додавати до окиснення.

У деяких окиснювальних способах зменшення стійкості вихідного матеріалу біомаси використовують хімічні реакції типу реакції Фентона (Репіоп). Такі способи описані, наприклад, в патентній заявці США Мо 12/6392:39, повний опис якої включений в даний документ за допомогою посилання.

Зразкові окисники включають пероксиди, в тому числі пероксид водню і бензоїлпероксид, персульфати, в тому числі персульфат амонію, активовані форми кисню, в тому числі озон, перманганати, в тому числі перманганат калію, перхлорати, в тому числі перхлорат натрію, і гіпохлорити, в тому числі гіпохлорит натрію (відбілювач для домашнього господарства).

У деяких ситуаціях в процесі контакту величину рН підтримують на рівні або нижче ніж приблизно 5,5, в тому числі в інтервалі від 1 до 5, від 2 до 5, від 2,5 до 5 або від приблизно З до 5.

Умови окиснення можуть також включати період контакту, що складає від 2 до 12 годин, наприклад, від 4 до 10 годин або від 5 до 8 годин. У деяких випадках температуру підтримують на рівні або нижче ніж 300 "С, наприклад, на рівні або нижче ніж 250, 200, 150, 100 або 50 "С. У деяких випадках температура залишається практично такою, що дорівнює температурі бо навколишнього середовища, наприклад, на рівні або приблизно 20-25 "С.

У деяких варіантах здійснення один або більше окисників використовують у вигляді газу, в тому числі шляхом утворення озону на місці використання при опроміненні матеріалу через повітря пучком частинок, в тому числі електронів.

У деяких варіантах здійснення суміш додатково включає один або більше гідрохінонів, в тому числі 2,5-диметоксигідрохінон (ОМНО) і/або один або більше бензохінонів, в тому числі 2,5-диметокси-1,4-бензохінон (ОМВО), які можуть сприяти в реакції перенесення електронів.

У деяких варіантах здійснення один або більше окисників електрохімічно отримують на місці застосування. Наприклад, пероксид водню і/або озон можна електрохімічно виготовляти в контакті або в реакційній посудині.

Інші способи функціоналізації

Будь-який із способів даного параграфа можна використовувати індивідуально без яких- небудь способів, описаних в даному документі, або в поєднанні з будь-яким зі способів, описаних в даному документі (в будь-якому порядку): паровий вибух, хімічна обробка (наприклад, кислотна обробка (включаючи кислотну обробку концентрованими і розбавленими мінеральними кислотами, в тому числі сірчаною кислотою, соляною кислотою, і органічними кислотами, в тому числі трифтороцтовою кислотою) і/або лужна обробка (наприклад, обробка вапном або гідроксидом натрію)), ультрафіолетове опромінення, обробка методом черв'ячної екструзії (див., наприклад, патентну заявку США Мо 61/115398, подану 17 листопада, 2008 р.), обробка розчинниками (наприклад, обробка іонними рідинами) і кріопомел (див., наприклад, патентну заявку США Мо 12/502629).

Ферментація

Мікроорганізми можуть виробляти ряд корисних проміжних і кінцевих продуктів, в тому числі ті, які описані в даному документі, шляхом ферментації низькомолекулярного цукру в присутності функціоналізованого матеріалу біомаси. Наприклад, в ході ферментації або інших біопроцесів можна отримувати спирти, органічні кислоти, вуглеводні, водень, білки або суміші будь-яких даних матеріалів.

Мікроорганізм може являти собою природний мікроорганізм або генетично модифікований мікроорганізм. Наприклад, мікроорганізм може являти собою бактерію, наприклад, целюлітичну бактерію, грибок, наприклад, дріжджі, рослину або протист, наприклад, водорість, найпростіше

Зо або грибоподібний протист, наприклад, слизовик (міксоміцет). Коли організми є сумісними, можна використовувати суміші організмів.

Прийнятні для ферментації мікроорганізми мають здатність конвертувати вуглеводи, в тому числі глюкозу, ксилозу, арабінозу, манозу, галактозу, олігосахариди або полісахариди, в продукти ферментації. Ферментуючі мікроорганізми включають штами роду Засспаготусев5 (цукрові грибки), наприклад, види Засспаготусез сегемізіае (пекарські дріжджі), Засспаготусев аієтайсив, засспаготусев имагит; рід Кісумеготусев, наприклад, види Кіпсумеготусев5 тагхіапив,

Кісумеготусез пгадіїї5; рід Сапаїда (кандида), наприклад, Сапаїда рзеийдоїгорісаїї5, і Сапаїда ргаззісає, Ріспіа 5Ірійб (родич Сапаїда 5пепаїає), рід Сіамізрога, наприклад, види Сіамізрога

Ізйапіає і СІамізрога орипідає, рід Распузоїеп, наприклад, види Распузоїеп Таппорпйси5, рід

Вгегаппотусе5, наприклад, види Вгейаппотусе5 сіаизепії (РПйПрріді5 с. Р., розділ. СеїЇшозе

Віосопмегзіоп ТесппоЇоду (Технологія біоконверсії целюлози) в книзі Напабоок оп Віоеїапо!:

Ргодисійоп апа ій айноп (Довідник по біоетанолу: виробництво і застосування), під ред. М/Уутап

С. Е., видавництво Тауїог 8. Егапсі5, Вашингтон, округ Колумбія, 1996 р., с. 179-212).

Дріжджі, що є в продажу, включають, наприклад, Кей 5іа-5/Лезайте ЕЩШапої Кеа, постачальник Кей 5іаг// езайге (США); ЕАГІФ, постачальник Ріеізсптапп'5 Уеабі, відділення фірми Вигп5 РпПйр Роса Іпс. (США); 5БОРЕКЗТАКТФО, постачальник АШесі, в даний час

І агетапа; СЕКТ, постачальник Сегі 5ігапа АВ (Швеція); і РЕЕКМОІ Ф, постачальник О5М зЗресіанев.

У ферментації можна також використовувати бактерії, наприклад, 7утотопав5 торії» і

Сіозігідіпт (егптосеїйПшт (РпПіірріаїі5, 1996 р., див. вище).

Оптимальне значення рН для дріжджів складає приблизно від 4 до 5, в той час як оптимальне значення рнН для бактерій 2утотопах складає приблизно від 5 до 6. Типові терміни ферментації складають приблизно від 24 до 96 годин при температурі в інтервалі від 26 "С до 40 "С, однак термофильні мікроорганізми віддають перевагу вищим температурам.

У деяких варіантах здійснення процес ферментації можна переривати повністю або частково, перш ніж низькомолекулярний цукор буде повністю конвертований в етанол. Проміжні продукти ферментації включають висококонцентровані цукор і вуглеводи. Ці проміжні продукти ферментації можна використовувати в приготуванні їжі для людини або тварин. Додатково або, як альтернатива, проміжні продукти ферментації можна молоти, стримуючи дрібнодисперсні частинки, використовуючи лабораторний млин з неіржавіючої сталі і отримуючи схожий на борошно матеріал.

Можна використовувати мобільні ферментери, які описані у тимчасовій патентній заявці

США Мо 60/832735 і в опублікованій в даний час міжнародній патентній заявці Мо УМО 2008/011598.

Подальша обробка

Дистиляція

Після ферментації, отримані текучі середовища можна дистилювати, використовуючи, наприклад, "бражну колону", щоб відділити етанол і інші спирти від складаючої основну масу води і залишкової твердої фази. Пара, що виходить з колони, може містити, наприклад, 35 мас. о етанолу і може надходити в ректифікаційну колону. Майже азеотропну суміш (92,5 95) етанолу і води з ректифікаційної колони можна очищати і отримувати чистий (99,5 95) етанол, використовуючи парофазні молекулярні сита. Донні осади з бражної колони можна спрямовувати на першу стадію тристадійного випарника. Дефлегматор ректифікаційної колони може забезпечувати тепло для цієї першої стадії. Після першої стадії тверду фазу можна відділяти з допомогою центрифуги і сушити в роторній сушарці. Частину текучого середовища (25 до), що виходить з центрифуги, можна повертати на ферментацію, а залишок спрямовувати на другу і третю стадію випарника. Велику частину конденсату з випарника можна повертати в процес у вигляді досить чистого конденсату, а невелику частину відділяти для обробки стічної води, щоб запобігти утворенню низькокиплячих сполук.

Проміжні і кінцеві продукти

Способи, описані в даному документі, можна використовувати для виробництва одного або більше проміжних або кінцевих продуктів, включаючи енергію, паливо, харчові продукти і матеріали. Конкретні приклади продуктів включають, але не обмежуються цим, водень, спирти (наприклад, одноатомні спирти або двоатомні спирти, в тому числі етанол, н-пропанол або н- бутанол), гідратовані або водні спирти, наприклад, що містять більше ніж 10 95, 20 У», 30 95 або навіть більше ніж 40 95 води, ксиліт, цукри, біодизельне паливо, органічні кислоти (наприклад, оцтова кислота і/або молочна кислота), вуглеводні, супутні продукти (наприклад, білки, в тому числі целюлітичні білки (ферменти) або генетично однорідні білки) і суміші будь-яких даних продуктів в будь-яких поєднаннях або відносних концентраціях, і необов'язково в поєднанні з будь-якими добавками, включаючи, наприклад, паливні добавки. Інші приклади включають карбонові кислоти, в тому числі оцтову кислоту або масляну кислоту, солі карбонових кислот, суміші карбонових кислот і солей карбонових кислот, складні ефіри карбонових кислот (наприклад, метилові, етилові і н-пропілові складні ефіри), кетон (наприклад, ацетон), альдегіди (наприклад, ацетальдегід), а,З-ненасичені кислоти, в тому числі акрилову кислоту, і олефіни, в тому числі етилен. Інші спирти і похідні спиртів включають пропанол, пропіленгліколь, 1,4- бутандіол, 1,3-пропандіол, метиловий або етиловий простий ефір даних спиртів. Інші продукти включають метилакрилат, метилметакрилат, молочну кислоту, пропіонову кислоту, масляну кислоту, бурштинову кислоту, 3-гідроксипропіонову кислоту, солі будь-яких даних кислот і суміші будь-яких кислот і відповідних солей.

Інші проміжні і кінцеві продуктів, включаючи продукти харчування і фармацевтичні вироби, описані в патентній заявці США Мо 12/417900, повний опис якої включений за допомогою посилання в даний документ.

Приклади

Наступні приклади призначені для ілюстрації, а не обмеження об'єму даного опису.

Приклад 1. Отримання волокнистого матеріалу з паперу з багатошаровим покриттям

Партію, що містить 1500 фунтів (681 кг) невживаних півгалонових (1,89 л) упаковок для соку, виготовлених з білого крафт-картону з багатошаровим покриттям без друку, що має об'ємну густину 20 фунтів на куб. фут (320 кг/м3), отримували від фірми Іпіегпайопа! Рарег. Кожну упаковку складали в плоский стан і потім спрямовували в подрібнювач РіІїпсп Вацдп потужністю

З л.с. (2,24 кВт) зі швидкістю, яка становить приблизно від 15 до 20 фунтів на годину (1,89-2,52 г/с). Подрібнювач був обладнаний двома 12-дюймовими (30,48 см) обертовими лезами, двома нерухомими лезами і 0,30-дюймовим (7,62 мм) ситом на виході. Відстань між обертовими і нерухомими лезами встановлювали на рівні 0,10 дюйма (2,54 мм). Продукт, що виходить із подрібнювача, нагадував конфетті і мав ширину від 0,1 дюйма до 0,5 дюйма (2,54-12,7 мм), довжину від 0,25 дюйма до 1 дюйма (6,35-25,4 мм) і товщину, що дорівнює товщині вихідного матеріалу (приблизно 0,075 дюйма або 1,9 мм).

Матеріал, що нагадує конфетті, надходив в різак Мипбоп моделі 5230 з дисковими лезами.

Модель 5030 містить чотири обертові леза, чотири нерухомих леза і сито на виході, що має 1/8- бо дюймові (3,18 мм) отвори. Відстань між обертовими і нерухомими лезами встановлювали приблизно на рівні 0,020 дюйма (0,5 мм). Різак з дисковими лезами розрізав частинки, які нагадують конфетті, в поперечному лезам напрямку, розділяючи частинки і утворюючи волокнистий матеріал зі швидкістю, що складала приблизно один фунт на годину (0,126 г/с).

Волокнистий матеріал мав питому поверхню по методу ВЕТ 0,9748 м2/г -/-0,0167 м2/г, пористість 89,0437 95 і об'ємну густину (при абсолютному тиску 0,53 фунта на кв. дюйм або 3,71 кПа) 0,1260 г/мл. Середня довжина волокон становила 1,141 мм, і середня ширина волокон становила 0,027 мм, даючи середнє співвідношення 1 /0-42:1.

Приклад 2. Отримання волокнистого матеріалу з біленого крафт картону

Партію, що містить 1500 фунтів (681 кг) невживаного біленого білого крафт-картону, що має об'ємну густину 30 фунтів на куб. фут (480 кг/м3), отримували від фірми Іпіегпайопа! Рарег.

Матеріал складали в плоский стан і потім спрямовували в подрібнювач Ріїпсп Вашої потужністю

З л.с. (2,24 кВт) зі швидкістю, яка становить приблизно від 15 до 20 фунтів на годину (1,89-2,52 г/с). Подрібнювач був обладнаний двома 12-дюймовими (30,48 см) обертовими лезами, двома нерухомими лезами і 0,30-дюймовим (7,62 мм) ситом на виході. Відстань між обертовими і нерухомими лезами встановлювали на рівні 0,10 дюйма (2,54 мм). Продукт, що виходить із подрібнювана, нагадував конфетті і мав ширину від 0,1 дюйма до 0,5 дюйма (2,54-12,7 мм), довжину від 0,25 дюйма до 1 дюйма (6,35-25,4 мм) і товщину, що дорівнює товщині вихідного матеріалу (приблизно 0,075 дюйма або 1,9 мм). Матеріал, що нагадує конфетті, надходив у різак Мипзоп моделі 5230 з дисковими лезами. Сито на виході мало 1/8-дюймові (3,18 мм) отвори. Відстань між обертовими і нерухомими лезами встановлювали приблизно на рівні 0,020 дюйма (0,5 мм). Різак з дисковими лезами розрізав частинки, що нагадують конфетті, в поперечному лезам напрямку, розділяючи частинки і утворюючи волокнистий матеріал зі швидкістю, що складала приблизно один фунт на годину (0,126 г/с). Волокнистий матеріал імає питому поверхню по методу ВЕТ 1,1316 мг/г -/-0,0103 м2/г, пористість 88,3285 95 і об'ємну густину (при абсолютному тиску 0,53 фунта на кв. дюйм або 3,71 кПа) 0,1497 г/мл. Середня довжина волокон становила 1,063 мм, і середня ширина волокон становила 0,0245 мм, даючи середнє співвідношення І /0-43:Ї.

Приклад 3. Отримання двічі розрізаного волокнистого матеріалу з біленого крафт-картону

Партію, що містить 1500 фунтів (681 кг) невживаного біленого білого крафт-картону, що має

Зо об'ємну густину 30 фунтів на куб. фут (480 кг/м3), отримували від фірми Іпіегпайопа! Рарег.

З л.с. (2,24 кВт) зі швидкістю, яка становить приблизно від 15 до 20 фунтів на годину (1,89-2,52 г/с). Подрібнювач був обладнаний двома 12-дюймовими (30,48 см) обертовими лезами, двома нерухомими лезами і 0,30-дюймовим (7,62 мм) ситом на виході. Відстань між обертовими і нерухомими лезами встановлювали на рівні 0,10 дюйма (2,54 мм). Продукт, що виходить із подрібнювача, нагадував конфетті (див. вище). Матеріал, що нагадує конфетті, надходив в різак

Мипзоп моделі 5СЗ30 з дисковими лезами. Сито на виході мало 1/16-дюймові (1,59 мм) отвори.

Відстань між обертовими і нерухомими лезами встановлювали приблизно на рівні 0,020 дюйма (0,5 мм). Різак з дисковими лезами розрізав частинки, що нагадують конфетті, утворюючи волокнистий матеріал зі швидкістю, що складала приблизно один фунт на годину (0,126 г/с).

Отриманий після першого різання матеріал надходив назад і піддавався повторному різанню і. описаних вище умовах. Волокнистий матеріал мав питому поверхню по методу ВЕТ 1,4408 м2/г -/-0,0156 м2/г, пористість 90,8998 95 і об'ємну густину (при абсолютному тиску 0,53 фунта на кв. дюйм або 3,71 кПа) 0,1299 г/мл. Середня довжина волокон становила 0,891 мм, і середня ширина волокон становила 0,026 мм, даючи середнє співвідношення І /0-34:1.

Приклад 4. Отримання тричі розрізаного волокнистого матеріалу з біленого крафт-картону

Матеріал складали в плоский стан і потім спрямовували в подрібнювач Ріїпсп Вацди потужністю

Мипзоп моделі 5С30 з дисковими лезами. Сито на виході мало 1/8-дюймові (3,18 мм) отвори.

Відстань між обертовими і нерухомими лезами встановлювали приблизно на рівні 0,020 дюйма (0,5 мм). Різак з дисковими лезами розрізав частинки, що нагадують конфетті, в поперечному лезам напрямку. Отриманий після першого різання матеріал надходив назад в різак з такими ж умовами, але сито замінювали ситом з 1/16-дюймовими (1,59 мм) отворами. Матеріал різали. бо Отриманий після другого різання матеріал надходив назад в різак з такими ж умовами, але сито замінювали ситом з 1/32-дюймовими (0,79 мм) отворами. Матеріал різали. Отриманий волокнистий матеріал мав питому поверхню по методу ВЕТ 1,6897 м2/г ч/-0,0155 м2/г, пористість 87,7163 95 і об'ємну густину (при абсолютному тиску 0,53 фунта на кв. дюйм або 3,71 кПа) 0,1448 г/мл. Середня довжина волокон становила 0,824 мм, і середня ширина волокон становила 0,0262 мм, даючи середнє співвідношення І /0-32:1.

Приклад 5. Обробка електронним пучком

Зразки обробляли електронним пучком, використовуючи склепінчастий безперервний хвильовий прискорювач Кподоїгоп? ТТ200, що додає електронам енергії 5 МеВ при вихідній потужності 80 кВт. Таблиця 1 описує використовувані параметри. Таблиця 2 містить номінальні дози, використані для зразків з даними номерами (в Мрад) і відповідні дози, отриманих зразків (в кГр).

Таблиця 1

Параметри прискорювача КподоїгопФ ТТ 200 0 бПучокС Її

Склад виробленого пучка Прискорені електрони

Номінальна (фіксована): 10 МеВ (10 кеВ-250 кеВ)

Розкидання енергії при 10 МеВ Говна ширина на рівні напівмаксимуму (ЕУУНМ) 300

Енергія пучка при 10 МеВ Гарантований робочий інтервал від 1 до 80 кВт

Енергоспоживання.д//-/://СЇ1111111111111111111111111111111111 охолоджування включені)

При енергії пучка 50 кВт -210 кВт

При енергії пучка 80 кВт -260 кВт (Радіочастотнасистема.д//:/// ЇЇ 107,5:1 МГЦ

Тпотвоп ТН7ВІ

Скануючий рупор нІ6НІШІІООИЗТОВЛЛТЛВТЛВТЛТОТЛОТЛОТЛОТОТИТИТОТОТ

Весно НИЙ ПНТ ЗНИНННН . . - о. 120 см виміряна на відстані 25-35 см від вікна

Від 30 до 100 95 номінальної довжини сканування

Номінальна частота сканування (при 100 Гця5 95 максимальній довжині сканування)

Однорідність сканування (по 90 95 5 9/ номінальної довжини сканування) п

Таблиця 2

Дози, передані зразкам

Повна доза (Мрад) (число відповідає номеру зразка) Передана доза (кГр)! нини нн шинишшшш 100,0 150.3 198,3 330,9 529,0 695,9 993,6 "Наприклад, доза 9,9 кГр була передана за 11 секунд при струмі пучка 5 мА і лінійній швидкості 12,9 фут/хв. (6,55 см/с). Час охолоджування між операціями обробки складав приблизно 2 хвилини.

Приклад 6. Способи визначення молекулярної маси целюлозних і лігноцелюлозних матеріалів гельпроникою хроматографією

Целюлозні і лігноцелюлозні матеріали для аналізу обробляли згідно з прикладом 4. Зразки матеріалів, представлених в наступних таблицях, включають крафт-папір (Р), пшеничну солому (МУ5), люцерну (А), целюлозу (С), просо лозиноподібне (55), траву (С), крохмаль (51) і сахарозу (5). Число 132 в номері зразка означає розмір частинок матеріалу після різання і пропускання через сито з отворами розміром 1/32 дюйма (0,79 мм). Число після дефіса означає дозу випромінювання (Мрад) і 05 означає ультразвукову обробку. Наприклад, зразок під номером

Р132-10 означає крафт-папір, який нарізали до розміру частинок 132 меш і опромінювали дозою 10 Мрад.

Для зразків, які опромінювали пучки електронів, число після дефіса означає кількість енергії, переданої зразку. Наприклад, зразок під номером Р-100е означає крафт-папір, яким передана доза енергії, що становить приблизно 100 Мрад або приблизно 1000 кГр (таблиця 2).

Таблиця З

Середня пікова молекулярна маса опроміненого крафт-паперу

Джернлео Номер ах УдьтвазвукОова Єередвя зраз зважка (Мраду обробка" молекраврня масааєтанини не відхилення

МН ю й БІлОовжоеняя

Трабт-навівр РІЗАОВ цю я вачажво

РІЗКЕ 18 й йебккт ше 0 Так БК "х|мовірно, низькі дози випромінювання збільшують молекулярну масу деяких матеріалів. "Потужність дози-1 Мрад/год. гОбробка протягом 30 хвилин ультразвуком (20 кГц) за допомогою рупора потужністю 1000

Вт в умовах рециркуляції матеріалу, диспергованого у воді.

Таблиця 4

Середня пікова молекулярна маса крафт-паперу, опроміненого електронним пучком пт в

Лжерезео Немер да Середна молекула зразка зразка сМраль масажетинааотне візхиления

Крафе-наннь пе Е Бо

Ра З щен е ло Ів УНН?

Ве ЕТ що вл й ГНІВ

РАДО 1 зтльа

Таблиця 5

Середня пікова молекулярна маса матеріалу після гамма-опромінення ше | й щі затв ямі 1 10 й кН ЯК Я - В віза і ге й ДО ВНа я ТАН й й й яко БТ

З 7 я. ОЗ ОН

ІН ї то й ВОК ж в

З й М ша в

АТЦ З ще й ЗАЧ я д235

ВОЗ ШЕ т Є 1557550 АВ - Й й Я Я

З й й ЗаБЯ ж аа «амцьиг В т й дова я З вої Ек ще і ч й ве Я аа 1 1 Ме ЗИ В хх НУ

Ж " Й ДОК жк ЯвЯ " Злиття піків після обробки. " Імовірно, низькі дози випромінювання збільшують молекулярну масу деяких матеріалів. 1 Потужність дози - 1 Мрад/год. 2 Обробка протягом 30 хвилин ультразвуком (20 Гц) за допомогою рупора потужністю 1000 Вт в умовах рециркуляції матеріалу, диспергованого у воді.

Таблиця 6

Середня пікова молекулярна маса матеріалу, опроміненого електронним пучком пн нин

Номер зразка | Мені Ява зідхиження 1 ЗАТВ ях ЗУ

Але в: і 34459 5 482

Я ее --- жх Я ! ! аеЯО ЕН

Аве ря 5 ця их Бе 7 о я Ж са дідо ! «а 44328 к 33

Абе й 30 пам в ру й

Аве їй 50 назв

Сів ї 1 47383 ЗАВ й веж ке А ЯКЕ

З 3004 жк 25 ! Її ж БУТ хх БЕ я я 3 свв і 19 72836 54075 що - | ЗО жк Я о-0а 1 Зо 17153 390 се БОа З 50 18950 5 143 1 923335 х ТВ вт | о пом

Ка 1803655 033 ! Ї АБО - 18 це гакя ї Й с ХНН Ж ще й тод а В щт-ба 1 ві ООЗБЯ з 1370 ет іда Її 16 98050 ж 255 гена Ії ЗО а вс

ЗТ-7Ве З та ЗАЗа ж

Гельпронику хроматографію (СРС) використовують, щоб визначити молекулярно-масовий розподіл полімерів. У процесі аналізу методом СРС розчин зразка полімеру пропускають через колону, наповнену пористим гелем, який захоплює дрібні молекули. Зразок розділяють на основі молекулярного розміру, причому більш крупні молекули елююються швидше, ніж молекули меншого розміру. Час утримання кожного компонента найчастіше визначають, використовуючи показник заломлення (КІ), світгтлорозсіювання при випаровуванні (ЕІ! 5) або ультрафіолетове (УФ) світло і порівнюючи з калібрувальною кривою. Отримані дані потім використовують для обчислення молекулярно-масового розподілу зразка.

Саме розподіл молекулярної маси, а не окрему молекулярну масу використовують як характеристику синтетичних полімерів. Щоб охарактеризувати цей розподіл, використовують статистичні середні значення. Найбільш поширеними з цих середніх значень є "середньочисельна молекулярна маса" (Мп) і "середньомасова молекулярна маса" (Му).

Способи обчислення цих значень описані в техніці, наприклад, в прикладі 9 міжнародної патентної заявки Мо МО 2008/073186.

Індекс полідисперсності або РІ визначають як відношення Мм//Мп. Чим більше значення РІ, тим ширшим або більш дисперсним є даний розподіл. Мінімальне значення, яке може приймати

РІ, дорівнює 1. Це значення представляє монодисперсний зразок, тобто полімер, всі молекули якого в розподілі мають однакову молекулярну масу.

Значення пікової молекулярної маси (Мр) являє собою ще одну характеристику, що визначається як вид молекулярно-масового розподілу. Вона означає молекулярну масу, яка є найбільш поширеною в даному розподілі. Це значення також дає уявлення про суть молекулярно-масового розподілу.

Більшість вимірювань методом СРС проводять відносно різних стандартних полімерів.

Точність результатів залежить від того, наскільки близько співпадають характеристики полімеру, що аналізується, і використовуваного стандарту. Очікувана помилка у відтворюваності між різними серіями окремо каліброваних визначень становить приблизно 5- 10 95 і є характеристикою обмеженої точності аналізу методом СРС. Отже, результати ОРС виявляються найбільш корисними, коли порівняння між молекулярно-масовими розподілами різних зразків здійснюють в процесі однієї і тієї ж серії визначень.

Для лігнпоцелюлозних зразків було потрібне отримання зразка перед аналізом методом

СРС. Спочатку готували насичений розчин (8,4 мас. 95) хлориду літію (ІСІ) в диметилацетаміді (ОМАс). Приблизно 100 мг зразки додавали до приблизно 10 г свіжоприготованого насиченого розчину ГіСІ в ОМАс і нагрівали суміш до приблизно 150-170 "С при перемішуванні протягом 1 години. Отримані розчини звичайно мали колір від світло-жовтого до темно-жовтого.

Температуру розчинів знижували до приблизно 100 "С і продовжували нагрівання протягом 2 годин. Температуру розчинів потім знижували до приблизно 50 "С і нагрівали розчини зразків протягом приблизно 48-60 годин. Потрібно зазначити, що зразки, опромінені дозою 100 Мрад, легше солюбілізувались в порівнянні з необробленими аналогічними зразками. Крім того, подрібнені зразки (позначені номером 132) мали дещо менші середні молекулярні маси в

Зо порівнянні з неподрібненими зразками.

Отримані розчини зразків розбавляли в співвідношенні 1:11, використовуючи ЮМАс як розчинник, і фільтрували через фільтр з політетрафторетилену (РТЕЕ) з розміром отворів 0,45 мкм. Профільтровані розчини зразків потім аналізували методом СРС, використовуючи параметри, описані в таблиці 7. Значення середньої пікової молекулярної маси (Мр) зразків, визначені методом гельпроникої хроматографії (СРС), приведені в таблицях 3-6. Кожний зразок готували в двох екземплярах і кожний приготований зразок аналізували двічі (роблячи два уприскування), таким чином, для кожного зразка робили по чотири уприскування. Стандартні зразки РОТА і РБЗІ1ІВ з полістиролу ЕазіСакю використовували для побудови калібрувальної кривої для шкали молекулярної маси, що складає приблизно від 580 до 750000 дальтон.

Таблиця 7

Умови аналізу методом ОРС 10мМ-мМв-148-84; 10М-МВ-174-129

Приклад 7. Аналіз поверхні методом часопролітної мас-спектрометрії вторинних іонів (ТовБ-

ЗІМ5)

Часопролітна мас-спектрометрія вторинних іонів (ТОЕ-5ІМ5) являла собою чутливу до поверхні спектроскопію, в якій використовували імпульсні пучок іонів (С5 або мікрофокусований

Са) для зняття молекул з найбільш зовнішньої поверхні зразка. Частинки знімали з атомних моношарів на поверхні (вторинні іони). Ці частинки потім прискорювали в "пролітній трубці" і визначали їх масу, вимірюючи точний час досягнення ними детектора (тобто час прольоту).

Метод ТОоЕ-5ІМ5 надає докладну інформацію про елементарний і молекулярний склад поверхні,

тонкі шари і межі розділення зразка і забезпечує повний тривимірний аналіз. Його широко використовують, включаючи напівпровідники, полімери, фарби, покриття, скло, папір, метали, кераміку, біоматеріали, лікарські засоби і органічні тканини. Оскільки ТОЕ-5ІМ5 являє собою метод дослідження, він виявляє всі елементи періодичної системи, включаючи Н. Дані Товг- 5ІМ5 приведені в таблицях 8-11. Використані параметри приведені в таблиці 12.

