KR101782761B1 - 바이오매스의 가공처리방법 - Google Patents

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Abstract

바이오매스(예컨대, 식물 바이오매스, 동물 바이오매스 및 도시 폐 바이오매스)가 연료 등과 같은 유용한 생성물의 생산에 이용하기 위하여 가공처리된다. 예를 들어, 시스템은 셀룰로스 재료 및/또는 리그노셀룰로스 재료 등과 같은 바이오매스 재료를 이용해서 생성물의 생산, 예를 들어, 발효에 의한 에탄올 및/또는 뷰탄올의 생산을 증대시킬 수 있다.

Description

바이오매스의 가공처리방법{PROCESSING BIOMASS}
관련 출원
본 출원은 미국 특허 출원 제12/417,840호(출원일: 2009년 4월 4일), 미국 특허 가출원 제61/180,032호(출원일: 2009년 5월 20일) 및 미국 특허 가출원 제61/252,293호(출원일: 2009년 10월 16일)에 대한 우선권을 주장한다. 이들 출원의 각각의 완전한 개시 내용은 따라서 여기에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 바이오매스의 가공처리방법, 그리고 그로부터 얻어진 바이오매스 재료를 포함하는 혼합물 및 조성물에 관한 것이다.
셀룰로스 재료 및 리그노셀룰로스 재료 등과 같은 각종 탄수화물이 생산되고, 가공처리되어, 많은 용도에 대량으로 이용되고 있다. 이러한 재료는 종종 한번 사용된 후 폐기물로서 폐기되거나, 또는 단순히 폐물 재료, 예컨대, 오수, 바가스(bagasse), 톱밥 및 여물 등으로 간주된다.
각종 셀룰로스 및 리그노셀룰로스 재료, 그들의 이용 및 응용은 미국 특허 제7,307,108호, 제7,074,918호, 제6,448,307호, 제6,258,876호, 제6,207,729호, 제5,973,035호 및 제5,952,105호; 그리고, PCT/US2006/010648(발명의 명칭: FIBROUS MATERIALS AND COMPOSITES, 출원일: 2006년 3월 23일) 및 미국 특허 출원 공개 제2007/0045456호 공보(발명의 명칭: FIBROUS MATERIALS AND COMPOSITES)를 비롯한 각종 특허 출원에 있어서 개시되어 있다.
몇몇 경우에, 가공처리, 예를 들어, 발효에서의 바이오매스의 존재는 저분자량 당(low molecular weight sugar)의 중간생성물 혹은 생성물로의 전환을 용이하게 한다. 본 발명자들은 저분자량 당, 매질, 예컨대, 용매 혹은 용매계 등의 매질 및 미생물과의 혼합물 중에 바이오매스를 내포시키는 것이 당의 전환에 의해 얻어진 중간생성물 혹은 생성물, 예를 들어, 에탄올 혹은 뷰탄올 등과 같은 알코올의 수율과 생산율을 향상시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 바이오매스를 내포시키는 것은 또한, 예컨대, 발효에 의한 불완전하거나 둔하거나 혹은 "고착된"(stuck) 생성물 전환을 방지할 수 있다.
바이오매스는 그 자체는 생성물(알코올 등)로 전환될 수 없거나, 혹은 저분자량 당과 함께 생성물로 부분적으로 혹은 완전히 전환될 수 있다.
바이오매스가 부분적으로 전환되는 경우에, 해당 바이오매스의 표면적 및 다공도(porosity)는 출발 바이오매스의 표면적 및 다공도에 대해서 증가하며, 이것은 저분자량 당의 생성물로의 전환률을 유리하게 증가시킬 수 있다.
몇몇 경우에, 바이오매스는 당화된 셀룰로스 혹은 리그노셀룰로스 재료의 나머지, 예컨대, 리그닌 및/또는 셀룰로스가 당으로 전환된 후에 남아 있는 기타 재료일 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 바이오매스 재료, 예컨대, 작용화된 혹은 기능화된(functionalized) 바이오매스 섬유 상에 고정화된(immobilized) 미생물 및/또는 효소를 이용해서 탄수화물, 예컨대, 저분자량 당을 생성물로 전환시키는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다. "고정화된"란, 미생물 및/또는 효소가 공유결합, 수소, 이온 혹은 등가 결합에 의해 및/또는 미생물과 바이오매스 재료, 예컨대, 섬유의 기공 간의 기계적 상호작용에 의해 직접 혹은 간접적으로 결합되는 것을 의미한다. 결합은, 예를 들어, 바이오매스 재료를 전기적으로 극성화함으로써 작성될 수 있다. 상호작용은 영구적이거나 반영구적이거나 순간적일 수 있다. 기계적 상호작용은 바이오매스 재료의 기공 혹은 다른 부위 내에 자리 잡거나 달라붙은 미생물 혹은 효소를 포함할 수 있다.
몇몇 구현예는 다음과 같은 특성들을 하나 이상 포함한다.
전환은 미생물에 의해서 저분자량 당의 적어도 일부를 알코올, 예컨대, 에탄올 혹은 뷰탄올로, 또는 탄화수소 혹은 수소로 전환시키는 것을 포함할 수 있다. 전환은 발효를 포함할 수 있다. 상기 미생물은 효모, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae; "S. cerevisiae"로 약칭됨) 및/또는 피키아 스티피티스(Pichia stipitis; "P. stipitis"로 약칭됨), 또는 박테리아, 예컨대, 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis; "Z. mobilis"로 약칭됨)를 포함할 수 있다. 이 방법은 바이오매스 섬유를 예컨대, 이온화 방사선으로, 예를 들어, 입자빔을 이용해서 조사하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바이오매스 섬유는 0.25㎡/g 이상의 BET(Brunauer, Emmet and Teller) 표면적 및/또는 적어도 70%의 다공도를 지닐 수 있다. 바이오매스 섬유는 내부 섬유를 지니면서 그의 내부 섬유가 실질적으로 노출되는 정도로 전단된 바이오매스 재료로부터 유래될 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 극성 작용기들을 지니는 바이오매스 재료, 상보적인 유인성 작용기들(complementary attractive functional groups)을 지니는 미생물 및 액체 매질을 포함하는 혼합물을 특징으로 한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 작용기들을 지니는 바이오매스 섬유들 및 상보적인 유인성 작용기들을 지니는 미생물을 포함하되, 해당 미생물은 상기 바이오매스 섬유들 상에 고정화되어 있는 것인 조성물을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 바이오매스, 미생물 및 용매 혹은 용매계, 예컨대, 물 혹은 물과 유기 용매와의 혼합물과의 혼합물 중에, 저분자량 당 또는 저분자량 당을 포함하는 재료를 생성물로 전환시키는 방법을 특징으로 한다. 용매 혹은 용매계의 예로는, 물, 헥산, 헥사데칸, 글라이콜, 클로로포름, 톨루엔, 아세트산에틸, 석유에터, 액화 석유 가스(LPG), 이온성 액체 및 이들의 혼합물을 들 수 있다. 용매 혹은 용매계는 단일 상 혹은 둘 이상의 상의 형태일 수 있다. 바이오매스는, 예컨대, 섬유 형태일 수 있다.
몇몇 경우에, 생성물의 제조 동안 존재하는 (예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 처리된 혹은 미처리된) 바이오매스 재료는 생성물의 생산율을 증대시킬 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이길 원치 않지만, 높은 표면적 및/또는 높은 다공도 고체 등과 같은, 고체가 존재하는 것은 용질의 유효 농도를 증가시키고 또한 반응이 일어날 수 있는 물질을 제공함으로써 반응속도를 증가시킬 수 있는 것으로 여겨진다.
몇몇 실시형태에서, (방사선) 조사, 산화, 화학적 처리, 기계적 처리, 초음파 분해(sonication), 증기 폭발(steam explosion) 및/또는 열분해가 실시된 바이오매스 재료는, 예컨대, 발효 속도 및 출력을 증대시키기 위하여, 저분자량 당 발효 과정에 첨가될 수 있다.
예를 들어, 조사된 혹은 미조사된 바이오매스 재료, 예컨대, 종이 섬유는 옥수수-에탄올 발효 혹은 사탕수수 추출물 발효 동안 등과 같은, 발효 과정에 가해져서, 생산율을 적어도 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100% 이상, 예컨대, 적어도 150%, 혹은 심지어 1000%까지 증가시킬 수 있다. 전환, 예컨대, 발효는 본 명세서의 실시예에서 정의된 바와 같은, 적어도 140%의, 몇몇 경우에는 적어도 170%의 퍼센트 성능(즉, 성능 %)을 발휘할 수 있다.
상기 바이오매스 재료는 높은 표면적, 높은 다공도 및/또는 낮은 벌크 밀도(low bulk density)를 지닐 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 바이오매스는 약 0.5중량% 내지 약 50중량%, 예컨대, 약 1중량% 내지 약 25중량% 또는 약 2중량% 내지 약 12.5중량%의 혼합물로 존재한다. 다른 실시형태에서, 상기 바이오매스는 약 0.5중량% 이상, 예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9중량% 이상, 또는 심지어 약 10중량% 이상의 양으로 존재한다.
상기 바이오매스 재료는 전환 과정 동안 스스로 소비되지 않기 때문에, 해당 바이오매스 재료는 다수의 배취 과정(batch process)에서 재사용될 수 있거나, 또는 비교적 커다란 부피의 생성물의 생산을 위해 연속적으로 사용될 수 있다.
몇몇 구현예는 다음과 같은 특성들을 하나 이상 포함한다. 상기 방법은, 혼합되기 전의 섬유질 바이오매스를, 예를 들어, 적어도 5M㎭의 총 선량으로, 예컨대, 이온화 방사선으로 조사하는 단계를 포함한다. 조사는 입자빔을 이용해서 수행될 수 있다. 조사는 바이오매스의 분자량을 감소시키도록 선택된 조건 하에 행해질 수 있다. 상기 조사는 방사선의 다수의 인가를 이용해서 수행될 수 있다. 이온화 방사선은 전자빔 방사선을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방사선은 약 10 M㎭ 내지 약 150 M㎭의 총 선량에서, 예컨대, 약 0.5 내지 약 10 M㎭/day, 혹은 1 M㎭/s 내지 약 10 M㎭/s의 선량에서 인가될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 조사하는 단계는, 예컨대, 감마선 및 전자빔 등과 같은 2종 이상의 방사선 공급원을 인가하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 상기 조사하는 단계는 바이오매스 공급원료에 대해 수행되는 한편 상기 바이오매스 공급원료는 공기, 질소, 산소, 헬륨 혹은 아르곤에 노출된다. 몇몇 실시형태에서, 전처리는 바이오매스 공급원료를 증기 폭발로 전처리하는 단계를 포함할 수 다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은, 예컨대, 바이오매스의 개별적인 단편의 하나 이상의 치수를 감소시킴으로써, 예를 들어, 전단, 스톤 그라인딩(stone grinding), 기계적 째기(mechanical ripping) 혹은 찢기(tearing), 핀 그라인딩(pin grinding), 습식 혹은 건식 그라인딩, 공기 마찰 밀링(air attrition milling), 절단, 짜기, 압축 혹은 이들 가공처리방법의 어느 것의 조합에 의해 바이오매스를 기계적으로 처리하는 단계를 포함한다. 몇몇 경우에, 기계적 처리 후에, 상기 바이오매스는 5/1 이상의 평균 길이-대-직경비를 지니는 섬유를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 준비된 바이오매스의 BET 표면적은 0.25㎡/g 이상일 수 있다. 기계적으로 처리된 바이오매스는 약 0.5 g/㎤ 이하, 예컨대, 0.35 g/㎤ 이하의 벌크 밀도를 지닐 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법들의 어느 하나에 있어서, 방사선은 돔형 둥근 지붕을 지닌 저장소(vault) 내에 있는 장치로부터 인가될 수 있다.
달리 규정되어 있지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해할 수 있는 것과 동일한 의미를 지닌다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 혹은 등가인 방법 및 재료가 본 발명의 실시 혹은 테스트에 이용될 수 있지만, 적절한 방법과 재료는 후술한다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 공보 및 기타 문헌은 그들의 전문이 참조로 병합된다. 모순되는 경우에는, 정의를 비롯하여 본 명세서는 조절될 것이다. 또한, 재료, 방법 및 예들은 단지 예시적일 뿐 제한하기 위해 의도된 것은 아니다.
본 발명의 기타 특징 및 이점은 이하의 상세한 설명으로부터 또한 청구의 범위로부터 명백할 것이다.
바이오매스의 가공처리방법, 그리고 그로부터 얻어진 바이오매스 재료를 포함하는 혼합물 및 조성물이 제공된다.
도 1은 바이오매스의 처리 및 발효 과정에서 해당 처리된 바이오매스의 이용을 예시한 블록도;
도 2는 미생물과 상호작용하는 작용화된 바이오매스의 개략도;
도 3은 회전식 나이프 커터 상에서 전단된 크래프트 판지의 적외스펙트럼;
도 4는 100 M㎭의 감마 방사선으로 조사 후의 도 3의 크래프트 판지의 적외스펙트럼;
도 5a 내지 도 5i는 실시예 13에서의 샘플 P132, P132-10, P132-100, P-1e, P-5e, P-10e, P-30e, P-70e 및 P-100e의 1H-NMR 스펙트럼;
도 5j는 도 5a 내지 도 5i로부터의 ~16ppm에서의 교환가능한 양자(exchangeable proton)의 비교도;
도 5k는 샘플 P-10Oe의 13C-NMR;
도 5l 내지 도 5m은 10초의 지연 시간을 지닌 샘플 P-100e의 13C-NMR;
도 5n은 샘플 P-100e의 10% wt./wt.의 농도에서의 1H-NMR.
카복실산기, 에놀기, 알데하이드기, 케톤기, 나이트릴기, 나이트로기 혹은 나이트로소기 등과 같은 소망의 종류 및 작용기의 양을 지닌 작용화된 바이오매스 재료는 본 명세서에 기재된 방법을 이용해서 준비될 수 있다. 이러한 작용화된 재료는 예컨대 발효 과정 동안 저분자량 당의 생성물로의 전환을 용이하게 할 수 있다.
바이오매스의 종류
본 명세서에 기재된 방법에 이용하기 위한 바람직한 바이오매스 재료는, 예컨대, 효모 등과 같은 미생물을 이용해서 당을 전환시키는 데 이용될 제제 상에 있는 상보적인 유인성 작용기들인 작용기로 작용화될 수 있는 섬유를 포함한다.
섬유 공급원으로는, 종이 및 종이 제품(예컨대, 폴리코팅지 및 크래프트지)을 비롯한 셀룰로스 섬유 공급원, 그리고, 목재, 및 목재-관련 재료, 예컨대, 파티클 보드를 비롯한 리그노셀룰로스 섬유 공급원을 들 수 있다. 기타 적절한 섬유 공급원으로는 천연 섬유 공급원, 예컨대, 목초, 왕겨, 바가스, 황마, 대마, 아마, 대나무, 사이잘마, 마닐라삼, 짚, 지팽이풀, 자주개자리, 건초, 옥수수 속대, 옥수수 여물(corn stover), 코코넛 헤어; α-셀룰로스 함량이 높은 섬유 공급원, 예컨대, 면; 및 합성 섬유 공급원, 예컨대, 압출 얀(배향 얀 혹은 비배향 얀)을 들 수 있다. 천연 혹은 합성 섬유 공급원은 미가공 조각 직물 재료, 예컨대, 자투리로부터 얻어질 수 있거나, 또는 이들은 소비자 사용 후의 폐기물, 예컨대, 천 조각들(rags)일 수도 있다. 종이 제품이 섬유 공급원으로서 이용될 경우, 이들은 미가공 재료, 예컨대, 미가공 조각 재료일 수 있거나, 또는 이들은 소비자 사용후의 폐기물일 수 있다. 미가공 원재료 외에, 소비자 사용후 폐기물, 공업적 폐기물(예컨대, 폐물), 및 처리 폐기물(예컨대, 종이 처리로부터의 유출물)은 섬유 공급원으로서 이용될 수도 있다. 또한, 섬유 공급원은 인간(예컨대, 오수), 동물 혹은 식물 폐기물로부터 얻어지거나 유래될 수 있다. 추가적인 섬유 공급원은 미국 특허 제6,448,307호, 제6,258,876호, 제6,207,729호, 제5,973,035호 및 제5,952,105호에 기재되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 바이오매스 재료는 하나 이상의 β-1,4-결합을 지닌 동시에 약 3,000 내지 50,000의 수평균 분자량을 지닌 재료이거나 해당 재료를 포함하는 탄수화물을 포함한다. 이러한 탄수화물은 β(1,4)-글루코사이드 결합의 축합을 통하여 (β-글루코스 1)로부터 유래되는 셀룰로스(I)이거나 해당 셀룰로스로스를 포함한다. 이 결합은 그 자체가 전분 및 다른 탄수화물에 존재하는 α(1,4)-글루코사이드 결합에 대한 것과 대조를 이룬다.
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전분 재료는 전분 자체, 예컨대, 옥수수 전분, 밀 전분, 감자 전분 혹은 쌀 전분, 전분의 유도체, 혹은 식용 음식 산물 혹은 작물 등과 같은 전분을 포함하는 재료를 들 수 있다. 예를 들어, 전분 재료는 아라카차(arracacha), 메밀, 바나나, 보리, 카사바, 칡, 안데스괭이밥(oca), 사고(sago), 수수, 보통 가정의 감자, 고구마, 타로, 얌(yam), 또는 1종 이상의 콩, 예컨대, 잠두, 렌즈콩 혹은 완두 등일 수 있다. 임의의 2종 이상의 전분 재료의 배합물도 전분 재료이다
몇몇 경우에, 바이오매스는 미생물 재료이다. 미생물 공급원은, 이하에 열거하는 것들로 제한되지는 않지만, 탄수화물의 공급원(예컨대, 셀룰로스), 예를 들어, 원생생물, 예컨대, 동물 원생생물(예컨대, 편모충류, 아메바류, 섬모류 및 포자충류 등의 원생동물) 및 식물 원생생물(예컨대, 알베오레이트(alveolate), 클로라라크니오식물(chlorarachniophyte), 크립토모나드(cryptomonad), 유글레나류(euglenid), 회조류(glaucophyte), 착편모조(haptophyte), 홍조류(red algae), 부등편모조류(stramenopiles) 및 녹색식물(viridaeplantae) 등의 조류)을 제공하는 것이 가능하거나 이들을 함유하는 천연 유래 혹은 유전자 변형된 미생물 혹은 유기체의 어느 것이라도 들 수 있다. 다른 예로는 해초, 플랑크톤(예컨대, 매크로플랑크톤, 메조플랑크톤, 마이크로플랑크톤, 나노플랑크톤, 피코플랑크톤 및 펨토플랑크톤), 식물플랑크톤, 박테리아(예컨대, 그람 양성균, 그람 음성균 및 극한성 생물), 효모 및/또는 이들의 혼합물을 들 수 있다. 몇몇 경우에, 미생물 바이오매스는 천연 공급원, 예컨대, 해양, 호수, 수역, 예컨대, 염수 혹은 담수로부터, 혹은 육지 상에서 얻어질 수 있다. 대안적으로 혹은 부가적으로, 미생물 바이오매스는 배양 시스템, 예컨대, 대규모 건식 및 습식 배양 시스템으로부터 얻어질 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 바이오매스 재료의 배합물은 본 명세서에 기재된 중간생성물 혹은 생성물의 어느 것을 제조하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 셀룰로스 재료 및 전분 재료의 배합물이 본 명세서에 기재된 임의의 생성물을 제조하는데 이용될 수 있다.
바이오매스를 처리하고 발효에 있어서 처리된 바이오매스를 이용하는 시스템
도 1은 바이오매스, 특히 섬유질 바이오매스를 처리하고, 해당 처리된 바이오매스를 이용해서 발효 과정을 증대시키는 시스템(100)을 도시하고 있다. 시스템(100)은, 예컨대, 바이오매스 공급원료의 내부 섬유가 노출되는 등과 같이 해당 바이오매스 공급원료가 기계적으로 처리되는 모듈(102)을 포함한다. 기계적 처리의 예들은 이하에 상세히 설명될 것이다. 상기 시스템(100)은 또한 기계적으로 처리된 공급원료가 예컨대 방사선 조사에 의해 작용화되는 모듈(104)을 포함한다. 작용화 후, 해당 작용화된 섬유는 전달 모듈(108)에 의해 발효 시스템(106)으로 전달된다.
작용화된 섬유는 이어서 발효 동안 존재하여, 발효에 이용되는 미생물, 예컨대, 효모 세포와 상호작용할 수 있는 기질(substrate)을 제공함으로써 발효 과정을 향상시킨다. 이 상호작용은 도 2에 개략적으로 도시되어 있으며, 해당 도 2는 작용화된 극성 섬유(10) 및 상보적인 극성 작용기를 지니는 효모 세포(12)를 도시하고 있다. 상기 섬유 및 효모 세포의 극성으로 인해, 세포는 하나 이상의 섬유 상에 고정화될 수 있다. 이들 섬유들에의 효모 세포(혹은 기타 미생물)의 결합은 수소 결합에 의해, 혹은 공유결합 혹은 이온 결합에 의해 이루어질 수 있다. 몇몇 경우에, 섬유들 상에 있는 작용기는 미생물 상에 있는 것들과 작용하여 공유결합을 형성할 수 있다. (예컨대, 모듈(102)에서) 기계적 처리에 기인하는 바이오매스 재료의 증가된 표면적 및 다공도는 섬유와 미생물의 상호작용을 위한 보다 큰 표면적을 제공하며, 이에 따라 이 상호작용을 증대시킨다. 고정화된 세포는 더욱 생산적이어서, 발효 과정의 효율과 수율을 증가시키며 이 과정이 영구적으로 "고착"되는 것을 방지한다.
단, 혼합이 발효 동안 수행된다면, 해당 혼합은 미생물과 섬유 간의 상호작용의 혼란을 최소화하기 위하여 비교적 온화하게(낮은 전단으로) 한다. 몇몇 실시형태에서, 미국 특허 가출원 제61/218,832호 및 미국 특허 가출원 제61/179,995호에 기재된 바와 같은 제트 혼합이 이용되며, 이들 문헌의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
도 1을 참조하면, 발효는 조질의 에탄올 혼합물을 생성하며, 이는 유지 탱크(110)로 유입된다. 물 혹은 기타 용매, 그리고 다른 비에탄올 성분들이 스트립 탑(stripping column)(112)을 이용해서 상기 조질의 에탄올 혼합물로부터 분리되고, 이 에탄올은 이어서 증류 유닛(114), 예컨대, 정류기를 이용해서 증류된다. 마지막으로, 에탄올은 분자체(molecular sieve)(116)를 이용해서 건조될 수 있고, 필요한 경우 변성되어 소망의 출하 방법으로 출력된다.
몇몇 경우에, 본 명세서에 기재된 시스템 혹은 그의 구성요소들은 휴대용일 수 있으므로, 해당 시스템은 한 장소에서 다른 장소로 (예컨대, 철도, 트럭 혹은 해양 선박에 의해) 수송될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법의 단계(스텝)들은 하나 이상의 장소에서 수행될 수 있고, 몇몇 경우에, 하나 이상의 단계들이 수송 중에 수행될 수 있다. 이러한 이동식 가공처리는 미국 특허 출원 제12/374,549호 및 국제 특허 출원 공개 제WO 2008/011598호에 기재되어 있고, 이들 문헌의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 기재된 방법의 단계들의 어느 하나 혹은 모두는 주위 온도에서 수행될 수 있다. 필요한 경우, 냉각 및/또는 가열이 소정 단계들 동안 이용될 수 있다. 예를 들어, 공급원료는 기계적 처리 동안 냉각되어 그의 취성을 증가시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 냉각은 초기의 기계적 처리 및/또는 후속의 기계적 처리 전, 동안 혹은 후에 이용된다. 냉각은 미국 특허 출원 제12/502,629호에 기재된 바와 같이 수행될 수 있고, 이 문헌의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다. 또한, 발효 시스템(106) 내의 온도는 발효를 증대시키기 위하여 조절될 수 있다.
물리적 처리
물리적 처리 방법은 기계적 처리, 화학적 처리, 방사선 조사, 초음파 분해, 산화, 열분해 혹은 증기 폭발 등과 같이 본 발명에 기재된 것들의 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 처리방법은 이들 수법의 둘, 셋, 넷 혹은 심지어 모두의 조합으로 (임의의 순서로) 이용될 수 있다. 한가지보다 많은 처리 방법이 이용될 경우, 해당 방법은 동시에 혹은 다른 시기에 적용될 수 있다. 바이오매스 공급원료를 작용화시키고/시키거나 그의 형태를 변화시키는 다른 방법은 또한 단독으로 혹은 본 명세서에 기재된 방법들과 조합하여 이용될 수 있다.
기계적 처리
몇몇 경우에, 상기 방법은 바이오매스 공급원료를 기계적으로 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 기계적 처리는, 예를 들어, 절단, 밀링, 프레스, 분쇄(그라인딩), 전단 혹은 저미기 등을 포함한다. 밀링은 예를 들어 볼 밀링, 해머 밀링, 회전자/고정자 건식 혹은 습식 밀링, 또는 기타 유형의 밀링을 포함할 수 있다. 기타 기계적 처리는, 예컨대, 스톤 그라인딩, 크래킹(cracking), 기계적 째기 혹은 찢기, 핀 그라인딩 혹은 공기 마찰 밀링을 포함한다.
기계적 처리는, 셀룰로스 혹은 리그노셀룰로스 재료를 "개방"(opening up), "응력 부여"(stressing), 파괴 및 파쇄하여, 사슬 절단되고/되거나 결정화도 저감되기 더욱 쉬운 재료의 셀룰로스로 만드는 데 유리할 수 있다. 개방된 재료는 또한 조사될 경우 산화되기 더욱 쉬울 수 있다.
몇몇 경우에, 기계적 처리는, 입수된 바와 같은 공급원료의 초기 준비, 예를 들어, 절단, 분쇄, 전단, 분체화 또는 저미기 등에 의한 재료의 크기 축소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 경우에, 느슨한 공급원료(예컨대, 재생지, 전분 재료 혹은 지팽이풀)는 전단 혹은 세단(shredding)에 의해 준비된다.
대안적으로 혹은 부가적으로, 공급원료 재료는 우선 기타 물리적 처리방법들, 예컨대, 화학적 처리, 방사선 조사, 초음파 분해, 산화, 열분해 혹은 증기 폭발 중 한가지 이상에 의해 물리적으로 처리되고 나서, 기계적으로 처리될 수 있다. 이 수순은 상기 기타 처리의 하나 이상, 예컨대, 방사선 조사 혹은 열분해에 의해 처리된 재료가 더욱 부서지기 쉬운 경향이 있기 때문에 기계적 처리에 의해 재료의 분자 구조를 더욱 변화시키기는 것이 더욱 용이할 수 있으므로 유리하다.
몇몇 실시형태에서, 상기 바이오매스 재료는 섬유질이고, 기계적 처리는 섬유 재료 중의 섬유를 노출시키기 위한 전단을 포함한다. 전단은, 예를 들어, 회전식 나이프 커터에 의해 수행될 수 있다. 바이오매스를 기계적으로 처리하는 다른 방법으로는 예를 들어 밀링 혹은 분쇄를 포함한다. 밀링은, 예를 들어, 해머 밀, 볼 밀, 콜로이드 밀, 코니컬 혹은 콘 밀, 디스크 밀, 에지 밀(edge mill), 윌리 밀(Wiley mill) 혹은 그리스트 밀(grist mill)을 이용해서 수행될 수 있다. 분쇄는, 예를 들어, 스톤 그라인더, 핀 그라인더, 커피 그라인더 혹은 버 그라인더(burr grinder)를 이용해서 수행될 수 있다. 분쇄는, 예를 들어, 핀 밀의 경우에서처럼, 핀 혹은 기타 요소를 왕복이동시킴으로써 제공될 수 있다. 기타 기계적 처리 방법은 기계적 째기 혹은 찢기, 섬유에 압력을 가하는 다른 방법 및 공기 마찰 밀링을 포함한다. 적절한 기계적 처리는 바이오매스 재료의 분자 구조 혹은 형태를 변화시키는 임의의 기타 수법을 추가로 포함한다.
필요한 경우, 기계적으로 처리된 재료는 예컨대 평균 개구 크기가 1.59㎜(1/16 인치, 0.0625 인치) 이하인 스크린을 통과할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 전단, 혹은 기타 기계적 처리 및 체거름(스크리닝)은 동시에 수행된다. 예를 들어, 회전식 나이프 커터는, 바이오매스 재료를 동시에 전단하고 체거름하는데 이용될 수 있다. 바이오매스는 정지 블레이드와 회전 블레이드 사이에서 전단되어 전단된 재료를 제공하고, 이는 체를 통과하고 나서, 이어서 통 속으로 포획된다.