Таблиця 8

Нормовані середні інтенсивності різних досліджених позитивних іонів (нормування відносно повного рахунку іонів "« 10000) о Ва во п Частивки Серед значенна о сСерезне начення є сСЕредне значення є

ШЕ Ма шо В 276 а 1 ЗВ

Її ді Ат З ва З Оу ч4 а КУ 75 45.5 157 ЗЕ 81 10.7

СН, ТА 7.8 1 -в 133 2 7 СУ 443 ха ТО Бо 718 я

Зо 3 ке в 483 З БУК «8

КЗ Са т їз Во 157 800 53 а СУ ЗУ ія: 5 ї1Бя чия 318

Сей 7 138 40,3 Я.Б аа 1 їй завів 5 115 ха 48 ШТ 5.3

Тт3 ОР КЕ т? Б 14 Я тв 347 сей тає 33 еВ 18 ЗВ. Я 07 Сем 17 тв 8 ЗА та 1 ща? зіва З З 1.05 1.4 Ба 107 т.е

Таблиця 9

Нормовані середні інтенсивності різних досліджених позитивних іонів (нормування відносно повного рахунку іонів "« 10000) ху в- із паж 00 Частинки Сенелюнк значення з Середне значенню З боерелнє значено за Е ТЗ а. ау ЗУ 15.5 15

За н за й.В ЕЙ 33 74 5.5 її Сн 15 щі ЯКЕ 5 що го 8 а 24 1 Кк ща 54 7 28 СМ НН ш. БІ ОА 43.5 1.4 хе оо 118 (У пяз У НАУ НА 45 Ох 187 пз те 1.55 їй їй

Таблиця 10

Нормовані середні інтенсивності різних досліджених позитивних іонів (нормування відносно повного рахунку іонів "« 10000) й Бота ре ов воще ува Й тпЖ и ХУЧОМИиХ пе х хееенох змахомих ікен. Тк ва ГУ 3 Ма жи о чих з ча ча 8» ЗО ох в3внм де Бен БУД НЕ не НС Кс Не Не КН кох З І В МИС т їх С 118 З З 35 їх тв в 18 АХ їв НЯ БІ 27 СМ Ми я Б бе 565 їяз МБО я 707 ові БК НЕ

Бі з» 16 3555 ха Не 185 ЩЕ щі мо Я Оу ща 33 Му ТК ОО ЯЖ о Ба ОВО 55 18 ми 85 вБі З 0745 ТЗ

СВ; а ме 435 5 а та ЗК: У Не М Я, В ке: ТК

Т-В Сойів ав я се їз 5 та За Уя шт 61 ща па

ТЗ На З Зх ВО ха 72 ТУ нн вн ОК 38 ЗВ Ж

БЕ У ЕМ у В Я: ВИ З ВИ ВЕ 3 щі а ж 3 153 ЗУ

З? се БОБ пате ОЗ Бі ям ба З 039 ЗР МЕ ОВ ОВ 84 бинейб; Б 305 з00 3130 095 0205 ові - ОБ з ож о

Таблиця 11

Нормовані середні інтенсивності різних досліджених позитивних іонів (нормування відносно повного рахунку іонів "« 10000) удлю зжнки корон 0 Єоуркове Я 00 бумянЕ о Єщрае й бередне ож брав ши: шо ше ши ши Ши п с о СС НТУ 18 Е Я і Ме ТА таз 8588 05 34 255 38 935 я «а с тка ОБЛ 5 283 зло ж ша БУ са ій БО с сво от із я Ох ба база ша 05 ОО вая Ох яв що. па вої» спа йо вада блЯЗ за вла зе ож МО 0

Таблиця 12

Параметри аналізу методом ТоБ-5ІМ5

Умови приладу:

Прилад РНІ ТАВІЕТ ПЇ

Джерело первинних іонів й о. 12 КВ для позитивних іонів 18 КВ для негативних

Потенціал пучка первинних іонів іонів

Струм первинних іонів (постійний струм) )/ 2 нА для зразків РЕ 600 пА для зразків Р132

Енергетичний фільтр/СО Вимкнений/ввімкнений

Погашені іони Немає

Компенсація заряду Ввімкнена 5 У методі ТОЕ-5ІМ5 використовували фокусований імпульсний пучок частинок (звичайно С5 або Са), щоб вибивати хімічні частинки з поверхні матеріалу. Частинки, що утворюються поблизу місця удару, частіше являли собою дисоційовані іони (позитивні або негативні).

Вторинні частинки, що утворюються далі від місця удару, частіше являли собою молекулярні сполуки, як правило, фрагменти більш крупних органічних макромолекул. Частинки потім прискорювалися на шляху прольоту до детектора. Оскільки можливе вимірювання "часу прольоту" частинок від моменту удару до детектора в наносекундній шкалі, можна забезпечити розділення маси з точністю до тисячної частинки одиниці атомної маси (тобто однієї тисячної частинки маси протона). У типових умовах роботи результати аналізу методом ТоБ-5ІМ5 включають: маса-спектр, що містить всю атомну масу в інтервалі від 0 до 10000 ат. од., растровий пучок, що виробляє карти будь-якої цікавлячої маси на субмікронній шкалі, і профілі глибини, отримані при зніманні з поверхні шарів, що розпилюються під дією іонного пучка.

Аналіз негативних іонів показав, що полімер містив зростаючі кількості груп СМО, СМ ії МО2.

Приклад 8. Порометричний аналіз опромінених матеріалів

Аналіз розміру і об'єму пор за допомогою ртуті (таблиця 21) оснований на нагнітанні ртуті (незмочуючій рідині) в пористу структуру при суворо регульованому тиску. Оскільки ртуть не змочує більшість речовин і не проникає мимовільно в пори під дією капілярних сил, її необхідно нагнітати в пустоти зразка, прикладаючи зовнішній тиск. Тиск, необхідний для заповнення пустот, обернено пропорційний розміру пор. Для заповнення великих пустот потрібна лише невелика величина зусилля або тиску, в той час як набагато більший тиск потрібен для заповнення дуже дрібних пор.

Таблиця 21

Аналіз розподілу розміру і об'єму пор методом ртутної порометрії

Явір ук ух, Кит усний ху ц Поввмй Повна Мехівнив и Ша помер Об'єм поверхня М п. дІвеетр нор техех блюунка ТеКЕТ НІ рн, зразка впровадже повія во МУ ОНЯОВИОсерА) й здат густина З ння жа й 7 даметра. дюнчетих мкм) А БА гро в БУ ІЗЕ ОО ЗБл НЕК Ма пі Бах АННУ

ВА хе НК ч85.3353 З ща 1556 паз Бах ХВАТ

ВУХ ВО 5.УЗКУ пл Зах Тон за б і1в15 БА ЕІ

ЕНН кни лвЕ кЗлЯа 12 Пс Я Б ХОЯУТУ

РІЗЖНОК Бінхх іт? Озю Па НА пі пщоЯ Алі ау ЗНА? ІРО па яКМ панії панів пла ТА ПАН

АН РУ НМА ОУЕН НОВ НЯНЯ ТУутьх БАЗИ ТУБІН аа нн Кущ. о ОБОВ НІК па плата Тк зав ща ЯК кла ЗІ Ба Раз Гр БАЯЖ Та вАСНОаНИ 49 о ве) о сеябве бінеї бе оз 35 маю

КОН я 145 Мк ЗАЛІВ пок п ОМ ГлУю ТАБ в» БУС КУ АК ТЕТ НК еДеНЕ ИНА ук УНК

ІЗ ННОХ 00 оБЕХ Та Оса 463 Ока Ба ОБОХ ати кад

УК ХНУ кеВ ТБ ЕНН ЖІ пт ПАНІ кове

УА ЗМІК ЗАКИ ЗАТ пЛлеО ДОВ пові ізо хода

ЗБ ЖНІ З МК 5335 ЯТЬ щІБя пу НВеНН ук гне НИ їБ5 ван ОК 41 плЕі 1855 Твін

Яейе Не ЗУ 00859 НАУКАТе КЯ119 пат БАЗУ ТЕХ

НЕ ЗЛУ КН: НЕ ЗО пани пам Е плазвк? НЕ тан еВ за З ЗВО НАЗЕН рію ПЗУ НЕК ТІ мів З.а3БА 7 ке Уч НН КБ ОЗлая БУ тал їх-5е для 5.38 З4 ак Лю БЗОоКа ПЗ БУК ЕЕ

Як ЗБИВ 5.5 ВИКаОа пло Ра ПК 1А145 толь їв й.Кі57 БлОх ЗДО чЕ ВОМ Тех пла НЕ: Тк із т РО КЕ шк Ше ОО ОЛІКЕ 1.5433 Ки

В.бе Та и КН: лах ЗЕ ВІЗАК ме ва сНнкМм

Ре вію БІ рам Т7а355 КЕНЕ: НН: 1 ТЕО

РАМ БАНІ ІЗ НТКУ? 15 а ЕТ ЯНЕТУ КУА кові в.о З рах ЗК ПУ ю 173 пе ра Е ОУН

Ж Пп зішще МР яд ЗБЕЛОВ Бема КТ Ах що щ-їе ПОБКУ пе пе НАЧЕ З.БЖо НА БУ зва ще ДВБ паз; зе ПАНА БЕ пак ідо ЗК.5КЯХ 10 аб пк вгкалею пінмі т о іх 0 З9З ЗАТВ

Ж-нЕ ПОН З нюх паху заава пах Бак Зі ВЖК щ-ЩОе 37 Тадва 13521 піні па п БУ ЗЛУКИ

АН: ПКУ БР зв аУТУ пл ЕНН ПКТ В Бан КІ м пе тя о 80 у ОН пан тух Каву? х1і53

Вії па 15378 а380 панк ВЛ ЯЕ? пах 15955 зЗрАНУ ще пе 15 Х фах ОЮІ ДНК ШК НИК РУ щеі1де пам ї5ко 38 Вав36 ВІ ла Е.А Лех 5- ПеквІ НЕ аа НАКОНИ пІІа БОКІВ КА мо

НВ па: НежУ ЗУгУЗ ІНН, 31953 пла фах ЗО ЕУВ

КУ па 2315 ХО по ЗВ ПА з. а52 залі

Прилад АшоРоге 9520 може створювати максимальний тиск, що становить 414 МПа або 60000 фунтів на кв. дюйм. Він містить чотири камери низького тиску для приготування зразків і збирання макропорометричних даних при тиску від 0,2 фунта на кв. дюйм до 50 фунтів на кв. дюйм (1,4-350 кПа). У двох камерах високого тиску збирання даних здійснюють при тиску від 25 фунтів на кв. дюйм до 60000 фунтів на кв. дюйм (0,175-414 МПа). Зразок вміщували в чашоподібний пристрій, так званий пенетрометр, який з'єднаний зі скляним капілярним стрижнем з металевим покриттям. Коли ртуть проникала в пустоти і оточувала зразок, вона опускалася по капілярному стрижню. Відхід ртуті з капілярного стрижня приводив до зміни електричної ємності. Цю зміну ємності під час експерименту перераховували в об'єм ртуті, знаючи об'єм стрижня використовуваного пенетрометра. Існують різноманітні пенетрометри з різними розмірами чаші (зразка) і капілярів, щоб можна було досліджувати зразки більшості розмірів і конфігурацій. Приведена нижче таблиця 22 містить деякі ключові параметри, обчислені для кожного зразка.

Таблиця 22

Визначення параметрів

Повний об'єм Повний об'єм ртуті, що впроваджується під час експерименту. Він впровадження може включати заповнення пустот між дрібними частинками, пористість зразка і об'єм стиснення зразка циліндричної форми пор. діаметр пор об'єму пор. діаметр пор поверхні пор.

Відношення маси зразка до об'єму заповнення. Об'єм заповнення

Об'ємна густина визначають заповненням при абсолютному тиску, що становить 0,50 фунти на кв. дюйм або 3,5 кПа.

Відношення маси зразка до об'єму зразка, виміряного при

Уявна густина максимальному абсолютному тиску, як правило, 60000 фунтів на кв. дюйм (414 МПа).

Приклад 9. Аналіз розміру частинок опромінених матеріалів

Спосіб визначення розміру частинок по статичному світлорозсіюванню оснований на теорії

Мі (Міє), яка також бере в себе теорію Фраунгофера (Ргайппоїег). Теорія Мі прогнозує співвідношення інтенсивності і кута як функцію розміру для сферичних розсіюючих частинок при тій умові, що інші змінні системи є відомими і залишаються постійними. Ці змінні являють собою довжину хвилі падаючого світла і відносний показник заломлення матеріалу зразка.

Застосування теорії Мі надає докладну інформацію про розмір частинок. Таблиця 23 представляє дані про розмір частинок, включаючи медіанний діаметр, середній діаметр і модальний діаметр як параметри.

Таблиця 23

Розмір частинок по лазерному світлорозсіюванню (дисперсія сухого зразка

Новмерсурююки еДНМНИМ ДЕБМетре середній дійметврічкм) МОдДальний люметр імкм! р, іїмкмі ши

АЗЗаН 321748 КО зо

МУКИ ВВА аа за4 5

ВОЗ Бай а ен

КТКЖАИКО ТВО ЗАБА ЯеБУї ва 3-00 кота ТОВ НО щі 407338 чатів зт В

ВІЗ тах ЗОВ ЗВУ

Розмір частинок визначали по лазерному світлорозсіюванню (дисперсія сухого зразка) за допомогою приладу Маїмегп Мавіегвігег 2000, використовуючи наступні умови:

Швидкість подачі: 35 95

Тиск диспергатора: 4 бар (0,4 МПа)

Оптична модель: (2.610, 1.0001), 1.000

Відповідну кількість зразка помішували на вібраційний лоток. Швидкість подачі і тиск повітря регулювали таким чином, щоб частинки були добре дисперговані. Ключовий компонент являв собою вибір тиску повітря, який руйнував агломерати, але не порушував цілісність зразка.

Необхідна кількість зразка змінювалася залежно від розміру частинок. Як правило, для зразків з дрібними частинками потрібна менша кількість матеріалу, ніж для зразків з крупними частинками.

Приклад 10. Аналіз питомої поверхні опромінених матеріалів

Питому поверхню кожного зразка аналізували за допомогою системи для прискореного вимірювання питомої поверхні і порометрії Місгоптегййс5 АБАР 2420. Зразки отримували попереднім дегазуванням протягом 16 годин при 40 "С. Після цього обчислювали вільний простір (в теплом і холодному стані) з гелієм і потім трубку із зразком знову відкачували, щоб видалити гелій. Збирання даних починалося після цього другого відкачування і полягало у встановленні заданого тиску, що регулював кількість газу, введеного в зразок. При кожному заданому тиску визначали і записували кількість адсорбованого газу і фактичний тиск. Тиск всередині трубки із зразком вимірювали за допомогою датчика. Додаткові дози газу продовжували вводити до досягнення заданого тиску і залишали до рівноваги. Кількість адсорбованого газу визначали складанням багаторазових доз, введених в зразок. Тиск і кількість визначають ізотерму адсорбції газу і використовуються для обчислення ряду параметрів, включаючи питому поверхню по методу ВЕТ (таблиця 24).

Таблиця 24

Визначення питомої поверхні по адсорбції газу

І Петомз повеохня водній 00 бнитома поверхня по

Номер зразка усі ім т І метеду ВЕЖ (в'я

ШК Що і ВО ЗНУУЯ 0О1. 15557 різав бо бурого иа тюе ОХ З яУво віза ЩІ Біо ооо 0033 Бей віза БО Ку: ОЗ ОВ 0303 Т.А візи шу ОТО 1 дав їз ві35 Фа БлчУ: пом иМОоВЯО 0 03НюЮ НА діа Роси ВЗ 005353 ПУХ дізе-аа Фр росо сатана щав пава

Зав щі мох о іона 05 по

Ти ше мозхО ЗВ Ов ОЯ п.яБЗЗ

СКУ НІВ ЩО чує ОА БК ОБ Ба з аа Нь В ще ог 0 З ОТО везе зшньиЗ фРеРОозпоемиЯВ 0 В3 34583 шень КСВ

СиКьцВ Не ее я 1 УЗ че ско оаУаоннм Ов О.аБаЗ ирРаана ЩО Бу: ПОН ТАТ В Ба АН

БОЮ «БО: пе бе заз

Вів В БокО МОНО З ОБУ Ол

Де ЕЕ Уа Я НТУ ах а о ща Ура СОЯ ТВ ЗУ ПО БУВ

АБ ша СВ Ов ПОБУ а ща ре Оо ХНН ОХ КЕ ОК ще ща рок У Ва ВОХ завхі ОЛОВО се це Он НК ЕЕ БО п а ща Коко ки ЗХ ВУ п рА.ів ЩЕ я тля та р.а ШЕ Мч ОВО заНЯУ 18 роде В РМ ОН НВ лат ТУ

РоАБИе ЩО РО чУН БНИК ТЯ за ке

РОН ЩІ плчч юн 1 ЗВ ав 1? в осені КІ НН КК КИ ваза

Щ-еїв ОК Кв ВЕ З За В ТКУ ние щ-ще ка КИ ВЗ лев Оле щен Кен ви НИ ЕЕ СК Са У в-ва сезон 0 паю плов

З.ае ФО МО ДНЯ ее ОХ

ВАНН ща мах ХНН и НЕ щЕ ФО Мчч и ЗНАВ Оле ВУ ве ща Ме язати Оле паз

БЕ ща че ЗВО ОК Ки веде щи ЗК Не УсЕ В пава ще е сто ЗВО 0318 185 ще ЩО вок ОО В ЗК ЛО ОВК

Модель ВЕТ для ізотерм являє собою теорію, що широко використовується для обчислення питомої поверхні. Аналіз включає визначення ємності моношару поверхні зразка шляхом обчислення кількості, необхідної для повного покривання поверхні одним щільноупакованим шаром криптону. Ємність моношару множать на площу поперечного перерізу молекули газу, що використовується в аналізі, щоб визначити повну площу поверхні. Питома поверхня являє собою відношення площі поверхні зразка до маси зразка.

Приклад 11. Визначення довжини волокон опромінених матеріалів

Дослідження розподілу волокон по довжині проводили трикратним вимірюванням представлених зразків за допомогою системи Теспрар Моггї ГВО1. Середні значення довжини і ширина волокон представлені в таблиці 25.

Таблиця 25

Визначення довжини і ширини лігноцелюлозних волокон і ях ! і Ствзиетичное | ; оМомерларазка ЗЕРОЖНЄ / Срредньозважена пе инровленя, | МШеряна м і ша шо | щі нні довжина середньозваженя но , рЕМя) ше о НИ

ШЕ се М ШК НЕ ПОН ЕХ ХНН поко А, ши ШКО: М ШИ М: ИН ОХ ЖИ, ши іш шк ШК МНЕ шик НК НН НИ ИН шк ни: НО: НН «ВИНИ НН НИК, ші Ши НК НИ: ИН нн шк ших ши ши: кеш еашш ше о я ШЕ ПКУ її ОВ Бе і

Приклад 12. Інфрачервона спектроскопія з перетворенням Фур'є (ЕТ-ІК) опроміненого і неопроміненого крафт-паперу

Аналіз методом інфрачервоної спектроскопії з перетворенням Фур'є проводили за допомогою спектрометра Місоіей трасі 400. Результати показували, що зразки Р132, Р132-10,

Р132-100, Р-1е, Р-5е, Р-10е, Р-З0е, Р-7О0е і Р-100е відповідали матеріалу на основі целюлози.

Фіг. З представляє інфрачервоний спектр крафт-картону, подрібненого згідно з прикладом 4, в той час як фіг 4 представляє інфрачервоний спектр крафт-картону на фіг. З після опромінення дозою 100 Мрад гамма-випромінювання. Опромінений зразок показує додатковий пік в області А (центр близько 1730 см-), який не виявлений в спектрі неопроміненого матеріалу. Потрібно зазначити, що було виявлене збільшення поглинання карбонільних груп близько 1650 см" при переході від Р132 до Р132-10 їі далі до Р132-100. Аналогічні результати спостерігали для зразків Р-1е, Р-5е, Р-10е, Р-З0е, Р-7Ое і Р-100е.

Приклад 13. Спектри ядерного магнітного резонансу протонів і атомів вуглецю-13 (спектри

ЯМРН і 3С) опроміненого і неопроміненого крафт-паперу

Приготування зразків

Зразки РІ132, Р132-10, Р132-100, Р-1Те, Р-Бе, Р-1б0е, Р-Збе, Р-7Ое і Р-100е для аналізу готували у вигляді розчину в повністю дейтерованому диметилсульфоксиді (0ОМ5О-й6), що містить 2 95 тригідрату фториду тетрабутиламонію. Зразки, які піддавали меншим дозам опромінення, виявляли значно меншу розчинність, ніж зразки, що отримали вищу дозу опромінення.

Неопромінені зразки утворювали гель в цій системі розчинника, але нагрівання до 60 "С приводило до розрізнення піків в спектрі ЯМР. Зразки, що отримали вищі дози опромінення, були розчинні при концентрації 10 мас. 95.

Аналіз

Спектри ЯМР "Н зразків в концентрації 15 мг/мл показали дуже широкий відмітний пік резонансу з центром при 16 м. ч. (фіг. 5А-5у)). Цей пік є характерним для рухомого протона ОН- групи, що було підтверджено струшуванням з "важкою водою Ого". Аналіз модельних сполук

Зо (ацетилацетон, глюкуронова кислота і кетогулонова кислота) переконливо показав, що цей пік був дійсно зумовлений рухомим енольним протоном. Цей передбачуваний енольний пік був дуже чутливим до концентрації, і автори не змогли встановити, чи був резонансний сигнал зумовлений енолом або, можливо, карбоновою кислотою.

Резонансні сигнали протонів карбоксильних груп модельних сполук були аналогічні тим, які спостерігали для зразків необробленої целюлози. (Ці модельні сполуки показували сильнопольний зсув приблизно на 5-6 м. ч. Приготування зразка Р-100е з більш високою концентрацією (10 мас. 95) привело до різкого слабкопольного зсуву в область сигналів карбоксильних кислот модельних сполук (--6 м. ч.) (фіг. 5М). Ці результати привели до висновку про те, що цей резонансний сигнал не є надійною характеристикою даної функціональної групи,

Зо однак дані показують, що кількість рухомих атомів водню збільшується при збільшенні дози опромінення зразка. Крім того, вінільні протони не були виявлені.

Спектри ЯМР "ЗС зразків підтверджують присутність карбонільної групи карбонової кислоти або похідного карбонової кислоти. Цей новий пік (при 168 м. ч.) не присутній в спектрі необроблених зразків (фіг. 5К). Спектр ЯМР з тривалою затримкою дозволив кількісно визначити даний сигнал для зразка Р-100е (фіг. 5І-5М). Порівняння інтегрування сигналу карбонільної групи з сигналами близько 100 13,8, що приблизно відповідає одній карбонільній групі на 14 ланок глюкози. Хімічний зсув при 100 м. ч. добре відповідає глюкуроновій кислоті.

Титрування

Зразки Р-100е ії Р132-100 (1 г) суспендували в деїіонізованій воді (25 мл). При перемішуванні до кожного зразка додавали індикатор алізаріновий жовтий. Зразок Р-100е змочувався з великим зусиллям. Обидва зразки титрували розчином 0,2 М Маон. Кінцеву точку ледве визначали і значення рН підтверджували за допомогою індикаторного паперу. Вихідне значення рН зразків становило приблизно 4 для обох зразків. Для зразка Р132-100 було потрібно 0,4 міліеквівалента гідроксиду, що дає молекулярну масу карбонової кислоти, яка дорівнює 2500 ат. од. Якщо вважати масу мономера як 180 ат. од., то одна карбоксильна група буде доводитися на 13,9 мономерних ланок. Аналогічним чином, для зразка Р-100е було потрібно 3,2 міліеквівалента гідроксиду, що відповідає одній карбоксильній групі на 17,4 мономерних ланок.

Висновки

Атом вуглецю С-6 целюлози, мабуть, окиснюється в карбонову кислоту (похідне глюкуронової кислоти), причому окиснення є несподівано специфічним. Це окиснення узгоджується зі смугою близько 1740 см" в інфрачервоному спектрі, інтенсивність якої зростає при опроміненні і яка відповідає аліфатичній карбонової кислоті. Результати титрування узгодяться з кількісним методом аналізу ЯМР ЗС. Збільшення розчинності зразка при вищих рівнях опромінення узгоджується із збільшенням кількості карбонових кислот протонів.

Передбачуваний механізм розкладання целюлози з "окисненням атома С-6" представлений нижче на схемі 1.

Схема 1 но ОН окиснення атома С-6 целюлози з. Мо Нн

Н бо 1 4 ос Н но оно о ун

Но онсо

Н основа

Н он ц но з. он Ан но

Фо - но о1 ра - ж

Н он он оно

Н Н нос тами но м оно

Н

Зо Приклад 14. Мікробне випробування попередньо обробленої біомаси

Певні лігноцелюлозні матеріали, попередньо оброблені згідно з описом в даному документі, аналізували на токсичність відносно звичайних штамів дріжджів і бактерій, що використовується в біопаливній промисловості на стадії ферментації у виробництві етанолу. Крім того, досліджували вміст цукру і сумісність з целюлазними ферментами, щоб визначити можливість здійснення даного способу обробки. Випробування попередньо оброблених матеріалів проводили в дві фази таким чином.

Фаза 1. Токсичність і вміст цукру

Токсичність попередньо оброблених трав і паперу як вихідних матеріалів вимірювали відносно дріжджів Засспаготусез сегемівзіає (винні дріжджі) і Ріспіа 5ірій5 (АТОС 66278), а також бактерій 7утотопав тпобіїї5 (АТСС 31821) і Сіовігідічт (егтосеПит (АТСС 31924). Дослідження зростання здійснювали для кожного з даних мікроорганізмів, щоб визначити оптимальний час інкубації і відбирання проб.

Кожний з вихідних матеріалів потім інкубували в двох екземплярах, використовуючи

Засспаготусев сегемізіає, Ріспіа 5ірйі5, 7утотопаб5 тобі і Сіовігідішт (егтосейшт в стандартному мікробіологічному середовищі для кожного організму. Солодово-дріжджовий СУМ) бульйон використовували для двох штамів дріжджів, включаючи Засспаготусев сегемівіає і

Ріспіа віїрійів.

Регенеративне середовище (КМ) використовували для 7утотопа5 торій і культурну середу (СМ4) використовували для Сіозігідічт (пегтосеїїшт. Для порівняння використовували позитивний контрольний зразок з додаванням чистого цукру, але без вихідного матеріалу. У процесі інкубації протягом 12-годинного періоду відбирали п'ять зразків через 0, 3, 6, 9, і 12 годин і аналізували їх на життєздатність (чашковий підрахунок для 7утотопав тпобії5 і прямий підрахунок для Ззасспаготусезх сегемізіає) і концентрацію етанолу.

Вміст цукру у вихідних матеріалах вимірювали методом високоефективної рідинної хроматографії (НРІ С), використовуючи колону Зподех"М Зудаг ЗРО810 або ВіогааФф НРХ-87Р.

Кожний з вихідних матеріалів (приблизно 5 г) змішували з очищеною зворотним осмосом (КО) водою протягом 1 години. Рідку частину суміші відділяли і аналізували на вміст глюкози, галактози, ксилози, манози, арабінози і целобіози. Аналіз здійснювали згідно з методикою

Національного біоенергетичного центра для визначення структурних вуглеводів і лігніну в біомасі.

Фаза 2. Сумісність целюлази

Вихідні матеріали випробовували в двох екземплярах з продуктом АссеПегазефФ, що є в продажу 1000, який містить комплекс ферментів, які відновлюють лігноцелюлозну біомасу в цукри, що ферментуються, при рекомендованій температурі і концентрації в конічній колбі

Ерленмеєра. Колби інкубували при помірному струшуванні зі швидкістю близько 200 об./хв.

Зо протягом 12 годин. Протягом цього часу зразки відбирали кожні три години (через 0, 3, 6, 9 і 12 годин), щоб визначати концентрацію цукрів, що відновлюються, (Норе і ЮОеап, Віоїесі -). (Журнал біотехнології), 1974 р., т. 144, с. 403) в рідкій частині вмісту колб.

Приклад 15. Аналіз концентрації цукру методом високоефективної рідинної хроматографії (НРІ С)

Аналізували 13 зразків на концентрацію цукру (НРІС) ії токсичність відносно трьох мікроорганізмів (Ріспіа 5іїрі5, засспаготусез сегемівзіає і 2утотопав ітпоБбіїїв5).

Таблиця 26 містить список обладнання, використаного для даних експериментів. Таблиці 27 і 28 представляють списки цукрів (із вказуванням постачальників і номерів партій), використаного в приготуванні стандартів для методу НРІС, і протокол, використаний в приготуванні стандарту для методу НРІ С, відповідно.

Таблиця 26

Обладнання, використане в експериментах

Таблиця 27

Цукри, використані в аналізі методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ)

Цукор виробник Каї ї Намев паетії глюЖкОоЗЕ аа 1е4НОо комлоза У за ВТО

ПЕН ее у гутув у дугу м ю д вУуки и ву. зравінсва ВинСнетка зе15о ТОБ» ТАВОов19 маша 10840 188979 56105275 жеКА Хе ЗК СЕУ ій Кк. те та тах3 ТКУ плактоза Я3Одя за ЗА но Зі

Таблиця 28

Отримання стандартів для методу ВЕРХ

Кеннемтраців, ще СКГєм розанну цукру ЇХ см нивознетої Повний об'єм (мл) нвмаєдеється МТУ ваднвімлі 4 ВО ми сі З мими ЕО ОО ре ЗМ СЯ мими у Бе 3 ОМА ОХ МІйНл жа 50

ЕНН са ми сі РЕНЕЄН а в а ми ог. мч «о «5

Перевінучней ствах ід ба мап ої з ов кл ях вх св ОВ ТВ; 15 мляп МІлхА

Аналіз

Кожний зразок (1 г) перемішували протягом ночі з очищеною зворотним осмосом водою при 200 об./хв. і 50 "С. Значення рН зразка доводили до 5-6 і фільтрували через шприц-фільтр з отвором 0,2 мкм. Зразки зберігали при -20 "С перед аналізом, щоб забезпечити цілісність зразків. Результати спостережень, зроблених під час приготування зразків, представлені в таблиці 29.

Таблиця 29

Спостереження під час приготування зразків для ВЕРХ

Зразок Никорнстане Додана водам) вн Спостереження 13 | юю вав Крихкий. лелие перемішується ві3ма 4 зк вл? Крихкий, певне веремівується

Низьке значення ВН З раю З хо ЗЛО сзуювляим доволиться ло 5.0 ! : «ях МН додаванні 1 М Мас

РІЗ НКУ й шля МаНЕЛОдаЖЕНІЯ НМ МОН дішеіо З 13 Су

ЗО159 і 15 З

ЗСКК КН і Як Я.

За ННЬМВ 5.3 я а

УЗИ і 15 оз

А ЯОНЮ і 15 що «Значення рН даних зразків доводили до даного рівня, використовуючи 1 М Ммаон

Готували свіжі стандарти, використовуючи вихідний розчин, що містить 4 мг/мл суміші шести цукрів (глюкоза, ксилоза, целобіоза, арабіноза, маноза і галактоза). Вихідний розчин готували розчиненням по 0,400 г кожного цукру в 75 мл наночистої води (фільтр 0,3 мкм). Після приготування вихідний розчин розбавляли до 100 мл, використовуючи мірну колбу, і зберігали при -20 "С. Робочі стандартні розчини з концентраціями 0,1, 0,5, 1, 2 і 4 мг/мл готували послідовним розбавленням вихідного розчину наночистою водою. Крім того, перевірочний стандартний розчин з концентрацією 1,5 мг/мл також готували з вихідного розчину.

Концентрації цукру аналізували згідно з методикою визначення структурних вуглеводів в біомасі (програма по біомасі МКЕЇ, 2006 р.), причому дана методика у всій своїй повноті включена в даний документ за допомогою посилання. Використовували колону 5подех Зидаг

ЗРОВ810 з випарним детектором світлорозсіювання. Перевірочний стандарт (концентрація 1,5 мг/мл) аналізували через кожні 8 вприскувань, щоб пересвідчитися в збереженні справності колони і детектора під час експерименту. Коефіцієнт варіації стандартної кривої (значення Кг) становив щонайменше 0,989, і концентрація перевірочних стандартних розчинів знаходилася в межах 10 95 від фактичної концентрації. Аналіз методом НРІ С проводили в наступних умовах:

Таблиця 30

Параметри високоефективної рідинної хроматографії (НРІ С)

Вприскуваний об'єм 20мкл

Рухома фаза наночиста вода", фільтрована через отвори 0,45 мкм і дегазована

Швидкість потоку 0,5 мл/хв.

Температура колони

Температура детектора Температура випарника 110 "С, температура розпилювача 907 "Первинні дослідження показали, що краще розділення досягнуто при використанні наночистої води, а не суміші ацетонітрилу і води в співвідношенні 15/85 як рухомої фази (виробник не рекомендує використання більше ніж 20 95 ацетонітрилу в даній колоні).

Результати

Результати аналізу методом НРІ С представлені в таблицях 31, 32 і 33.

Таблиця 31

Концентрація цукру, виражена в мг/мл і мг/г екстракту

Н Кош Монесвхания Міиногахврий і МБиМийахОНнАа 1 у кілву. РО млн САМ. і НОЯ і і дурна адньеи зрабіно уДИЗВЕа о жжюокоама іо гаююах і пезчйвао і вн ка ! Сех Се Н ще НЯ ! вда м : я | -х зх і

Я і МН о НН СЛИНИ : Мо НН ШИ

Енннннннн нн нн мон зн ни ін нн зно по о кн зо зон пою пи пн

Н : Н - Н З Н Н Н Н і :ОВЖМО ом зе їмо Б овийщая 1ооЖ РОЗНА Р ожж о зуща Їж ої ван їж о

Н Н ц ї ї пе ї 1 Н ПИ Н т Н

ВН ОН и и ПІ ПО о В Я

У о У В о в в и

Пе КН и КН НИ В В ВК ВВА не ОН ОА В КАК КК КК у КК

Коен о М Кр КК Во вк М НК НВ В п нн нн нн нн нон ан есе ев вне НЕ о СЕБЕ ЦЕ В В ВЕ в в ВЕ В о С ЗВ

КВ в ЕН в М в В Кв АК в фон Же КК в КЕ КК и В и ВК МА ВИ МК ДА ВКА ОО МАККИОЯ о и КК КК р и и в п КК і З ї ? ї 7 З ї 7 ї |: Н па и иа а ее нн нн нн нн ни нн нн нн нн нм нн нн не нн : 435735. ФЛ 88 п. її БУ 1 68 роз п В о: Б 1 37 ОО КО: інн суди ши дит пи ни нн а ни нин нн нн и ни нн нн нн у нн нн нн у не нн тих

Кс м НА НН я я НК НК А НН МН ШОВ 51 і ни нн нн нн о и нн нн нн нн нн нини ни си нин в нн нн п нн нн о пн нн нн нн нні ки ши: ши: ши сш ша ши: ша ша ши же: ше о в в о и и в КК М

М ПИПИНИ еп І КИ ИПИЛИМИ ПІП пф ПОКИ П ТИВ ТТ ПИ МИТІ. до ПИТИ и ПАИЦИЙИИИИЦ ПИ плн нин ПИШНИЙ секр них о и он Кв в

ООН КК НН НК ВН В А НК В НН ВИК

ЕК НК В КВ В В В КВН

М В о о НН В в ВО МЕТ

ОО о м в в ОО К В В Я

М и А В М В В В А З НК Я шк в пк в и в п нн п п а в в В в В В В ! а : : : Н Н Н Н Н : : З : Н реву уд ду утри о рило дру Р ручну роду М ред ур де ут Кос фер

ОСЯХ ИН ОН ОІВ ОВНА БОБ В АКВА ВН

НО КУ ї т ОО ОО юЮ МАМ 1 ба 1 БАЗ І 5 і пою

Таблиця 32 . о/

Концентрація цукру, виражена в 95 від маси паперу

Жонник тав укр

Пфосухого мили різу БТ: ОВТ ОВ. 7 та зо ЕЕ іелеНи:

Колобка зоз опж:о м 2в

Тлюввув Зоо ва Зах зав кЕНлоА Волю Ва зла уЗваитОЗВ. ва БЮ лю йо вравима що ме ап ри: «анна пса дю зда йо

Таблиця 33 . о/ -

Концентрація цукру, виражена в 95 від повної маси зразка

НИ , Н ї 7 Н тт - ту

І БонименчнНх ! ; Н Н і іцеюму їй Б ї У двух Я 22 я св ух ! Кт т х Н

ГУБУ СТСУМНО аауа АТ. А. ех ФІ. ЗО13 ЩОВУ3» 85333: дві е535а Ма іовнизки ' Уж КУ о 1 якої. Н с г Ч

ІЗризкА | и 15 з ї8 Мо: Ви: ше їв ЗК.

Н Н |: Н Н Н і | ; Н Н Н

Тіни ї Н Н '

ТДБІК УЗ нм пк у чук м хи (ч ї К що 1 реловнуя сахе офаю зо роде Ммою заг і вв о мо ав

БЕН Кбаяа ще ово оз дю зяї ії З За. зда зло змі

Н Н Н Н Н

ЕКЗ А: НИ ЗИ СУ ІНН Я НЯ ЗО ФО Ва. пля пк зве. : Н і щи : Н : Н тгВлНЕТОЗВ пд лю ПАК ОО ії ЗХ: О01Ю В. п КаНЗ М : Кк ще зкк ії дк пах і пе де мкк

Н иОЕНІНУВ Н НУ й пд Н Л.А ПВ ЗА ої ах ЗЕ: пах п ПБС т Н Н Н Н Н і і зяб за под да НЯ заз 1 523 вд: лю птв 53 і

І МВ ! Я Я

Приклад 16. Дослідження токсичності

Дванадцять зразків аналізували на токсичність відносно набору з трьох виробляючих етанол культур. У даному дослідженні в зразки додавали глюкозу, щоб зробити відмінність між вирощуванням клітин культур на мінімальному середовищі і токсичністю зразків. Тринадцятий зразок випробовували на токсичність відносно Ріспіа віїрйіє. Короткий опис використаної методики приведений в таблиці 32. Опис використаних хімічних речовин і обладнання для випробування токсичності приведений в таблицях 34-36.

Таблиця 34

Умови випробування токсичності : Перанетр | дулнимовне лМмМУИВ о бопелечинусессовуюкіе і МЕ ВОВИХ

ГПовуєсремня вНоштУЮаНИЯ | Наскратне ! СХ емінохули ма 1 Гея 1 го Температура інкубації о жаТе Є 1панлють сор нння Суха. 155 кю 155 ообб'ям колби Граєнмеєра Зо ми щ0Ю мо 250 ми

ДОК'єм кереденни Юма ТОВ ми ЗО мо

КенннВ чне нкУоаци па ЗВ З ЗВ : Час зиноазізуУ В етакНВа од й і пгадині 2, В, «4,30, 2, ЗБ

Час вохувамня кдітвм (Рад) : х ча ! як пахув ше нн ж, 54. 38 ха, В і о Огодих годин й годив

Таблиця 35

Реагенти, використані для випробування токсичності

Кочпочент середовища / Виробнне ! те ' Номер парт

Сжчовнне о Воно Скениву ЗаТЕТОЕ АТХ єнота ЗСВОВО ОО Венщов Оіохілаєм НО ТІВ

ЛЕВ с МО дя чих ка укосу Вес СМокннм ЕВ? аЗЖКНОВ

ГЕцУтен дл х шої пара Не А

Кенлоза. кшШка МО Віта

Глюка Жде ОВ НЕ НИЗ

Ехотракт дріжлків івивкомиестаний для / Веноп Дюк ВИВеО ВО В

СОННА СВ

КкеРражт предків,

ІВНКОИВоеНиК ЛЕК у з : й Божен: КН ИН тіБББОЗ «ноніхї Дузононве повів Вас ГСК шЛЖТОО 1555555

МмоБОє Ти Віда МОгЯ ШК

ЧО» МКНтк дама КО ка. Візи УЗ атак Ню

Соложво- дрів лових булебсн БООБО ЮК жан н нка Кн вини

Таблиця 36

Компоненти У5І, використовувані у дослідженні із струшуванням колби

Ковтюовент фкезев ово катвонн 00/ Немео парти

Мівмиорана диж еаноях т МІВ пи а чувак винне УКР ОВТ Тщ піз ца

Ерер в вівнолі ЖК ТВ ЗМ НКИ, ВУ Тобс1а

Випробування проводили з використанням трьох мікроорганізмів, як описано нижче. засспаготусез сегемізіае АТОС 24858 (з колекції типових культур США)

Культуру Засспаготусев сегемізіае на скошеному середовищі готували з регідратованої ліофілізованої культури, отриманої з АТСС. Порцію матеріалу культури на скошеному середовищі висівали штрихом на солодово-дріжджовий бульйон20 г/л агар (рн 5,0) і інкубували при 30 "С протягом 2 діб. Колбу Ерленмеєра об'ємом 250 мл, що містить 50 мл середовища (20 г/л глюкози, З г/л екстракту дріжджів і 5,0 г/л пептону, рН 5,0) інокулювали однією колонією з чашки з солодово-дріжджовим бульйоном і інкубували протягом 24 годин при 2576 і 200 об./хв. Після 23 годин росту зразок витягували і вимірювали його оптичну густину (600 нм в ультрафіолетовому спектрофотометрі) і чистоту (барвник Грама (ОСгат)). На основі цих результатів одну колбу (так звану колбу для посіву) з оптичною густиною (00), що дорівнює 14,8, і чистим барвником Грама вибирали для інокуляції всіх досліджуваних колб.

Досліджувані посудини являли собою колби Ерленмеєра об'ємом 500 мл, що містять 100 мл стерильного середовища, описаного вище. Всі колби витримували в автоклаві при температурі 121 7 їі тиску 15 фунтів на кв. дюйм (0,1 МПа) перед додаванням досліджуваних матеріалів.

Досліджувані матеріали не стерилізували, тому що обробка в автоклаві змінює вміст зразків.

Досліджувані зразки додавали під час інокуляції (а не перед нею), щоб зменшити можливість забруднення. Крім досліджуваних зразків по 1 мл (1 об. 95) матеріалу з колби для посіву додавали в кожну колбу. Колби інкубували, як описано вище, протягом 36 годин.

Рісніа віїрііє МАНІ. х-7124 (з колекції культур АКБ)

Культуру Ріспіа 5іїрйй5 на скошеному середовищі готували з регідратованої ліофілізованої культури, отриманої з колекції культур АК5. Порцію матеріалу культури на скошеному середовищі висівали штрихом на солодово-дріжджовий бульйон20 г/л агар (рн 5,0) і інкубували при 30 "С протягом 2 діб. Колбу Ерленмеєра об'ємом 250 мл, що містить 100 мл середовища (40 г/л глюкози, 1,7 г/л азотистої основи дріжджів, 2,27 г/л сечовини, 6,56 г/л пептону, 40 г/л ксилози, рН 5,0) інокулювали з невеликою кількістю матеріалу з чашки і інкубували протягом 24 годин при 25 "С і 125 об./хв... Після 23 годин росту зразок витягували і вимірювали його оптичну густину (600 нм в ультрафіолетовому пектрофотометрі) і чистоту

Зо (барвник Грама). На основі цих результатів одну колбу (так звану колбу для посіву) з оптичною густиною 5,23 і з чистим барвником Грама вибирали для інокуляції всіх досліджуваних колб.

Досліджувані посудинами являли собою колби Ерленмеєра об'ємом 250 мл, що містять 100 мл стерильного середовища, описаного вище. Всі пусті колби витримували в автоклаві при температурі 121"С і тиску 15 фунтів на кв. дюйм (0,1 МПа) і додавали середовище, стерилізоване на фільтрі з отворами 0,22 мкм, перед додаванням досліджуваних матеріалів.

Досліджувані матеріали не стерилізували, тому що обробка в автоклаві змінює вміст зразків, а стерилізація на фільтрі непридатна для стерилізації твердих речовин. Досліджувані зразки додавали під час інокуляції (а не перед нею), щоб зменшити можливість забруднення. Крім досліджуваних зразків по 1 мл (1 об. 95) матеріалу з колби для посіву додавали в кожну колбу.

Колби інкубували, як описано вище, протягом 48 годин. 2утотопаз тобіїїх АТСС 31821 з (колекції типових культур США)

Культуру 2утотопаб5 торії на скошеному середовищі готували з регідратованої ліофілізованої культури, отриманої з АТТС. Порцію матеріалу культури на скошеному середовищі висівали штрихом на фарбувальні чашки (глюкоза 20 г/л, екстракт дріжджів 10 г/л, агар 20 г/л, рН 5,4) і інкубували при 30 "С в атмосфері, що містить 5 95 СО», протягом 2 діб.

Пробірку об'ємом 20 мл з гвинтовою кришкою, що містить 15 мл середовища (25 г/л глюкози, 10 г/л екстракти дріжджів, 1 г/л МазО4-7НегО, 1 г/л (МН4І)250», 2 г/л КНгРО», рН 5,4) інокулювали однією колонією і інкубували протягом 24 годин при 30 "С без струшування. Після 23 годин росту зразок витягували і вимірювали його оптичну густину (600 нм в ультрафіолетовому спектрофотометрі) і чистоту (барвник Грама). На основі цих результатів одну пробірку (00-1,96) вибирали, щоб інокулювати другу колбу для посіву. Друга колба для посіву являла собою колбу об'ємом 125 мл, що містить 70 мл середовища, описаного вище, і інокулювали 700 мкл (1 об. 95) і інкубували протягом 24 годин при 30 "С без струшування. Після 23 годин росту зразок витягували і вимірювали його оптичну густину (600 нм в ультрафіолетовому спектрофотометрі) і чистоту (барвник Грама). На основі цих результатів одну колбу (так звану колбу для посіву) з О0-3,72 вибирали для інокуляції всіх досліджуваних колб.

Досліджувані посудини являли собою колби Ерленмеєра об'ємом 250 мл, що містять 100 мл стерильного середовища, описаного вище, за винятком 5 г/л екстракту дріжджів. Всі пусті колби витримували в автоклаві при температурі 121 "С і тиску 15 фунтів на кв. дюйм (0,1 МПа) і 60 додавали середовище, стерилізоване на фільтрі з отворами 0,22 мкм, перед додаванням досліджуваних матеріалів. Досліджувані матеріали не стерилізували, тому що обробка в автоклаві змінює вміст зразків, а стерилізація на фільтрі непридатна для стерилізації твердих речовин. Досліджувані зразки додавали під час інокуляції щоб зменшити можливість забруднення. Крім досліджуваних зразків по 1 мл (1 об. 95) матеріалу з колби для посіву додавали в кожну колбу. Колби інкубували, як описано вище, протягом 36 годин

Аналіз

У двох зразках аналізували концентрацію клітин, використовуючи розподіл по чашці для 27утотопаз торії і прямий рахунок (гемоцитометр і мікроскоп) для Засспаготусез сегемівіає і

Ріспіа вірі. Відповідним чином розбавлені зразки 7утотопах торії розподіляли на чашки з декстрозним екстрактом дріжджів (глюкоза 20 г/л, екстракт дріжджів 10 г/л, агар 20 г/л, рН 5,4), інкубували при 30 "С в атмосфері, що містить 5 95 СО», протягом 2 діб і рахували число колоній.

Відповідним чином розбавлені зразки Засспаготусе5 сегемівзіаеє і Ріспіа віїрйіє змішували з 0,05 95 трипанового синього і завантажували в гемоцитометр Нойбауера (Меибацег). Клітини рахували при 40-кратному збільшенні.

У трьох зразках аналізували концентрацію етанолу, використовуючи біохімічний аналізатор

У5І на основі аналізу алкогольдегідрогенази (У5І, Іпіегесіепсе). Зразки центрифугували зі швидкістю 14000 об./хв. протягом 20 хвилин і зберігали надосадову рідину при -20 "С для збереження цілісності. Перед аналізом зразки розбавляли до концентрації, що становить 0-3,2 г/л етанолу. Стандартний розчин, що містить 3,2 г/л етанолу, аналізували приблизно через кожні 30 зразків, щоб пересвідчитися в збереженні цілісності мембрани в процесі аналізу.

Оптична густина (600 нм) зразків не повідомляється, тому що тверді досліджувані зразки перешкоджали вимірюванню поглинання шляхом збільшення каламутності зразків, і результати є неточними.

Результати аналізу етанолу

Ефективність використовували для порівняння кожного зразка з контрольним зразком для кожного мікроорганізму (таблиці 37-39). Однак процентну ефективність не можна використати для порівняння штамів. При порівнянні штамів потрібно використовувати повну концентрацію етанолу. При аналізі даних процентна ефективність, що складає менше ніж 80 95, може вказувати на токсичність, якщо це супроводжується низьким числом клітин. Для визначення

Зо процентної ефективності використовують наступне рівняння:

Процентна ефективність-(вміст етанолу в даному зразку/вміст етанолу в контрольному зразку)х100

Таблиця 37

Концентрація етанолу і процентна ефективність при використанні засспаготусез сегемізіає у озразка р Конценеренія Ефективність Концентрацівн; Кефективність Конментрація "Ефективність ! втввопу УНІ РЕ ії втаНоду з) І СЕЗ | гханожу ПУХ) | Ер і

КОВІ» | 43 і УЛ. Щі 135 : ЗяБ 0. шо ши ше ше ши ши ши ж ни нн шишки: ше ши шк ши І М НІ ! СЯ ЮК. ЗВ

Таблиця 38

Концентрація етанолу і процентна ефективність при використанні Ріснпіа 5іїріїів (о Важеро нн В ЕВНВНЕ дон нення КВН оон рн ВВ он «вача | Концентрація Бфективність Кеовцентрая ОЕфектнимість Бониентреція: Бфектнанить ! | і ОЗЕНОЯУ ПИ НЕ ФУКО НУ УЛ: Не і каное А (а

Мк о НИМ МК ХНИ МИНА МКК З АКНЕ ДЕК КМ МАН КК НН А

СОВИ М: ВИШ НИК ЗНИШНН ВНН с «АНА ННННН НН МАК т МАН НИК х МАЕ ех СИ М С МИ НИЄ з: УМ НВК СХ АН ПОН С УМ МОН Зх МН НЄ З

Свак ОС ЕС ТТ ПТО,

Виділені жирним шрифтом зразки представляли собою найкращі виробники етанолу, концентрація якого перевищувала 20 г/л і була аналогічною концентраціям в деревних гідролізатах (Н. К. Згеепаїй і Т. УМ. Уейгіе5, Віозоигсе ТесппоІоду (Технологія біоджерел), 2000 р., т. 72, б. 253-260). "Аналіз в наступному експерименті зі струшуванню колбою.

Таблиця 39

Концентрація етанолу і процентна ефективність при використанні 7утотопав тобіїв зваїкио 00 Кеоевтрамоя : Ббмекувентсть о Кухннежтраців Бфектнвність Ковхенхрання Ефектиннють

І ро втаНейе ЧА: СК) і ехвнаяу (М! іа о втанонУ (Я, КО

Результати аналізу концентрації клітин

Процентну концентрацію клітин використовують для порівняння кожного зразка з контрольним зразком для кожного мікроорганізму (таблиці 40-42). Однак процентну концентрацію клітин не можна використовувати для порівняння штамів. При порівнянні штамів потрібно використовувати повну концентрацію клітин. При аналізі даних процентна ефективність, що складає менше ніж 7095, може вказувати на токсичність, коли вона супроводжується низькою концентрацією етанолу. Для визначення процентної концентрації клітин використовують наступне рівняння:

Процентна концентрація клітин - (число клітин в даному зразку/число клітин в контрольному зразку)х100

Таблиця 40

Результати аналізу концентрації клітин для засспаготусез сегемівіає

Номер о 00 Концевтраців с й Концентрація | бе шитТин

ОЖБКЯНХО о влівніх Ома) кнітив ке схійбняу шк: шк: ше ше ши ШИ ши ше ши: ше: ши ше ни ше Ше хш М З МЕ шазсие НИ и НН нс: МИ НН я ЗАНКННК К НК

Таблиця 41

Результати аналізу концентрації клітин для Ріспіа Брі жвава Концентрація ще Ковцевтрвц бо і й ІЕЕ ННХ НЕНЬ квіжнно іклітин іх Нім) кл вовилЕНЕ ЗКУ

АНЯ Я

САН ВВ шк ше шшнш наши ши шк шо ши шк наше лиш ше

ОО КОННХЛЬО: 18 СЕ. КАК і б

Таблиця 42

Результати аналізу концентрації клітин для утотопав тпорбіїї5 в зер ух : Концентрація скіни і Концектрація Флінн і Жкліня Няня 0 іжхвжнВіх НИ мя ! шк ше: ше ша: аж шо ши: ши шшшие: шк них МИ, ши: шиши: ши ши: ши НИ -ВЯ ВВ насе сани шк ши нак: ни нн АН

ЯНВ. ши ка С КЕ МНН ИККАННЄ СА шк ши сша ши и НИ ї Контроль СА ДИ ВИ я. ПИ МЕ Я ДО ПОМ ЕЕ ЗМ

Приклад 17. Ферментація зразків целюлози при струшуванні в колбі з використанням Ріспіа 5іїріїїв

Суть експерименту

Тринадцять зразків випробовували у виробництві етанолу з використанням культури Ріспіа вірйіє без додавання цукру. їх випробовували в присутності і за відсутності целюлази (комплексний фермент АссеПегазе 1000Ф від фірми Сепепсог). Обладнання і реагенти, використані для експериментів, перераховані нижче в таблицях 43-45.

Таблиця 43

Обладнання і періодичність обслуговування

Обладнання Виробник і модель Періодичність обслуговування

Струшувані (2) В. Вгацп Віоїесп, Сепотаї В5-1 | Щоквартальне

Спектрофотометр Опісат, ОМЗ3ЗО0 Піврічне

Біохімічний аналізатор УЗІ | Іпіегзсіепсе, 51 Щомісячне

Таблиця 44

Компоненти У5І, що використовуються в дослідженні зі струшуванням колби

Хомпенент Момер но каталогу Номера

Міеміозна для етанолу У ОТ плн аз

Стандяртннй пож етвнони КО тт зт піг733пай

ОМ вОвОо учення мех моржі У я по

Буферннй Очна в екв їБ Що Й 2; Що ота

Таблиця 45

Хімічні речовини, що використовуються в дослідженні зі струшуванням колби

Компонент Биробнико 0800 ГеєстраійнНий 0000 Номер пере серединних Й | номер

Сезовннх еопорА 3473705 Ар-т2ва-3

Сан НеБу І

ГАНОЕНЕКА НОВЕ ЯРОКИЖК весвов ПіСКІЙьОп 29 7128173

Пастон Кекоп СНекійВог ІВ запа

Совки вроюдковий бульшм Сей СК ОВ 1-0 ие

Ком я х й й й і щен сепепеог де се ; : й се щу 1800794133

Коннов ВюСтетка Оета щей

Глювоза Бідтна О-о озоном

Культуру Ріспіа 5іїрйі5 МАК. х-7124 на скошеному середовищі готували з регідратованої ліофілізованої культури, отриманої з колекції культур АК5. Порцію матеріалу культури на скошеному середовищі, висівали штрихом на солодово-дріжджовий бульйон (УМ)20 г/л агар (рН 5,0) і інкубували при 30 "С протягом 2 діб. Колбу Ерленмеєра об'ємом 250 мл, що містить 100 мл середовища (40 г/л глюкози, 1,7 г/л азотистої основи дріжджів, 2,27 г/л сечовини, 6,56 г/л пептону, 40 г/л ксилози, рН 5,0) інокулювали однією колонією і інкубували протягом 24 годин при 2576 і 100 об./хв... Після 23 годин росту зразок витягували і вимірювали його оптичну густину (600 нм в ультрафіолетовому спектрофотометрі) і чистоту (барвник Грама). На основі цих результатів одну колбу (так звану колбу для посіву) з оптичною густиною 6,79 і з чистим барвником Грама вибирали для інокуляції всіх досліджуваних колб.

Досліджувані посудини являли собою колби Ерленмеєра об'ємом 250 мл, що містять 100 мл середовища (1,7 г/л азотистої основи дріжджів, 2,27 г/л сечовини, і 6,56 г/л пептону). У колбу із середовищем для росту не додавали цукор (глюкозу або ксилозу). Всі пусті колби витримували в автоклаві при температурі 121 "С і тиску 15 фунтів на кв. дюйм (0,1 МПа) і додавали середовище, стерилізоване на фільтрі з отворами 0,22 мкм, перед додаванням досліджуваних матеріалів. Досліджувані матеріали не стерилізували, тому що обробка в автоклаві змінює вміст зразків, а стерилізація на фільтрі непридатна для стерилізації твердих речовин. Досліджувані зразки (перераховані в таблиці 46) додавали під час інокуляції (а не перед нею), щоб зменшити можливість забруднення. Крім досліджуваних зразків по 1 мл (1 об. 95) матеріалу з колби для посіву додавали в кожну колбу. Для колб, що містять зразок Р132-100, було потрібне додавання 0,4 мл 1М Маон, щоб довести значення рН до 5,0. Колби інкубували при 30 "С ї 150 об./хв. протягом більше ніж 96 годин.

Один набір приготованих в двох екземплярах колб на кожний вихідний матеріал містив комплексний фермент АссеїЇІегазхеФ від фірми Сепепсог (1,25 мл на колбу, причому найвища рекомендована доза становить 0,25 мл на 1 г біомаси) в спробі одночасного оцукрювання і ферментації (55). У іншому наборі приготованих в двох екземплярах колб комплексний фермент АссеїПегазеф не містився. Всього проаналізували 52 колби.

Зо Також аналізували шість контрольних колб. Позитивні контрольні колби містили порошок целюлози БоЇкКагБіос 200 МЕ (партія Мо ОА158072, виробник Іпіегпайопа! Рірег Согрогайіоп) в кількості 2,5 г на колбу об'ємом 100 мл (концентрація 25 г/л) з додаванням і без додавання комплексного ферменту АссеїІегазеФф). Крім того, використовували тільки контрольні зразки, що містять цукри (глюкозу і ксилозу).

Таблиця 46

Кількість кожного вихідного матеріалу, доданого в кожну колбу пиши ИШЮ ми вела 2.5

Іо о

РІЗ 2. дз 5 діа З

АТ ОЮ У

От 5 13810 5

ЗО З

Уа 5

МБО не

Образец А 5

Аналіз

Зразки аналізували для визначення концентрації етанолу (таблиці 47, 48 їі 49), використовуючи біохімічний аналізатор У5І на основі аналізу алкогольдегідрогенази (У5І,

Іп'ег5сіепсе). Зразки центрифугували зі швидкістю 14000 об./хв. протягом 20 хвилин і зберігали надосадову рідину при -20"С. Перед аналізом зразки розбавляли до концентрації, що становить 0-3,2 г/л етанолу. Стандартний зразок, що містить 2,0 г/л етанолу, аналізували приблизно через кожні 30 зразків, щоб пересвідчитися в збереженні цілісності мембрани в процесі аналізу.

Результати

Таблиця 47

Результати аналізу контрольних колб

Контрольний зразок Концентрація етанолу (г/л) й й

Зразок, що містить глюкозу, але не містить 13.20 19.00 20.60 21 60 елюлози і фермент

Зразок, що містить кристалічну целюлозу (ЗоїЇКагіос) але не містить цукру і ферменту

Зразок, що містить кристалічну целюлозу (ЗоїКагіос) в кількості 25 г/л і добавку АссеПегазетд 6.56 7.88 9.80 8.65 1000, але не містить цукру

Таблиця 48

Результати аналізу струшуваних колб без комплексного ферменту АссеїПегазеФ 1000 ше МИ МОНЕ: ХНН МОНЕ КЕ СКШИННХ МИНЕ НЄ МИ ЯКЕ ЗАЙ.

Совиоко А і 58 | а в. я З ан

Таблиця 49

Результати аналізу струшуваних колб з комплексним ферментом АссеїІегазетб 1000 / Номар зразка ет ЗВННОВВТНВК нн рт шок А Гу | Я І 339 | 2.98

Приклад 18. Аналіз целюлози

Суть експерименту

Тринадцять зразків випробовували на сприйнятливість до целюлази, використовуючи промислову целюлазу АссеїПегазеФ 1000 від фірми Сепепсог при оптимальних умовах температури і рн.

Методика

Дана методика являє собою модифікацію лабораторної аналітичної процедури МЕЕЇ. ГАР- 009 "ферментативне оцукрювання лігноцелюлозної біомаси". Зразок матеріалу додавали в 10 мл буферного розчину 0,1 М цитрату натрію (рн 4,8) і 40 мг/мл тетрацикліну (для запобігання росту бактерій) в пробірці об'ємом 50 мл в двох екземплярах. Кількість зразка, доданого в кожну пробірку, вказана в таблиці 50. Деякі зразки було важко змішувати (Р132, Р132-10, Р132-100), тому їх додавали в меншій концентрації. Також готували позитивний контрольний розчин, що містить 0,2 г порошкоподібної целюлози БоЇКкаБіос 200 МЕ (партія Ме ОА158072, виробник

Іптегпайопа! Рірег Согрогайоп), і негативний контрольний розчин (без зразка). У пробірки додавали достатню кількість очищеної зворотним осмосом (КО) води, щоб довести повний об'єм до 20 мл. Перед використанням буферний розчин цитрату натрію і воду нагрівали до

Фермент АссеїІегазефФ 1000 додавали в кожну пробірку в кількості 0,25 мл на 1 грам біомаси (максимальне дозування, рекомендоване фірмою Сепепсог). Пробірки інкубували під кутом 45" при швидкості обертання 150 об./хв. і температурі 50 С (умови рекомендовані фірмою

Сепепсог) протягом 72 годин. Зразки витягували через 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 48 ї 72 години (таблиці 52 і 53), центрифугували зі швидкістю 14000 об./хв. протягом 20 хвилин і надосадову рідину заморожували при -20 "С. Концентрацію глюкози в зразках аналізували за допомогою біохімічного аналізатора У5І (Іпіегесіепсе), використовуючи умови, описані в таблиці 51.

Стандартний розчин глюкози з концентрацією 2,5 г/л готували розчиненням 2,500 г глюкози (виробник Зідта, номер по каталогу 57528-5КО, номер партії 107Н0245) в дистильованій воді.

Після розчинення повний об'єм доводили дистильованою водою до 1 л в мірній колбі. Свіжий стандартний розчин готували щотижня і зберігали при 4 "с.