바이오매스 재료는 건조 상태(예컨대, 그 표면에 물이 거의 없거나 전혀 없는 것), 수화 상태(예컨대, 물을 10중량%까지 흡수함) 또는 젖은 상태, 예컨대, 물을 약 10중량% 내지 약 75중량% 지닌 상태에서 기계적으로 처리될 수 있다. 바이오매스 재료는 액체, 예컨대, 물, 에탄올 혹은 아이소프로판올 하에 부분적으로 혹은 완전히 침지된 상태에서 기계적으로 처리될 수도 있다. 바이오매스 재료는 또한 기체(공기 이외의 기체의 분위기 혹은 스트림 등), 예컨대, 산소 혹은 질소, 또는 증기 하에 기계적으로 처리될 수 있다.
기계적 처리 시스템은, 예를 들어, 표면적, 다공도, 벌크 밀도 등과 같은 특정 형태 특성, 그리고 섬유 공급원료의 경우에 길이-대-폭 비 등과 같은 섬유 특성을 지니는 스트림을 생산하도록 구성될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 기계적으로 처리된 재료의 BET 표면적은 0.1 ㎡/g 이상, 예컨대, 0.25 ㎡/g 이상, 0.5 ㎡/g 이상, 1.0 ㎡/g 이상, 1.5 ㎡/g 이상, 1.75 ㎡/g 이상, 5.0 ㎡/g 이상, 10 ㎡/g 이상, 25 ㎡/g 이상, 35 ㎡/g 이상, 50 ㎡/g 이상, 60 ㎡/g 이상, 75 ㎡/g 이상, 100 ㎡/g 이상, 150 ㎡/g 이상, 200 ㎡/g 이상 또는 심지어 250 ㎡/g 이상이다.
기계적으로 처리된 재료의 다공도는, 예컨대, 20% 이상, 25% 이상, 35% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 예컨대, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 97.5% 이상, 99% 이상 또는 심지어 99.5% 이상일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 기계적 처리 후, 상기 재료는 0.25 g/㎤ 이하, 예컨대, 0.20 g/㎤, 0.15 g/㎤, 0.10 g/㎤, 0.05 g/㎤ 이하, 또는, 예컨대, 0.025 g/㎤ 이하의 벌크 밀도를 지닌다. 벌크 밀도는 ASTM D1895B를 이용해서 결정된다. 요약하면, 이 방법은 공지의 체적의 계량 실린더를 샘플로 채우는 단계 및 해당 샘플의 중량을 구하는 단계를 포함한다. 벌크 밀도는 샘플의 중량(g)을 실린더의 공지의 체적(㎤)으로 나눔으로써 산출된다.
상기 바이오매스가 섬유 재료이면, 기계적으로 처리된 재료 중의 섬유는, 1회 이상 전단되더라도, 비교적 큰(예컨대, 20-대-1보다 큰) 평균 길이-대-직경비를 지닐 수 있다. 또, 본 명세서에 기재된 섬유 재료 중의 섬유는 비교적 좁은 길이 및/또는 길이-대-직경비 분포를 지닐 수도 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 평균 섬유 폭(즉, 직경)은 대략 5,000개의 섬유를 랜덤하게 선택함으로써 광학적으로 결정된 것이다. 평균 섬유 길이는 보정된 길이-가중치 부여된 길이이다. BET 표면적은 다점 표면적이고, 다공도는 수은 다공도측정법에 의해 결정된 것이다.
상기 바이오매스가 섬유 재료이면, 기계적으로 처리된 재료 중의 섬유의 평균 길이-대-직경비는, 예컨대, 8/1 이상, 예컨대, 10/1 이상, 15/1 이상, 20/1 이상, 25/1 이상 또는 50/1 이상일 수 있다. 기계적으로 처리된 재료의 평균 섬유 길이는, 예를 들어, 약 0.5㎜ 내지 2.5㎜, 예컨대, 약 0.75㎜ 내지 1.0㎜일 수 있고, 제2섬유 재료의 평균 폭(예를 들어, 직경)은 예컨대 약 5㎛ 내지 50㎛, 예컨대, 약 10㎛ 내지 30㎛일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 바이오매스가 섬유 재료이면, 기계적으로 처리된 재료의 섬유 길이의 표준 편차는 기계적으로 처리된 재료의 평균 섬유 길이의 60% 이하, 예컨대, 해당 평균 길이의 50% 이하, 평균 길이의 40% 이하, 평균 길이의 25% 이하, 평균 길이의 10% 이하, 평균 길이의 5% 이하, 또는 심지어 평균 길이의 1% 이하이다.
몇몇 상황에서, 낮은 벌크 밀도 재료를 준비하고, 해당 재료를 치밀화한 후(예컨대, 다른 부위로 더욱 쉽고 더욱 저렴하게 수송하게 하기 위하여), 해당 재료를 보다 낮은 벌크 밀도 상태로 역전시키는 것이 바람직할 수 있다. 치밀화된 재료는 본 명세서에 기재된 방법들의 어느 하나에 의해 가공처리될 수 있거나, 또는 본 명세서에 기재된 방법의 어느 하나에 의해 가공처리된 임의의 재료는 이어서, 예컨대, 미국 특허 출원 제12/429,045호 및 국제 출원 공개 제WO 2008/073186호에 개시된 바와 같이, 치밀화될 수 있고, 이들 문헌의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
방사선 처리
하나 이상의 방사선 처리 수순은 바이오매스를 처리하는데, 예컨대, 해당 재료를 작용화하는데 이용될 수 있다. 방사선은 또한 상기 재료 혹은 해당 재료를 바이오처리하는데 필요한 임의의 매질을 멸균화시킬 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 전자를 그의 원자 궤도로부터 방출시키는 재료 내에 축적된 에너지는 상기 재료를 조사하는데 이용된다. 방사선은 (1) 무거운 하전된 입자, 예컨대, 알파 입자 혹은 양자, (2) 예를 들어, 베타 붕괴 또는 전자빔 가속기에서 생성된 전자 또는 (3) 전자기 방사선, 예를 들어, 감마선, x선, 또는 자외선에 의해 제공될 수 있다. 하나의 접근법에 있어서, 방사성 물질에 의해 생성된 방사선은 공급원료를 조사하는데 이용될 수 있다. 다른 접근법에서, 전자기 방사선(예컨대, 전자빔 이미터를 이용해서 생산됨)은 공급원료를 조사하는데 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 (1) 내지 (3)의 임의의 조합이 임의의 순서로 혹은 동시에 이용될 수 있다. 인가되는 선량은 소망의 효과 및 특정 공급원료에 의존한다.
몇몇 경우에, 사슬 절단이 요망되고/되거나 폴리머 사슬 작용화가 요망될 때, 양자, 헬륨핵, 아르곤 이온, 규소 이온, 네온 이온, 탄소 이온, 인 이온, 산소 이온 혹은 질소 이온 등과 같은 전자보다 무거운 입자가 이용될 수 있다. 개환 사슬 절단이 요망될 경우, 양으로 하전된 입자가 증가된 개환 사슬 절단을 위해 그들의 루이스산 특성을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 최대 산화가 요망될 경우, 산소 이온이 이용될 수 있고, 최대 질화가 요망될 경우, 질소 이온이 이용될 수 있다. 무거운 입자 및 양으로 하전된 입자의 사용은 미국 출원 제12/417,699호에 기재되어 있고, 이 문헌의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
하나의 방법에서, 제1수평균 분자량(MN1)을 지니는 셀룰로스이거나 해당 셀룰로스를 포함하는 제1재료는 조사되어, 예컨대, 이온화 방사선(예컨대, 감마 방사선, X-선 방사선, 100 ㎚ 내지 280㎚ 자외(UV)광, 전자 빔 또는 기타 하전 입자의 형태)에 의한 처리에 의해, 제1수평균 분자량보다 낮은 제2수평균 분자량(MN2)을 지닌 셀룰로스를 포함하는 제2재료를 제공한다. 제2재료(또는 제1 및 제2재료)는 제2 및/또는 제1재료 또는 그의 구성요소인 당 혹은 리그닌을 이용할 수 있는 미생물(효소 처리되거나 되지 않은 것)과 배합되어, 본 명세서에 기재된 것들과 같은 중간생성물 혹은 생성물을 생성할 수 있다.
제2재료는 제1재료에 비해서 감소된 분자량 및 몇몇 경우에 있어서, 감소된 결정화도를 또한 지니는 셀룰로스를 포함하므로, 상기 제2재료는 일반적으로 미생물 및/또는 효소를 함유하는 용액 중에서 더욱 분산가능하고/하거나, 팽윤가능하고/하거나 가용성이다. 이들 특성은 제2재료를 용이하게 처리하여 제1재료에 비해서 화학적, 효소적 및/또는 생물학적 공격에 더욱 민감하게 만들고, 따라서, 원하는 생성물, 예컨대, 에탄올의 생산 속도 및/또는 생산 수준을 크게 향상시킬 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 제2수평균 분자량(MN2)은 제1수평균 분자량(MN1)보다 약 10% 이상, 예컨대, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60% 이상, 또는 심지어 약 75% 이상 낮다.
몇몇 경우에, 제2재료는 제1재료의 셀룰로스의 결정화도(C1)보다 낮은 결정화도(C2)를 지니는 셀룰로스를 지닌다. 예를 들어, (C2)는 (C1)보다 약 10% 이상, 예컨대, 15, 20, 25, 30, 35, 40% 이상, 또는 심지어 약 50% 이상 낮을 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 출발 결정화도(조사 전)는 약 40 내지 약 87.5%, 예컨대, 약 50 내지 약 75% 또는 약 60 내지 약 70%이고, 조사 후의 결정화도는 약 10 내지 약 50%, 예컨대, 약 15 내지 약 45% 또는 약 20 내지 약 40%이다. 그러나, 몇몇 실시형태에 있어서, 예컨대, 광대한 조사 후, 5% 이하의 결정화도를 가지는 것도 가능하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 조사 후의 재료는 실질적으로 비정질이다.
몇몇 실시형태에서, 출발 수평균 분자량(조사 전)은 약 200,000 내지 약 3,200,000, 예컨대, 약 250,000 내지 약 1,000,000 또는 약 250,000 내지 약 700,000이고, 조사 후의 수평균 분자량은 약 50,000 내지 약 200,000, 예컨대, 약 60,000 내지 약 150,000 또는 약 70,000 내지 약 125,000이다. 그러나, 몇몇 실시형태에 있어서, 예컨대, 광대한 조사 후, 약 10,000 이하 또는 심지어 약 5,000 이하의 수평균 분자량을 지니는 것도 가능하다.
몇몇 실시형태에서, 제2재료는 제1재료의 산화 레벨(O1)보다 높은 산화 레벨(O2)을 지닐 수 있다. 상기 재료의 보다 높은 산화 레벨은 그의 분산성, 팽윤성 및/또는 용해도에 도움을 줄 수 있고, 더욱, 화학적, 효소적 혹은 생물학적 공격에 대한 재료 감도를 증대시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제1재료에 비해서 제2재료의 산화 레벨을 증가시키기 위하여, 조사는 산화 환경 하, 예컨대, 공기 혹은 산소의 블랭킷 하에 수행하여, 제1재료보다 더욱 산화된 제2재료를 생성한다. 예를 들어, 제2재료는 더 많은 하이드록실기, 알데하이드기, 케톤기, 에스터기 또는 카복실산기를 지닐 수 있고, 이것은 그의 친수성을 증가시킬 수 있다.
이온화 방사선
방사선의 각 형태는 방사선의 에너지에 의해 결정된 바와 같이, 특정 상호작용을 통해 탄소-함유 재료를 이온화시킨다. 무거운 하전된 입자는 주로 쿨롱 산란을 통해 물질을 이온화시키고; 또한, 이들 상호작용은 더욱 물질을 이온화시킬 수 있는 에너지 전자를 생산한다. 알파 입자는 헬륨 원자의 핵과 동일하며, 이것은 각종 방사성 핵, 예컨대, 비스무트, 폴로늄, 아스타틴, 라돈, 프란슘, 라듐, 수개의 악티늄족 원소, 예컨대, 악티늄, 토륨, 우라늄, 넵투늄, 퀴륨, 칼리포르늄, 아메리슘 및 플루토늄 등의 동위 원소의 알파 붕괴에 의해 생성된다.
입자들이 이용될 경우, 이들은 중성(미하전), 양하전 혹은 음하전되어 있을 수 있다. 하전된 경우, 하전된 입자는 단일의 양하전 혹은 음하전 또는 다수의 전하, 예컨대, 1, 2, 3 혹은 심지어 4개 이상의 전하를 지닐 수 있다. 사슬 절단이 요망될 경우에, 양하전 입자가 그들의 산성 특성으로 인해 부분적으로 바람직할 수 있다. 입자들이 이용될 경우, 해당 입자들은 정지 전자(resting electron)의 질량 혹은 그 이상, 예컨대, 정지 전자의 500, 1000, 1500, 2000, 10,000 혹은 100,000배 이상의 질량을 지닐 수 있다. 예를 들어, 입자들은 약 1원자 단위(amu) 내지 약 150원자 단위, 예컨대, 약 1원자 단위 내지 약 50원자 단위 또는 약 1 내지 약 25, 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12 혹은 15 amu의 질량을 지닐 수 있다. 입자를 가속시키는데 이용되는 가속기는 정전 DC, 전기역학적 DC, RF 선형, 자기 유도 선형 혹은 연속 파일 수 있다. 예를 들어, 사이클로트론식 가속기로는 벨기에의 IBA로부터 로다트론(Rhodatron)(등록상표) 시스템 등이 입수가능한 한편, DC 방식 가속기로는 RDI(이제는 IBA 인더스트리얼사임)로부터 다이나미트론(Dynamitron)(등록상표) 등이 입수가능하다. 이온들 및 이온 가속기는 문헌들[Introductory Nuclear Physics, Kenneth S. Krane, John Wiley & Sons, Inc. (1988), Krsto Prelec, FIZIKA B 6 (1997) 4, 177-206, Chu, William T., "Overview of Light-Ion Beam Therapy" Columbus-Ohio, ICRU-IAEA Meeting, 18-20 March 2006, Iwata, Y. et al, "Alternating-Phase-Focused IH-DTL for Heavy-Ion Medical Accelerators" Proceedings of EPAC 2006, Edinburgh, Scotland 및 Leaner, CM. et al., "Status of the Superconducting ECR Ion Source Venus" Proceedings of EPAC 2000, Vienna, Austria]에 기재되어 있다.