Таблиця 50

Додана кількість кожного зразка

ТВ 'и'и ит й ск З це адяня у проник у кунайств НАВ НІ з

Номев Хуівсо " що 13 0.5

Цоопююокюжеюстсс стос стою ах окомкчх косо нкаскусоодснкткк кекс со сооКс о М хо нккск осот оссооокооскюетх : а ; ше ч Н Ген 132 ! 0.5

РІ135-100 | 0.5

ЩУКА АААМАААА АТ ВСТА е че ня снення чле е ллють еле ніеч Челсі ре точ снепчюні чення Я ; ос і хорд дз . 075 р; МК з і і шо Я нн ЕТО ! 0.5 і руч Її пн дізаеОю 0.75

ДК ою к КС ЮК АКЖ КК КАКАО КД КАК КАКАО Ж КК КК АК КАЖУ юю КкККАКи» ско

ІЗ З Н ї їх (3135 | І:

Інн фу р рев пи ну он нн і 2132-10 | 0.75

СелеОю | 0.7

І пече і й ин ми нн пн нт

УМБ132-100 | 0.75

Зразок А | 075

Зоїкайіос МООМК контроль п і бю нин а а и п

Негативний контроль : й Не

Таблиця 51

Компоненти У5І, використані в дослідженні із струшуванням колби

Хомповент номер по КТалЛОГУ Номер парті ух ; ся хаус М ху еУ Ех с ЖЖ

Глюкюозна меморана о 2385 ап? апй124 кірка сві були МК хе ух с й я й

Глюкозни й бубер те 2357 ОТ4О1ЯА

Результати

Таблиця 52

Результати аналізу целюлози

Ї з ши Конпентрація вюкози смгемлі нон часі інкуВВНЙ (голе) жи ши ши ши ши жи ше ти шк те з не и НИ о ; 32 | пла і 43 0 700 5 Вал ВТО 1 3085 1 56 5 БО 1585 мн п в кп ; різ3в шЕ: ЗУ БВ | 8 Ва т 0 ве 035 НВО

Ева ов кон нан пн кухлик ЗИМ мінова со нн зон он зи ан і віЗа-8а ОО ЗВО БА 0 ТИ 0 ОВ о вяЯ? НО ЗО 38 і діа пис: и Шия МИ НК З и с Є З В С В М В З В Я ! діа Не ка ШЕ ИН ШВА і КК М.В | сл НН кни С Я З МЕ Є Я ним ово пнссвинининиини КУМ пом на п о аа пом пол і АТО пає во ва Он ЗВ 4068 Б. ун оман пиши пн пентння пня нин ни миня ин ин і 3 св шк НИ / Ем ши М АК М Я МЕ У ПН ' 32-18 я ше: ше: ВЕ ВЕ Ше ЖЕ НИК Ех ВНС НЯ Я СЕН нн и к О їх чо п нини ння пон нн ин нн нин:

Й піч кА: ние Ах: ЩЕ А І ШК | ЗЛЯ ЗА РО ЗЧУ ЯВ : 5М4 ; щз2 8 тав дО я Олю 40 1 2 Зв ен на мон помнннннни речі чт нн мини пон моно мон мин ен нн мання зн зно нн и о п в о маїзаяай 0070 576 383 ЯЗ 0 478 00 5ОО 1 БОБ 0 Во 3 ї і і | і і : Н : фннтяляяяя, нн в п нн оно ном нн ин 1 Зразок А Соя Где тя ше шшек тиме дише лише ние одн оон нон, мно: мно щих зн сно нн сінна зи пов

УНстревнвій 0 БОШ : Н ії. СЕ, ; ве що ії щжу Її дк Н я І (Месивнвнвй В Гео оз оо об) оо 0 1 005 003 009 бозетевний СУМ бл ЗВ 36 ато вав ооБаВ о) т7лв влдв вВ

Говінк Її. Коноентрвація глюкозв зетярвие крав ванни

ТК. щ нн нн Що о, | ре: виш : ке: ИН - з АЮ о нн ВК !

Мк І й ен ї А сткхум аг - МК ен вена нн НМА: а Уві ЧЕ Н

Га ОК ден : КУН ; ій х ВК он нав вні інн З ле БІЙ ши З ен ин нн ін с й Е

Еш | в НН : « ТНхчтннний І їх ще ДК ї КЕ пи шо к Я С; зн ни кино и нн. ВВЕ ЗМЕКаКЕК і ке ДІД фокююннняннкоєєкхюкєтреєтутютю трун алу чААнк няння

Часігоднні

Кількість целюлози, переробленої в пробірці, обчислювали таким чином

Концентрація глюкози (г/мл)х20 мл (об'єм зразка)х0,9 (поправка на молекулу води, доданої при гідролізі целюлози)

Процентну частку всього зразка, переробленого в глюкозу (див. приведену нижче таблицю 53) обчислювали таким чином:

Маса переробленої целюлози (г)у/маса доданого зразка (г) (див. подробиці в таблиці 5) х 100

Таблиця 53

Результати аналізу целюлози

Го Новер і Мерероблена з вюокоїу частка повної маєм зразки СБ) пр часі інкубації (ге ши нн а и ж ж ше ши ше ши ен зв я кищнн я миши що яВОВНЄ й пиши Мо пон МО Мови пиони пон

ОВ 0 85 0458 о5Л ЗРО 6 0 ЗОВ 0 ЯЗВ о 54529 860 нев нене понині винні зн нн нн ин нини ц оон ооо пон ові В | 1505 | ів ха її ЗБОЇ УТЮ | Заг а Я.

ООБІЗВО ОЗУ | ТВ | 2035 1 ВВ 0 УЗД Ав | ЗАЯ5 | ВО Я.

ОА. -е З | 8 | 574 1 БВ ТТ 1 тд ' се НИ ДЕННЕ

ОАТМО п р оа55 ! Ах . ВВ і Б 7.56 | ВЛЯ 5508. а нн вини оон винні інн ати чн тючкчюю» нн зів пні нн дім зо Я І лю і тав і вла ВР ООВТУ | ЕМ Ша и о езз в851 Зо 0 зда 379 З. о8 4358 | Я. : др ч Її щу КУ й з у уч: спе ку тоже Я лежу Н жопу :

Ям о аЯ 1 ЗЯ їЗо ї мк НН Ки ШЕ А В С ВИ С: З В СХ ВО

ОЗ зві м І Б.Я | БВ 5 ве І АБО КЦНОСТ нон а п т и и у

ОМ ша Зав | 4.32 Вл БВ | 5.28 ! 5.43 ТВ РО

ШУ ка ЕН ЕІ МИ НЕ ВЕ В ВЕСТ Бей БВ ця У. в ОВУ нен нн п кп нн кн нн нн в в в и

Увазі 8 І яв | ВЗ ТВО 1 ЯТІ 887 | ЯК ВУЗ ОО РУВ: нн кн п и п и п п п

Приклад 19. Ферментація у струшуваній колбі при використанні Ріспіа 5іірйіє

Суть експерименту

Ферментацію у струшуваній колбі при використанні Ріспіа 5йрйіє здійснювали з використанням чотирьох целюлозних матеріалів, що мають найвищу процентну ефективність, згідно з таблицею 36.

Методика

Експерименти проводили при параметрах, приведених в таблицях 54-56.

Таблиця 54

Обладнання і періодичність обслуговування . Періодичність

Обладнання Виробник і модель род обслуговування

Струшувані (2) В. Вгайп Віоїесії, Сепготаї В5-1 Щоквартальне

Спектрофотометр Опісат, ОМ300

Біохімічний аналізатор У5І | Іпієївсієпсе, У5І Щомісячне

Таблиця 55

Компоненти У5І, використовувані в дослідженнях із струшуванням колби

КХампонект Момерпокатанюту 0 Номера

Мембрана для етанолу УВІ 2785 пУмМтОюЗа сланлартини розчин оетаному го й ВУЗИ чено

ЖЛуферннй розчин встано Зо ЗВУ шт З ОВ,

Таблиця 56

Хімічні речовини, використовувані для ферментації у струшуваній колбі і Каміни Н Я суху хх ухи Їжу ним зи ! : НИ: кампнені ; Вироби не Реєс чпащІнНнНиМ о Номери

Е «ередонни і і наМмер і ! пи п оку у им Он ПИ в, і учня Н ХА і у оче їх я пі ' Сечовина : Мо МВ : зЯТитОов ії Арт ЯЗ чєшшш шк и анна ши о ойзотиствоснови 0 Весох Оіюкійвов | се1940 ОО, о ВН НН КН;

Коипоза нн в Аеваг 000000 ВНЯСТО ОВ

Глюжова Кійексеютє 000 Вин 0000 ОЛОВО.

Розвиток посіяної культури

Для всіх наступних експериментів зі струшуванням колби для посіву готували згідно з наступною методикою.

Робочий запас клітин Ріспіа 5іірйі5 МЕ! м-7124 готували з регідратованої ліофілізованої культури, отриманої з колекції культур АК5. Кріоампули, що містять культуру Ріспіа 51рйй5 в розчині, який містить 15 об. 95 гліцерину, зберігали при -75 "С. Порцію відталого матеріалу з робочого запасу клітин висівали штрихом на солодово-дріжджовий (УМ) бульйон--20 г/л агар (рН 5,0) і інкубували при 30 "С протягом 2 діб. Перед використанням чашки витримували протягом 2 діб при 4 "С. Колбу Ерленмеєра об'ємом 250 мл, що містить 100 мл середовища (40 г/л глюкози, 1,7 г/л азотистої основи дріжджів, 2,27 г/л сечовини, 6,56 г/л пептону, 40 г/л ксилози, рН 5,0) інокулювали однією колонією і інкубували протягом 24 годин при 25 "С і 100 об./хв...

Після 23 годин росту зразок витягували і вимірювали його оптичну густину (600 нм в ультрафіолетовому спектрофотометрі) і чистоту (барвник Грама). На основі цих результатів одну колбу (так звану колбу для посіву) з оптичною густиною між 4 і 8 і з чистим барвником

Грама використовували для інокуляції всіх досліджуваних колб.

Проводили три експерименти, використовуючи зразки А132-10, А132-100, (3132-10 і 5132- 100. У експерименті Мо 1 в цих чотирьох зразках досліджували концентрацію етанолу при змінній концентрації ксилози і при постійній концентрації глюкози. У експерименті Мо 2 в цих чотирьох зразках досліджували концентрацію етанолу при подвійній концентрації вихідного матеріалу, використаного в експериментах згідно з таблицею 36. Нарешті, в експерименті Мо З в цих чотирьох зразках досліджували концентрацію етанолу при одночасній зміні концентрацій ксилози і глюкози.

Експеримент Мо 1. Зміна концентрації ксилози

Чотири зразки целюлози (А132-10, А132-100, (5132-10 і 5132-100) випробовували при змінній концентрації ксилози, як показано в приведеній нижче таблиці 57.

Таблиця 57

Склад середовища в колбах експерименту Мо 1

Обробка Концентрація ксилози (г/л) Концентрація глюкози (г/л) 100 96 Ксилоза 50 96 Ксилоза 2595 Ксилоза 10 96 Ксилоза жк 0|000000100100

Досліджувана посудини (всього 40 колб Ерленмеєра об'ємом по 250 мл), містили по 100 мл середовища. Готували середовище п'яти різних типів, використовуючи кількості ксилози і глюкози, приведені в таблиці 57. Крім того, середовище містило 1,7 г/л азотистої основи дріжджів (Ме 291940 від фірми Весіоп бісКіпзоп), 2,27 г/л сечовини (Ме 9472706 від фірми

ЗСПОЇАК СПетівігу) і 6,56 г/л пептону (Ме 211677 від фірми Весіоп бБісКіпб5оп). Всі колби витримували пустими в автоклаві при температурі 121 "С ї тиску 15 фунтів на кв. дюйм (0,1

МПа) і стерилізоване на фільтрі (фільтр з отворами 0,22 мкм) середовище помішували в колби перед додаванням досліджуваних матеріалів. Колби витримували при кімнатній температурі протягом 4 діб і перевіряли на забруднення (помутніння) перед використанням. Досліджувані матеріали не стерилізували, тому що обробка в автоклаві змінює вміст зразків, а стерилізація на фільтрі не є достатньою для стерилізації твердих речовин. Досліджувані зразки (А132-10,

А132-100, 1132-10 ї 132-100 в кількості 5 г на 100 мл) додавали під час інокуляції (а не перед нею), щоб зменшити можливість забруднення. Крім досліджуваних зразків в кожну колбу додавали по 1 мл (1 об. 95) матеріалу з колби для посіву. Колби інкубували при 30 "С і 150 об./хв. протягом 72 годин.

Зо На жаль, одна колба (зразок А132-100, що містить 100 95 ксилози) розбилася під час експерименту. Тому всі результати, отримані після 24 годин інкубації, приведені для однієї колби. Після 72 годин інкубація 100 95 вихідної кількості целюлозних матеріалів (5,0 г) додавали в колби, що містять 100 95 ксилози (всього 7 колб, тому що розбилася одна колба, яка містить зразок А132-100), і додатково інкубували, як указано вище, протягом 48 годин.

Таблиця 58

Додавання вихідного матеріалу в колби, що містять 100 95 ксилози, при інкубації протягом 72 годин дао батознній? З діза-100 5 віза 5

Аналіз

Зразки відбирали з 40 досліджуваних колб після інкубації протягом 0, 6, 12, 24, 36, 481 72 годин. Крім того, зразки відбирали через 24 і 48 годин після додавання кількості другого вихідного матеріалу, в колби, що містять 100 95 ксилози (див. таблицю 58).

Усього в 292 зразках аналізували концентрацію етанолу, використовуючи біохімічний аналізатор У5І на основі аналізу алкогольдегідрогенази (У5І, Іпіегзсівпсе).

Зразки центрифугували зі швидкістю 14000 об./хв. протягом 20 хвилин і зберігали надосадову рідину при -20 "С. Потрібно зазначити, що в нульовий момент часу зразки потрібно було фільтрувати через шприц-фільтр з отворами 0,45 мкм. Перед аналізом зразки розбавляли до концентрації етанолу від 0 до 3,2 г/л. Стандартний розчин, що містить 2,0 г/л етанолу, аналізували приблизно через кожні 30 зразків, щоб пересвідчитися в збереженні цілісності мембрани.

Всього 47 зразків аналізували підрахунком клітин. Зразки відбирали після 72 годин інкубації і через 48 годин після додавання додаткового целюлозного матеріалу. Відповідним чином розбавлені зразки змішували з 0,05 95 трипанового синього і завантажували в гемоцитометр

Нойбауера (Мецибрацег). Клітини вважали при 40-кратному збільшенні.

Експеримент Мо 2. Аналіз при подвійній концентрації вихідного матеріалу

Досліджувані посудини (всього 8 колб Ерленмеєра об'ємом по 250 мл) містили по 100 мл середовища. Середовище містило 40 г/л глюкози, 40 г/л ксилози, 1,7 г/л азотистої основи дріжджів (Ме 291940 від фірми Весіоп бісКіпзоп), 2,27 г/л сечовини (Ме 9472706 від фірми

ЗСПОЇАК СПпетівігу) і 6,56 г/л пептону (Мо 211677 від фірми Весіоп бісКіпзоп). Колби готували таким же чином, як в експерименті Мо 1. Досліджувані зразки (А 132-110, А132-100, 2132-10 і

Се132-100 в кількості 10 г на 100 мл) додавали під час інокуляції (а не перед нею), щоб зменшити можливість забруднення. Крім досліджуваних зразків в кожну колбу додавали по 1 мл (1 об. 95) матеріалу з колби для посіву. Колби інкубували при 30 "С і 150 об./хв. протягом 72 годин.

Аналіз

Зразки відбирали з 8 досліджуваних колб після інкубації протягом 0, 6, 12, 24, 36, 48 і 72 годин. Результати аналізу на вміст етанолу в 56 зразках, проведеного згідно з експериментом

Мо 1, приведені в таблиці 59. Кількість клітин, визначена для зразка, інкубованого протягом 72 годин, згідно з експериментом Мо 1, приведена в таблиці 60.

Таблиця 59

Концентрація етанолу в колбах з подвійною кількість вихідного матеріалу зразка (годин) 2017 1111111881771111026 17777012 | о 7726117 Ї71111175 7. 1.7.7.771021 7 177171717111020 | ол 21217111 2416711171771717111073 7 177171717111069 | 031 2 щ "

Таблиця 60

Концентрація клітин після інкубації протягом 72 годин в колбах з подвійною кількістю вихідного матеріалу

Експеримент Мо 3. Зміна концентрацій ксилози і глюкози Чотири зразки целюлози (А132-10,

А132-100, 5132-10 ї 5132-100) випробовували при зміні концентрацій ксилози і глюкози, як показано в приведеній нижче таблиці (таблиця 61). 5О0

Таблиця 61

Склад середовища в колбах експерименту МеЗ о б9Цукюр | 77777777777700777777711111111Ї1111111111111101

Досліджувані посудини (всього 32 колби Ерленмеєра об'ємом по 250 мл), що містили по 100 мл середовища. Готували середовище чотирьох різних типів з кількостями ксилози і глюкози, приведеними в таблиці 61. Крім того, середовище містило 1,7 г/л азотистої основи дріжджів (Мо 291940 від фірми Весіоп РіскКіпзоп), 2,27 г/л сечовини (Мо 9472706 від фірми ЗСПОЇАК Спетівігу) і 6,56 г/л пептону (Мо 211677 від фірми Весіоп ОісКіп5оп). Колби готували згідно з експериментом Мо 1. Досліджувані зразки (А132-10, А132-100, 3132-10 ії 132-100) додавали під час інокуляції (а не перед нею), щоб зменшити можливість забруднення. Крім досліджуваних зразків в кожну колбу додавали по 1 мл (1 об. 95) матеріалу з колби для посіву. Колби інкубували при 30 "С і 150 об./хв. протягом 72 годин.

Аналіз

Зразки відбирали з 32 досліджуваних колб після інкубації протягом 0, 6, 12, 24, 36, 481 72 годин (див. таблиці 62-65). Усього в 224 зразках аналізували концентрацію етанолу, використовуючи біохімічний аналізатор У5І на основі аналізу алкогольдегідрогенази (У5І,

Іп'ег5сіепсе). Зразки центрифугували зі швидкістю 14000 об./хв. протягом 20 хвилин і зберігали надосадову рідину при -20 "С. Потрібно зазначити, що для деяких зразків потрібно було центрифугування і подальше фільтрування через шприц-фільтр з отворами 0,45 мкм. Перед аналізом зразки розбавляли до концентрації, що становить 0-3,2 г/л етанолу. Стандартний розчин, що містить 2,0 г/л етанолу, аналізували приблизно через кожні 30 зразків, щоб пересвідчитися в збереженні цілісності мембрани У5І.

Таблиця 62

Результати аналізу етанолу в зразку А132-10

Час повна, бе | 1096 | 2595 | 5БОзЬ | 10096 | 095 1095 | 25 | 5095 годин Ксилоза | Ксилоза |Ксилоза | Ксилоза |Ксилоза| Цукру" Цукру" Цукру" Цукру" 0 | 043 042 | 042 | 041 | 039 | 053 | 057 | 056 | 056 6 | 116 | 116 | 1245 | 1716 | 112 | 093 | 091 | 083 | 088 36 | 7710 | 1740 | 20.25 | 21.35 | 2025 | 1.29 | 427 | 9.99 | 17.55 24 години після 23.15 додавання 48 годин після 21.55 додавання "Аналіз експерименту Мо З

Таблиця 63

Результати аналізу етанолу в зразку АТ32-100

Час Концентрація етанолу (г/л) інкубації) де | 1095 | 25е6 | БОзЬ | 10096 |. 095 1095 | 2595 | 505 зразка Кк Кк Кк Кк годин Ксилоза |Ксилоза | Ксилоза |Ксилоза | Ксилоза| Цукру Цукру Цукру Цукру 0 | олії | 009 017 | 020 | 018 | 0ла | 014 | 009 | олз 6 | оз | оль | оль | ол | 014 | оло | олі | олі | оз 15.90 | 15.70 | 16.50 | 16.05 | 14607 11.15 16.00 | 17.90 | 16.90 | 19.45 | 17807 16.10 15.75 | 16.70 | 19.30 | 22.15 | 27.00" 15.60 14.85 | 15.35 | 18.55 | 21.30 | 28.50" 12.90 шир І ПВ ОВ ПНЯ ПНЯ ПО ПОЛО ПО НО "Аналіз експерименту Мо З "Всі результати на основі аналізу однієї колби

Таблиця 64

Результати аналізу етанолу в зразку 0132-10

Час Концентрація етанолу (г/л) мазка. бе | 1095) 25е; | БО9Ь | 10095 | 095 1095 | 2595 | 5095 годин Ксилоза |Ксилоза | Ксилоза | Ксилоза |Ксилоза| Цукру" | Цукру" Цукру" | Цукру" 0 1009 | 008 008 | 008 | 008 | 005 | 0.05 | 005 | 006 6 | 014 | 0лз | 0ла | 0ла4 | о0лз | олі | о0ла | олі | ол2 12 | 7101 | 096 | 100 | 087 | 1714 | 048 | 160 | 179 | 171 15.90 | 15.70 | 16.30 | 16.05 | 14.60 11.10 1510 | 17.45 | 16.80 | 18.75 | 22.15 | 0.09. | 3.02 | 8.69 | 16.55 15.95 | 16.90 | 19.25 | 2110 | 24.00 16.50 13.50 | 15.80 | 18.55 | 21.25 | 26.55 | 0.09. | 011 | 555 | 1415 24 години після 24.95 додавання 48 годин після 24.20 додавання х Аналіз експерименту Мо З

Таблиця 65

Результати аналізу етанолу в зразку 132-100

Час Концентрація етанолу інкубації О до 10 Фо 25 90 50 95 100 Фо о о о о зразка |Ксило- Ксилоза | Ксилоза | Ксилоза | Ксилоза Цукру" Цукру" Цук з. Цук з. (годин) за |Ммас/об. 95) | (мас/об. 95) (мас./об. 95) (мас/об. 95 укру | зУкру | лУукру | лукру 0 1004| 004 | 004 | 004 | 005 |0051005| 0.05 | 0.06 6 1|007| 007 | 008 | 008 | 007 |0041|005| 0.05 | 0.06 712 |060| 056 | 067 | 058 | 071 |о0л13|137| 148 | 1.44 24 |13.05| 14.45 14.90 13.95 12.05 10.55 36 |1510 17.10 18.25 18.20 19.25 16.10

Продовження таблиці 65 14.40| 17.00 19.35 22.55 24.45 15.85 14.70 15.40 18.45 22.10 27.55 14.30 24 години після 25.20 додавання 48 годин після 24.60 додавання х Аналіз експерименту Мо З

Зразки відбирали після інкубації протягом 72 годин для підрахунку клітин (див. таблиці 66- 67). Відповідним чином розбавлені зразки змішували з 0,0595 трипанового синього і завантажували в гемоцитометр Нойбауера (Меибацег). Клітини вважали при 40-кратному збільшенні.

Результати

Одну колбу для посіву використовували для інокуляції всіх досліджуваних колб в експериментах Мо 1 і Мо 2. Виміряна оптична густина (600 нм) в колбі для посіву становила 5,14, і концентрація клітин становила 4,65 х 10 клітин/мл (таблиці 65-66). Отже, первинна концентрація клітин в досліджуваних колбах становила приблизно 4,65х105 клітин/мл.

Другу колбу для посіву використовували для інокуляції колб експерименту Мо 3. Виміряна оптична густина (600 нм) в колбі для посіву становила 5,78, і концентрація клітин становила 3,75х108 клітин/імл. Отже, первинна концентрація клітин в досліджуваних колбах становила приблизно 3,75х105 клітин/мл.

Таблиця 66

Концентрація клітин після інкубації протягом 72 годин

Концентрація клітин 108/мл)

Зразок 0 9 10 96 2596 50 95 100 95 0 9 10 95 25950 50 95

А132-10

А1Т32-100 0.99 / 1.07 / 0.99 | 0.78 | 1.97 | 0.03 | 033 | 0.44 | 1.81 в132-10 с132-100 "Зразки були сильно забруднені після 72 годин росту. Це очікувалося, тому що культура

Ріспіа не показувала хорошого росту без додавання цукру, і домішки (із нестерильних зразків) могли перевершити в рості культуру Ріспіа

Таблиця 67

Концентрація клітин при інкубації протягом 48 годин після додавання 100 95 ксилоли і глюкози

Концентрація клітин (10 в/мл)

А132-10 10.17

А132-100 2132-10 с132-100

Приклад 20. Випробування токсичності лігноцелюлозних зразків відносно Ріспіа в5іїрйів5 і зЗасспаготусез сегемівіає

Суть експерименту

Тридцять сім зразків аналізували на токсичність відносно двох виробляючих етанол культур, а саме Засспаготусеб5 сегемевзіає і Ріспіа 5ірйй5. У цьому дослідженні в зразки додавали глюкозу, щоб розрізнити вирощування культур на мінімальному середовищі і токсичність зразків.

Таблиця 68

Умови випробування на токсичність й | Органом

Парамати» ан А по м он Мор о у у ну ку нин арямете о Масопатнпусев сегоУнцає Вістна ре

Об'ємінокуляцї м 000000 дра и см авокулящи кн; ! ішль Їх НК каігнвмиа ро пилью жах КУ хлітвні мл! Я

Жювторення вино УВИЦИХ Я п Коелов в одному екземи : о Температура нкувації пики Зк :

Н і Я у Н с яю Я

Швидкість сірушувана | зав | їз "Повинй час : не тз Е 1: сх САНЯ ' їж я : інкубації годин) Е : ізе аналі етанолу 00000 щу дово дооодту судно доня вс зналіку етанолу ОВ, ря, 38,48, 72 0.8, 2, В ТВ це пілвахУнЕУ ЕЛЕН СК «й, ТУ : за а ї ізн пов ни нн УКХ ут тт фен яттннни ная Кт чут нн

ГЕН. | Огодин і Згоди

Методика

Суть використаної методики приведена в таблиці 68. Опис хімічних речовин, використаних у випробуванні токсичності, приведені в таблиці 69. По дві контрольні колби (без додавання зразка) готували для кожного мікроорганізму на кожний тиждень випробування. Всього проаналізували 82 колби.

Протягом експериментів не було виявлено етанолу і клітин в колбах, що містять культуру

Ріспіа віірйі5, із зразками С, С-Тїе, С-бБе і С-10е протягом перших 24 годин інкубації. Для підтвердження результатів випробування повторювали. Друге випробування підтвердило деяке інгібування росту культури Ріспіа віїріїї5 при додаванні в колби зразків С, С-1е, С-5єе і С-10е.

Таблиця 69

Хімічні речовини і матеріали, використані у випробуванні токсичності

В мине мм НН УМО іо нм нн ОН, і каМмпОнентх | ; я заестрванннВ й М:

ОМП ОНеНІ о Виробник РеєстраНінние Номевтиртй і середовища ! І виМмеЮр ; о КХеювина ОПОВ Спетевну зв 0 АНЯ оо ютнетасснова 0 Весюв квот 00 391940 татка ШИ ! Пенн басювп Оки вВоп 211577 ла

ПА А А А фр ПАМ Ах ПМ ру ви м пою ср

Конпеза Н АнНз Леза Ат 0 иОНю ши; лиш НН МИНА іс Я ши: шиши: Ш балок звоютновнй бані: ; Меси Мектой 51120 пЕТВеНВ

Таблиця 70

Компоненти У5І, використані у випробуванні токсичності

Компонент | Номер по каталену

Мембрана аля ставолу ОЇ ТВ

Єтандартвни зїмючин етанолу БІ що рт ЖЕН

Пуберний пох ветаномі 7

Досліджувані зразки

Сім досліджуваних зразків (всі мають позначення С) подрібнювали за допомогою кавомолки, прийнятної для малих зразків. Зразки подрібнювали до такої міри, щоб можна було розрізняти розміри частинок (при порівнянні зразків) неозброєним оком. Зразок номер С-100е легко подрібнювали для отримання частинок дрібного розміру.

Всі зразки додавали в колби в кількості 50 г на літр, за винятком шести зразків, позначених Р (25 г на літр). Ці зразки були від білого до кремового кольору і крихкими на вигляд, і вміст колб неможливо був перемішувати належним чином (внаслідок недостатності вільної рідини) при концентрації 50 г/л. Зразки 5 легко розчинялися, і їх можна було, потім додавати в колби в вищій концентрації. Зразки А і С можна було, потім додавати в кількості 100 г/л.

Випробування здійснювали з використанням двох мікроорганізмів, як описано нижче. засспаготусез сегемізіае АТОС 24858 (з колекції типових культур США)

Робочий запас клітин культури Засспаготусе5 сегемізіае АТСС 24858 готували з регідратованої ліофілізованої культури, отриманої з колекції типових культур США. Кріоампули, що містять культуру Засспаготусев сегемізіае в розчині 15 об. 95 гліцерину, зберігали при - 7576. Порцію відталого матеріалу з робочого запасу клітин висівали штрихом на солодово- дріжджовий бульйон (УМ)20 г/л агар (рН 5,0) і інкубували при 30 "С протягом 2 діб. Колбу

Ерленмеєра об'ємом 250 мл, що містить 50 мл середовища (20 г/л глюкози, З г/л екстракту дріжджів і 5,0 г/л пептону, рН 5,0), інокулювали однією колонією з чашки з солодово-дріжджовим бульйоном (УМ) і інкубували протягом 24 годин при 25 "С і 200 об./хв... Після 23 годин росту зразок витягували і вимірювали його оптичну густину (600 нм в ультрафіолетовому спектрофотометрі) і чистоту (барвник Грама). На основі цих результатів одну колбу (так звану колбу для посіву) з 00-9-15 і чистим барвником Грама використовували, щоб інокулювати колби для росту. Після 23 годин росту вміст колби для посіву мав низьке значення оптичної густини (5,14) і кількість клітин (1,35х108 клітин/мл). Потрібно зазначити, що колонія, взята з чашки для посіву, була менша звичайної. Отже, в кожну досліджувану посудину додавали по 0,5 мл посівного матеріалу (замість планової кількості, що становила 0,1 мл).

Зо Досліджувані посудини являли собою колби Ерленмеєра об'ємом 500 мл, що містять 100 мл стерильного середовища, описаного вище. Всі колби витримували в автоклаві при температурі 12ГО і тиску 15 фунтів на кв. дюйм (0,1 МПа) перед додаванням досліджуваних матеріалів.

Досліджувані матеріали не стерилізували, оскільки обробка в автоклаві приводить до зміни зразків. Досліджувані зразки додавали під час інокуляції (а не перед нею), щоб зменшити можливість забруднення. Крім досліджуваних зразків в кожну колбу додавали по 0,5-1,0 мл (0,5- 1,0 об. 95) матеріалу з колби для посіву. Колби інкубували, як описано вище, протягом 72 годин.

Ріспіа зріїїз з колекції культур АКЗ

Робочий запас клітин культури Ріспіа вірні МКК м-7124 готували з регідратованої ліофілізованої культури, отриманої з колекції культур АК5. Кріоампули, що містять культуру

Рісніа 5іірйі5 в розчині 15 об. 95 гліцерину, зберігали при -75 "С. Порцію відталого матеріалу з робочого запасу клітин висівали штрихом на солодово-дріжджовий бульйон (УМ)20 г/л агар (рН 5,0) і інкубували при 30 "С протягом 2 діб. Перед використанням чашки витримували до 5 діб при 4 "С. Колбу Ерленмеєра об'ємом 250 мл, що містить 100 мл середовища (40 г/л глюкози, 1,7 г/л азотистої основи дріжджів, 2,27 г/л сечовини, 6,56 г/л пептону, 40 г/л ксилози, рН 5,0), інокулювали однією колонією і інкубували протягом 24 годин при 25 С і 125 об./хв... Після 23 годин росту зразок витягували і вимірювали його оптичну густину (600 нм в ультрафіолетовому спектрофотометрі) і чистоту (барвник Грама). На основі цих результатів одну колбу (так звану колбу для посіву) з оптичною густиною 5-9 і чистим барвником Грама використовували для інокуляції всіх досліджуваних колб.