감마 방사선은 각종 재료 속으로의 상당한 침투 깊이의 이득을 지닌다. 감마선의 공급원으로는 코발트, 칼슘, 테크네튬, 크롬, 갈륨, 인듐, 요오드, 철, 크립톤, 사마륨, 셀레늄, 나트륨, 탈륨 및 제온의 동위원소와 같은 방사능 핵을 들 수 있다.
x선의 공급원으로는 텅스텐 혹은 몰리브덴 혹은 합금 등의 금속 표적과의 전자빔 충돌, 또는 Lyncean에서 상업적으로 생산되는 것들과 같은 소형 광원을 들 수 있다.
자외 방사선의 공급원으로는 듀테륨 혹은 카드뮴 램프를 들 수 있다.
적외 방사선의 공급원으로는 사파이어, 아연 혹은 셀렌화물 창 세라믹 램프를 들 수 있다.
마이크로파의 공급원으로는 클라이스트론(klystron), 슬레빈형 RF 공급원(Slevin type RF source), 또는 수소, 산소 혹은 질소 가스를 이용하는 원자 빔 공급원을 들 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 전자빔은 방사선 공급원으로서 이용된다. 전자빔은 높은 선량률(예컨대, 1, 5 혹은 10M㎭/sec), 높은 처리량, 낮은 오염 및 낮은 제한 장비의 이점을 들 수 있다. 전자는 더욱 효율적으로 사슬 절단을 일으킬 수 있다. 또한, 4 내지 10MeV의 에너지를 지닌 전자는 5 내지 30㎜ 이상, 예컨대 40㎜의 침투 깊이를 지닐 수 있다.
전자빔은, 예컨대, 정전기 발생기, 캐스케이드 발생기, 트랜스포머 발생기, 주사 시스템을 구비한 저 에너지 가속기, 선형 캐소드를 구비한 저 에너지 가속기, 선형 가속기 및 펄스 가속기에 의해 발생될 수 있다. 이온화 방사선 공급원으로서의 전자는, 예컨대, 재료의 비교적 얇은 부분, 예컨대, 0.5 인치 이하, 예컨대, 0.4 인치, 0.3 인치, 0.2 인치 이하, 또는 0.1 인치 이하의 부분에 대해서 유용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 전자빔의 각 전자의 에너지는 약 0.3MeV(million electron volts) 내지 약 2.0MeV, 예컨대, 약 0.5MeV 내지 약 1.5MeV 또는 약 0.7MeV 내지 약 1.25MeV이다.
전자빔 조사장치는 벨기에의 루바인-라-누브에 소재한 이온빔 애플리케이션즈(Ion Beam Applications) 또는 캘리포니아주의 샌디에이고시에 소재한 더 티탄 코포레이션(the Titan Corporation)으로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 전형적인 전자 에너지는 1MeV, 2MeV, 4.5MeV, 7.5MeV 혹은 10MeV일 수 있다. 전형적인 전자빔 조사장치 전력은 1㎾, 5㎾, 10㎾, 20㎾, 50㎾, 100㎾, 250㎾ 혹은 500㎾일 수 있다. 공급원료의 탈중합 레벨은 인가된 선량과 이용된 전자 에너지에 의존하는 한편, 노광 시간은 전력과 선량에 의존한다. 전형적인 선량은 1kGy, 5kGy, 10kGy, 20kGy, 50kGy, 100kGy 혹은 200kGy의 값을 취할 수 있다.
이온 입자 빔
전자보다 무거운 입자는 본 명세서에 기재된 바이오매스 재료의 어느 하나를 조사하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 양자, 헬륨 핵, 아르곤 이온, 규소 이온, 네온 이온, 탄소 이온, 인 이온, 산소 이온 혹은 질소 이온이 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 전자보다 무거운 입자는 (보다 가벼운 입자에 비해서) 보다 많은 양의 사슬 절단을 유발할 수 있다. 몇몇 경우에, 양하전 입자는 그들의 산성도로 인해 음하전 입자보다 많은 양의 사슬 절단을 유발할 수 있다.
보다 무거운 입자 빔은 예컨대 선형 가속기 혹은 사이클로트론을 이용해서 발생될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 빔의 각 입자의 에너지는 약 1.0MeV/원자 단위 내지 약 6,000MeV/원자 단위, 예컨대, 약 3MeV/원자 단위 내지 약 4,800MeV/원자 단위 또는 약 10MeV/원자 단위 내지 약 1,000MeV/원자 단위이다.
소정의 실시형태에서, 탄소-함유 재료, 예컨대, 바이오매스 재료를 조사하는데 이용되는 이온 빔은 하나 이상의 유형의 이온을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이온 빔은 둘 이상(예컨대, 셋 혹은 넷 이상)의 상이한 유형의 이온의 혼합물을 포함할 수 있다. 예시적인 혼합물은 탄소 이온과 양자, 탄소 이온과 산소 이온, 질소 이온과 양자, 그리고 철 이온과 양자를 포함할 수 있다. 더욱 일반적으로, 전술한 이온(혹은 임의의 다른 이온)의 임의의 혼합물이 조사 이온 빔을 형성하는데 이용될 수 있다. 특히, 비교적 가벼운 이온과 비교적 무거운 이온의 혼합물이 단일 이온 빔에 이용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 재료를 조사하기 위한 이온 빔은 양하전 이온을 포함한다. 양하전 이온은, 예를 들어, 양하전 수소 이온(예컨대, 양자), 귀금속 가스 이온(예컨대, 헬륨, 네온, 아르곤), 탄소 이온, 질소 이온, 산소 이온, 규소 이온, 인 이온 및 금속 이온, 예컨대, 나트륨 이온, 칼슘 이온 및/또는 철 이온을 포함할 수 있다. 임의의 이론에 얽매이길 원치 않지만, 이러한 양하전 이온은 재료에 노출될 경우 루이스 산 부분으로서 화학적으로 거동하여, 산화 환경에서 양이온성 개환 사슬 절단 반응을 개시시키고 유지하는 것으로 여겨진다.
소정의 실시형태에서, 재료를 조사하기 위한 이온 빔은 음하전 이온을 포함한다. 음하전 이온은, 예를 들어, 음하전 수소 이온(예컨대, 하이드라이드 이온), 및 각종 비교적 음전기 핵(예컨대, 산소 이온, 질소 이온, 탄소 이온, 규소 이온 및 인 이온)의 음하전 이온을 포함할 수 있다. 임의의 이온에 얽매이길 원치 않지만, 이러한 음하전 이온은 상기 재료에 노출될 경우 루이스 염기 부분으로서 화학적으로 거동하여, 환원 환경에서 음이온성 개환 사슬 절단 반응을 유발하는 것으로 여겨진다.
몇몇 실시형태에서, 재료를 조사하기 위한 빔은 중성 원자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 수소 원자, 헬륨 원자, 탄소 원자, 질소 원자, 산소 원자, 네온 원자, 규소 원자, 인 원자, 아르곤 원자 및 철 원자의 임의의 1종 이상이 바이오매스 재료의 조사에 이용되는 빔에 포함될 수 있다. 일반적으로, 상기 유형의 원자의 임의의 2종 이상(예컨대, 3종 이상, 4종 이상 혹은 그 이상)의 혼합물이 빔에 존재할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 재료를 조사하는데 이용되는 이온 빔은 H+, H-, He+, Ne+, Ar+, C+, C-, O+, O-, N+, N-, Si+, Si-, P+, P-, Na+, Ca+ 및 Fe+의 하나 이상 등과 같은 단일 하전 이온을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 이온 빔은 C2+ , C3+, C4+, N3+, N5+, N3-, O2+, O2-, O2 2-, Si2 +, Si4 +, Si2 - 및 Si4 -의 하나 이상 등과 같은 다가 하전된 이온을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이온 빔은 또한 다가의 양 혹은 음 하전을 담지하는 더 많은 복합 다핵 이온을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 다핵 이온의 구조에 의해서, 양 혹은 음 하전이 이온의 실질적으로 전체 구조에 대해서 효율적으로 분배될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 양 혹은 음 하전은 이온의 구조의 부분에 대해서 다소 편재화되어 있을 수 있다.
전자기 방사선
전자기 방사선으로 조사가 수행되는 실시형태에 있어서, 해당 전자기 방사선은, 예를 들어, 102 eV 이상, 예컨대, 103, 104, 105, 106 이상 또는 심지어 107 eV 이상의 에너지/광자(전자 볼트: eV)를 지닐 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 전자기 방사선은 104 내지 107, 예컨대, 105 내지 106 eV의 에너지/광자를 지닌다. 전자기 방사선은, 예컨대, 1016 ㎐ 이상, 1017 ㎐ 이상, 1018, 1019, 1020 이상 또는 심지어 1021 ㎐ 이상의 주파수를 지닐 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 전자기 방사선은 1018 내지 1022 ㎐, 예컨대, 1019 내지 1021 ㎐의 주파수를 지닌다.
바이오매스의 퀀칭 (quenching) 및 제어된 작용화
이온화 방사선에 의한 처리 후, 본 명세서에 기재된 재료 혹은 혼합물의 어느 것이 이온화될 수 있고; 즉, 처리된 재료는 전자 스핀 공명 분광계에 의해 검출가능한 수준에서 라디칼을 포함할 수 있다. 이온화된 바이오매스가 대기 중에 남아 있다면, 카복실산기가 대기중 산소와 반응함으로써 발생되는 정도까지 등과 같이 산화될 것이다. 몇몇 재료를 지니는 몇몇 경우에, 이러한 산화는 탄수화물-함유 바이오매스의 분자량을 더욱 파괴시키는 것을 도울 수 있기 때문에 바람직하고, 산화기, 예컨대, 카복실산기는 몇몇 경우에 용해도 및 미생물 이용을 위해 도울 수 있다. 그러나, 라디칼은 조사 후 조정 시간 동안, 예컨대, 1일, 5일, 30일, 3개월, 6개월 이상 혹은 심지어 1년 이상 동안 "살아있을" 수 있으므로, 재료 특성은 시간 경과에 따라 계속 변할 수 있어, 이것은 몇몇 경우에는 바람직하지 않을 수 있다. 따라서, 이온화된 재료를 퀀칭하는 것이 바람직할 수도 있다.
이온화 후, 이온화된 임의의 바이오매스 재료는 이온화된 바이오매스 중의 라디칼의 레벨을 감소시키도록 퀀칭될 수 있으므로, 해당 라디칼은 전자 스핀 공명 분광계에 의해 더 이상 검출가능하지 않을 수 있다. 예를 들어, 라디칼은 바이오매스에 충분한 압력의 인가에 의해 및/또는 해당 라디칼과 반응(퀀칭)하는 기체 혹은 액체 등과 같은 이온화된 바이오매스와 접촉하여 유체를 이용함으로써 퀀칭될 수 있다. 라디칼의 퀀칭을 적어도 돕기 위하여 기체 혹은 액체를 이용하는 것은 이온화된 바이오매스를, 예컨대, 카복실산기, 에놀기, 알데하이드기, 나이트로기, 나이트릴기, 아미노기, 알킬아미노기, 알킬기, 클로로알킬기 혹은 클로로플루오로알킬기 등과 같은, 소망의 양 및 종류의 작용기에 의해 작용화하는데 이용될 수 있다.
몇몇 경우에, 이러한 퀀칭은 이온화된 바이오매스 재료의 일부의 안정성을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 퀀칭은 바이오매스의 산화에 대한 내성을 향상시킬 수 있다. 퀀칭에 의한 작용화는 또한 본 명세서에 기재된 임의의 바이오매스의 용해도를 향상시킬 수 있고, 그의 열 안정성을 향상시킬 수 있으며, 각종 미생물에 의한 재료 이용을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 퀀칭에 의해 바이오매스 재료에 부여된 작용기는, 예컨대, 미생물에 의한 부착용의 수용체 부위로서 작용하여, 각종 미생물에 의한 셀룰로스 가수분해를 증대시킬 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 퀀칭은 바이오매스를 기계적으로 변형시킴으로써, 예컨대, 바이오매스를 1, 2 혹은 3차원으로 직접 기계적으로 압착시키거나 바이오매스가 침지되어 있는 유체에 가압, 예컨대 등방성 가압하는 등 함으로써, 바이오매스에의 압력의 인가를 포함한다. 이러한 경우에, 재료 자체의 변형은 라디칼들을 가져오고, 이들은 종종 해당 라디칼들이 재결합하거나 다른 기와 반응할 수 있도록 충분히 밀착된 부근에서 결정 영역 내에 포획된다. 몇몇 경우에, 압력은 바이오매스의 온도를 리그닌, 셀룰로스 혹은 헤미셀룰로스 등의 바이오매스의 성분의 용융점 혹은 연화점 이상까지 승온시키도록 충분한 열량 등과 같은 열의 인가와 함께 인가된다. 열은 재료 중의 분자 이동도를 향상시킬 수 있어, 라디칼의 퀀칭을 도울 수 있다. 압력이 퀀칭하는데 이용될 경우, 해당 압력은 약 1000psi 이상, 예컨대, 약 1250psi, 1450psi, 3625psi, 5075psi, 7250psi, 10000psi 이상 또는 심지어 15000psi 이상일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 퀀칭은 유체, 예를 들어, 액체 혹은 기체, 예컨대, 라디칼과 반응할 수 있는 능력을 가진 기체, 예를 들어, 아세틸렌 혹은 질소 중의 아세틸렌의 혼합물, 에틸렌, 염소화 에틸렌 혹은 클로로플루오로에틸렌류, 프로필렌 또는 이들 기체의 혼합물 등과 바이오매스와의 접촉을 포함한다. 다른 특정 실시형태에서, 퀀칭은 바이오매스를 액체, 예컨대, 적어도 바이오매스 내로 침투할 수 있거나 바이오매스 내에 용해가능한 액체와 접촉시키는 단계 및 1,5-사이클로옥타다이엔 등과 같은 다이엔류 등과 같은 라디칼과 반응시키는 단계를 포함한다. 몇몇 특정 실시형태에서, 퀀칭은 바이오매스를 비타민 E 등과 같은 산화방지제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 필요할 경우, 바이오매스 공급원료는 그 안에 분산된 산화방지제를 포함할 수 있고, 퀀칭은 바이오매스 공급원료 내에 분산된 산화방지제를 라디칼과 접촉시킬 수 있다.