Досліджувані посудини являли собою колби Ерленмеєра об'ємом 250, що містять по 100 мл стерильного середовища, описаного вище. Всі колби витримували пустими в автоклаві при температурі 121 "С і тиску 15 фунтів на кв. дюйм (0,1 МПа), і стерилізоване на фільтрі (фільтр з отворами 0,22 мкм) середовище помішували в колби перед додаванням досліджуваних матеріалів. Досліджувані матеріали не стерилізували, тому що обробка в автоклаві змінює вміст зразків, а стерилізація на фільтрі не є достатньою для стерилізації твердих речовин.

Досліджувані зразки додавали під час інокуляції (а не перед нею), щоб зменшити можливість забруднення. Крім досліджуваних зразків в кожну колбу додавали по 1 мл (1 об. 95) матеріалу з колби для посіву. Колби інкубували, як описано вище, протягом 72 годин.

Аналіз

Зразки витягували з колб для посіву безпосередньо перед інокуляцією і з кожної досліджуваної колби через 24 і 72 години і аналізували концентрацію клітин, використовуючи прямий підрахунок. Відповідним чином розбавлені зразки культур Засспаготусев сегемівзіає і

Ріспіа 5йПрйй5 змішували з 0,0595 трипанового синього і завантажували в гемоцитометр

Нойбауера (Мешибапег). Клітини рахували при 40-кратному збільшенні.

Зразки витягували з кожної колби через 0, 6, 12, 24, 36, 48 ії 72 години і аналізували концентрацію етанолу, використовуючи біохімічний аналізатор МУ5І на основі аналізу алкогольдегідрогенази (У5І, Іпіегесіепсе). Зразки центрифугували зі швидкістю 14000 об./хв. протягом 20 хвилин і зберігали надосадову рідину при -20 "С. Перед аналізом зразки розбавляли до вмісту етанолу, що становить 0-3,2 г/л. Стандартний розчин, що містить 2,0 г/л етанолу, аналізували приблизно через кожні 30 зразків, щоб пересвідчитися в збереженні цілісності мембрани в процесі аналізу.

Обчислення

Наступні обчислення використовували для порівняння кількості клітин і концентрації етанолу з контрольними колбами.

Процентна ефективність - (концентрацій етанолу в досліджуваній колбі/концентрація етанолу в контрольній колбі)х100

Процентна кількість клітин - (Кількість клітин в досліджуваній колбі/кількість клітин в контрольній колбі)х100

Результати

У колбі для посіву культури Засспаготусез сегемізіае оптична густина (600 нм) становила

Зо 5,14, і концентрація клітин становила 1,35х108 клітин/мл. По 0,5 мл матеріалу з колби для посіву додавали в кожну з досліджуваних колб. Отже, вихідна концентрація клітин в кожній колбі становила 6,75х105 клітин/мл. Під час другого тижня випробування в колбі для посіву культури засспаготусеб сегемізіае оптична густина (600 нм) становила 4,87, і концентрація клітин становила 3,15х107 клітин/мл. По 1 мл матеріалу з колби для посіву додавали в кожну з досліджуваних колб. Отже, вихідна концентрація клітин в кожній колбі становила 6,30х10 клітин/мл. Значення рН вмісту колби з культурою Засспаготусез сегемізіає при відборі зразка в нульовий момент часу приведене в таблиці 71. Значення рН вмісту колби знаходилося в оптимальному інтервалі для росту культури засспаготусез сегемізіає (рН 4-6). Регулювання рн не було потрібне.

Таблиця 71

Значення рН вмісту колби з культурою Засспаготусев5 сегемізіає при відборі зразка в нульовий момент часу о Вбюмерзвака Й рН Й о МНомевзрюка ши шк -жйбс ши: ни: ши: ше шк; ши ши: шшшнши ши шк: шк: ши ше ж ши ши киш с нн нн п А шк ин: лише НН шишки ие МИ НК НЕСЕ КН с: КК ше ше ше шк шк ше ни НИ "5 означає сахарозу "С означає кукурудзу "5 означає крохмаль

Значення концентрації етанолу і ефективності культури в колбах з Засспаготусез сегемівзіає представлені в таблиці 72 і 73. Найвищі концентрації етанолу отримані в зразках серії 5.

Таблиця 72

Концентрація етанолу в колбах з культурою Засспаготусез сегемізіає о Номер 7. .Концентрація стинолу ПУЛІ в настуні, моменти часу (голим! ння ши ши ших: ник м и нн; НН; ШК НИ донИеЛЬА 00100070 О85 0 Б60ОВЛЯ ОВ БВ іконтоль В ПА й 100005 4 В ВЯЗ В 5.75 "аналіз під час другого тижня

Див. список номерів зразків в таблиці 72

Таблиця 73

Ефективність культури в колбах з Засспаготусез сегемізіає шк жшшшш ши: ши ше є ше МЕ СИ

А | Та | наз | ЕСУ | 715

АЕН

УІШ ШИ ! Зк і ТЕ? ! ща

ШИ: ши нших ШИ ши: ШЕ ши ши шше ши шш Ш шк ши ше лиш: ше: М

БЕ | та і Зоя | та | КД ші ше: их ше М ЩО ВИШ Ся ДИ оо ЖнНноюпь де 99 : ВВ | 19055 ! 131.5 "аналіз під час другого тижня

Значення кількості клітин і процентної концентрації клітин в колбах з культурою

Засспаготусез сегемізіаеє колби представлені в таблиці 74. Високу кількість клітин спостерігали у всіх колбах, однак виявилося, що не всі клітини виробляли етанол.

Таблиця 74

Кількість і процентна концентрація клітин культури Засспаготусез сегемівзіає

І ж мно Кількість клини Процентна хоноснтрація коти

Момер зразка С р еаринню - отннн- ши: шин: ши: ше ше ж ше я зош ши: ши: ши: ши: с ше ше

СЯЄ сх що ЗА шк ши ши шшши: ше шишки: ши не

ПОКИ ЧИХ КК З ОМ КОН ОКА пон и А киш: ИН КИ КИМ: НИК ПИ КИ КЕ А НИЙ ' БТЛОЄ | 058 ! пе ОІВ | ява ши і ШИшШННИ: ИН ИН НМА ЗМ. МАННА НААН кН о еНтрюль Ве по оо | що | 108.

У колбі для посіву культури Ріспіа 5їїрйі5 оптична густина (600 нм) становила 5,01, і концентрація клітин становила 3,30х108 клітин/мл. По 1 мл матеріалу з колби для посіву додавали в кожну з досліджуваних колб. Отже, вихідна концентрація клітин в кожній колбі становила 3,30х105 клітин/мл. Під час другого тижня випробування в колбі для посіву культури

Ріспіа взіїріїіх оптична густина (600 нм) становила 5,45, і концентрація клітин становила 3,83х108 клітин/мл. По 1 мл матеріалу з колби для посіву додавали в кожну з досліджуваних колб. Отже, вихідна концентрація клітин в кожній колбі становила 3,83х105 клітин/мл. Значення рН вмісту колби з культурою Ріспіа 5іїріїі5 при відборі зразка в нульовий момент часу приведене в таблиці бо

75. Значення рН вмісту колби знаходилося в оптимальному інтервалі для росту культури Ріспіа віірії5 (рН 4-7). Регулювання рН не було потрібне.

Таблиця 75

Значення рН вмісту колби з культурою Ріспіа 5Ііріїїз при відборі зразка в нульовий момент часу

ВЕ 5ВО ! ТО і 44 ! ше: ни: ни 3 НН шк ши: ШИ

БОБ | 427

Значення концентрації етанолу і ефективності культури в колбах з Ріспіа в51їрйіб представлені в таблиці 76 і 77. Найвищі концентрації етанолу отримані в зразках серій с і А.

Колби С-30е, С-50е і С-100е також містили високі концентрації етанолу. Значення кількості клітин і процентної концентрації клітин в колбах з культурою Ріспіа 5іїрйі5 представлені в таблиці 78. Низькі кількості клітин спостерігали в колбах з позначенням 5. Низькі кількості клітин спостерігали також в колбах, що містять зразки С, С-1е, С-5е і С-10е, при відборі зразків через 24 години.

Кон ен і шк центрація етанолу в й

Ду ва Що її Фт нн лови -- шк пет нт урн ги ре хо : як я У ї що й» 3 к ОБОВ ВБОВВ длкнння Р шик шк; го і шк ше настео моменти часх го:

ЗЕ лхяннжк киянин ких З ї ОККО іх вн КВН ХО геул і п ні Я шин | сш в ше --

Я т є ШІ т ше я Е шк - " | тя: Г | нЕ п. шк ай ! т в нені зен ін ступ нн НИ меня НК фе БАК пи тя - шо шо й ш ШЕ шен Ії ші -- т ших Шиш мок М Ко ден ше - ; Те ср пло нки 4 в С ші 15 осн мин ЗИ ні ше ПК пф БУ пен коня ВМ ручних іч я: ши ВН плн кі жнннннни СУ сення ТО а сонні, | ви шин шик КВН ник:

СЕ шик: ші. ше ше нн ПО «В 1586 вс У ЖЕ 5 шин КВ ке шини ши 15. ШЕ ом, минав пи хх я М па вн Н х г пеня ; о 5 ши МИШКИ ск шн! ш- у шише ШЕ. й. : пе АОС няняянафяння ОМ. і неви М іх фе ІМ ЩО шк її -- --- хе ше Її мини ння же БЕ о . о шо ї Я ей ше ШИ ще ші ши - ши й шк Пн ше ш ву пилки чдття ЕН пдфе 1. Н манні НН щі «КК нний В по о вико шу. ши ту шк Дер ше с. ит теж чи Ре шо ї-

З | г. ши шо нии ії ШЕ У о то шк: ши: пише се ши сша що - ! | іш п СТВ | дя сежееки ни Ре пфнчннни кл м

ТЕЗ - ШКО ОБОВ сна Ка ск НН дет ьо го що шик: СД ший тя

УК що Н казна у о у нен шини їй 5 ЩІ ШІ | ї ї-- - сі о В НУ рення і й з5 Щ - й шк ! ши У шен НКУ зе -- шо. ст - -Е . он ще НЯ по нн ворони Я 5 І ШІ ; 1 и пух пен щХ п: т ви ши: - - | ши ше шини с шини В ш- ше й й ша - В ши КУ пишне, Га ше ши ни МН у | Пенн и ення 13 6О пише ще і СІ мал ВК сля ГИ помннишнн НАМ др БАЗ М М . из 8 шини; ще шен ІВ. що - й пе . ші п ши нку Б шк 7 шко М сін Я - Еш шов с що шо їх і-й З - 5 шо --я й С 7 Щі ТУ ї ння і. 3 Щ ШЕ . ши пе що ! ШО КУ пофнннчю нн і АС шо шк ш р що шо же КК ши ші КЛ сн Конні УА

З с - в ше ЕЕ кання 135 шини пт ще - У поофнннкннн чан ачнднкн МИ я 1 А

З шт ше шини ще Я шк ї шк !

Ш- А ОЕ и же що суши с ши БА ши ни шк

ЕК Він 6 а я т СЕ о ій А фччнекнк рек дернини Ей Ш ШК її шо | | с

СнТрюлЬ В шк уж ВЗ чн | хв шо ; 8- не ! ї ши 2 кох ванних доски що м й п | щ- ши ши Ох по ЩІ ги -ї що чн Тнннннннй ДНК МАЕ й не фессеннекхух ЕІ тан хе пААААААААААЬ Мана ьньм ВВ й ШЕ нНЕ ще

СКК в вк вл 4 і с і Гу І а

Та

Ефективність культури в колб і Шо пе ншнннкиння ес

Ї меня їх внвя зовн, ож жа ж НИ Ж КВ Ж

ЩО ово зі ек навісї віру цастувні момен п т т п ст 7 ооо ооо ВО ВВВ ; Й НЙ - й шк шк - т як покммммнмооаана я 5 . М М й як 180. й З і 4 З ; й хх МОМ ОО ух і

СЕ Ех нини сті ше ННІ Коси нн нн м шк дя ї у: кн нини дак АХ | ЗЕ ЗІ динчкннннннкн -- с ВВ нн Ід пер м чнннннн зн ГЕ З Н шк се нн В : інши у ше -йфя ння ТБ | їі ши шк ще Фен З 115 прин і. ; оду пллчччннкчях АКТ Н вд В СУ : Еш ши й К Е ДН нн х 4 Н За а ния її у КУ Н

ЛОТУ, Тая нн нен коуч і осн ї ткнлкккжкккькиккєкккюмя джххжккжнаюк ва А -д ен: нин ТЯ Е ФА Б ши ХЕ : ДЕ шО | тин а шк є сини З кни Я Н

Н «Алл отжюю клялякюжкь фаляжкня З, ' реве чання пчччченнчннн КК Ме ! і «ЕІ шк : ї . Щ і каш З й ї х З Дорн х в

Н ес ннннни и жжжюю - ї КЗ рожа пе ще ! Е ЗЕ шк ВАЕ енишнннкх 5 пи и і шк ЯКЕ ння В | З Пн У я: ШИ Я і не нин .дллятятллллннія НЄ : х ок чн шк де «Ян ме | Еш й і і. а ШИ а ї Хр уктнннннні виь сном і-й | В денне ! 4 Дб рннннтн нн - шк ве ! с шшн Н жо і іш ;

УМ : | З к- пон чн птн вот хх м ще і - ШИ м ШИ Ншй че ! : окон саеаАх І Есе НИ і ши ; пе и і іх ШИ

Коннов ЗЕ | У Я нн Е Ко ши: і і : | ША | НА пором чні чання Но З і ші | Стреня пд ї 1596 пшш ї ї ОЛЬАЄ х г У ттття ях 5 пт х І оо

КК ОК З 1ЩХ М І З хи «аналіз пі п АВМ: ще. д час другого тижня

Таблиця 78

Кількість і процентна концентрація клітин культури Ріспіа 5іїрйів шо ! ЦО клітиніма) | квірчнуекліхвна комтроля» В ше ши ши нн СИ В як ИН: нини; нн ник знижен НК

ВНУ і же : Та І ТВ і 1750 і нш: ши ши шкох т Вижи: ха Ми: КО ши шини ши ши: ша

УК | 1.73 і 78 ОД т7.В і ше шити мит ши ши нини ше ш ше ше шнек шкжиши шиаши: ши нин шк ши ши шшк: ж ши ши ши ши шише: шишш: ши ши ши: ШИ ШИ Бай | ко : У те ще 15 у я ру шшшни ни Тл БВ ш шк шиши ши ше шишшк "аналіз під час другого тижня

Суть результатів по токсичності для клітин 2утотопав ітпорбіїї5

Як показано на графіку ТА, підвищені кількості клітин (наприклад, більше ніж в контрольному зразку) спостерігали в зразках, що містять Р-132-10, (3-132-10 ії МУ5-132-10, в момент часу через 24 години. Кількість клітин в присутності всіх інших зразків була порівнянна з контрольним зразком. Це спостереження показує, що субстрат не були токсичними відносно 7утотопав тобіїї5 протягом 24 годин після посіву.

У момент часу через 36 годин зменшення кількості клітин (наприклад, внаслідок втрати клітин або загибелі клітин) спостерігали для всіх зразків, включаючи контрольний. Найбільше зниження кількості клітин спостерігали для тих зразків, які містили Р-132-10 і 5-132-10. Вірогідна причина цього ефекту є загальною для всіх зразків, включаючи контрольний зразок. Таким чином, причина цього ефекту полягає не в досліджуваних субстратах, тому що вони відрізняються для кожного зразка і не містяться в контрольному зразку. Можливе роз'яснення цього спостереження включають неправильні для культури умови (наприклад, температура, склад середовища) або концентрації етанолу в зразку. -о Бвабнк А Концентрації стано для купе поваз пові с Мч ! Ї

КО

5 сх ах ї ВО Яні ЯК ік нВХ «Корі ВВ АВ «Кі В ОВ «й це з ее 6 ща 6 Юм ява

Ук ке щ и й а ЗШ я С си и ше ик ВН НЕ С НН:

Же ау Же Я ій З « і ще а « ж

ШО гої пек ее ШЕ

Як показано на графіку 18, всі клітини виробляли порівнянні кількості етанолу (наприклад, 5- г/л) в кожний момент часу, незалежно від субстрату. Згідно з даними про кількість клітин, 10 представленими на графіку 1А, концентрація етанолу в кожному зразку досягала максимуму через 24 години. На відміну від даних про кількість клітин, концентрація етанолу не зменшувалася в подальші моменти часу. Це очікувалося, тому що етанол не видаляли з системи. Крім того, ці дані свідчать, що виробництво етанолу в цих зразках може відбуватися в результаті ферментації глюкози в середовищі культури. Жоден з досліджених субстратів не показав збільшення виробництва етанолу.

Традню НЕ Концентреци столу дня дувотмевав ве їз за в в. в и в В

Щи з. 8 а З 5 5 8 З - ба . и: СВО ВОШЕ. її Б

Ж ви иа и Ви Вивих іні: пік він й Ей ЕЕ Ка Мун ій ВМ ї, Я я

СТШНИКе з хх. Е ; їх З Кі: ху хх

КК я ще Кк Я е ву ді щен що яв 5 и М М я ші Ша ї

ВІ ЕВ СТЕ за Бей св ше.

Графіки ТА і 1В спільно свідчать, що концентрація етанолу, яка складає більше ніж приблизно 6 г/л, може бути токсичною для 7утотопавх торБбіїї5. Ці дані також представлені як процентне нормоване відношення до контрольного зразка, як показано на графіку 1сС.

Графік НС. Процентне відношення досту клітин зав - і внросннитва етвнале для жутототах пюбних

ШН аю жа !

ИН за ОБ БО йо» дь я пи

Б о ї З . о с ЕЕ ЕІ с ні. ники нік ніша нні жені: Енн і . ще Б . 8 є Я і. й і В ії Я ій а. Як ж. Е. "й їв с Ей Я Ей Ве и км В В хм ШК МР ою В кВ В В г шк и В дк З М КЕ ЗД

СеЗ що х ге е І ЩА в й--У - св ; і Ь «5 ж ч Е й КО

Го йкітни ся тва БЕВК ЗУ 0 Косютвен єть БЕЕВ Мол

Ріспіа віїріїів

Як показано на графіку 2А, кількість клітин була порівнянна з контрольним зразком. Крім того, хоча спостерігали дещо зменшену кількість клітин в зразках, що містять -132 і МУ5-132, зменшену кількість клітин не спостерігали для 5-132-10, (2-132-100, А-132-10 або А-132-100.

Таким чином, малоймовірно, що субстрати А або С є токсичними. Навпаки, зменшена кількість клітин, що спостерігається для -132 і М/5-132, ймовірно, викликана аномалією експерименту або присутністю непереробленого субстрату, що якимось чином перешкоджає росту клітин.

Загалом ці дані свідчать про те, що глюкоза, присутня в контрольному і експериментальному зразках, ймовірно, є достатньою для забезпечення оптимального росту Ріспіа віїрйіє, і що присутність додаткового субстрату в зразку не збільшує цю швидкість росту. Дані результати також свідчать, що жоден із зразків не є токсичним для Ріспіа 5іїрйів5.

Гужннк ЗА. Конценемнив каб ові БЕН: зба не | т І ГЕ же й

ШИН НН НІК НІК НВ Я І ж ЕІ -В З... з ях хх хи. чу вити рія ще чт хх ноу ло и Кор СУ сх ія ей ярх дО ух ХХ Ме ши и а а в о а м и нн В СК СИ МО 5 й Ж є З а с СВ КУ се ! Ж год ча тох !

Не о

Як показано на графіку 28, незважаючи на аналогічну кількість клітин, представлену на графіку 28, значно збільшене виробництво етанолу спостерігали для всіх зразків, що містять досліджуваний субстрат. Концентрації етанолу збільшувалися з плином часу для кожного з досліджених моментів часу. Найвищу концентрацію етанолу спостерігали для А-132-10 в момент часу через 48 годин (наприклад, приблизно 26,0 г/л). Порівнюючи концентрації субстрату з найвищими рівнями виробництва етанолу з даними про кількість клітин, представленими на графіку 2В, видно, що культура Ріспіа 5іїрйй5 не є чутливою до збільшення концентрації етанолу. Крім того, виробництво етанолу виявляється таким, що залежить не від кількості клітин, а від типу субстрату, присутнього в зразку.

Грешінк «Б. Концентрацн етанолу для Рідна збе і її їх г Ж

У у Бак х КЗ їй Не ще ек

ТЕ - щи ши ше щини ше і ні ші: ж ЕЕ Ки ин ів

М щі КБ о я Со я БІ Я ки ЕН

Ко І ВЕ З її ШЕ гу я В Зх 5 ще як В Бе а ВК вань М.В. жене. Еш: нкші я хе на в НА НО Я НД АН з й Кк Кей кх Б Кк т - х. хо а г ї шЖх те б Її сви ОК зуї СНИ Ж пек у ї м ся ІН с о В п в Ко М А у І У ш щі де що М В Нв с а Миш їй КО з -

Бра ОД ай ге

З . . . . . .

Результати на графіках 2А і 2В спільно свідчать, що досліджувані субстрати не забезпечують збільшення росту Ріспіа 5іїрійі5, однак вони значно збільшують кількість етанолу, що виробляється клітинами цього типу. Ці дані також представлені як процентне нормоване відношення до контрольного зразка, як показано на графіку 2С.

График БО. Пірзоцентне візвсншення росту Китне і вина тва етносу для ВІ ке

ВО я

Я Я Й

КОЮ я ще п. вояк в ПВ ОНА г . заз 4 п 11 ж 1 Зх х ї завів ВХ

Зо ши ши ши ши шини ши ши ши ши

Ка ши В

КЕ БЯ В ВМ В, кож В ОЗ ях вза ж ов Ж ЖЕ ФК жу УНН ге ж Ок ем С ше ук т їх 0 еКДИВНЯ Мб ОК ух мн: С МК НИ ЗА В

Чо Обов -- з що «У я: Й КУ шо м : кх 3 х жкКлинни сі га КОМ жк вза Клітини сб аа З ЗВ год засспаготусез сегемівіає

Як показано на графіку ЗА, зразки (с-132-100, А-132, А-132-10, А-132-100 ї Му/5-132 забезпечували дещо підвищену кількість клітин в порівнянні з контрольним зразком. Жоден зразок не показав значного скорочення кількості клітин. Ці результати свідчать, що жоден із зразків не є токсичним для засспаготусез сегемізіає.

Гран ЗА Ковцентрація клітнналя 0 Заевпамнвусев сепелвізе - аа

ОЗ гі ШЕ ши що шк г

Ку си ше ше ше шик ше шшЕ ше ше ше ше ше ШЕ: й Я же щ ще жк же ЩО. З сс: -- В -- З... ща жк кн Я. ке - ж Я. Ж З -- я м Фах оо Ома ДЕ ШИ В

Ко Б М ? ще « Ко Ку

Ж ще проза тов

Як показано на графіку ЗВ, збільшення виробництва етанолу спостерігали для оброблених клітин кожного типу в порівнянні з контрольним зразком. Зіставлення цих зразків, що містять найвищу кількість етанолу, з даними про кількість клітин, представленими на графіку ЗА, свідчить, що концентрації етанолу, що перевищують 5 г/л, можуть чинити несприятливий вплив на кількість клітин. Однак це спостереження має місце не для всіх зразків.

Гук ЗВ. Концентчиниг етанолу пяя 0 Звеоланотуєев - Бегевіне ! їх - гі м а щ Я т НН п ОО І р мо ще ШЕ ШИ Я в. в т по

ЕЕ | ЕВ | ней ней ки ШИН НИ як ні " вла г ж сш ож ж нн Ве

ШЕ ке ШЕ жене ев жо кн ШЕ ШЕ шк Н

КЕ й Інні ЕЕ. швів шен і. ТЕБЕ кни ж а ша ж с о ж с а С с и А и І А а а В В ВИС МКУ КЗ я што а М ГУ 7 Й вия В пох вв оягов анода вгод

Ці дані також представлені як процентне нормоване відношення до контрольного зразка, як показано на графіку ЗС.

Грав МО. Проценуне відномення росту клігния : і анробннутву етанолу для басойажлуюсх сетпеуівіве «І Ї бе я Вк ГІ ЗЕ ще в за ЩІ вис ней Нав св вк ков Не ЕН НИК і ШЕ НЕ НЕ Н НІ.

У БІ | Ту ї БМК ї ій . ИН. с ЕЕ: п кн Ж ЕЕ С ОК Еш: ВК ши и А ЗК Кн ЗВ ШК НК

ОКО ОМ чи НА ово во НЕ сх щ к ще ШЕ 5 М о І ес й як М (дено РЕЕТОВ Зб увд Ш Кненя За ВИЮЙ ЗВ го

Мк жк книжн ЖАНАААЖК Ж ЖАААЖАНК КК МАААНИК КК АКАКАМАНККАНАААААЖАТАНАААНАМААКААНКК Ж АААНАТ ЖК ААЖЖКНН КК АААК НАВАН

На закінчення, жоден із досліджених зразків не виявився токсичним у випадку 7утотопав5 торбіїв, Ріснпіа 5іїрйі5 або Засспагоптусез сегемізіає. Крім того, культура Ріспіа 5іїрйі5 виявилася найбільш ефективною з даних трьох типів клітин для виробництва етанолу з досліджених в експериментах субстратів.

Інші варіанти здійснення

Описаний ряд варіантів здійснення даного винаходу. Проте, буде зрозуміло, що можна виробити різні модифікації без відхилення від суті і виходу за межі об'єму даного винаходу.

Наприклад, волокна можуть бути присутніми в будь-якій бажаній формі і можуть мати ряд різноманітних морфологій. Як правило, бажано, щоб целюлозні матеріали мали високу питому поверхню. У деяких випадках волокна можна впроваджувати в одношарові або багатошарові листи, наприклад, волокна можуть являти собою частину високоефективного сухого повітряного пилового фільтра (НЕРА) або подібних виробів. Листовий матеріал може мати питому поверхню, що складає, наприклад, приблизно від 1 до 500 мг/г. Волокнистий матеріал може бути накладним, наприклад, отриманим аеродинамічним способом з розплаву, складчастим, у вигляді сітки або решітки, або виготовленим в іншій геометрії. Волокна можуть бути екструдованими або спільно екструдованими.

Волокна можуть мати будь-який бажаний розмір частинок, від нанорозміру, наприклад, менше ніж приблизно 1000 нм, наприклад, менше ніж 500 нм, 250 нм, 100 нм, 50 нм, 25 нм або навіть менше ніж 1 нм, до більш крупних частинок, розмір яких складає, наприклад, більше ніж 100 мкм, 200 мкм, 500 мкм або навіть 1000 мкм, або агломератів частинок.

Хоча субстрати біомаси обговорювалися в даному документі, дані субстрати можна використати в поєднанні з іншими субстратами, наприклад, неорганічними і синтетичними субстратами, описаними у тимчасовій патентній заявці США Мо 61/252300, поданій 16 жовтня 2009 р., повний опис якої включений в даний документ за допомогою посилання.

Волокна або волокнистий матеріал, що містить волокна, можна попередньо обробляти мікроорганізмом і/або ферментом, і/або волокна або волокнистий матеріал можна приводити в контакт з мікроорганізмом і/або ферментом в ході біопроцесу, включаючи оцукрювання або ферментацію.

Зо Як обговорювалося вище, ферменти можна іммобілізувати на волокнах замість мікроорганізмів або разом з ними.

Ферменти і знищуючі біомасу організми, які розкладають біомасу, що включає тому числі целюлозні і/або лігнінові компоненти біомаси, містять або виробляють різні целюлітичні ферменти (целюлази), лігнінази або різні низькомолекулярні знищуючі біомасу метаболіти. Ці ферменти можуть являти собою комплекс ферментів, які чинять синергетичну дію, розкладаючи кристалічні целюлозні або лігнінові компоненти біомаси. Приклади целюлітичних ферментів включають: ендоглюканази, целобіогідролази і целобіази (В-глюкозидази). У процесі оцукрювання целюлозний субстрат спочатку гідролізується у випадкових положеннях, утворюючи олігомерні проміжні продукти. Ці проміжні продукти стають потім субстратами для розщеплюючих екзоглюканаз, включаючи целобіогідралазу, які утворюють целобіозу з кінцевих ланок целюлозного полімеру. Целобіоза являє собою водорозчинний 1,4-зв'язаний димер глюкози. Нарешті, целобіаза розщеплює целобіозу з утворенням глюкози.

Целюлаза здатна розкладати біомасу і може бути грибкового або бактеріального походження. Прийнятні ферменти включають целюлази родів Васіїйи5, Рхоейдотопав, Нитісоїа,

Еизагішт, ТНієїаміа, Астетопішт, СНгузоврогішт і Тгісподегта і включають види Ниптісоїа,

Сорііпиб5, ТНівіаміа, Ривагшт, Мусеїйорпіїйога, Астетопішт, СерНаІозропййт, Зсуїаїїдійт,

Репісіййшт або АзрегоіПи5 (див., наприклад, європейський патент Мо 458162), зокрема, отримані вибором штамів з видів Нитісоїа іпб5оЇїеп5 (перекласифікований як Зсугаїйдіит епторпіїчт, див., наприклад, патент США Мо 4435307), Соргіпи5 сіпегеи5, Ризагішт охузрогит,

Мусеїїорпїога Іпепгторпіа, Мегіріїи5 дідапіеив5, Тпівеіаміа гегтевігі5, видів Асгетопішт, включаючи

Асгтетопішт регзісіпит, Астетопішт астетопішт, Астетопішт Бгаспурепішт, Астетопійт діспготовзрогат, Астетопішт обсіамайт, Астетопішт ріпКепопіає, Астетопішт гозеодгізеит,

Асгетопішт іпсоЇогаїшт і Асгетопішт їигайшт; переважно з видів Нитісоїа іпзоїеп5 ОМ 1800,

Еизапйит охузрогит ОМ 2672, Мусеїйорпійога (Шептпорпйа СВ5 117.65, вид СерпаІозрогійт

ВУМ-202, вид Асгетопішт СВ5 478.94, вид Асгетопішт СВ5 265.95, Асгетопішт регвісіпит

СвВ5 169.65, Асгетопішт асгетопішт АНИ 9519, вид Серпаіозрогішт СВ5 535.71, Асгетопійт

Бгаспурепішт СВ5 866.73, Астетопішт аіспготоврогат СВ5 683.73, Астетопішт оБбсіалхайт

Св 311.74, Астетопішт ріпКепопіае СВ5 157.70, Астетопішт гозеодіізеит СВ 134.56,

Асгетопічт іпсоЇогаїит СВ5 146.62 і Асгетопішт їигаїшт СВ5 299.70Н. Целюлітичні ферменти можна також отримувати з Спгузозрогішт, переважно штаму Спгузозрогішт ІсКпоу"епзе. Крім того, можна використовувати Тгісподегта (зокрема, Тгісподегпта мігіде, Тгісподегта геевзеїі, і

Тіісподегта Копіпдії), алкалофільні бацили (див., наприклад, патент США Мо 3844890 і європейський патент Мо 458162) і Змнеріотусе5 (див., наприклад, європейський патент Мо 458162).