작용화는 본 명세서에 기재된 무거운 이온의 어느 것과 같은 무거운 하전된 이온을 이용함으로써 증대될 수 있다. 예를 들어, 산화를 증대시키는 것이 요망된다면, 하전된 산소 이온은 조사를 위해 이용될 수 있다. 질소 작용기가 요망된다면, 질소를 포함하는 질소 이온 혹은 음이온이 이용될 수 있다. 마찬가지로, 황 혹은 인기가 요망된다면, 황 혹은 인기가 조사에 이용될 수 있다.
선량
몇몇 경우에, 조사는 약 0.25M㎭/초 이상, 예컨대, 약 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0M㎭/초 이상, 또는 심지어 약 2.5M㎭/초 이상의 선량률에서 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 조사는 5.0 내지 1500.0kilo㎭/시간, 예컨대, 10.0 내지 750.0kilo㎭/시간 또는 50.0 내지 350.0kilo㎭/시간의 선량률에서 수행된다.
몇몇 실시형태에서, 조사(임의의 방사선 공급원 혹은 이들 공급원의 조합을 이용한) 조사는 재료가 적어도 0.1 M㎭, 적어도 0.25 M㎭, 예컨대, 적어도 1.0 M㎭, 적어도 2.5 M㎭, 적어도 5.0 M㎭, 적어도 10.0 M㎭, 적어도 60 M㎭ 또는 적어도 100 M㎭의 선량을 받을 때까지 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 조사는 약 0.1 M㎭ 내지 약 500 M㎭, 약 0.5 M㎭ 내지 약 200 M㎭, 약 1 M㎭ 내지 약 100 M㎭ 또는 약 5 M㎭ 내지 약 60 M㎭의 선량을 받을 때까지 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 비교적 낮은 선량, 예컨대, 60 M㎭ 미만의 방사선이 인가된다.
초음파 분해
초음파 분해는 재료, 예컨대, 본 명세서에 기재된 재료의 임의의 하나 이상, 예컨대, 1종 이상의 탄수화물 공급원, 예컨대, 셀룰로스 혹은 리그노셀룰로스 재료 혹은 전분 재료의 분자량 및/또는 결정화도를 저감시킬 수 있다. 초음파 분해는 또한 재료를 멸균시키는데 이용될 수 있다.
하나의 방법에 있어서, 제1수평균 분자량(MN1)을 지니는 셀룰로스를 포함하는 제1재료는 물 등의 매질에 분산되어, 초음파 분해되고/되거나 그렇치 않으면 공동화되어, 제1수평균 분자량보다 낮은 제2수평균 분자량(MN2)을 지닌 셀룰로스를 포함하는 제2재료를 제공한다. 제2재료(또는 어떤 실시형태에서는 제1 및 제2재료)는 제2 및/또는 제1재료를 이용할 수 있는 미생물(예컨대, 효소 처리와 함께 혹은 효소처리 없이)과 배합되어, 중간생성물 혹은 생성물을 생산할 수 있다.
제2재료는 제1재료에 비해서 감소된 분자량 및 몇몇 경우에 있어서는 감소된 결정화도도 지니는 셀룰로스를 지니므로, 상기 제2재료는 일반적으로 미생물을 함유하는 용액 중에서 더욱 분산가능하고/하거나, 팽윤가능하고/하거나 가용성이다.
몇몇 실시형태에서, 상기 제2수평균 분자량(MN2)은 제1수평균 분자량(MN1)보다 약 10% 이상, 예컨대, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60% 이상, 또는 심지어 약 75% 이상만큼 낮다.
몇몇 경우에, 제2재료는 제1재료의 셀룰로스의 결정화도(C1)보다 낮은 결정화도(C2)를 지니는 셀룰로스를 지닌다. 예를 들어, (C2)는 (C1)보다 약 10% 이상, 예컨대, 15, 20, 25, 30, 35, 40% 이상 또는 심지어 약 50% 이상만큼 낮을 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 출발 결정화도(초음파 분해 전)는 약 40 내지 약 87.5%, 예컨대, 약 50 내지 약 75% 또는 약 60 내지 약 70%이고, 초음파 분해 후의 결정화도는 약 10 내지 약 50%, 예컨대, 약 15 내지 약 45% 또는 약 20 내지 약 40%이다. 그러나, 소정의 실시형태에 있어서, 예컨대, 광대한 초음파 분해 후, 5% 이하의 결정화도를 지니는 것이 가능하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 초음파 분해 후의 재료는 실질적으로 비정질이다.
몇몇 실시형태에서, 출발 수평균 분자량(초음파 분해 전)은 약 200,000 내지 약 3,200,000, 예컨대, 약 250,000 내지 약 1,000,000 또는 약 250,000 내지 약 700,000이고, 초음파 분해 후의 수평균 분자량은 약 50,000 내지 약 200,000, 예컨대, 약 60,000 내지 약 150,000 또는 약 70,000 내지 약 125,000이다. 그러나, 몇몇 실시형태에 있어서, 예컨대, 광대한 초음파 분해 후, 약 10,000 이하 또는 심지어 약 5,000 이하의 수평균 분자량을 지니는 것이 가능하다.
몇몇 실시형태에서, 제2재료는 제1재료의 산화 레벨(O1)보다 높은 산화 레벨(O2)을 지닐 수 있다. 상기 재료의 보다 높은 산화 레벨은 그의 분산성, 팽윤성 및/또는 용해도에 도움을 줄 수 있고, 또한, 이것은 화학적, 효소적 혹은 미생물 공격에 대한 재료 감도를 더욱 증대시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 제1재료에 비해서 제2재료의 산화 레벨을 증가시키기 위하여, 초음파 분해는 산화 매질 중에서 수행되어, 제1재료보다 더욱 산화된 제2재료를 생산한다. 예를 들어, 제2재료는 더욱 하이드록실기, 알데하이드기, 케톤기, 에스터기 또는 카복실산기를 지닐 수 있어, 그의 친수성을 증가시킬 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 초음파 분해 매질은 수성 매질이다. 필요한 경우, 해당 매질은 과산화물(예컨대, 과산화수소), 분산제 및/또는 완충제 등의 산화제를 포함할 수 있다. 분산제의 예로는, 예컨대, 라우릴황산 나트륨 등의 분산제, 및 예컨대, 폴리(에틸렌 글라이콜) 등의 비이온성 분산제를 들 수 있다.
다른 실시형태에서, 초음파 분해 매질은 비수계이다. 예를 들어, 초음파 분해는, 예컨대, 톨루엔 혹은 헵탄 등의 탄화수소, 예컨대, 다이에틸에터 혹은 테트라하이드로퓨란 등의 에터, 또는 심지어, 아르곤, 제논 혹은 질소 등의 액화 가스 내에서 수행될 수 있다.
열분해
하나 이상의 열분해 처리 수순은 바이오매스 재료를 물리적으로 처리하는데 이용될 수 있다. 열분해는 또한 해당 재료를 멸균화하는데 이용될 수 있다.
일례에서, 제1수평균 분자량(MN1)을 지니는 셀룰로스를 포함하는 제1재료는, 예컨대, 관형상 로 내에서(산소의 존재 혹은 부재 하에) 제1재료를 가열함으로써 열분해되어, 제1수평균 분자량보다 낮은 제2수평균 분자량(MN2)을 지닌 셀룰로스를 포함하는 제2재료를 제공한다.
제2재료는 제1재료에 비해서 감소된 분자량 및 몇몇 경우에 있어서는, 감소된 결정화도도 지니는 셀룰로스를 지니므로, 상기 제2재료는 일반적으로 예컨대, 미생물을 함유하는 용액 중에서 더욱 분산가능하고/하거나, 팽윤가능하고/하거나 가용성이다.
몇몇 실시형태에서, 상기 제2수평균 분자량(MN2)은 제1수평균 분자량(MN1)보다 약 10% 이상, 예컨대, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60% 이상, 또는 심지어 약 75% 이상 낮다.
몇몇 경우에, 제2재료는 제1재료의 셀룰로스의 결정화도(C1)보다 낮은 결정화도(C2)를 지니는 셀룰로스를 지닌다. 예를 들어, (C2)는 (C1)보다 약 10% 이상, 예컨대, 15, 20, 25, 30, 35, 40% 이상 또는 심지어 약 50% 이상만큼 낮을 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 출발 결정화도(열분해 전)는 약 40 내지 약 87.5%, 예컨대, 약 50 내지 약 75% 또는 약 60 내지 약 70%이고, 열분해 후의 결정화도는 약 10 내지 약 50%, 예컨대, 약 15 내지 약 45% 또는 약 20 내지 약 40%이다. 그러나, 소정의 실시형태에 있어서, 예컨대, 광대한 열분해 후, 5% 이하의 결정화도를 지니는 것도 가능하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 열분해 후의 재료는 실질적으로 비정질이다.
몇몇 실시형태에서, 출발 수평균 분자량(열분해 전)은 약 200,000 내지 약 3,200,000, 예컨대, 약 250,000 내지 약 1,000,000 또는 약 250,000 내지 약 700,000이고, 열분해 후의 수평균 분자량은 약 50,000 내지 약 200,000, 예컨대, 약 60,000 내지 약 150,000 또는 약 70,000 내지 약 125,000이다. 그러나, 몇몇 실시형태에 있어서, 예컨대, 광대한 열분해 후, 약 10,000 이하, 또는 심지어 약 5,000 이하의 수평균 분자량을 지니는 것도 가능하다.
몇몇 실시형태에서, 제2재료는 제1재료의 산화 레벨(O1)보다 높은 산화 레벨(O2)을 지닐 수 있다. 상기 재료의 보다 높은 산화 레벨은 분산성, 팽윤성 및/또는 용해도에 도움을 줄 수 있고, 또한 화학적, 효소적 또는 미생물 공격에 대한 재료 감도를 증대시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제1재료에 비해서 제2재료의 산화 레벨을 증가시키기 위하여, 열분해는 산화 환경 중에서 수행되어, 제1재료보다 더욱 산화된 제2재료를 생산한다. 예를 들어, 제2재료는 제1재료보다 더 많은 하이드록실기, 알데하이드기, 케톤기, 에스터기 또는 카복실산기를 지닐 수 있어, 해당 재료의 친수성을 증가시킬 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 재료의 열분해는 연속적이다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 재료는 미리 정해진 시간 동안 열분해되고, 이어서, 재차 열분해되기 전에 제2의 미리 정해진 시간 동안 냉각될 수 있다.
산화
하나 이상의 산화 처리 수순은 바이오매스 재료를 물리적으로 처리하는데 이용될 수 있다. 산화 조건은, 예컨대, 공급원료의 리그닌 함량에 따라, 변할 수 있고, 보다 높은 산화도는 일반적으로 보다 높은 리그닌 함량의 공급원료에 대해서 바람직하다.
하나의 방법에서, 제1수평균 분자량(MN1)을 지니는 동시에 제1산소함량(O1)을 지니는 셀룰로스를 포함하는 제1재료는, 예컨대, 공기 혹은 산소-풍부 공기의 스트림 중에서, 관형상 로 내에서 제1재료를 가열함으로써 산화되어, 제2수평균 분자량(MN2)을 지니는 동시에 제1산소함량(O1)보다 높은 제2산소함량(O2)을 지니는 셀룰로스를 포함하는 제2재료를 제공한다.
제2재료의 제2수평균 분자량은 일반적으로 제1재료의 제1수평균 분자량보다 낮다. 예를 들어, 상기 분자량은 다른 물리적 처리에 대해서 위에서 설명된 바와 같은 정도로 감소될 수 있다. 제2재료의 결정화도는 또한 다른 물리적 처리에 대해서 위에서 설명된 바와 같은 정도로 감소될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 제2산소함량은 제1산소함량보다 적어도 약 5% 높으며, 예컨대, 7.5% 이상, 10.0% 이상, 12.5% 이상, 15.0% 이상 또는 17.5% 이상 높다. 몇몇 바람직한 실시형태에 있어서, 제2산소함량은 제1재료의 산소함량보다 적어도 약 20.0% 높다. 산소 함량은 1300℃ 이상에서 작동하는 노(furnace) 내에서 샘플을 열분해시킴으로써 원소 분석에 의해 측정된다. 적절한 원소 분석기는 VTF-900 고온 열분해로를 구비한 LECO CHNS-932 분석기이다.
일반적으로, 재료의 산화는 산화 환경에서 일어난다. 예를 들어, 산화는 공기 혹은 아르곤 풍부 공기 등과 같은 산화 환경에서 열분해에 의해 영향받거나 도움받을 수 있다. 산화를 돕기 위하여, 각종 화학약품, 예컨대 산화제, 산 혹은 염기가 산화 전 혹은 동안 재료에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 산화 전에 과산화물(예컨대, 과산화벤조일)이 첨가될 수 있다.
바이오매스 공급원료의 난분해성(recalcitrance)을 저감시키는 몇몇 산화적 방법은 펜톤형 화학(Fenton-type chemistry)을 이용한다. 이러한 방법은, 예를 들어, 미국 특허 출원 제12/639,289호에 개시되어 있고, 그의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
예시적인 산화제로는 과산화수소 및 과산화벤조일 등의 과산화물, 과황산암모늄 등의 과황산염, 오존 등의 산소의 활성화 형태, 과망간산 칼륨 등의 과망간산염, 과염소산나트륨 등의 과염소산염 및 차아염소산나트륨(가정용 표백제) 등의 차아염소산염 등을 들 수 있다.
몇몇 상황에서, pH는 접촉 동안 약 5.5에서 혹은 그 이하에서, 예컨대, 1 내지 5, 2 내지 5, 2.5 내지 5 또는 약 3 내지 5에서 유지된다.
산화 조건은 또한 2 내지 12시간, 예컨대, 4 내지 10시간 혹은 5 내지 8시간의 접촉 기간을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 온도는 300℃를 초과하지 않도록, 예컨대, 온도가 250, 200, 150, 100 혹은 50℃ 이하에서 유지된다. 몇몇 경우에, 온도는 실질적으로 분위기, 예를 들어, 약 20 내지 25℃에서 유지된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 1종 이상의 산화제는, 전자 등과 같은 입자의 빔으로 공기를 통해서 재료를 조사함으로써 인-시투(in-situ)로 오존을 발생시키는 등에 의해, 가스로서 적용된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 혼합물은 전자 이동 반응을 도울 수 있는, 1종 이상의 하이드로퀴논, 예컨대, 2,5-다이메톡시하이드로퀴논(DMHQ) 및/또는 1종 이상의 벤조퀴논, 예컨대 2,5-다이메톡시-1,4-벤조퀴논(DMBQ)을 추가로 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 1종 이상의 산화제는, 인-시투로 전기화학적으로 발생된다. 예를 들어, 과산화수소 및/또는 오존은 접촉 혹은 반응 용기 내에서 전기화학적으로 생성될 수 있다.
작용화하는 다른 처리방법
이 단락의 방법의 어느 것이라도 본 명세서에 기재된 방법들의 어느 것 없이 단독으로 혹은 본 명세서에 기재된 방법들, 즉, 증기 폭발, 화학적 처리(예컨대, 산처리(황산, 염화수소산 등의 무기산, 트라이플루오로아세트산 등의 유기산에 의한 농축 및 희석 산처리를 포함함) 및/또는 염기 처리(예컨대, 석회 혹은 수산화나트륨에 의한 처리)), UV 처리, 스크류 압출 처리(예컨대, 미국 특허 출원 제61/115,398호(출원일: 2008년 11월 17일) 참조), 용매 처리(예컨대, 이온성 액체에 의한 처리) 및 동결 분쇄(예컨대, 미국 특허 출원 제12/502,629호 참조)의 조합으로 (임의의 수순으로) 이용될 수 있다.
발효
미생물은 작용화된 바이오매스 재료의 존재 하에 저분자량 당을 발효시킴으로써 본 명세서에 기재된 것들과 같은 다수의 유용한 중간생성물 및 생성물을 생산할 수 있다. 예를 들어, 발효 혹은 기타 바이오처리는 알코올, 유기산, 탄화수소, 수소, 단백질 또는 이들 재료 중의 임의의 혼합물을 생산할 수 있다.
미생물은 천연 미생물 혹은 공학적으로 조작된 미생물일 수 있다. 예를 들어, 미생물은 박테리아, 예컨대, 셀룰로스 분해 박테리아, 균류, 예컨대, 효모, 식물 또는 원생생물, 예컨대, 조류, 원충 또는 균류-유사 원생생물, 예컨대, 점균류일 수 있다. 유기체가 거부반응을 일으키지 않을 경우, 유기체의 혼합물이 이용될 수 있다.
적절한 발효 미생물은 예컨대 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 만노스, 갈락토스, 올리고당 혹은 다당류 등의 탄수화물을 발효 생성물로 전환시키는 능력을 지닌다. 발효 미생물로는 사카로마이세스종(Saccharomyces spp)의 속(genus)의 균류, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시아(빵 효모), 사카로마이세스 디스타티쿠스(Saccharomyces distaticus), 사카로마이세스 우바룸(Saccharomyces uvarum); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)속, 예컨대, 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)종, 클루이베로마이세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis)종; 칸디다(Candida)속, 예컨대, 칸디다 슈도트로피칼리스(Candida pseudotropicalis) 및 칸디다 브라시카에(Candida brassicae), 피키아 스티피티스(칸디다 쉐하타에(Candida shehatae)와 관련됨); 클라비스포라(Clavispora)속, 예컨대, 클라비스포라 루시타니에(Clavispora lusitaniae)종 및 클라비스포라 오푼티에(Clavispora opuntiae)종; 파키솔렌(Pachysolen)속, 예컨대, 파키솔렌 탄노필루스(Pachysolen tannophilus)종; 브레탄노마이세스(Bretannomyces)속, 예컨대, 브레탄노마이세스 클라우세니이(Bretannomyces clausenii)종(Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C.E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212)을 들 수 있다.
시판의 효모로는, 예를 들어, Red Star(등록상표)/Lesaffre Ethanol Red(미국 Red Star/Lesaffre사로부터 입수가능), FALI(등록상표)(미국 Burns Philip Food Inc.의 분사인 Fleischmann's Yeast사로부터 입수가능), SUPERSTART(등록상표)(Alltech사로부터 입수가능), GERT STRAND(등록상표)(스웨덴의 Gert Strand AB사로부터 입수가능) 및 FERMOL(등록상표)(DSM Specialties사로부터 입수가능)을 들 수 있다.
예컨대, 지모모나스 모빌리스 및 클로스트리듐 써모셀륨(Clostridium thermocellum)(Philippidis, 1996, 전술함) 등의 박테리아가 또한 발효에 이용될 수 있다.
효모의 최적 pH는 약 pH 4 내지 5인 반면, 지모모나스 박테리아의 최적 pH는 약 pH 5 내지 6이다. 전형적인 발효 시간은 26℃ 내지 40℃의 범위 내의 온도에서 약 24 내지 96시간이지만, 호열성 미생물은 보다 고온인 것이 바람직하다.
몇몇 실시형태에서, 발효 과정의 전부 혹은 일부는 저분자량 당이 에탄올로 완전히 전환되기 전에 중단될 수 있다. 중간생성물인 발효 생성물은 높은 농도의 당과 탄수화물을 포함한다. 이들 중간생성물인 발효 생성물은 인간 혹은 동물 소비를 위해 식품의 제조에 이용될 수 있다. 부가적으로 혹은 대안적으로, 중간생성물인 발효 생성물은 스테인레스강제 실험실 밀에서 미립자 크기로 분쇄되어 밀가루 형태 물질을 생성할 수 있다.
미국 특허 가출원 제60/832,735호(이제는 국제특허출원 공개 제WO 2008/011598호로 공개됨)에 기재된 바와 같은 이동식 발효기가 이용될 수 있다.
후가공처리
증류
발효 후, 얻어진 유체는, 예를 들어, "비어 칼럼"(beer column)을 이용해서 증류되어 대부분의 물과 잔류 고체로부터 에탄올과 기타 알코올을 분리할 수 있다. 비어 칼럼을 나온 증기는 35중량% 에탄올일 수 있고 정류 칼럼으로 공급될 수 있다. 정류 칼럼으로부터 거의 공비(azeotropic)(92.5%) 에탄올과 물의 혼합물은 기상 분자체를 이용해서 순수한(99.5%) 에탄올로 정제될 수 있다. 비어 칼럼 바닥부분은 3-작용 증발기의 제1작용부에 보내질 수 있다. 정류 칼럼 환류 응축기는 이 제1작용부를 위해 열을 제공할 수 있다. 제1작용 후, 고체는 원심기를 이용해서 분리되고 회전 건조기에서 건조될 수 있다. 원심기 유출물의 부분(25%)은 발효로 재순환될 수 있고, 나머지는 제2 및 제3증발기 작용부로 보낼 수 있다. 대부분의 증발기 응축물은 적은 부분이 폐수 처리로 분리되어 낮은 비등 화합물의 구축을 방지하면서 상당히 깨끗한 응축물로서 상기 처리로 되돌아갈 수 있다.
중간생성물 및 생성물
본 명세서에 기재된 방법은 에너지, 연료, 식품 및 재료 등과 같은 하나 이상의 중간생성물 혹은 생성물을 생산하는데 이용될 수 있다. 생성물의 구체적인 예로는, 수소, 알코올(예컨대, 1가 알코올 혹은 2가 알코올, 예를 들어, 에탄올, n-프로판올 혹은 n-뷰탄올), 예컨대, 10%, 20%, 30% 이상 혹은 심지어 40% 이상의 물을 함유하는, 수화된 혹은 함수 알코올, 자일리톨, 당, 바이오디젤, 유기산(예컨대, 아세트산 및/또는 락트산), 탄화수소, 부산물(예컨대, 셀룰로스 분해 단백질(효소) 혹은 단세포 단백질 등과 같은 단백질) 및 임의의 조합 혹은 상대적인 농도에서의 이들의 임의의 혼합물, 그리고 임의선택적으로 임의의 첨가제, 예컨대, 연료 첨가제를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 기타 예로는 아세트산 혹은 뷰티르산 등의 카복실산, 카복실산의 염, 카복실산과 카복실산의 염과 카복실산의 에스터(예컨대, 메틸, 에틸 및 n-프로필 에스터)의 혼합물, 케톤류(예컨대, 아세톤), 알데하이드류(예컨대, 아세트알데하이드), 알파, 베타 불포화 산, 예컨대, 아크릴산 및 올레핀, 예컨대, 에틸렌 등을 들 수 있다. 기타 알코올 및 알코올 유도체로는 프로판올, 프로필렌 글라이콜, 1,4-뷰탄다이올, 1,3-프로판다이올, 이들 알코올의 임의의 메틸 혹은 에틸 에스터를 들 수 있다. 기타 생성물로는 메틸아크릴레이트, 메틸메타크릴레이트, 락트산, 프로피온산, 뷰티르산, 숙신산, 3-하이드록시프로피온산, 이들 산의 임의의 염 및 이들 산의 임의의 것과 각각의 염과의 혼합물을 들 수 있다.
식품 및 약제학적 생성물을 비롯한 기타 중간생성물 및 생성물은 미국 특허 출원 제12/417,900호에 기재되어 있으며, 해당 문헌의 전체 개시 내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
실시예
이하의 실시예는 예시하기 위해 의도된 것일 뿐, 본 발명의 개시 내용을 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예 1 - 폴리코팅지로부터의 섬유 재료의 준비
벌크 밀도가 20 lb/ft3인 미인쇄된 폴리코팅 백색 크래프트 판지로 이루어진 미가공 1/2갤론 쥬스 카턴의 1500파운드 스키드를 인터내셔널 페이퍼사(International Paper)로부터 얻었다. 각 카턴은 평탄하게 접은 후, 대략 15 내지 20 파운드/시간의 속도로 3 hp Flinch Baugh 세단기에 공급하였다. 상기 세단기는 2개의 12 인치 회전 블레이드, 2개의 고정 블레이드 및 0.30 인치 배출 스크린을 장비하고 있었다. 회전 블레이드와 고정 블레이드 사이의 간극은 0.10 인치로 조정하였다. 세단기로부터의 출력은, 폭이 0.1 인치 내지 0.5 인치, 길이가 0.25 인치 내지 1 인치 그리고 두께가 출발 재료(약 0.075 인치)의 두께와 거의 동등한 컨페티와 유사하였다.
컨페티-유사 재료는 문손(Munson) 회전식 나이프 커터인 모델 SC30에 공급되었다. 모델 SC30은 4개의 회전 블레이드, 4개의 고정 블레이드 및 1/8인치 개구를 지닌 배출 스크린을 장비하고 있었다. 회전 블레이드와 고정 블레이드 사이의 간극은 대략 0.020 인치로 설정되었다. 회전식 나이프 커터는 컨페티-유사 조각을 나이프-에지를 가로질러 전단하고 해당 조각들을 찢어서 약 1 파운드/시간의 속도로 섬유 재료를 방출하였다. 얻어진 섬유 재료는 BET 표면적이 0.9748 ㎡/g +/- 0.0167 ㎡/g, 다공도가 89.0437%, 벌크 밀도(@0.53 psia)가 0.1260 g/㎖였다. 섬유의 평균 길이는 1.141㎜였고, 섬유의 평균 폭은 0.027㎜였으므로, 42:1의 평균 L/D를 부여하였다.
실시예 2 - 탈색된 크래프트 판지로부터의 섬유 재료의 준비
벌크 밀도가 30 lb/ft3인 미가공된 탈색된 백색 크래프트 판지의 1500파운드 스키드를 인터내셔널 페이퍼사로부터 얻었다. 상기 재료는 평탄하게 접은 후, 대략 15 내지 20 파운드/시간의 속도로 3 hp Flinch Baugh 세단기에 공급하였다. 상기 세단기는 2개의 12 인치 회전 블레이드, 2개의 고정 블레이드 및 0.30 인치 배출 스크린을 장비하고 있었다. 회전 블레이드와 고정 블레이드 사이의 간극은 0.10 인치로 조정하였다. 세단기로부터의 출력은 폭이 0.1 인치 내지 0.5 인치, 길이가 0.25 인치 내지 1 인치 그리고 두께가 출발 재료(약 0.075 인치)의 두께와 거의 동등한 컨페티와 유사하였다. 컨페티-유사 재료는 문손 회전식 나이프 커터, 모델 SC30에 공급되었다. 배출 스크린은 1/8인치 개구를 지녔다. 회전 블레이드와 고정 블레이드 사이의 간극은 대략 0.020 인치로 설정되었다. 회전식 나이프 커터는 컨페티-유사 조각을 전단하고 약 1 파운드/시간의 속도로 섬유 재료를 방출하였다. 얻어진 섬유 재료는 BET 표면적이 1.1316 ㎡/g +/- 0.0103 ㎡/g, 다공도가 88.3285%, 벌크 밀도(@0.53 psia)가 0.1497 g/㎖였다. 섬유의 평균 길이는 1.063㎜였고, 섬유의 평균 폭은 0.0245㎜였으므로, 43:1의 평균 L/D를 부여하였다.
실시예 3 - 탈색된 크래프트 판지로부터 2회 전단된 섬유 재료의 준비
벌크 밀도가 30 lb/ft3인 미가공된 탈색된 백색 크래프트 판지의 1500파운드 스키드를 인터내셔널 페이퍼사로부터 얻었다. 상기 재료는 평탄하게 접은 후, 대략 15 내지 20 파운드/시간의 속도로 3 hp Flinch Baugh 세단기에 공급하였다. 상기 세단기는 2개의 12 인치 회전 블레이드, 2개의 고정 블레이드 및 0.30 인치 배출 스크린을 장비하고 있었다. 회전 블레이드와 고정 블레이드 사이의 간극은 0.10 인치로 조정하였다. 세단기로부터의 출력은 컨페티(전술한 바와 같음)와 유사하였다. 컨페티-유사 재료는 문손 회전식 나이프 커터인 모델 SC30에 공급되었다. 배출 스크린은 1/16인치 개구를 지녔다. 회전 블레이드와 고정 블레이드 사이의 간극은 대략 0.020 인치로 설정되었다. 회전식 나이프 커터는 컨페티-유사 조각을 전단하고 약 1 파운드/시간의 속도로 섬유 재료를 방출하였다. 상기 제1전단으로부터 얻어진 재료는 전술한 바와 동일한 설비에 도로 공급되어 재차 전단되었다. 얻어진 섬유 재료는 BET 표면적이 1.4408 ㎡/g +/- 0.0156 ㎡/g, 다공도가 90.8998%, 벌크 밀도(@0.53 psia)가 0.1298 g/㎖였다. 섬유의 평균 길이는 0.891㎜였고, 섬유의 평균 폭은 0.026㎜였으므로, 34:1의 평균 L/D를 부여하였다.