Прийнятні целобіази включають целобіазу з Азрегойи5 підег, що продається під торговим найменуванням МОМО2УМЕ 188 "М,

Можна використовувати комплексні ферменти, в тому числі ті, які постачає фірма Сепепсог під торговим найменуванням АССЕ ГГ ЕКАЗЕФ), наприклад, комплексний фермент АссеПегазефФ

Зо 1500. Комплексний фермент АссеПегазе?ж 1500 має багатофункціональну ферментативну активність, діючи, головним чином, як екзоглюканаза, ендоглюканаза (2200-2800 одиниць

СМС/г), геміцелюлаза і В-глюкозидаза (525-775 одиниць рМРО/г), і має значення рнН від 4,6 до 5,0. Активність комплексного ферменту як ендоглюканази виражена в одиницях активності відносно карбоксиметилцелюлози (одиниці СМС), в той час як його активність як В-глюкозидази виражена в одиницях активності відносно пара-нітрофеніл-пара-О-глюкопіранозиду (одиниці ріМРО). У одному варіанті здійснення використовують суміш комплексного ферменту

АссеїЇІегазефФ 1500 і целобіази МОМО2УМЕ "М 188.

Відповідно, інші варіанти здійснення знаходяться в межах наступної формули винаходу.

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб ферментації низькомолекулярного цукру, який включає: контакт низькомолекулярного цукру в середовищі з листом, що містить окислені волокна біомаси і ферментуючий мікроорганізм, іммобілізований на волокнах; і ферментацію низькомолекулярного цукру в умовах, придатних для конверсії вказаного цукру в органічну кислоту ферментуючим мікроорганізмом; причому волокна біомаси окислені в окислювальному середовищі способом окислення, вибраним з групи, яка складається з опромінення дозою, що становить від 5 до 60 Мрад, хімічного окислення при рівні рН нижче приблизно 5,5, ультразвукової обробки і піролізу.

2. Спосіб за п. 1, в якому органічну кислоту вибирають з групи, яка складається з масляної кислоти, молочної кислоти, оцтової кислоти, пропіонової кислоти, бурштинової кислоти, 3- гідроксипропіонової кислоти, солі будь-якої з вказаних кислот і сумішей будь-якої з вказаних кислот і відповідних солей.

3. Спосіб за п. 2, в якому органічна кислота являє собою масляну кислоту.

4. Спосіб за п. 2, в якому органічна кислота являє собою молочну кислоту.

5. Спосіб за п. 1, який додатково включає ферментацію органічної кислоти у спирт.

6. Спосіб за п. 5, в якому спирт являє собою бутанол.

7. Спосіб за п. 1, в якому волокна мають нанорозмірну середню величину частинок. 60

8. Спосіб за п. 1, в якому мікроорганізм являє собою бактерію.

9. Спосіб за п. 1, в якому волокна окислені за допомогою опромінення, а опромінення здійснюють іонізуючим випромінюванням.

10. Спосіб за п. 9, в якому опромінення здійснюють з використанням пучка частинок.

11. Спосіб за п. 1, в якому волокна біомаси включають целюлозний або лігноцелюлозний матеріал.

12. Спосіб за п. 1, в якому волокна біомаси одержують з біомаси, вибраної з групи, яка складається з паперу, паперових виробів, відходів паперу, деревини, деревностружкових плит, тирси, сільськогосподарських відходів, стоків, силосу, трав, рисового лушпиння, вичавок, джуту, коноплі, льону, бамбуку, мексиканської агави, манільского прядива, соломи, стрижнів кукурудзяних качанів, кукурудзяної соломи, проса прутоподібного, люцерни, сіна, кокосових волокон, бавовни, морських водоростей, інших водоростей і їх сумішей.

13. Спосіб за п. 1, в якому волокна біомаси одержують з початкового матеріалу біомаси, який містить внутрішні волокна і який був подрібнений до такої міри, що його внутрішні волокна стали практично відкритими.

14. Спосіб за п. 1, в якому волокна біомаси мають пористість, яка становить більше ніж 70 95.

15. Спосіб за п. 1, в якому волокна біомаси екструдують або спільно екструдують.

16. Спосіб за п. 1, в якому лист складений, зігнутий або пропущений через сито або сітку.

17. Спосіб за п. 1, який додатково включає виділення волокон біомаси після ферментації і повторне використання волокон у другому процесі ферментації, що слідує.

18. Спосіб за п. 1, в якому лист являє собою багатошаровий лист.

19. Спосіб за п. 9, в якому опромінення здійснюють, використовуючи пучок електронів.

20. Спосіб за п. 1, в якому окислені волокна біомаси одержують за допомогою окислення вихідної волокнистої біомаси до такої міри, що на вихідній волокнистій біомасі утворюються функціональні групи.

21. Спосіб за п. 7, в якому функціональні групи вибирають з групи, яка складається з гідроксильних груп, альдегідних груп, кетонних груп, складноефірних груп або карбоксильних груп.

22. Спосіб за п. 7, в якому мікроорганізм прикріплюється до окислених волокон біомаси через функціональні групи. я сови Яісеаси ТО БОХОХ 1053- й / й І еВ ж ИН ПОШУ ШТ дуеру ШЕ Ї ! ві | Ферментанія ше і ше ї й злеєжюнжт весь м р а і з а нн Я ква й с- яння перен ВВ ння ОО - ши. Її зей ріжемо З ііі папі для тя -к п | панк се

Фіг. 1 іч р ; я й х н (дея ва. К 1

Фіг. 2 180 ;

що.

що. В ооо Шин в з п, іл Ах 7 ; і 1 тал аєть Й і | !

К. Е У Во Е дя Я Н. ча 0 юю емо що 1500 оо БВ Ханльові чнела с і

Фіг. З

ЕІ чо що см що

ЩО. зе З КехУ ще Е с 0 - я Ь фону Ше ж МК ру ля : - з й; як ке й в. о ; я куму х й Е : я я ; х во Ва: г ще УКВ ї Ї Го Її с. Ме ЗКУ 3 ' М ! Б " Ба у ка Е З І х : Не с і ї Я «Є | і «в і дикі Е : яг ! Е її у ; З Ка Я ї З ! і з з і ! й М | і Область й я КЕ в й | М МІ Ї чк й. «хх Акт БНО ї ; тя їй ій сек ік ілг КМТ я піні А а ва зай ЗАЗ - тут ее х і «КН Кок й ЗО ха ящю з0Ю 180 чо що пк пек докт ре -їх ин чиснаем нн ним ин нн п нн ні ни о нн вен Її пи не п п с п в з по ве ТЕТ вх з ї : ї ї Н ї ї : Н ї ї : ее Кя ї Н Влекими КИ А Ши нн І І Я 01 лен ТОБ м нн в В В ТТ ЯК її | ПЕнер ка ден коми ' кине ше, Корююююкіксюксьнкоя Комо дрицн МИ Кора: пиши ишши Вишивання уран дже ТМ пк «В конк ке 3 ДК М у І А нн НЕ ОБР ої0 рнеозну Що нн нн нн нн ня До ОК ободі Не пе шини мине нин нки нн нн нн нн нн нн Зі ЗК нн ни кн и п ЗМ и о и З КЕ ТОК РОЗ ЯМАМИ І и У п З НИ ПИ Ж: РОЗ СД ККЕВКЕМИ аб шій Н : і Її : : ї Н ї ві : Н Об ік: Еш ; димаря жит лен и а но нан д оон сет ! ! : ! ! : : : Е ? В : : г ї енер Как В згх пиши на пе М З Зими КАС че ШИ з ШИ НЕ НИ НА А КОКО 5 Ж сСплрие КА МЕ р нин не Дон їй тк : нн НУ ВЕНУ ї Ко вектрмете Ж МЕТ АХЗ, Кк ; Ї З ; ї ееегіфнннекйннню нн п З Текекминкии У ї х шин м нн вх Вени ВЕ и о ЕНксх Жовкві ПОЗУ Ме Кг Я І ш М ЗИ НЕ ен п и п ЕЕ НИМ НН пиши щі ЗОВ ОВ. 104. нин ни З и НН а я М фуд нкф ев : : ї ; і Н їні : : : і ті Ж Куна век: СЛОВ Кен: нини ши ни нини нин ни ни ми и ши що керюн я КВ Х М 4 і ЗИ МИ: нин ЕН НИ ЩО Ще Кн какро НЕ и ие З нн и з НН Ех не ПН ткати: ЗНО ВН 3 З ен ин кн НН нн нн шшш ди ш ши шен інн нн ші скверни вереня аж вок м ни и п и ни З и: не НИ а ВЕН Я Не З шо ш щ ме Ен НЕ ше шк я МЕНШЕ ШЕ Міпекрух мимо ХЛ ЖЕ Код ачд нн ДАЛЯ АААДА АААХ дн АД плода ШИ Я Твнмряних кЖВнх нини ни ик ин пен а п м а п и М рони кколнн я 1 Н її : : Н : : В ї ї нина и ко ннне нн но я мене не ни У п пз М М М ЗУ То Мекка тонни ГХ СКД Ен нин Ин НИЄ нн и ни НЕ З ЗНМ поки ІК ме ж З шин ши ин Я А : рЯШНУ НЕ ЗБУШЕ: ЧИ ро ФК БХУХХВКММ МЕ хх Ко: мне ЧИ НН пренвеекинкисЕню яв их кн ЦК КсЯ УНЕНиИНЕН НН НЕ ж МИНЕ ЗИ ЗМ А ЩЕ: НИ БЕЗЕ ОНЕУ Я ЕНН Ше НН Ен Не Е ШЕС НН: З В . НИ що пЕя: МІВ ГЕ Н ник ви і ник ин Мн Ми и Бай ре НЕ НК КАНА Модна : ї ; т ; ! Ї : З Е і; Я Кен и в а Я тЕ Бу жо: нин 3 НЕ ЗУ її: її ! ї зНЕНУ ЗЕ І Векявкуоя з я: НН ЗЕ НЕ ИН ВН її нажет я о З Пи НН НН НИ Не З НЕ НЕ ЕЕ: ЕНН ко ве» ї з : ї ї : Н : Її : ї : ї : : ши х стінні Ж: Том. що ОЇ : х : : т : ї ї 1 : ї ї ОН І ООмже ня КО дол ен З и її В 5 : її ЩО роУвю слрнихькя З ОТ: 0: й тої НЕ У : ни ЗИ ЕВ; ФЕНА бфрех реувуче 5 і ше ши ши ши ши ши ше шій ше акне. ся К ї Н х : ї їх їх : Н І ї Я ІК ВОК Жук роуника: сам же однині ода ів 1: ТОР ож вв МОМ НУ х З 5 Мт 5 Ем фея я Кт ї ОК я Її Міжвнва ах КО і шен ши м и м и ЕН, ИН з Вввввк кулонів о с ї ї І щ-Ши : ї їх ї : : З ї : т КА: 3: : зашхкнкаких. ЕТЄХ о їх Е Я лайн ех ІН ІН ПН НЕ МЕН Є В; ТВ Ж Ор вт ех ТОВКОВ я ши а а ВО А АК Я ОБО АМНЛМ САМКА і пен а кн 4 кю, ї К їх овАСе ни и ПОЕМ В КВН моно СМоМВва Ю Я ЯК ; ен А КУ са до ї з і; сЗ ХК З Мем КБ Я шо КК З око КУ ву я я й м ей хе ж Я я по я МЕЖ Жх ВЕ ХК кінні РЕЖ ТКК вежкноня Че хя кі ка ворогу ЖЕК З У ІокоВе КК Коен : ія ЗХ Ії дев ї нн їш яд і «КЕ з муйалї т УВО МОНЕ мим МУК «КОХ. Сак пек ОЗ не ВІКУ Мекка па я Хкрнмхо земних З пеки: МОХНК КК срочиеи ХЕ

Фіг. А

Бежнке вн: МУКАХ ВЕ нн а а вв ек мкВ ВУСТ УТ ОХ Мк юних М ШЕ нн нн нн и ЗП п п и и ПЕ Е Мокре НЕ ДНКЯКНЯ М є куме о Я : ї и п ї ї ІЗ ї ї ї ї 1 ї Н г: у Н Ж . ж й й Фо ї Н ї ї Н з ї т 3 ї у Н ї ї : 1 ЕЕ ЖАХИ сх вен ння ке нн и НН Ав зе нов вве нин или й ване зв і о пи й Тов Хоми хе ПН І НН М п а, з о п п з а п НИ МУ МеккіМ ме ни НН и и ЗИ. ЗІ нн ко п п ПИ НВ : тех. киперки сходи «її ї 1 їх т 1 х І ї ї ї Н ї : Н ї х. 1 ї Ма ПМ ши в и п ВД НН ФУ і ї ї ї т : І ї т ї ІЗ і : ї 1 Н Н ї ї ї Зіджчнм мо. 510105: ие с и п ни нн пп п п орех Аня 1 Ї г Н о 21 ї : Н Н : ї Внк Щ ме: ДЕН ПК НД НЕ НО І А І ЕМ ПО ОНА НН А: т рак Том Пн и нн нн в п п п М п В М ЕЕ В ОО їх ІЗ : кої ОЇ ї : : ї : Н ї : 3 Од ї й у В ж мал умкх св ; ж з ИН НЕ ЗЕ ЗИ З рин у чн НЕ же ОО Кхомлеммт спек кими як ЛАЗАР ТА ЖК У Е пИнЕ Яни и Ки м о ни п м п м пп ЗИ ее з ви НВ во В В п ННЯ весни хесднн МК ж НИ М М м а м м п с М З и з о ЗНУ ки жено сш вда хи у імен ЗК и и І В з п с п по СУ ВК ННЯ НЕК ХМ У НИ З о с но М НН Пон нн нн А ІЗ йха хм КАК під лили или Волинянин кун кукі Коні налити чити я кон дою дня мал ННЯ уе- ХВ з ум нм м п З о З ЗА ЗА ЗМ М А М МВ МЕ аа о ВЕУ її ї КО : ї Н : : ї : : Н ї Бе : ЗМ ЯН ЯНА Й 3 1 ї т В : : 3 ї : ї ї ї 1 : ІН у І Гху й Я ехо хх, Си ОНИ НН АК ММК НК АЕН АНА НК МНН НКИ ЯК де дитини фирма кма фм нДитиололи Дод жд Мф ною подо 1 ФК х ТТ : 7 КС у НИ: ! ко Гей ЗЕ ІЗ ї Молккщоть утуфихІ АВ. НН ЗЕ и о з п п п п п ЗП и н е3Х сни п дншии РО ДЕ І о м п п о ВИ М З ЧЕ ЕВ В с ВВ ро А А А А А А А АК А ВК Й юна ЕНН и ник ни ни не мий пос ня міх п м и ни ник зи маки вн ВО НОСОВ КО 13 ВВЕ ОС 5 Кахоми БІЛА зд ІОНИ ни нн М и Не сн о А НЕ КЕ ЕЕ СН НН АКА Кен зни нн нн и Мина по ів нин вій пін пий вве век ж кед у ни нини Му хлдОя не Еш З НЕ З п п п І п п а и ЧЕ МЕ З МВ ВИ ВЕ СК ВІВ ОКУ -х ї : ї ї Н ї їх ї Її І ї 3 Я Н ОО жЖ СЯ ЗУ ЖЖ и Й меш З ДИ СН НН НН З НН ДИН НН 8 3: 5 сх ю іх Ме ж нн нин п СМ В п п В З ШИ ВК В НЯ що кохав зи ВИН ЗІ НН НИ З з и З НИ ВІ Ж її Ма п ї ї ІЗ Я Її ' і: х І І ї Н : ІЗ : З 3: КОДИ шо шлю Щи хх Ф. Е и и ни з п з ЧА з зп чн я ОКО Ж ВІ 8 її ЗЧулима ММЗ МВ и в в в КА и и АК: УА г М с нн з Ми ни и НИ кий Знав Не нн З Ка: НИМИ КК м ху ї 5 : я : ї : І: їх ї Їх ї ; : М В 3 По: ВОМКУВИ Ж У р І ї : : ї І: їх : : Й З ЗЕ аЕк и прим, ш ЕН НИ З НЕ НН ЗИ М НН З З З и п и З З і ОВ ЖК ка кхправизхко ШОК дос ехо днина Ко до дної МОВ яв ЕК ад я В Ко мно ни сн ни нн нн нн нн ни нн нн ни ни ни В рені Ежжкм кожних: У т в ї ї ї Н ї ці Е І Її : х т ЖЕ її 2. г НЯ ие. Б зн М І ни З и нн по п з п с о и З С Я У ВИ З ОККО УЖ Фе ж ІНН НІ и п НН п УП п п ЗП ЗМ КУ з ЕН І ОО КУ х- ще лк дилем, п ння фуд фу ни дин длиу -ї; КУ як -Я ле ЕК М о ЗМ ХЕ 7 т ми ме ин З ВЕ ц ОХ ПАМаи пев м ОО ШЕ І НЕ не З и З п У чн п З А НЕ 3 Р Нідвнена херем ких 1 Х ї ІЗ ї ї ІЗ ї Н х ї Н 1 Н І ІЗ 3 53 Ел с орзую сир л ок що і Не ЗНУ НЕ Н ЕУ ї ЧІ ММ ї 05 Че бознмх дядах 1, КУККМН Є ж Ко рве и сало оре ов зв а но зх ЗЛА УЛАЛАЯ я ва ря ХА с, У ТЕ ї Т ІЗ т ї ї : 7 : ї І М ЯН РОСх АК щ 5 ї я ї ї Я 1 ї Н Н ї КОошщшюЕоа ї МИ Ю КК с В 3 ї а: ї Н Н : : : ї Т.І Кік Я ЩЕ ПД лНе и В нн НН НН НН я НН ку ще «Фах А А А А А А А АХ ЛКК ДК осв, тжмуе І У ни о не и ви а с і НВК УМум ит й що 5 ще КУ ка ще що шко З ща ще хе КН АХ Ва См З кА - Біжи ЗИ хкжкцснхй КК и в и ж а т жк и мм В В В и и С В о З В СО М ВЕ шк пек. ПОЧНУ пк Тони ких кККецеНе ВиМівнЕ вени за М Я Мн мя Мочакт хрхуанних я Кивнамимх прюораую ІМ АСВ ТТН ЖеКИХ ДНК Ж Й МЕкпиЕрОВу: ВКБОКУЖиХ ев т а МК

Фіг. ЗВ птоз щ Енн мами замі и они ам ний ні він они зв в нн снснй н Зав Кеззвнних КММККСВ лан НН НН НК ВИ ОВО ВН : - го КЕ нс : рити У ТК ї т із ту У зе Мама суне уиниМик хо Н 1 В Н т ї ї ї ї 1 ІЗ ї ї Її 3 ї ї Що тоді уд ско тки сш бр Кн анна нини с сф миє ую мим ВМ. кажох: Кл ІниВ М вкркахмки тиці якої ї ї ї. 1 т. ї : ї : 7 ї ї 1 ї З 3 ВУ : З офіхкін ку і ї у 3 ї Н Н (У 3 ї ї І 1 : ї ї 1 ї : Мр ії ях ж и вилити ши МЯЗІВ кн нн В пп п п пн п КК й Ух ни и ник М С А НН НО З НН НН НЕ т3-АМВВЕН: з ВК в НН пис шен тм нин и В ПН зи вк ни МЕ З Н пи н Н Іа ВО сах х ї ї З 1. з. 3. я СЯ Н ї ї їх п х. м м я І п впав я Ку сени ни вн нн нн нн в в ВК ВН В пеки клю кнеи ВАНІ КАХ І М М А М п М А М МЕ З М І А В ВЕ а п в нн секта Ожина нн й ок ни с нн ни ни ни ни ня Но МОНЕ ЕКО С МЕНЕ УЖЕ алї х 1 ї т ї В І Ї 5 : ї І : 1 ї : : : Н З ре схо ух сон нн нн нн и нн ВЕБ ОЧЕ НАУ ії : ї ІЗ Н Н і ї 7 х В Її ї ї : ї ГКУ а З Ежх цих дим БЕОХУЕВ кн и и В и М БЕК Е х хі БОЖОЮ 10 20 ВЕЖ КОЮ. 5 Жуки жан, Е о о А В НА Я о о у Й Я оду кити шия я ке о син м и Зно зн В п з за З Зо ов о кн сн: За В МОН хв и НКУ КОКО: ї І НЯ СВ НЕ не ій ТУ КУ й і І ї. з. Збити іти обегететтєнки М и НЯ т СУКНЯ 3 КО Ех сг сиг барв ї фе рантья тк» нини нн км вн кни нн рх ани кет Кік пох: 3К3 Б ї Н ї ї Ц ї ї ї : ї ї 1. су В ї Не ї 1 ЖОПд скдчеио, ще св вики ни нн нн о в п п п В нн п ПК Про ХК БЕК ВУ НИ А и и ЕД А А І ПН КЕ А НН ЗК ОНИ шин и НИ ОВУ омани зи ПИ Є а о З в по р ПО ГТ 3 Ж роду З и кг 3; Кб не еерен ети в еки рекет ееткюфн ккд ек ек фнккеєд є ку род днк рф пед М ТК. Я ВИ ЖЕ я по НК ни а КАН ДН А НН НИ ЧИН МИ Во Код жааі М Ко М ни м А ни А в о ОВ виш оон хну МК їх Та они пи зве зви сі зи За З З Ве Зак нив зн ВЕ ТЕ перо МИ ЕІ МГ щі за ни А А НН п... по ї К счишммє к не Фін нен нина нини нини ни ни нин о пдирфсрняя КУКА В Я, м В ї ї 1 4 ї 1 : Н ї її ІЙ Я : о т ї Е т пт НА Кос нан мана ик сн а нн на нн нн и не хе: ся : : Н ї ї ї ї Н : ї ї ї у ї КІ РОКУ еИННУ ї Му щи ДК хе ЗК рою панни дитин Дір фунт ви т Кон м ААВАВА М люнння о МЕНЮ МАМУ УХА КУ тр юри ит у ву КЕ в ВА ЩЕ ур : ї ї В : : ї І ї ї ї їх : ї ОВ НКУ У ЕОМОКдл ДМ З ФЕ МК ке каф нн іткре ни кед кий о гори и Км ектмфееткнядння МОМ ке М Ко о НД ДМ НИ МК З З НА МНН З 5 Її ОКУреНюю корпора х З денну ему кути сю оеєпидоююкк дик ютююю єкт нні сек й й у Де ММ ий В Ми Зм о зв ов ній оо з по зо о в в зни их жк Ви З НІ ; і я уднжених нки» х хі У у. ї Холод ї 5 3 : Ж хом гай УК с щ їх нн ни нн нн нн нн ни нн ни нн нн ее нн нн сне крекер кунауєх: ВВ - В Я и и о п п и п п З о ї : і: ке пекло до ще ВД сег дю они овен нти слини ники денне Є егфннх Же т фаху ЗБІМ М З ре зим и з НИ ИН З НИ У п с ЗНА ЕН 10 подо о мо М 1 ш ДТ феохвікм острови юне ти ин и нн Енн Зерна З Ко діжі Ко 1 Я жа ї її З Е гом ти УВА ВХ ЗНЗ ЗД 1 а хання лвНих БЛОЖОХ ПО ЖНШЕ и нене нн пн нн нн нн КИ ОН дення хв шок т ж Я ПЕН» НК ї її р : ї ОАЕ ЧИ їх ОАЕ УКУ М зе НВ МОЯ ЦИМИ МАМИ, ЖІ МА Ам МИ НА ей ЗА МИТО Ну ОСЖжо в ум. ви фев Нео он на пн и нн но ш ТОК МОЛЯХ в че хе С вед» я ХХ ю ще Р Кк? ну - щЗ У Ще сяж. щх ІМК МУ ов ния с о и а МОУ я Ж у ко г и Ку Ом ЧУ ж. ще од и м о о В Кк ОКО ОО пожнх ЯВН. хвхененн Крок, ВЖИ Возна СМ талі вують пул же вки о Керує інки муки шия ОКІМ НІ зУтнм Влефр ї В їщ. З ще ЕМ «ВІННІ: пек КОКОН Мк: ВКМКВИКХ й Грекамуяу паскуванн ях ТЕдЕКОККних промах Зррениу роли я Є ТЕЖЕ ПИ М НВККМН У: Уроки ємищ ММ. ТЕМ снщ КК іг. а «Фіг. ас а п ан и ОХ 33х ЗЕ ВИК ЗАЛ Зо о З Зо А ВАН З З ЗА В ЗК З ВЕ М о З НО Я: КІН ши шенні в В ЕМ НЕ ри І ние з з и М и НЕ ЗИ п З З ни нн ни и: Пс А св : : шини Бр РО О Р. МПрмодгука: сшковк ул еняя З б ння тних ДИН НЕННЯ ЩУ ІЗ ї ї І 1 і ШУ їх ост ек т от Я пери жи шини нини и и ши ви м ни нн м ни и п и В не ві ооо МН НЕ ННКЕННЯ ЕМ захвитоввях не з нн З ЗП НН не М и з и ПН ИНА НН НВ Я й Щ як те п п І ОН В НЕ п У ЗЕ ІНН ДН ще НЕ НИ Ши НЕ УНЬ ро пек Ії : т 14 ї її КО В ин З ЕН : г: Я ОО Ж оду д ок м а нн х х їх х х ; Н : і х ком я ек вн ни нн В НН Пенн: З, Чех ен інши шин и нене енд ЗАВ КНУ ПОКИ ж и п и С й З п Ен М ЕН ПТБ Уртртитттть БееМмрю ва ве и и нн НЕ НН а З В І ни ЗМ М З З Є КОРЖ Рева і НИК А НА НК НН А НН НН НА З НН ж Ше ШЕ с в ви х у у с З 5 1 ; у Мушининн ими нинни ни і н и ен и миша вин зонд Кара ПЕТЯ ЖІ шин ши М п притрву ВКак яке м НН НЕ НЕ НИ п З се Я ЗІЕНН НЕ НЕ НН: МИ НЕ МИ ІК Ес ИН чн Ен ЗИ З НИ НЕ Я М З и НЕ НЄ РОБ роса нее км ал Мішин иа ши ше нини фей ие 2.2. НІБе ВОК кана ма па ЕЛЕ п ни з и п п НЕ и: З В НН Ми НЕ ЕНН ; дев уеевга хм УЖНУ Во ов ою Бої и ие и Я НИ СИ АН УМ м п ЗМ З КСВ Щ НИ ІА НЕ НН: БЕ Б Я Я НИ ШЕ ШЕ. шу ко : : шої ї і їх ї : ї І Я її: З ГОР чав кан МНН УНН т : Н хо Н ї ОВО Чи лвуюхха сдмилу. т КК ЕХ Я дінні ннні нн нини ши ин ння зроду Ж і 05 04 НЕК леноунве данцеми ТОХУМЕЕКМЬЄ в В М НЕ ан и п ЕМ З З З: ТОБ ТЕ ТЕ ЕЕТТЯ Виддахв: В шо Ди ЕНН Ми ЕН НН Не п З и ЗМК ШЕ ІН НЕ ШЕНШЕ Но шо О МО озБютеєн ЖЕМЕОВЕНЕВЬ МК ее и и нини ние мини ин ин. ой М т еру: ТМЖКЕЖКЕ ВЕ Я ; нн нини МВ нн ни мо ння мні и ни нки ОО НК . її Н ОЗ З з ж ПЕ НИ М НЕ ИН М НЕК ! НН: жор жо і нм ЕН У НО з п а В В ЗЕ М Я ЕЕ ї ЕК ми: ПМ - ВЕН НМ НК НН 3 111 ЕКО с: В Кен ун ТОК М : : З ІЗ х Аа ф я пф одн ит оди Винники ЗКУ ту КК З нини нин в У НЕ М М ЗМ М ПИ ПИ З ЗВ ЗМ МИ НУ ЖЕО БК ОО: 010 Би пошуки Е Коен НН и НН НН І І У НН НИ НИ ИН РОБ ої 100 ф ббекчва пПОМЧЕКЯЮ ТЯ: о НИ А НК НИ Не ИН: ЗЕ З ПИ З НН ЕН ИН ово шк п нн м нн п чні З ї У ЗЕ ї : В Кедажня: ЕНН КО КУ й щї і Беафнвнт вн ви нн они фер ня КН: ПОЖКЕ НК Ж п ; мн ще з ПИ А и и НИ УМ З З з З ПО А ЗУ З МН М ВЕ ШЕ У Й Не НЕ Як В ШЕ НЕ НИ З МЕНЕ НЕ ШЕ ЕН ЕЕ НЕМА ни В ЗУ АН НН В А НН НЕ А НН НЕ ЗНО ВОЗ здернию ВЕЖ В В нин нні НО КН НН КН НН МЕ А 20210 Увка ВК УН ЖО КЕ ШИ шкали миши ши и ин нини а Муки Ед й п БУ НЕ МН НЕ НЕ НЕ НЕ ВИН НИ У ЕЕ зе з НИ НЄ ШЕУ Звуж баг, щЩ же ОМ НН и нн НИ ИН м НЕ Ех КЕНЕ І М у МНН НИ и НК МН МЕН т БА БОЯЕМЕ 05 0 Виза Же Енн нн ки м нн и и М М ЩЕ сюди очосикее пиши ниннннишниии ши кма щї : и не и НЕ І Кн УНН НЕ п М ЗИ ЗИ В М ЗМ ЕЕ КМ ЗК ЕНН ОК виру хя ши шини нини іш рок ков я, З де Дяк хе же ке кеккх Мк Кокс ехо сік ккке хх фах кни ЖЕК рюнйнн-яхоі КВК і: ФУ Я 7 ї ї З Теж з і з З Н пед фне ВЕ же ще Дж ужхюфюккиск, АК КЕЕМ ПЕКИ КИ ВІКИ ж З Н КО х її ї хх ї ї : РШУ ІМК ХЕ ЗИ я є вк - ї ї ОЇ ї пох Ох ї пої кої пот Як: їОЖО рокшм она Ох ОБО РОЮ Я ОО: ОО КІ КІ. " ЗИ рого ПИВЕрЦвЯ ху НН ННЯ Кот Н пої ОУН : ї ЖОО0Я010 8 Моно: ЩА ЩО Ден сі нн нини и ни СВК ВО ДВОРУ УК. КІ ще ЕЕ ие НИ НИ З а З З З ЗИ пе НЕ ЯКЕ Емо не З Сон аЖ о: я Ши ШЕ М Не М НН п НЕ НЕ ни ж шк Шо ОО М щ ї ОО М Ол пої рт її КОЮ В Ї 5 НИ ЗК я КУ ее ши о ее м НИК ВВ В и ве в З З З ни не КС НЕ ЗМ ее и и в Зоо Ко НІ БК Б ул ТВ вових знов кк ЦК ЗИ НК ОНИ: мес н Ше З ЗИ ЗЕ ЗМ ЗНИНЕ НИНЕ ОА І КОВО БОЖА вд фін енндненннік нн и мінон пишне в НЕ НК НК в щи ІЗ Х т. ІЗ іх і: і: їМ й Сх ТАКТ ин ую й їх З ке хи ке х 1 Е ХХ У Н пр рнтьх ОНКННЗМН НВ 5 Сх. сені й еко т вн ни нт и ни в ЦЮ і; повна яв » ж шк се як сх че ков с пок дю союж КА се Бищунке: КУ ик им ши нан КА Яну У а и Се о КО Ка ее з ду в ви у КУ У РЕЖ КК піомюаекий Брук ЕК кине й СУДИНИ ік ивк косе шим Жінсіснізсеви вен Бу з і: Ко а в ан ЧК Уви ВлЕф ТВ ме ЕР ВН нок в ВН : тріо вв. ще з Зіна цленх ГОМ Мам В КК Ж земний кв я Щі щення уми акеннВ КЕ . ГЕН ВАЧККККеНЯ «Фіг. 50 ен унх В КОНКМе казка ово а ни пев ксснннни нн они у нні на кін ї : х с з з - з я с вк вн в ІЧ ших ше нини ши нти ми ВИН, мин они о Ракова ПК» Її Н У і : т і ї РУ : Я ї ї : ї : Е щої рамка вюул Ї шини ше ин ши ши п п п с п м п о і п ЕК г ши ши і : ши шше м НЕ: Ї Кк Кк ДОМЕН М з ок : ї Н : ї у Ї І: іУ : Я І ї Н 1 : В ї ї їх имак СЕ | й г не Шк НЕ о З о п нн п п ВЕ З Б пек В КОКО ОХ: Кох НИ ІН НИ З НН З ВИ У У - ин ПИ МИ Не ШН й НН НН НН НН З НН В ШЕ ше Ши МЕ ШО НН А З ВЕ НН ЧЕ йо 0 БМММЕНЕЕ ЕКО в реие ин не нн на а Кдснй : : ; Е ша а в ; ; : З : х 7 і: З : : меню м авьн сво внмоьвнке фе «І, ї и и м м а а р о в п о Є Б во я : : 1 : ї ї : : : ї ї 1 ї ї 7 1 і: ї ши шшшшшшшшшш шшшшш ш Ма ЕЕАМЮ ОКО нин нн нн нн п п з п п і тео МІН АХ і : : : : ї ї ї : ї : : ї ІЗ ї : ї що : КОХ МЕКТВОЕТЕ ЯМ КАХ і Я НИ : и : Н : Н ІЗ її її й Я НН ги не ше НЕ нин нин з ПН и НН ТОБ МНКрууювювєть озкк КМ ен ТИХ: КУТОВУ я 1 ше НН І НН СИН пи ЗА НЕ ШЕ НАМ УНН БОБІВ х у : Її Н ї В : ї : ї їх ї ї ї ї : 1 : ; ї ї Н : Н ї ї НУ Н І : ІЗ ї ї ї ї Я т. 1 код сопадуніоукух жом я жуки ки : : Іі Б ї : : : Ще : : ї : Я Я Код химиаких денк: ЗМЕН у мм нин и и І и п пн п п п п З а ЗВ тиха М шо м ни З рр: ОО ря : и: тк її і КО її Н ї : ії : і ї і ЇХ Зо Я і. МИ ДИ НИ КН їі ни У нн нн си ЗМ НН ОБ ИМ КК Кт плини вними о олли у ї : Й 5 ц х З Н ї З К ; ї Кізккщенкяе НК Вр реятв еннекентнн нан и НН З КАЗЕККУНК РКНИХК ГМК З ї т ї т ї ї ї ї : Н ї ї : : Н 3 ОО Б ТВихувлую як ї в ши ні м А ТОБ Перо вю вки юанн У ни ни м ни Не По п п п п о Ж В КО рокденир КВ ВИ и нн и п НЕ М ЗИ роя дренн : РО БКещенвню ун мк ж НЕ нН У НН НЕ п с НН З НЕ Є ОТ: То Є фнкояюи ВЕУ НН НЕ с АН НН НЕ НН НЕ М ни и МЕ КО Безе юи НОЖОЖМКН ЯК ил ни и пи и не М З и Р: її Вау хащкл т пон ЗЕ КН є З НИ ПЕ ши НИ ШИ Я НЕ НН НЕ оо 2й ї Я їх Її : ї ї ї : : : Її : : : ї ї Н Ж: Кокс Змі ЗМ де м мин не и НЕ и п он я з п В ЕЕ МНН КО Мас ЗМІ КК ИЕ АК ш ши не ни З З ки п о п п п п п З ЖЕН її таких ШИ - пн ни т и п и п п по п п не МДЕ ВІН УК З РОУЖО ММ, ш Ви М ник ни з УНН не п п и пи пи Не Б БЕЗ 1155 : Я су ми нн ше НИ І НН п ОВ ІЗ 101 МБ жНЧК М іч ші 16 НЕ ни А її БЕ БУХ о тур х вч ще ї Н Не ОЗ : ге ИН : НУК ЗЕ ЯК НН Інк ВК Ж НЕК В з не КА МАК Я ПН НН ї 8: І 1.0 Вище: я КРБ ЕКЗЕ Б ї- ї ія ї пе і и зи ин з ВН х ши шшшшшш ши ши х3. ОО з и І ЗЕ її ї : ОН А Я то БОБ в ІЗ ї : 1 І: Н Я і ОО : ї З 85 є ЗНУ ОКО КК КУКИ ль ЕЙ меш ни ни НН п п о п по п о ЕЕ Є ВН КЗ ши ши ши і п п а п нн ше