실시예 4 - 탈색된 크래프트 판지로부터 3회 전단된 섬유 재료의 준비
벌크 밀도가 30 lb/ft3인 미가공된 탈색된 백색 크래프트 판지의 1500파운드 스키드를 인터내셔널 페이퍼사로부터 얻었다. 상기 재료는 평탄하게 접은 후, 대략 15 내지 20 파운드/시간의 속도로 3 hp Flinch Baugh 세단기에 공급하였다. 상기 세단기는 2개의 12 인치 회전 블레이드, 2개의 고정 블레이드 및 0.30 인치 배출 스크린을 장비하고 있었다. 회전 블레이드와 고정 블레이드 사이의 간극은 0.10 인치로 조정하였다. 세단기로부터의 출력은 컨페티(전술한 바와 같음)와 유사하였다. 컨페티-유사 재료는 문손 회전식 나이프 커터인 모델 SC30에 공급되었다. 배출 스크린은 1/8 인치 개구를 지녔다. 회전 블레이드와 고정 블레이드 사이의 간극은 대략 0.020 인치로 설정되었다. 회전식 나이프 커터는 컨페티-유사 조각을 나이프-에지를 가로질러 전단하였다. 제1전단으로부터 얻어진 재료는 상기와 동일한 설비에 도로 공급하고, 스크린은 1/16 인치 스크린으로 교체하였다. 이 재료는 전단되었다. 제2전단으로부터 얻어진 재료는 상기와 동일한 설비에 도로 공급하고, 스크린은 1/32 인치 스크린으로 교체하였다. 이 재료는 전단되었다. 얻어진 섬유 재료는 BET 표면적이 1.6897 ㎡/g +/- 0.0155 ㎡/g, 다공도가 87.7163%, 벌크 밀도(@0.53 psia)가 0.1448 g/㎖였다. 섬유의 평균 길이는 0.824㎜였고, 섬유의 평균 폭이 0.0262㎜였으므로, 32:1의 평균 L/D를 부여하였다.
실시예 5 - 전자빔 처리
샘플은 출력 파워 80㎾에서 5 MeV 전자를 전달하는 돔형 둥근 지붕을 지닌 로도트론(Rhodotron)(등록상표) TT200 연속파 가속기를 이용해서 전자빔으로 처리되었다. 이하의 표 1은 이용된 변수를 나타낸다. 이하의 표 2는 샘플 ID를 위해 이용된 공칭 선량(M㎭) 및 샘플에 전달된 대응하는 선량(kgy)을 기록하고 있다.
로도트론 (등록상표) TT 200 변수
빔
생성된 빔 가속된 전자
빔 에너지 공칭(고정): 10Mev(+0keV-250keV)
10MeV에서의 에너지 분산 FWHM(full width half maximum) 300keV
10MeV에서의 빔 파워 보장된 작동 범위 1 내지 80㎾
소비 전력
대기 조건(진공 및 냉각 ON) <15㎾
50㎾에서의 빔 파워 <210㎾
80㎾에서의 빔 파워 <260㎾
RF 시스템
주파수 107.5±1㎒
4극진공관 형 톰슨 TH781
주사 혼(scanning Horn)
공칭 주사 길이(창으로부터 25-35㎝에서 측정됨) 120㎝
주사 범위 공칭 주사 길이의 30% 내지 100%
공칭 주사 주파수(최대 주사 길이에서) 100㎐±5%
주사 균일성(공칭 주사 길이의 90%에 대해서) ±5%
샘플에 전달된 선량
총 선량( M㎭ )
(샘플 ID와 연관된 번호) 		전달된 선량(kgy) 1
1 9.9
3 29.0
5 50.4
7 69.2
10 100.0
15 15.03
20 198.3
30 330.9
50 529.0
70 695.9
100 993.6
1 예를 들어, 9.9kgy는 빔 전류 5㎃, 회선 속도 12.9 피트/분에서 11초로 전달되었다. 처리들 간의 냉각 시간은 약 2분이었다.
실시예 6 - 겔 투과 크로마토그래피에 의해 셀룰로스 및 리그노셀룰로스 재료의 분자량을 결정하는 방법
분석용의 셀룰로스 및 리그노셀룰로스 재료를 실시예 4에 따라 처리하였다. 이하의 표에 제시된 샘플 재료는 크래프트지(P), 밀짚(WS), 자주개자리(A), 셀룰로스(C), 지팽이풀(SG), 목초(G), 전분(ST) 및 수크로스(S)를 포함한다. 샘플 ID 번호가 "132"인 것은 1/32 인치 스크린을 통한 전단 후의 재료의 입자 크기를 의미한다. 대쉬선 뒤의 숫자는 방사선의 선량(M㎭)을 의미하며, "US"는 초음파 처리를 의미한다. 예를 들어, 샘플 ID "P132-10"은 10M㎭로 조사되어 있고 132 메쉬의 입자 크기로 전단되어 있는 크래프트지를 의미한다.
e-빔으로 조사된 샘플에 대해서, 대쉬선 뒤의 숫자는 샘플에 전달된 에너지의 양을 의미한다. 예를 들어, 샘플 ID "P-100e"는 약 100M㎭ 혹은 약 1000kgy의 에너지 선량을 전달한 크라프트지를 의미한다(표 2).
Figure 112016047841285-pat00002
Figure 112016047841285-pat00003
Figure 112016047841285-pat00004
Figure 112016047841285-pat00005
겔 투과 크로마토그래피(GPC: Gel Permeation Chromatography)는 중합체의 분자량 분포를 결정하는 데 이용된다. GPC 분석 동안, 중합체 샘플의 용액은 소분자를 포획하는 다공성 겔로 충전된 칼럼을 통과시킨다. 해당 샘플은 보다 큰 분자가 보다 작은 분자보다 더욱 빨리 용출되는 상태로 분자 크기에 의거해서 분리된다. 각 성분의 체류 시간은 굴절률(RI: refractive index), 증발 광산란(ELS: evaporative light scattering), 또는 자외선(UV)에 의해 가장 잘 검출되고 교정 곡선과 비교된다. 이어서, 얻어진 데이터는 샘플의 분자량 분포를 계산하는 데 이용된다.
유일한 분자량보다는 오히려 분자량 분포가 합성 중합체를 특징화하는 데 이용된다. 이 분포를 특징화하기 위하여, 통계학적 평균치가 이용된다. 가장 흔히 쓰이는 이들 평균치는 "수평균 분자량"(Mn) 및 "중량 평균 분자량"(Mw)이다.
이들 값을 산출하는 방법은 당해 분야에, 예컨대, WO 2008/073186의 실시예 9에 기재되어 있다.
다분산지수 또는 PI는 Mw/Mn의 비로서 정의된다. PI가 클수록, 분포가 보다 넓어지거나 보다 분산된다. PI의 가능한 최저치는 1이다. 이것은 단분산 샘플을 나타낸다; 즉, 해당 분포 내에 모든 분자를 지닌 중합체는 동일한 분자량을 지닌다.
피크 분자량값(MP)은 분자량 분포의 모드로서 규정된 다른 디스크립터이다. 이것은 상기 분포에서 가장 풍부한 분자량을 의미한다. 이 값은 또한 분자량 분포에 대한 식견을 부여한다.
대부분의 GPC 측정은 상이한 중합체 표준에 대해서 이루어진다. 그 결과의 정확도는 분석중인 중합체의 특성이 이용된 표준의 것과 얼마나 근사하게 일치하는 지에 따라 좌우된다. 개별적으로 교정된 상이한 일련의 결정치 간의 재현성의 예측되는 오차는 대략 5 내지 10%이고, 이것은 GPC 결정치의 제한된 정확성에 특징이 있다. 따라서, GPC 결과는 상이한 샘플의 분자량 분포 간의 비교가 동일한 일련의 결정 동안 이루어질 경우 가장 유용하다.
리그노셀룰로스 샘플은 GPC 분석 전에 샘플 준비를 필요로 하였다. 먼저, 염화리튬(LiCl)의 포화 용액(8.4중량%)은 다이메틸 아세트아마이드(DMAc) 중에 제조되었다. 대략 100 ㎎의 샘플을 대략 10g의 신선하게 제조된 포화 LiCl/DMAc 용액에 가하고, 이 혼합물을 1시간 교반하에 대략 150℃ 내지 170℃로 가열하였다. 얻어진 용액은 일반적으로 담황색 내지 암황색이었다. 용액의 온도는 대략 100℃로 저감되었고, 추가의 2시간 동안 가열되었다. 이어서, 용액의 온도는 대략 50℃까지 저감되었고, 샘플 용액은 대략 48 내지 60시간 동안 가열되었다. 단, 100 M㎭에서 조사된 샘플이 그들의 미처리된 대응품에 비해서 더욱 용이하게 가용화되었다. 부가적으로, 전단된 샘플(번호 132로 표시됨)은 절단되지 않은 샘플에 비해서 다소 낮은 평균 분자량을 지녔다.
얻어진 샘플 용액은 용매로서 DMAc를 이용해서 1:1 희석시키고, 0.45㎛ PTFE 필터를 통해서 여과시켰다. 다음에, 여과된 샘플 용액은 이하의 표 7에 기재된 변수를 이용해서 GPC에 의해 분석을 실시하였다. 샘플의 피크 평균 분자량(Mp)은, 겔 투과 크로마토그래피(GPC)에 의해 결정된 바와 같이, 표 3 내지 표 6에 요약되어 있다. 각각의 샘플은 두 벌로 준비하였고, 해당 샘플의 각각의 제제를 샘플 당 총 4회 주입을 위해 두 벌(2회 주입)로 분석을 실시하였다. EasiCal(등록상표) 폴리스타이렌 표준 PS1A 및 PS1B는 분자량 규모 약 580 내지 7,500,00 달톤에 대해서 교정 곡선을 생성하는데 이용되었다.
GPC 분석 조건
기기: Waters Alliance GPC 2000
칼럼(3): Plgel 10T Mixed-B
S/ N's: 10M-MB-148-83; 10M-MB-148-84; 10M-MB-174-129
이동상 (용매): DMAc 중 0.5% LiCl (1.0 ㎖/min.)
칼럼/검출기 온도: 70℃
주입기 온도: 70℃
샘플 루프 크기: 323. 5 ㎕
실시예 7 - 비행시간 2차 이온질량 분광법(Time-Of- Fliqht Secondary Ion Mass Spectrometry: ToF - SIMS ) 표면 분석
ToF-SIMS는 샘플의 가장 최외표면으로부터 분자를 제거하기 위하여 펄스 이온빔(Cs 혹은 마이크로포커싱된 Ga)을 사용하는 표면-감지 분광법이다. 입자는 표면(2차 이온) 상의 원자 단층으로부터 제거된다. 이들 입자는 이어서 "비행관"(flight tube) 내로 가속되어, 그들의 질량이 검출기에 도달하는 정확한 시간(즉, 비행 시간)을 측정함으로써 결정된다. ToF-SIMS는 표면, 박층, 샘플의 계면에 대한 상세한 원소 및 분자 정보를 제공하고, 완전한 3차원 분석을 부여한다. 그 용도는 반도체, 폴리머, 도료, 코팅, 유리, 종이, 금속, 세라믹, 바이오재료, 약제 및 유기 조직을 비롯하여 광범위하다. ToF-SIMS는 측량 수법이므로, H를 비롯하여 주기율표 내의 모든 원소가 검출된다. ToF-SIMS 데이터는 이하의 표 8 내지 표 11에 제시되어 있다. 이용된 변수는 이하의 표 12에 보고되어 있다.
Figure 112016047841285-pat00006
Figure 112016047841285-pat00007
Figure 112016047841285-pat00008
Figure 112016047841285-pat00009
Figure 112016047841285-pat00010
ToF-SIMS는 재료 표면 상의 화학적 종류를 제거시키기 위하여 집속된 펄스 형상의 입자빔(전형적으로 Cs 혹은 Ga)를 이용한다. 충격 부위에 보다 가깝게 생성된 입자들은 이온(양 혹은 음)을 해리시키는 경향이 있다. 상기 충격 부위로부터 훨씬 멀리 발생된 2차 입자들은 분자 화합물, 전형적으로는 훨씬 큰 유기 거대분자의 단편으로 되는 경향이 있다. 이 입자들은 이어서 검출기를 향하여 가는 도중 비행 경로 내로 가속된다. 입자의 나노초 규모로 충격 시간으로부터 검출기까지의 "비행시간"을 측정하는 것이 가능하므로, 0.00X 원자 질량 단위(즉, 양자의 질량의 천분의 일)로서 미세한 질량 해상도를 생성하는 것이 가능하다. 전형적인 작동 조건 하에, ToF-SIMS 분석의 결과는 0 내지 10,000 amu의 범위에 걸쳐서 모든 원자 질량을 측량하는 질량 스펙트럼을 포함하며, 래스터링된 빔은 서브미크론 규모의 대상의 임의의 질량의 맵을 생성하고, 심도 프로파일은 이온빔 하에 스퍼터링에 의해 표면층의 제거에 의해 생성된다. 음이온 분석은 폴리머가 CNO, CN 및 NO2기의 양을 증가시킨 것을 나타내었다.
실시예 8 - 조사된 재료의 다공도 측정( porosimetry ) 분석
수은 기공 크기 및 기공 체적 분석(표 21)은 조밀하게 제어된 압력 하에 다공질 구조로 수은(비젖음성 액체(non-wetting liquid))을 강제로 밀어넣는 것에 기초하고 있다. 수은은 대부분의 물질을 젖게 하지 않고 모세관 작용에 의해 기공을 자발적으로 침투하지 않으므로, 외압을 가함으로써 샘플의 공극(void)들 내로 강제로 압입될 필요가 있다. 상기 공극을 채우는데 필요한 압력은 기공의 크기에 반비례한다. 단지 작은 양의 힘이나 압력이 커다란 공극을 채우는데 필요한 반면, 보다 작은 기공의 공극을 채우는 데는 훨씬 큰 압력이 필요하다.