Ко. нн и ЗІ НИ нн нн и п п с УК ЯЗ ОХ Зухд ск Се ЯН ря сн нн ни з НН ИН ПН І З ЕН Од ЕВ т Р Чо кеоповню у ТВ щ зин НИ ни ЗИ ен НИНІ 53 ОЗ доку ОюЕКаМ. м: ІЗ Н : ї і ї : Н ї Я Її 3 : т : ОО і І Е ї І ЯК ДУХ ХВ ЗЕ З ІЗ Н : Н Н ІЗ Н : : ї т ї ї ї : МАЕ Я Що: ЇХ зауамих оо зр ККУ Я 5 І нн не ее З п п п п в ЩО 00 Бір лю куме МЕ 43 і. нн ни и ши шини ши ї КЕ | ОР ик худахння дано НК є «ку ОКО ме нн ние ПИ А А В ЕІ НН ЗА виш ї- ох ЗП НЕ Я Я о: пн и НИ ОБО: ВОАС хв Сх І А НН М ЕНН ще се | бажкм ха Дикун ІЗ І о нн век о ВКЛ стежки тканин Я АК Я» кшне нн, по НЕ А ДО В КАН ИНА п І. з САН А С ЗУ ЕВ он З Я ши З ШАХИ ОК Б С НИ м сй ше я шо й вд Со - на К. он у дим ІМ вики ні за в вл АЮ и ни ду му Бкв; БЖН вки УЕВНЕМ ТК венах ШИ й ІККМЕАННЕ ПОКИ МК ККУ МХікаєсвяез сових між В КТ Зх тим . Хосе змо ку к ще у Хічкни увя ав МТ м КУ вимо как прЕеевк ВЕК Ж з ЗВТ м еВ вм х о Ов З ЕК КВК ОЗНАКУ Зх дюнхуух ХОЖНКХ ; г я Е ІНК ВІ ММК пежУ КМ рскокеєєєююютюєттюююю ПОЕМУ ее к лк в пон Н Е со І НН ТО их С ж ні мив пр зи ни зі пан: Імя мішха: пику УМА акХКхВІ м и и и п с пе: ТО ївоЮ ож прям М ОЯВКНК ІМ сюхкаеахея пи нн і і ЕЕ ЕНН НЕ ї кре вавтя: Ме хійенаі І дерну ї Н ї ї ї ї ї Із 1 т Н ї І ї по: Кос КА З ВЕ ШЕ м и шин ши Ши НЕ Е кохе ЗХ ши шшшшнш пиши 1 лважяв й : Я Н : : Н ї : ї ї ї : Я і : : ї ї Но: ї ПЕ ПВ ї : ї І : А 3 Н ї : ї Н : Е ї : Н ї | : їОБяМІМіКК: МУ : : ї їх : х Її ї : ї ї х : Н ї 1 ї : : рик ше хі ї : Н ОО: Н її РИ: ї Ох : Н Н Н хх : КОС коджкищи м: я, Н Н Н ІЗ : У ї : т Її т : ї : : : ї днини КАК соч кіл кю т : ОВО: Н о. ї : Н хх : оон РО Е ско в Ж ТЕКЕКАЯККЕ В шо БЕ: ПО ж ечННЯ Ше конк спе кв овен: їх 1005 Ба: БОАЖЮ пилки уні нАма ПОВЕМЯ МЕ : ї : їх і: Н Хокедеж июня ТО В Н В ї : пЕОЇ Кот в жнис ВОККНмх есе нн но нн нин ЕН: НЕ НИ ОН ЩО нфороуукуюкх сзжиих ШО ОЇ : і ії її ї : її: Н : ї ОО: Ж сен вану с Ан М НЕ НН пиши НЕ НН ЗИ НИ: ЕЕ ІМЖ МН ве дик, ІлОВЕКК т у : р Я ї. х ї : : Н : ї й Н ї и ОЇ Коші плхнка Ма ГЛИ ї ї н тт т: ї ї : х І ї : Н : ї ї Ж : ТОЖ БУТЕНКО х Я Н ї : : ї М ОЇ : М ї : Н : 1 ЕОЖ о: КО де 13 Р І и НЕ З: Я у їж Буд дві Я : Н їх : : ї ї Е Ї ї ї ї : ї Н ї ї ЦО КОТ ших ги НН НЕ ЕЕ М НИ НИ ни НЕ ЩО свювеМ МЮЛяКЧ Я и око! кі: : її : Н ої : рот ОВО Кох ск з. ОБО 1 зн НИ Я КОРСЕОЯ БО: ОЇ Ка: М. т. пі Ї Я : Е : : ї З їх: г Н ї пої Н ОЇ Курку тати ПЕ

:. : Н ї : 4 В Н ї : ї : ї : Н Н ! їх Мо ж о ЖацЕкуютИхиНи ї в І : Н ї : т ї Н : : ї : ї Й : : тої ВХ КО пюзихоюонх й ОБОВ ОБО Ох ЕН НН Мен. промах ва : : Н Ол : т и : : : Н ї ї Н т реф еня Віра 5 НПМ Ах ї Я Н ї Н І ї ї ї ї : ї Хуютижня им екннх кове і Кі ож яТЕБУКНЕОВ МИХ У Н : Н ї ї хі Хо слони, КУМ третуєтих ЗЕ: РРО ожаююхах сирних ОР Долю донна сонну Кз МЕ НЕ БЕБІ: Копомн КММУВИМ кгх ШТ дія реренння ЕМ НЕ Тена 4 НЕ ЗМЕН ХОНЕОВЕНВ КВ М В їх ї : у ї Ї ї : ї т кто ї З 1 ' сш. КЕ в НЕ НЕ ЕН НЕ УНН КИШЕН: том: ТО ваза ХК НУи ї Н Н : : : ї Н Н : І ї ї м К м У КУ ННЯ ст У МІЗЕНУМ гм ШЕ НЕ НН НЕ нини ши ши : ОР Обжаовю МХУНУКН УТ, ОБО: ЕН ЕЕ ШЕ ПИШЕ НЕ Ва КО ува т ї х І Її : ї їх Н ї : ї Н ї І ї ї кі ОК" «їж КІН Н РИ Н : ї Н ї Н : Е : Н І ї їх В їофбиддащ о "нин нн ШЕ НЕ УМ НН НН НЯ ОР ОО обкх що ЗУ не х жо. БО ОО Н : Н Бо : Я ЕЕ Я її о Миши Ми : Фе т ние не НН ИН ин НН НЕ в Ерос й в ; МЕН НЕ НЕ м и НН НЕ НИ ій ЛЕК: ВЕК. кад БЯ нн и и ОБ ЗНУ ЗІ. Ж ухомка: пекежиекиа р є ПОЕМ ВИ пе поки ов Но не злаануї м Ме НИ уеофен етно У ЕХ КО техеозюревкя ПЕ рек: у Од ние мини НН НАШ НИ НЕ ши ЕНН рії Зкоке ум ХМ вич іі ДОЮ Н ї : : І ї Н ІЗ : ї Ї Н : І ЕЕ. : ІН Ти ПО А КУ я нин гот : її : 4 11 Е ХХ 1 1 Жукова: КІМ и Ж Ох Н : Н І : ї 1 І : : ї : Н ї Н ВІВ: РОТУ В - спред х Я ВЕ ї : : Н : Н ї Н І : ї ї : Н І Н ЗК: " са се шк КО КВ, Я РОЮ: НЕ НЕ: оо 1 В ВЕ ЕЗЯ ШЕШ ЗЕНИК КУКИ ура кеуе Ж 1 нн нн ни БОБОВІ: БЕН Ах Кок канежя т МО хв. жо : В : : ї Н Н ІЗ ї ї ї : : Я В ЖІЗЕЖК ЇЇ МНК як ОБО: вого її ТЕ ж ШИ ЩЕ ЕК: Я ЕНН маку клану п НЕ ИН Ото ни З НН НЕ БОР ОБЖ ЯІВЕ РО дово На НЕ НИ ЕНН ГОРЕ: М УНН 3 К 1 ОО еконо щі й Ж Н ї ї : : ї (Я 3 Н І : : ї : : т ВІ ї ІЧ ЕНН арх, МУХИ ш ОБО ге НЕ ПИШНІ ВО х Ве. Пбооюй Кехлюх Й вими й : ОБО от 11: Я ІННИ А Я Хожхжюкй Ач пон ве ОО: ДПЕ ЗЕ ми нн КАЖУ ли пожя ЗЖММ МК: зкокиеця мох ве ОТО. зи НИСНИННИИ о НО ОВ пса Ух се пек ками ЩХ Ї пошли них фонфтніннн ення ек жен я -й «М фімеркане хнзевни знов хе С ее пня их --Х З о, КК Аа сохк оку що Сорт ВИТ СОУ ще ко я КО БЕОту Й У ЕКВТКК МКК; сих пе ОО и кеш я КО Й ММ Ня БОКПееКЕМ ЗА Я шо у ок и МЕЛОКЕ й ок я ПЕ а М ши ТЕМ КУ крім ХОТВИКа дКЕтАУЄК ХХ імічнісшуи ана ПН Во чі ЩЕще пан СЕК вх З СИХ ї ї. че сих И Кам УВК я те РАВА паче я 7 Хекамік ува АЮ

Фіг. ЗЕ поюдуни ВИМ Е я м ао не пивний - М ві ові мом зрив З, ПАМУКНВ вн акеЯ КМ и нн и о аа вс: Коко ЗНИК їй іди о емо зн нн зна нан зн ї 1 : ща ха ща пиши ши: ШИ | пекищау. пен МК Виа не ми позі Еондн фкхдКккдАкннкн ку НИ У БОНН тт о Кондро ен НЕ НН кі ї Затнащх: ЗІХ СУ нон нн нн ние нин нн НИ І ЕЕ ик я хворе ще по нива ї Я : Я 1 ї ї Я От її ї ї Не ї ві су ї їх : : Я І ї : Я ї ї ї : : ї " ї І ННЯ трі и ЕНН і БОЮ РЕЯ НИ НЕ М Зк ме ее Р: В пише І М НЕ І НН КОРОЮ отв їм да КО і го: ше и п НЕ Я пн ИН ЕЗШНН ТО ЄЕК АК ЕЕ НЕ ШЕ Бор я І: ОБО комою ЗК Я Бр ши ши нн ОК Ум ЗВ прив ї Н Е І ї : і у Н ї ї ї : : м Н д 1 5 ОСниктххетв ДОМ ВВС БІСТЖІЗИМЕ ТІ ї : ї ї і : І 1 . Н Н : : : : Н ї : : 5 є пи мМ ВУЗУ НН НИ НИМ ЗМЕН Ор НИ НА НЕ и НИ НН НИ НЕ З НН Ма не ккд МК у м нин ШИН НЯ НЕ ННЯ и Не НІШ ВЕУ Мрккен ст КЕКВ 4 Н у к:.Ї Н : і її ЕН: : ї І Мине кфккдннячнк ЗК -Кх ВЕ НИ: : ША ЕН: ще яю ек - КЕ 1 ні мн мн нн нн ши НИК "БМИКМНх ; І ПЕН а ЕЕ КО ущкех хамех СКМ сек 0: фр ння ше НИ з ИН ОК 0 кова й ефе сефостн др Бор Бр Я ше ЯН ШИ НИ пове В ще МНН ЕЕ М не п НЕ НН: ЕНН І НЕННЯ рої оре ем ЕК Я Е З МИНЕ УНН Бр: Кл ЕНН НЕ Ом МЕМа ВИК г ; ж нн и ЗІ НИ ше НИ НИ НЕ НЕ ШЕ ни НЕ НИ і ЯН: г и ЗИ КО Кого щі Торф зі т Н її У : ї 7 : з 1 ї ї : х : : ї Н ї м «сен ПЛ, ЗЕМНЕ ИН Бр ЕНН НН ШЕ: ЩЕ В вдахунем еанх ПМ і : : ї ї Н У ї 1 : ї т ї і: Е х : Я 1 УКте юку ниж ще Я ши: ши Шо со ї Її ї Н 1 ї : ї 7 Ї ї Н т Н ї Н : 1 т ник ше МЛМ АК з ШУ Н І Н ї : : : їх В ; : : Н Н ї 1 І МЕМ У ТА ТЕХНО у ї РН ї Ох ї ШЕ Н : : скління ннсдннннюх 8 МУМККО ІАЕ хо ї 1 ї ї ' і 7 ї І ї ї р ї Диня ке нн, о ОЗ І Фудика ПИЛОК з С МИНЕ НУ ї одлнн Ах нн Али дулю НН М куту Ї з їн 1 ї ї У 3 т Ден мин зневааку ї и пеневест У ї 1 ек ди ВІ -к ПЕ пня гне нн: Колонія КЕ 181 Ко бик В іхах др піпллкдллттия т ї ї 2 І ї : В ї й НИК ї ї кім ми пох ни ння ник Я р рН. К пажеенх юю ВІ х т ї т 1 4 т Її ї ї х Н Н : : Її ї Ії ї " сопюхк ху ж Ше А ШО Я 4. ОЗ Рок і Е ЕЕ НУ ТЕ кухня Е ї ОО З її Ї : 1 ! : Н ТЕ В : КО ОБУБ п. ах 251 ОО 1 ї 88 ІБ ших защиїи Речнея Я ї г: їх ї ї : : Н ї : ї Н Н її Я : 7 КІШКИ В, Є ще ЩЕ НИ НЕ НЕ а не НЕ НИ МО алею мкм ЖЕ а їх Еш ше ЕЕ ШЕ НЕ ЕНН МЕ 54 . НО ожяамю СІЕ ОВО ЕЕ : ої ИН ї Н ! : : С 2 родах я пені БУ ж ще не МИ ЕЕ БР в ве шке КОН Я ї Орос ни пи Не ИН 14 ну с меми НО донні: Я щ: БО. | 540 шо зни вин о ТЕ ОВ вх свеуннок ем. З «з ИНА НИ свв вн ик нини нн ШЕ РТ час даммно Ж: пк КУ ок не Ше ИН ЗИ З гої : КО фо лм ве пане ВК І їх МО укр ВЕНИ НН жи А НН НЕ Я ОВК: Ху ухиенек: ря, ж не І ї їх : 7 7 Е ї ї І ї : М : І ї Ох пон Фран МЕТ ОВХ, ЩЕ ї г ОО КО ї г: : Н Н : : : Її : Грока крему МЕ певна . ЛЕ ї х ї ї х ї ї ї ї ї : Н Я Н І и М: ЕКО а содожх: МОЖЕ х оо З НН НЕ НН НЕ НЕ НК гне и А І хи ких ваохх: ХХ І: 3 1020500 ОР їі о НИ : В 1 о дія ЩЕ ЗЕ МЕ І ЕН и и МИ НН НЕ ІЗ БОР сажки їх Е ї і її. ї ї Н і Н Н Н : І : : Н 3 й шожохі - "ЕН НЕ М УНН З ПН НН ; ТК; і пехеукюни їй я п и НЕ НН олії ВОДО ВКО А реродми ЖАХ Щ- 3 ї Е Н Н Я Н Н Н Н у : : : Ех КАК слух звик. КО ще кед : Н : НЕ ї Н Н : ї Н : Дек м Ти лани сі ПА ди У Ж ї БОР ООЕаЯ АВК фонд нку нкеюя са ши пек Тв Як «ФІ : : Н й сукня хг ті нлкуяик я тклких я Сз о х КВ: аоекмуиЙ ! офооекеф ек кекс кн тн ші ще лу У й ЯК Бережна ВВ хкхмоча уанхвку КИ орні Мктолякнкнк ант КВ КЕ ШНх Ук ду у 7 споюенках как М и ЕВ мож су Ж Кр Мав З Пкпиакаке кою мно ЗУ щ ле «У. ж У ит То ча Я дк 3 0 КК Я ПО сс ОХ й ті охк пзкВан і й А МАВ КМ Я пев. ще не на й треків пухку: Я є С че ИН хека чл ЩЕ : з ни М В мубяді Земна п увенкх г пічні зсуви алеї нав пики БОКИ С іні кине - Кк ко а і Гевко нн нн и в п в Еехуднихуни: ПРА ї РИ: кої з: 315 ї Н : : п ЕН по й щі з - ОРВК лу ро рожевим виворвхажкни ї ї З І : ї 5 х ї їх 7 : ї х ї : 1 т 1 Кока п. ру рек их с Х : Е Н ї З : ; ї 1 ї ї ї Ї Н І : їі Ву Н І Пхжма дя ПОДИяКІК Ім ха КеиМК. -ї ї ї 4 Ол ог: ї Я ї р ї КО ОКО оожау: ХХ он нн и НН ЕВ ВІН ТИХ ВИ и р з а р м з п р п у п п А В Мем іН їх ї Н : ї 1 ї ї ї 1 ї : Я : Н : р ї РОЗ пчую г імк ку. умів и п а п З п п а п п в а я ромен Нам Е ї 1 ї ї » ї Н ї ї ї ї І ї ї х Н М 1: я, Й Й ек зу її : ие я і ої ї ї Я : Я І: Н ї ої і ЗІ иННЕМ МО У, ХЕ ж Ше; ї ї Я І ї ї ї ї Я : ї. ї Н г : 1 Коко АЛ дня Б- пахюдрих дриля нудних нн в в и В в Ме КК ЕТ м м м п п в и п ЗВ З з коня ЗМО ЗДАВ Ну ї : ! : ще Я ! : : її її ЖЕ НИ Пророк пкеть КНУ ВЕ ор ше НИ ще її гої НИ ЕК Її ІРО ОР Міецруврюцт кнмхероманипеник уко БОТИ Та г 3 2 : ох В ї 002 Я ї КО Ко. НН й й - 11 у ще и нн и з НН ни о п о: З ЗК, ліги нотні тлі дено сон Ду рі пи В лит АКА роя КН АЖ то пед нли КАК па ехо ши ія На іс пи пе мим вин зни и и и едннннй Чак Кк: дак: БОЖЕ НЕНИХУ ї і ї ї : : ї їх : : Я ї ї ІЗ х ї : ї І : соло , ни и УНН ОЗ ОК Ої1 ої 1 РОБ о р оВяае М, ЗНА УНЕУ : Я : : : їх 1: ИН ро: сх НЕ І Вк нн НИ ни нн нн п п о нн в НН В Б В БВ З І В ї о, ї Ї ї р : ї : : І ї Н : х й Н Кожух не ших нн и вини мими ни шин м ан й Он А В с І ЩЕ МЕ М М в М а п З ВІ А А ЗУ Ко Бодьматк прин ККЗ ОО Ох : : 1 кої її ЕН 2 ої рот В й си Її і : : Її : : ї 1 : : : : і ї Н Н ї І Н дохо муанскехик их ц Х ї ї : : ї : ї ї : : ї Н ї 1 : Н ЩО вух, жк - ї Еш и п и п п а п з п с по п В: М Ся ВУ М: ї ї І: вою ї. Н Я ї ї Н їх : ї ' : ї р В пока К Меси нн нн и и нн нн нин кан Зп ОА ХННи Ж х Е ї т ї ї Н їх у. ї ї ї ї Ї х і: З Н : В ї Кепою хохет 13 Й їх Е! Ен ние НИ НЕ п о з У З Є сп З Я З пак ЦЕ й : Ро ої ої : р З | нин ее: Мене ИН сх укихакі кА х є ШЕ ІНН ИН НИ НЕ НЕ дО ро ро ож хв Я Ж Н ї ї : ї ї Н : ї ї 1 ї : ї у : : ї ї - Хто Х НИ нн НИ НН ШЕ ШИ но ші ня мех ВН М М М УНН КТ : : У У Н ТЕ ВН хажк Я к х і В : : Н ї : ї : ї у ї В ї у ШО ОРО.Н 105 охала У Ж нини ни ши ши ни и нн и нн нн нн пк ж о В ШЕ В В ОО В ки ї й : : ї й ї Н : ї Її Н ї ї ТИХ, ОВІК ОО 03 дек р жх, - З : її. ї ї у х І 1 ї ї : : х : Н : тк: ї ВоОмжЕи ще -М ОНИ І ЕМ ОЗ 17 ї : ОЇ ЕН ще У: НН ОНА а Ка вин и нн М п п нн и В ШК 24 СБуваке пендиномна У о: ни м ен п п п В ЗІ В В | Жуки ваоймнеНЕм ої щх КУ у ї І 1 ї ї І ї Н Е ї ї ї : їх ї КЕУКЯ їсте ла ув ща КУ ї : їі : | їі : ї її : : їз : і НЕ ї З Меехе дику В ЯК ще ; рн нн п ни п п п п о в У, ЕН ЗК Я У ЯКУ осукрув уки ПЕНЯ Ше І кв п А А пк п А НЕ КНКО З оббмкоухкаєрь: вч» КИ т ФЖооиниринисрии кт ахеудсеккдкикекккк ї фев : : СО НИ У КО бкрузнуд тиха Фагот Б Я Конуфенн фен р елек Манна енд нуквннх сія К кенннной МХревчая ж жкурм Ко г х : ї ї : Н ї ї ї ї Х : : ї ї т Я ї : ї шк ху здано і укл У: ї ОЇ | | ОЗ І НН ЧИ гої ОО Еї в ШК І Мк» комуна дана БИ З : ї ї ї ! І ї 1 х Я : х ї ї З ШНШК: ї шоку УС и ши нн с НН Бо ВЕН |. ЖОАЖІІККУ : ї ї ї НИ яЯ ї у ї ї : ї Н то КОЖ (Я о ем Узимим: ен НВ В АК НН НН би ев вх Усний ккиМкУкиХ ЯК ов на МА о СВК СЯ ою меті ухода ВИ БЕЖЕ и и и и и ом мн и ВН Но. ; ОО ИН М в ка а СЕМ ЗК хом кення а ОВ ОО кн но п С В С КЕ У в Ок о о З ОВ - 7 ше У режи ЖК вкнекнкя і з своих проц ШЕ че Я ке пере Ми папи чив Міні ення Нім. чи У Б ема) пр венї Ви ДЕК НМ й ії ІЛИК КИМ МКУ КН Кс Повені пре о ЯМ М Здахухмекх дода кумй а ди пикаох: ОК ХоклерасНк С пи а а ОО Жрмнеххмк ККОЯ ик дур НО У В ВК ВК З КИ ВЕ ЗІ и НК ик а ВИ Я кН ат НН І А З З Я з МЕ У ВН Не ВЕ ЗА кн нн а и кни сере да а о а я коса ДИ Кт го ФО і : : : : ЖЕО Хмоемау пашихо МЕН В сих ду ие св ж нев ер ни в и а же ММК Ах ЗЕМ До ек НУюн с НИЙ ВЕК М АС ВНИ ЯДЕ НЕ п М М ХМ п З: ЗИ З Тв дл пн нн в в в в и В купа КУ У В І МЕ МІНИ ОН ОШ Н ЗН НО Н ен нн нн з п Мо: в ні пози пив стажі НЕ ї На: В У ен Не нн Є З З ТУ ОК ІК ВИ с лі ШИ М М й и й А ЯН НИ НА МВ ЗВ В НИК НН НН М М ЕН а т незнивни и нон нин вин нен ни нн ни ни нн Шлдсаня 0 Ми АВК ре нас Клима ИН НН А ПИ хек жила Жоойошн феон ВК ВК ій З У З м Я шен пики се В т ій сне шк нят нн наван си клосУ и ЯКНе З. імя з У Не НИ А ПН ЗК НН КА : ії: оохадЕНої со нини ни нин ши ок и ми о перев ре ення 0 Ментужеюкатю злеклууюти я мтуетт: мя: 15. Тя КЗ З ІЗ У ї Н х : І ї ї ї п : у шк и ІФ КЕ За пеки нини ни ни и нн пи и ни нн сен За тн ТОК я ЗЕ НИ ЗЕ НЯ її: ПЕН а зов З В М А ния 1 вн ни ни и п В В У ШУ их 0 МБ ВВВаНКВ дичних ЗК о Ди и и НЕ МУ ої т ЕЕ кої ЕЕ. КОКО Ж 0 Жид вдв ї З пн нн ння дюни Кн увів МА у ТМ У : 7 ї х ї ї 7 ї х З В ї ї з ШУ х КУ діди ВІК ЛИ КВ си ЯН ВИН НН НН Ка М З З с М МИС КВК СЯ з х я о і : : ї я ї Я ї ЕК Ме «дою З УК соч етивсо, З ї : ї ц : ї ї х т 3: Я з ЖЖ ЩІ, вик нни кни ни и нн мини ри нини ни ни нн ее с ЕВ МНН скла мя и НН НЕ НН Ж Є Ко ЖЕК меня МОЗ

1.3 Гана нини нн мин нини ник мин ни ня В нн и нн ша ШИ Я « в У я 1 : Од БУ я Я ОК Е: ДНК УМ МІ Пи З ТСН кро В НЕ І НЕ КТК тут 0 Бауеча ОМА МА МЕ п 4 - З : ї 3 ї 1 її ї ї Н ї : І : т Не В ї І ІчпроамІки ЗОЗ МІВ, Пежо нн ни нн и нн иа Но сти о сн зу й хо її мог шик ниви ши мк ие пень В а п М ке М НК хе ДЕ А ОВО о У А А АНА Н т ї їх ї У ї пк ки ун в ОНА о и Не В ОО М шини нн нн ви ши ни ШИ в оо В ш ЕК 00120002... ї ї 1. ї ї ї ї : ї х т мВ 1 ї М, : тт М а 10 Н Ор дк. НЕ Б: дж ї хви я х ер нин нн и в нн нн о нн КВН ходкинї 0 Б нуа ЗК ЗЕ МУ ро шк лк : ї Н т ї т ї ря ї т ї ї : т ї В 5 "ом Ме КНЕУ КЗ нн нин ни нон пі или фік ти Жлие М лк о Н здій Лера АВМ м: ще ка В СД ННЯ ж Ви і ни З З ПЕН: КТ кети пам КУ пе х ї ї 1 т ї ї ї ї ї і ї : :. хх ї з пх опіка ; НО нн ни и ан и м и КН: ЗБК 0 НН поврения ; щ шими ниви ни нив ами ми и нив нки: ви а ми о НОВ ша ух, нн НН Ми и М ни М ЕН ЗЕ В о В ОК В роя й ї І ї ОА ї т Де х нн нн нини і вк сосен ВИН А и м В окон Пен КН НН і. КОВО ема вк орео ВМ ВьЕ мова нс нн и п м а и ВК ВН ВИД ОВ СВ а У щ в Ме М НИ НЕ ЕЕ ТЕ ЕК 0СНеваєвхя кутан а БК ща А НН т ї В т ее ЧЕ 0 БХиранка дежнхо ЗМК Є же ДК имени Мити диинии ния рили нитку и или М Мн Козир у й ЕК МЕН ЖИВЕ НК МОВ АК АК ЗЕ НЕСНИ И ННА ЧАК ЕЙ ПО 0 Лети в і ниж арик ни спини ННЯ ЯН Ай нан ан Ма за НН НЯ Ж Жодний Ук В ДЕ ел с Ка век ання Кей ка с мок т КК ви Нд дав ди Я з щк їх Ок ОО х КН ж ХУ КК. З УК шу 0 ЗМК КИ А в а о и В и я В Ов о а А В АВ В С С а С ока з ЖжшЖЖ КЕ яхакикцНЕ Ч срихи вужі хю зве ЗЕ жов КУ с НА МіЖтрицих Ме; цихеуУМхиь Зінічн зем яв МН во еВ 7 маля до сЕВАВе ВЕН НЕь - м и Отит ІН КУКИМХ «КК УИКНЯ Я Х пре меня пак ВИКО Хатришка іх Хе Фф і г 5 І МЕ пев Ех що Тен КК

Кон невне орнн ня пон ни НИ ак Т ї Е ї ї ї 7 ї і ї пити ВІК сн й ни зок пк я Ме і ' . | : ї ї ї Я й ї Я 7 т 7 т я и і ща с на В зе ва ви ва ки с У я І ОН Ж Он І І І ННЯ У ЗМ ВЕ В З а ЗИ ЗИ ев зав чн вве вва «ех Ен ше не ние и ИН НЕ М ЕЕ НИ ЗЕ шви они не МИ кі ен до ни и они Хан ой НН Еш сф нн СН хх т Макет жен хи ГОМ Не М НУ І зе її п ск нН МЕ ие НН МЕНЯ Восени мин мин нем меси ни я ни знан окон нні 55 БУкащі скехеня 5 ГЕ фе фр фефеЯ фонді ШЕ ОЇ М ЕН пекан пе є ЗЕ НЕ ЩЕ ПИ НН НН кине У ИН Ен МВ У Доки дк, й | шини ие коми пе ДК НЕ НЕ НЕ НЕННЯ ОР І: хі Б 5 ВО: КАК чюте хе ефек не оо ШИ шик не ШЕ Н пишеш с кіш ше дез кн ен а и шия НИ НН ШИ: я. ШИШИИ с а тн ши ШЕ ЩЕ й М ЗЕМ ККУ «реве кед нн рев пишиниин м ВЕ МН НН ПЕ НН НЕ УНН Е ПИ НИ НЕ М НИ ЗВ НН Кенія их фик р кктв ок люк чнн ЕК НИ КУА ВЕН НИ НЕ ЕНН Еш ШЕ Брі НИ ЗЕ НН ЕН НЕ МК у ом ни и кни й НН шо ЕК 14 п НЕ ї УМ УНН УНН: БЕР: ІНШ НЕ ЕІ ЕЕ и Я Не Шк МЕ НЕ ЗЕ ЗВ НН НЯ М З нЕ Н Н НЕ ЗІНЕ ж ШЕ кіш не поет твниф они ни и: М М ИН Я аж і ТЕ Ії Же Ек вл: жи Ен З МОЗМ ВЕН кни кине ОН ие М ЕНН БЕ и М НН НЕ ЗМЕН НЕ ЗМ І НН: БОЮ ее ник ння Мн я яри Ди дин міння ЕК БО НЕ НИ АН кор в і сходи ніреистртня дв ; ші Ен Ен ши МЕ ШЕ В ВЕ НН В ЩЕ У ВЕН ними НЯ Кн ЕН З І ЕН БЕР З А МЕ НИ НЕ ЕНН МАН и НН в фе Кеннеді хо тт жк із НЕ ЗЕ З ИН я 13 рон У ИН ЗИ КОМ ще 13: нн нн ман ан нм ДЕН КИ НИЄ Еш щи и а и о и о В док кох дено мані фон дно кс ніки мені он е Уже ши не МЕ МИ НЕ М МИНЕ шин ние сісіні о иа нн ши ни А НЕ М Зм М ШЕ У ее нн нн бли ен НЕННЯ М ІН ЗЕ З НН НЕ ЗНУ ЗЕ ПИ ЗМ М З п НИ сни и нин МИ нн ок ЗК сс пт як в нинишишиши ши ШЕ МЕ НЕ ШЕ ЗВ УНЕ З НЕ НЕ ЗНА ТОЖ КТЮТІ сежетікі з МА их данні ЕЕ ШИ ШНЕК МЕ НН: ще МЕ ШИ ЗЕ НИ НН ШЕ Ше ШЕ и М Ви о а КН А ЕІ ЗЕ ШЕ ЖЕ ПЕ НЕ Я ЕЕ о ни а ЕК їв іЯ сен коди доле КЕ Ки ножем диння КЕсЯннЕ і. ЗО ЗИ ПЕ ее я Я і м м а Кк ОД В ло В ит.

23 ЖК ОР: . Еш НИ ЕНН Не и НЕ оНне й и нн ви а ами коквкук кро нковлічавие щи Дн не Не нн Ще ЕЕ ЯН ЗЕ ЗДУ Мена усу оо ск дочірні шик ЕНН ЕК Зефір БОТОД ОВО В див ку ДАН НЕ А ШЕ У пев Вис: Вс а Я зоря В овен Ко лік жк жов ей сонних ГИ зни НЕ З ИН З в НК м КА СТЮОЯ у лу Кеш ние ев ТК і МЕНЕ ШЕ Еш ШЕ НН НЕ її Еш о ня ення ри и Ки вм во т. ЗЛА Б. т. 5 їх ЕЕ ЗИ НЕ РОМ Не У пкжной ях і-ї ЕЕ: КОЖ КВ ОНИ КИ ЗАКО соках зей ен ; у І ; м . ЗНА ноя НН знан о М НК ная мех ей ЕК НУВ соковвчн Ол са ж Мен У нн поем З он КУТУ не Моя ее се ВН ЗЕ У и Як Олі нн он ви ВВ пен З у й й ше юку БОрОВ ОВО КОСОЮ а От В не В ке ЗВ оф еьх їй ОД нн ПИ МИ З ЗНУ Не 513 ОБОВ У ве кож дим каф ренй ік ДЕ ВЕН ШЕ Ж ни КН БЕ А У емо ВОК НК КК НИ о КК АХ сек н о вну МИ | ре зв вікон ни пк во ЗК фев хе фе фенн ІМЕНА пило ЗМ ЗЕ ТНЕУ М НЕ ЕК Ер ХА о ХК Ки ни мини ними кн ефек веж ЕН МИНЕ НЕ В НЕ М НЕ НЕ: ВЕ Кк рек іссеВ ферум ке де орди ши ні ИН А ЕН ше ши и ЕЕ нн ї де В ВК хо ох ої ї ї с хх РО 4 1 її ероюуих Я Кк с шини ни нджніяокяьнх хо шиї гер маки н ШИНИ НЕ ШИ ШЕ пет НАЕК ЕК ТМ ВИ Керн якеня Кок ЕцаНИНЯк.

Ен. КО АН АН із У не ЗНУ 3 ізн вій пав пік о к: се т ме КН І І А ВЕ ЗНАННЯ її пи фо ей Н її р ума ві КН З «ФК ее Кв деки ОК кі ши и ши ШЕ. п й я ! еле чення дове їх Ані ШЕ М НЕ НЕ ЕЕ ЕН ве я ШЕ «Коба те ЗО НЕ УНН ої кк, Ден и ШЕ с НИ ИН У и БЕ І - ша НВ В ОМ НЕ А АЕН ГЕ ШК у и ку НН и МИ ЕЕ У НЕ ЯН й в и я З ИН НН рфовокофку ее З 43 ОМ Зх УАдЩК я В у ОКХ А нний МК КН иа ТМ дух дюн ред дк ше ще о шо шик вим ни осв ей знаний пеушневи шо сетей ; У шюжкоі і ВТ т о ДЕ т НА НК ее ВЕ ре ва за пені Ки Ки ГУ и ДВ 80 нь вия ЕН Й М а а СТЕ ЕЕ х БЕК пе ос о хе ЗЕ сни АК ее 34 ефе Кер Зк ШИН йо : иа ЕЕ ВН е сотова з зо в МИ МИ жк: оон КК ск з онко В З ке й ЕН іже нн и ВК Кб дк г НИ З и ЛЕК аку « шо З ВОЮ У НВ З ЯН В У «ке фохден і КК вк» х домі ! ши зх пед КН БОБ ВЕК НИ МВ А Я и ння хіккш ж У Дн Мене ше не ММ МІ ОНИ МО ій МОЖ венах «уче еВ во М пиши ше ши ВЕ я дення Вин и ці ї і НЕ : НИ ЯНКУ ЕН КИМ и БО дет т пе хколк ГНЕ и У а У ОНИ НН ; р ферит яння св Я: Не МНН ви всі ех диф км СЕК Зх як ВІ Р В: 2 ма и м из Ко З ник ЯН КАВА рення ЕЯЙ ши Ж Не У ШЕ ЛКШИ Я ПН МАУ НЕ и ЕЕ НЕ: ди нив ву ша ши на я Б шик де І БО: Б БЕ ЕЕ ЕНН ЕН М ЕЕ г Керр пе ше Земан зн НЕ НЕ НА НЕ НИ НН: З: оо Ок ОО Зах ЗМ З а ЗМЕН ЗН і пиши ї РОЮ РОЮ: СУ х НЕ ЕЕ ЗЕ ЗИ НН и І ЕЕ сука ІЕЕ ЕІ ЕН У і МЕ А и З М УНІ ИН БЕР оФОЮ 5: ЕУМсНЕ У їх с : тонам ц ДН Не нен ЗИ ЗАПИ Дн НЯ ОК Ох ї ОО ЖЕ і: ; й їй ря ох пенні В СН ВП ПН КЕ СК нишененя сен в У У У ов о - З де А КУМ НК ВН Я екв ек з А М З Я МОБ У МАСИ З М ВЧ А осв вити а шщь ШС ЗВ В С В С В ж АК С; Бе З Е х як шк ОВ с у З я Як хі Що че щ ще ; -Е «ее щі і коя а с м в КЕЙ МІНІ НВ : і й шо З ЗНУ В ЗЕ Зх з УВК М ЯК .

Фіг. ЗІ поминання ї ти и і : : : : : ен нн нон я СК Я : : ї : Я : Н Я ВІ Ох а КУ ем, пн кас і ї : 4 ї й З її КЗ ВУХ окуні : : : кет па ка и Б ши Певне ! Й | : ! : п : ; і. та Ой пр ду ка я зак 1 : : ї : : т їв ї З СБ бмжмауу дих: МИ лідеи ОО і : вч 5 : : З га: 1: й ВЕ КЕ ОянаВХ деку КО лк я Жим кое Аа оо и м п Ен ни не ШЕ КЕ фкома НК нн ние НИ ІН м нин и й НИ ЕН ША нини шишишишшенн Мена 1 т ій І ї х сх Її М Н х Її ї Ж ТЕДДІ Ок Но: ї Я ї : Її ї Я : НИ НЯ : ї ВУ 133 хх ІВ ШМІЕТКМИ «ії і : ї : ї Я : ї ЕД ! ІЗ : ТЕ рда Коня Шишишеи і НЕ НЕ: КЕ прокат х ї ення вн и сан - ; і і : про всАн шини ен нн шин ни Пояс М ЛАНЕ ; | : : і : Кх Е ? г 3 ан я их ши у, ах Ще ; і : І : ї 1 ї 13: : І: п ко г : о : | ; : І Квекцюхокте ЯМ ЕІ А і З : : 00 НИ ї ТЕ: КО : ТЕ Нахнужеків лених "ши ники ни ие : ши Еш нн ше 11 ес слова анна махяе ГЕ КЕКК ше Еш ни ї ши ни шшш реж ши х ї 1 но І ї ї ї х (Я : ІЗ Її . ї Х Оу, МН х ЕК В : Я В : т НУ ї Ех ШЕУ Н М : її Ха вкеуеня дане: ТЕКТИ Е що ї ї ї ї І І ї х г Я і Ки т ГК сало ГУОвУ МИ ре Я ї : : ї Ї ОБ і| її : її ва З НАВЯ еря яння : ОК ЕНН ОВ : Ж пруохини: ПК ЕК ж шк ние пи В Жорео ЩІ і ПЕ: ЗЕ ПЕ теме МЖК ВБОТВ М жи ши шиши ни ш ще ЯК ВЕН. Ор рор ое е ї З Я нн ни ОНЕУ НИ : ЖЕ Кілюквль рук: ЗК х : Я : : : ОВ: БО: ОВ Я КІ Мет ери КТ КУ Я : : Я : В: ОК 1 г : ТЕ Гюнюредне х сащжікя ; - ї Н ї : ї : і ЕЗ : : М: к : : КЕ акт ке я се ще ше ши и а и Ж: ЩЕ ом ПОІТе СНУ ШИ Не нин ни нн ни кн ш с КА ТВ Деврорткв БАЖЕУМН Ж я . СУ нн пе їі З Р Ках дач КЗ і кн нн в и С Б ЖЕНУ ЕХ НЕ Гожаюжя Ж щі ї ї ї : Я не ми а КК я УК Я ДК Ей сажх Б г : Ї : Н : ЕВ пт фран еВ КУДИ ЖАВ ш їообиео Каайборіх 81 ВВ, КО КЕНЕ У МОВ: КВІМКненЕ ш їж ВИК З Е с ОБІВе і прове чех: В ЕВ . ТЕ З 8: і БШЕ ОО ЗЕ: попосеневннн с. я ! | Е : шк ! ОО Н ЖЕ конк довго а м щй ЕНН и ще: ЗЕ З ННЯ ШЕ ИН НЕ омегою кН сих З : Її : : : І! К ї ще : : КЕ Я меми са саКх хі ЕВ ї : : Я КЕ: т ЕВ Х ОО ЕЕ Кі лам малини ВЖК І я ши ши ин ие ВЕ А ГЕ НВК еУ ЛИШЕ НЕ СЕ финомно поз мое КК. 1: са пк щу Е : : : 1 ї : ї ЕВ ОО НУ ЕЕ УКНЦИМНЕ ПО КИТ УМХ БО Б УСЕ. и у а о Ж ВН і у Чер муакнунх дх я ш За Кевві ж тв в «БК жін й Я їі В РЕ дНМиКих джин. ЯМКИ роз КИ: С ОК АВ КК ве ІЗ МОН и НН Зо м АЗОВ ши Б Ян в В Пе КО ВЕБ ВОБЕ о срекн х і: ї ТЯ М В БЕК ЙО ОК ТМ М сови: Я ЯВ Ах їх ї р т ї кеВ КЕКС ЗВ ТЕХ КВ ї і ЗКУ ННЯ: ІВ М І Н ї ї Н шк ТОЮ ря: ІН ОК їм ха ха п Ї ї Я : ї : : Я : ї ЛКК ТЕ фежаших ДІЯ КЕКВ ї ї ї їх : І Н ї ї ї ї Ї ї ї ї Ех дей АТАКУ пре Я хім В : х : и ї : : ї : Н : 7 ВК АТМ ЕЖМТЯ Ломов ї : : І : Ї Н Ї 2 ї ше МАЄ ПТ я га - У УК УЖЕ ку юки 5 З я В В В Е шко М а ЕЙ У АВ ШОК а щи он нн ва іні МУ дкнне шк МЕ и о и ОН В У іх киу Іпу ЗК оон. ОА С ШУ ка й тс що Бе У ОК У КАХ хуя. : м і ї 5 « Ех є й ще «В МК НО Юа ее Му х поко комі ше ік Уке КУБИКИ зіхйчці зе я Кри ВЖК УвлЕкицИХ Й Хімічні зе зав : п УВІМЖненХ пчнІзаеуив яю См яз панни К Жахи ка ї КОМ УНх КИЗИМКе Її АННУ ПНЯ Хквеж Ух: Пе Тема Уув вони пи ни нн нн нн Енн пн они и ов ин овен ї рин КА флот фоесиі фол усе Шуваатва: ВИМ УК МІ з мА А а ор а В ; ї Е : Е В ЕКУЕВЕ ЖК Же Б У й ї Ї ї Й иа нен п мнения ї Чумак пвхих. Пі хор комий ан и и С : Я КЕ ШИ п г мк ї- В з В В пен нн нн нн ї ВК зудяви ЗВ Що С ин ши нн о лив а пиши и нн вн пи в В НЕ ВИ ОК НКУ Кияни ут видих пелет ; ї Н ї г ї Й 3 й шо КОЖ ЕД яви : : : : : й о ни в В В ДАН НИКУ ОС зн кни нн ни ан Би 7 В : : : ї НЕ ЗНАННЯ зних В ВАК КЕТАЮ Дн ї " гі син нини нн нн нн нн нні нн ння пд НЕК АЗ ХК осетер : : : Н Н Я Е; ї Зіни Мо дви ЯМИ ЕК АХ Ему УМ т : Ї х т ї : фени сирих СІЙ ев не зі Пт, ї шу Ко, х : : і ц ї- вин ання ї Н ї х Я ї ї Я КИ АН Акт нн нини я Еш НН ОТИТ ї ї : Е ї т : Її они нн НК ния ск. Ум ТИ КМ нн нн нн втру елини солод. ЗМККОСККВНАНИХ ДЯН ВКМ к

ЖК. 7 : и : : : : Н ї и зи В й х Н : ї жнив діти фін дин ї ; т 3 3 «сапу КО век нин ни по п В В В В Я. ин м ВК Б ВК НДІ р ШЕ : Н Н нн Її ї пане ПІКІВ МК ОВК ех мн немов ння т - З Н У ОН НЕК: ОК й й їх х ї : Діснея фестини віти дитя пет, вок о пон Я 7 ї З соте ХХХ, т ЖЕ : : і х дими Вилити Дитини пиття дииити дин солимо ї Ці хім лв ек: АВ ек же р Н : Н В З Вон НН ТЕТ прварюциє сконуютня й КО ож м нин нн в : ї : Н ї СЯ ложки: З пдв ние Я Н Ка ї ї нки и анод тижнях ДинннрнянКя ЕК Бохнимжща: МОН КВ ож В ЕНН п Ки Кия Т7 ї В : х Н І зро тих хи тв і : КЕ. Додон яко вик ши ЕН. думка: МОЯ КВН ЕХ кій З йому ї Ох мефетивотрм сину це Нах кр ЯН г ЕжКЯ брам нер СИ ИН: : : : : рент Мнея хх й х : Н і п с а ка ее Не хх ЯК пф темою долити ї : Її ї Ко : ня Ме УЮ рю ау мом, В КК пеня С Я Би бони нн ЛЕК ух Щк МОВА Кон вн : Метифисеве Втр СЖКЕВКХ УМОехивюх о ДАЮ нене БОЮ : ВИН ї пи оку ред ПК х УК днем и нн жен : ї ЕНН У М... Схеми: НЕЮ В мух 7 ї і Н В ї ї ПО ЯН НН я а Ук СК пет Ка хх в пн нн и п М В ди ї 4: ХМнрмаа хв вух МК ша нина нн и а М І ШЕ Ж. ОРІ Бех ДИНИ М й ій ІЗ : ; Фенираннні ев інфе фі Ще : ГУ ї КА Чек лониихми діжа: ПТМ КС х ВО : ї : НИ екв пен МАЕ нини ни чну З ї хо у ТХ ДО вн подо Е х 7 й ї : не М Я и ня и

3. як ї : і: Н : : пен нн ни нн ни они ї НЕ клини ТЕ пре онкн н а м Кт Я : ї ї : -Я і се Не КИЙ НО Ул : : т ї ї : ї В А СЛНААННА А ння т зання ни кВ КК ш ОН ет в ти фин ДиниЯя ЕН УК іду ЦЕ х нан юннкяя ї КЕ : Я ї Е : її З ЗК з шлю вом та м ХХ а ННЙ В : Я : Я 0: Е : Вин ЗН ЗІ оВЖ ЕМ їх. КЕ МОН ї Я с, її: ї : : ї : й ї Мем Ко кН С нись з НЕ о о нн нн и ФВ зва АК ВВЕ АВ НЕ ЦЮ стелю Мод я З й 3 Не ВИКО кн х ВН піт Я Я СОМИ Ше и НЕННЯ в ТЕХ НАБУ Кмин ва доня ять : : Її: дк кистю ннннлдння Кехкнидо Кн Оки неКка Уа ЯКЕ УДИ хе 1 о Я ни Вома ї Яо АВ НИ ті ак нн на МЕ А : онов м ран в ВИХ ЗЛУКИ УК вд вв В 7 ї ї Ко с Ех БУМКЦИ УК Шен сень М Оно кя сх т ХУ й і В ей я з гармхнаня Ех п я Я Ук пок АК ОО ов ПОН МЕЖ ЗКУ МОЖ ша МхНеНе ШК АК ша Ок ще А и і КОНЯ оком шпак ки ро ХОМ ДЗ о и о В СИ МЕ ЧУ КЕ Ре й М а В М В шк МВлЕКМІВа ач В її Зепуєхо полахей НИ й Я МкжО ськ о їу а и Ви КИ кій зи ав ЕЕ ек МНК Жені В ДЕК КОМ НОВ Ме век М ня У і й Теяловатк ЖЕ;

Фіг. УК днини: ЩУКИ ПМ орви нен нн нн нн Ї 1 Керекнаннк: МКК і: ЗД дім умінням 3 і, о: В Кк ек : і Й : Ї і ; 3 оце ВЕЖІ ЖЕ мовна х ї Н Ві ї 1 еконо поки С в коки : Н Е 3 ; Н і: 3 1 лкахнне дчкцех М камені х Її х ї БУ 3 нд х ж ї ї 5 1 ї 3 Гвфежи ЗВЯІЯ ї Ї З : : : ВОЮ ут ї : З Н : і інве Не й Е ї У ї : Х кодек корек самих Ж ї ВКЛ ї : Е: кими ве

ОВ. : 000 Б АВЕОМичнні ЕУ ї ту ї : і Туман кох ЖЕ ї ї ї ї у пута гу ї : З і : і рони АНЮ зі летакиктя КУ Е пимкумамне міо ох ВІ ТИМ я х ї НЇ і : Н ЇХ Викуженик клю да мнк мм ок В. х ІЗ 3 і ооюооюкккк ик осо фосесюююсену ЕК вай - ен нн ен нн зок жен» : і вами щен ег І 3 3 Е 1 ну Я МУ ВЕК що Е Е і І НІ Ка нд па З БЕК Е ї : : З вно Е Е і і Е : р вки ї ї х З 3 ЇХ вв і Ман к МО М ї І 3 З Ї 1 ВВ З КИ я ї Е ї і І і Н ї ЗЕ КЕ Я Н ї Х ще Я ї ї ІЗ 3 Ї с 1 З т пи писотни З МД Я ї Н З | ї ІЗ ї З Кік тки ДСІВ ї х |: ІЗ ї ї ї З удачі «с мкм хм : : ! і і і МК: | пковвн кону: З ї Е ї 3 ІЗ ї ї : З кодшвнноя ї КУМ : ї Н З : ІЗ З Н М пад: ЗЯ УМХ в : і ! | | Е У У оенсннной КАНД КН ВН ЖИВ ї КЕ Н ІЗ а ана КОМИ Енн: знан ин: пн ух зе : і ка хан Н щх я. Ку Ге ГУ їх ке піц М : к і ВІ ї Е : ІЗ ; тю ї 7 3 І ї КЕ Я ІЧ Х п днов фирмо м шк : Я ї : і ї : кої З КЕ ПО, т Я В т Я А о зд З Е ! Н ї 1 ї ІЗ ЩЕ З З кукі УКІеКНЕМУ. «ЕЕ ІЗ ' 1 т у ї Е х ; ЕК мдл нео ктиї Ж ї і і : : ї : т ; В Межа пиворновня: КЗ ї ї Е 3 (у Я їх г днтжотинтнки Кри БУ і ї 3 ї І ї Я МЕ З сКрну рхокмити НЕК т ї і : ї ї Я МЕ ше камерних ГК НЕ І їдкі і : і : НЕО Еко: дитини ПЕК

ОЗ. Її ї х Ж ї : Ж кінсвоатогу меми КЕ ге ї Вт х і: ї : СЕН я і Миша З хе ЕХ і ї ї х 1 Е Я ЗО У шкоду що й ве І ї ; з ї З ЕІ синій КАН ОКХ КО ї я за науки еф пд, х «Її й НК з нини наван скдех ес ие, ІЗ о Кжжлакнкв: Д Б Ку З х Е ї й у Я І І че В : ї 1 Н ї ї Н п імахдми ВІ ТУ Н ї ї М 7 Н Е ї Іов дж ум м ж і : У 1 З : І Н ІІМА АТ ЖЖ МУ хх і ї ї ї ї З ! Я Іо пріх вок ками Мі Ж і Н ! ! і : І | : р А МОН я ЩІ ї ї ї ї ІЗ Я Я І: тах ІК «ера мух, -Х ! Н Її і Н 1 | З М Мем ЗБ хитання хх Н ї ІЗ х ї : Ж Тож ІКАО КВН хе І ї ї ІЗ х : я КО КА УКВ КА КНУ й ї ; В і пучку ЕК еючунюу тет есте титу пОКе КК МИ ВИДІ ско Метт оту сотих дк ж й ІН Грріву кове нику Ман Я поко аж хг КУСНа Сов ММ НЕНХУ КУ кю Ок їм ЗЕ 1 КОЗУ МУ ЗКУ і МЕ: хвхорнох 44 ЧІ КВК Ми я ях р. кі но Ту ча НУВВАНИ с виншеаех Хімічні зствноядер Сім Уіоркиання пронамача: Сецуенання куки ТЕ я мя ЗКУ с. ЕВ тан ЕН ЕМОУЗНВОВНК г

Фіг. зм Тамнткакц (ке

КЗ нен нини нн пон п нн нн нн вити хик М Яку ЕН і ї ЕН ї ї і ї ї М Я Крах ВЕДЕ КІ КУМ ри нн нн кн п п а А а М В ПО ДО НК МАМ у І, ї і ; них вне Ту дкумяи а ПО коала кння х 3 1 Я Я ї І ІЗ ко адан ЗИ З фресеннн шишка жна нн нн ж и М СТ ЕЕ Е ій ї ї НИ І ЗЕ п А ИЙ Б Др пеня нн панни сп зиск пен Ми Мн и НН Щ 1 х Я ї ї : Е Іди й 7 В ї і ї ї ЗКУ ї інонає мя ТУ ення нн нн нин мн КУДИ Не КО З Н ї : Н БО Н Ева БАК тк (ч (Ч щ З. х Х й: х у ск жа. жир аг З: ее с зв нання нн Мн и сен ке фун «Одекцееки і ЯМ ОКА Ме ЗК ча НМ ОЇ Ї Н Н НН гіди, молимось МКК ДВ вне пок НК кн і вин ші ЕзДЦ юань ЕЛЕКТ кю АН СОУ в Шк по КО КАК ЗМ : З ; ї ІН МН я нання она Вс докеююоютек ін орогісюююсюнус косе фоеюююсхсенк пос ідх Зону ВХ доні: ІК ВЕ КМ ШКІВ : ї І х Н гена ва БО Ерееичх в вони нин зн зви ння о о А ко у ї ї З ї ІЗ І жк ВЕ ЖИ МЕ КУ щ є З . КК й ще ї Я Молонососня росте фроорогогогогої юне сюсетотреессе сек есте; уосседресссссттссстітссссої Ж МЕ НУ ї г Ї ї Кз ї Терен пенею ПЕВ, : ї 1; ХІКОУх ЗЕКУдИ МОНЕ ши нн а п нн нн т и п МК ПН ВО шу ї Зх ї В ЦІ : ї У Мем пи хв В мк ї ї М ї У М ще потхи ух БУ сш нен нн вин мой мин зн з зни ефек Дяк Жид: ПОМОЖЕ шко ІЗ ІЗ кої ї : Н її ЕК дпімоміну нюх ов ек . їх. ІЗ ї ї ї 5 ї Ех ЗМУ ХОЛІ ВІЗ п и М пи п пи КК и и ВВ вав й МУК у т 3 ї Не ЗМ ЗМ НВК ЕЕ ЕЕ Еш ЯКУ Мн нн в В ех в а КК В ВС ВЕСТ од Е : ЕУНН : Н Ей і кум Якщо Пп ЩО кречетюєкя ни нн и нн ЗВУ не ен долом Б її 4 ї ї її : х х с. Ж Т жк зажкоК ЕЕ ТЕМ сштог екшн кокс к оо, НК Х Є З З Жмукнки ЕІ КІМ шо ВЖК нини ним зма нин у нем нині и ми Зно Ми; за кання що Би ЕІ ІМ да са ІЗ 3 ЩІ ї їх ЖЖ пюЖЖМ ВДЕ. й як тр нн нн нн нн нн ко ші ев ше Курінна дик, р Є хі І ї к хЕ ї КК Млк 3 ик писемних З Ж ме ши не ши них ни шк Зркя поменше жених іже рихихх З не - 1 ї ї ї ї ЗЕ х ЕДІНУ і Масла поживи шо в нн нини ин мн вн нин Беж ше шо Це жекою воврнни їж КЗ а у х і; х З КЗ. УЕММУ ЩУКИ. Ї ц ОН ІЗ ї Кк т ГУ МІВ Хх Зк хх доти і ких У шо ВІ ин и Ми Ин СН КЕКВ ня ше м нн КОКЕНКа ХА ККо КУТ в У Н ї ї КОВО АОЗ 1: ЕК Мих пвишаисх лаклію: КОЖЕН реу І нні ні зн мн МН з ман совет рей р ВАМ ЖИ г ШУ и їх Ех ї пд КЕ г 155 3 Я с щ ще хе У ШК х ї дея и сх о м в це сені покине сосен зав ни ОО коша еко ке: ШИ акне а а п пп п а а а а п ЕВ по ВВ Ох 9 К мм ми у тех лу 7 кН ОН Зх КУ т ЩІ ЗА че НУ за її тежща ЕМ ванкна ДЕК Не МУКИ АНЯ ск уж я вкл ду К Зіни ния праце Км З АК еенО ву жав ЕН ОМ З Блума Зхоимх дюдакииМи Ве Зм можусх МКК Фі г. Тк темах Ки -- 8.8: 8:8::8::8:8:::8:8:8 8 8).):!:)/8:8:8: 8:88: 8: 4-78... : 8:99: :./:::/7:3 2-9: /8: 8.-ї7И7-72.:868686.6.6.67676767676 6 6 .--