Figure 112016047841285-pat00011
AutoPore 9520은 414㎫ 혹은 60,000 psia의 최대 압력에 이를 수 있다. 샘플 준비 및 0.2 psia에서 50 psia까지의 거대기공 데이터의 수집을 위하여 4가지 저압 스테이션이 있다. 2개의 고압 챔버가 있고, 이들은 25 psia에서 60,000 psia까지의 데이터를 수집한다. 샘플은, 금속 코팅이 실시된 유리제 모세관 기둥에 접합된, 침입도계(penetrometer)라 불리는 주발 형상의 장치 내에 놓인다. 수은이 샘플 내 및 주위에 있는 공극을 침투함에 따라, 상기 모세관 기둥 아래로 이동한다. 모세관 기둥으로부터의 수은의 손실로 인해 전기 용량의 변화를 가져온다. 실험 동안의 용량의 변화는 사용 시 침입도계의 기둥 체적을 알고 있으므로 수은의 체적으로 환산된다. 상이한 주발(샘플) 크기 및 모세관을 구비한 다양한 침입도계가 대부분의 샘플 크기 및 형태를 수용하기 위하여 이용가능하다. 이하의 표 22는 각 샘플에 대해서 산출된 주된 변수의 몇몇을 정의한다.
변수의 정의
변수 설명
총 침입 체적 실험 동안 침입된 수은의 총 체적. 이것은 작은 입자들 간의 틈새 충전, 샘플의 다공도 및 샘플의 압축 체적을 포함할 수 있다.
총 기공 면적 원통형상 기공을 가정한 면적으로 환산된 총 침입 체적
중간 기공 직경 (체적) 누적 체적 그래프 상에서의 50번째 입자의 크기
중간 기공 직경 (면적) 누적 면적 그래프 상에서의 50번째 입자의 크기
평균 기공 직경 총 기공 면적으로 나눈 총 기공 체적(4V/A)
벌크 밀도 벌크 체적으로 나눈 샘플의 질량. 벌크 체적은 충전 압력, 전형적으로는 0.5 psia에서 결정된다.
겉보기 밀도 최고 압력, 전형적으로는 60,000psia에서 측정된 샘플의 체적으로 나눈 샘플의 질량
다공도 (벌크밀도/겉보기 밀도)×100%
실시예 9 - 조사된 재료의 입자 크기 분석
정적 광 산란에 의해 입자 크기를 정하는 기술은 미 이론(Mie theory)(프라운호퍼 이론(Fraunhofer theory)도 포함함)에 의거한 것이다. 미 이론은 다른 시스템 변수가 공지되어 일정하게 유지되는 조건에서 구형상 산란 입자용의 크기의 함수로서 강도 대 각도 관계를 예측한다. 이들 변수는 샘플 재료의 입사광의 파장과 상대 굴절률이다. 미 이론의 적용은 상세한 입자 크기 정보를 제공한다. 표 23은 중간 직경, 평균 직경 및 최빈 직경(Modal Diameter)을 변수로서 이용해서 입자 크기를 요약한 것이다.
Figure 112016047841285-pat00012
입자 크기는 이하의 조건을 이용해서 Malvern Mastersizer 2000을 사용하여 레이저 광 산란(건조 샘플 분산)에 의해 구하였다:
공급률: 35%
디스펜서 압력: 4 Bar
광학적 모델: (2.610, 1.000i), 1.000
적절한 양의 샘플을 진동 접시 상에 도입하였다. 공급 속도와 공기 압력은 입자가 적절하게 분산된 것을 확실하게 하기 위하여 조정되었다. 주된 요소는 응집을 파괴하는 공기 압력을 선택하는 것이지만, 샘플 무결성(integrity)을 떨어뜨리지 않는다. 필요한 샘플의 양은 입자의 크기에 따라 다양하다. 일반적으로, 미립자를 지닌 샘플은 조질의 입자를 지닌 샘플보다 적은 재료를 필요로 한다.
실시예 10 - 조사된 재료의 표면적 분석
각 샘플의 표면적은 Micromeritics ASAP 2420 가속 표면적 및 다공도측정 시스템을 이용해서 분석되었다. 샘플은 40℃에서 16시간 동안 우선 탈기함으로써 준비되었다. 이어서, 헬륨을 이용한 자유 공간(따뜻한 공간과 차가운 공간의 양쪽 모두)이 산출되고, 이어서, 샘플 관이 재차 배기되어 헬륨을 제거한다. 데이터 수집은 두번째 배기 후에 시작하고, 목표 압력을 정의하는 것으로 구성되며, 이는 얼마나 많은 기체가 샘플내로 투입되는지를 제어한다. 각 목표 압력에서, 흡수된 가스량과 실제 압력이 구해지고 기록된다. 샘플관 내부의 압력은 압력 변환기에 의해 측정된다. 기체의 추가 투입은 목표 압력이 달성되어 평형을 이룰 때까지 계속될 것이다. 흡착된 기체량은 샘플 상에 다수의 투입량을 합계함으로써 구해진다. 압력과 양은 기체 흡수 등온선을 정의하며, BET 표면적을 포함하는 많은 변수를 산출하는데 이용된다(표 24).
Figure 112016047841285-pat00013
등온선을 위한 BET 모델은 특정 표면적을 산출하기 위하여 광범위하게 이용되는 이론이다. 분석은 크립톤의 치밀하게 충전된 단층을 지니는 전체 표면을 덮는데 요구되는 양을 산출함으로써 샘플 표면의 단층 용량(monolayer capacity)을 구하는 것을 포함한다. 단층 용량은 총 표면적을 구하기 위하여 프로브 가스의 분자의 단면적을 곱한다. 비표면적은 샘플의 질량으로 나눈 샘플 분취액(aliquot)의 표면적이다.
실시예 11 - 조사된 재료의 섬유 길이 결정
섬유 길이 분포 테스트는 Techpap MorFi LB01 시스템을 이용해서 제시된 샘플에 대해서 3회 수행되었다. 평균 섬유 길이 및 폭은 이하의 표 25에 기록되어 있다.
Figure 112016047841285-pat00014
실시예 12 - 조사 및 미조사된 크라프트지의 푸리에 변환 적외 (FT-IR) 스펙트럼
FT-IR 분석은 Nicolet/Impact 400 상에서 수행되었다. 그 결과는 샘플 P132, P132-10, P132-100, P-1e, P-5e, P-10e, P-30e, P-70e 및 P-100e가 셀룰로스계 재료와 양립하는 것을 나타내고 있다.
도 3은 실시예 4에 따라서 전단된 크래프트 판지의 적외스펙트럼인 반면, 도 4는 100M㎭의 감마 방사선에 의한 조사 후에 도 3의 크라프트지의 적외스펙트럼이다. 조사된 샘플은 미조사된 재료에서 발견되지 않는 영역 A(약 1730㎝-1에서 집중됨)에 추가의 피크를 보이고 있다. 단, ~ 1650㎝-1에서 카보닐 흡수량의 증가는 P132에서부터 P132-10으로 또한 P132-100으로 감에 따라 검출되었다. 마찬가지의 결과가 샘플 P-1e, P-5e, P-10e, P-30e, P-70e 및 P-100e에 대해서 관찰되었다.
실시예 13 - 조사 및 미조사된 크라프트지의 양자 및 탄소-13 핵자기공명( 1 H-NMR 및 13 C-NMR) 스펙트럼
샘플 준비
샘플 P132, P132-10, P132-100, P-1e, P-5e, P-10e, P-30e, P-70e 및 P-100e는 2% 테트라뷰틸 암모늄 플루오라이드 삼수화물과 함께 DMSO-d6에 의한 용해에 의해 분석을 위하여 준비되었다. 보다 낮은 레벨의 조사를 받은 샘플이 보다 높은 조사를 받은 샘플보다 유의하게 덜 가용성이었다. 미조사된 샘플은 이 용매 혼합물 중에서 겔을 형성하였지만, 60℃로의 가열에 의해 해당 NMR 스펙트럼에서 피크를 제거하였다. 보다 높은 레벨의 조사를 받은 샘플은 10% wt/wt의 농도에서 가용성이었다.
분석
15㎎/㎖에서의 샘플의 1H-NMR 스펙트럼은 16ppm에서 집중된 명백한 매우 넓은 공명 피크를 보였다(도 5a 내지 도 5j). 이 피크는 에놀에 대해서 교환가능한 -OH 양자의 특성이며, "d2O 진동"에 의해 확인되었다. 모델 화합물(아세틸아세톤, 글루쿠론산 및 케토-굴론산)이 분석되었고, 이 피크가 실제로 교환가능한 에놀 양자인 것을 확신시키는 사례로 되었다. 이 제안된 에놀 피크는 농도 효과에 대해서 매우 민감하였고, 본 발명자들은 이 공명이 에놀 혹은 가능하게는 카복실산에 기인된 것인지의 여부를 결정할 수 없었다.
모델 화합물의 카복실산 양자 공명은 처리된 셀룰로스 샘플에 대해서 관찰되었다. 이들 모델 화합물은 ~5 내지 6ppm으로 업 필드 시프트되었다. 보다 높은 농도(~10% wt/wt)에서의 P-100e의 준비는 모델 화합물의 카복실산 공명이 발견된 곳으로의 극적인 다운 필드 시프트를 초래하였다(도 5n). 이들 결과는 이 공명이 이 작용기를 특징짓기에 신뢰할 수 없다는 결론을 가져오지만, 그 데이터는 교환가능한 수소수가 샘플의 조사 증가에 따라 증가하는 것을 시사한다. 또한, 비닐 양자는 검출되지 않았다.
샘플의 13C-NMR 스펙트럼은 카복실산 혹은 카복실산 유도체의 카보닐의 존재 유무를 확인한다. (168ppm에서의) 이 새로운 피크는 미처리된 샘플에 존재하지 않는다(도 5k). 긴 지연을 지니는 13C-NMR 스펙트럼은 P-100e에 대해서 신호의 정량화를 가능하게 하였다(도 5l 내지 도 5m). 대략 100ppm(C1 신호)에서의 공명에 대한 카보닐 공명의 적분 비교는 C1에 대한 카보닐 탄소의 비가 1:13.8, 또는 매 14개의 글루코스 단위마다 대략 1개의 카보닐인 것을 시사한다. 100ppm에서의 화학적 시프트는 글루쿠론산과 충분히 상관을 지닌다.
적정(titration)
샘플 P-100e 및 P132-100(1g)은 탈이온수(25㎖) 중에 현탁되었다. 지시약 알리자린 황색은 교반하에 각 샘플에 추가되었다. P-100e는 젖기 더욱 어려웠다. 두 샘플은 0.2M NaOH 용액으로 적정되었다. 종말점은 매우 미묘하였고 pH지를 이용해서 확인되었다. 샘플의 출발 pH는 두 샘플에 대해서 ~4였다. P132-100은 0.4밀리당량의 하이드록사이드를 필요로 하였고, 이는 2500 amu라는 카복실산의 분자량을 부여하였다. 180 amu가 모노머에 대해서 이용된다면, 이것은 13.9 모노머 단위에 대해서 하나의 카복실산기가 있는 것을 시사한다. 마찬가지로, P-100e는 3.2밀리당량의 하이드록사이드를 필요로 하였고, 이것은 매 17.4 모노머 단위에 대해서 하나의 카복실산이 되도록 계산한다.
결론
셀룰로스의 C-6 탄소는 이 산화에서의 카복실산(글루쿠론산 유도체)에 대해서 산화되는 것을 나타낸다. 이 산화는 ~1740㎝-1에서의 조사에 의해 성장하는 IR 밴드와 일치하며, 이는 지방족 카복실산에 상당한다. 적정 결과는 정량적인 13C-NMR과 일치한다. 보다 높은 레벨의 조사에 의한 샘플의 증가된 용해도는 카복실산 양자의 증가된 수와 충분히 상관을 지닌다. "C-6 산화된 셀룰로스"의 분해에 대한 제안된 메가니즘은 이하에 반응식 1에 제공된다.
Figure 112016047841285-pat00015
실시예 14 - 전처리된 바이오매스의 미생물 검사
본 명세서에 기재된 바와 같이 전처리된 구체적인 리그노셀룰로스 재료는 에탄올 생산에 있어서의 발효 단계를 위하여 바이오연료 산업에서 이용되는 효모 및 박테리아의 통상의 균주에 대한 독성에 대해서 분석되었다. 또한, 당 함량 및 셀룰라제 효소와의 융화성(compatibility)을 조사하여 처리 공정의 생존성을 결정하였다. 전처리된 재료의 테스트는 다음과 같이 두 단계로 수행된다.
단계 1 : 독성 및 당 함량
전처리된 목초 및 종이 공급원료의 독성은 효모인 사카로마이세스 세레비시애(와인 효모) 및 피키아 스티피티스(ATCC 66278)뿐만 아니라 박테리아인 지모모나스 모빌리스(ATCC 31821) 및 클로스트리듐 써모셀륨(ATCC 31924)에서 측정된다. 성장(혹은 증식) 연구는 각 유기체에 의해 수행되어 배양 및 샘플링의 최적 시간을 결정한다.
각 공급원료는 이어서 각 유기체에 대해서 표준 미생물 배지에서 S. 세레비시애, P. 스티피티스, Z. 모빌리스 및 C. 써모셀륨으로 두 벌로 배양된다. YM(Yeast Mold) 브로로스(YM broth)가 두 효모 균주인 S. 세레비시애 및 P. 스티피티스에 대해서 이용된다. RM 배지는 Z. 모빌리스에 대해서 이용되고, CM4 배지는 C. 써모셀륨에 대해서 이용된다. 순수한 당이 첨가되지만 공급원료는 없는 양성 대조군이 비교를 위해 이용된다. 배양 동안, 5가지 샘플 전체가 시각 0, 3, 6, 9 및 12시간에 12시간에 걸쳐서 채취되어, 생존성(Z. 모빌리스에 대해서는 플레이트 계수치 및 S. 세레비시애에 대해서는 직접 계수치) 및 에탄올 농도에 대해서 분석된다.
공급원료의 당 함량은 Shodex™ sugar SP0810 또는 Biorad Aminex(등록상표) HPX-87P 칼럼이 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용해서 측정된다. 각 공급원료(대략 5g)는 1시간 동안 역삼투(reverse osmosis: RO)수와 혼합된다. 이 혼합물의 액체 부분이 제거되고, 글루코스, 갈락토스, 자일로스, 만노스, 아라비노스 및 셀로비오스 함량에 대해서 분석된다. 해당 분석은 내셔널 바이오에너지 센터 프로토콜(National Bioenergy Center protocol) "Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass"에 따라 수행된다.
단계 2: 셀룰라제 융합성
공급원료는 엘렌메이어 플라스크 내에서 권장 온도와 농도에서, 리그노셀룰로스 바이오매스를 발효가능한 당으로 환원시키는 효소들의 복합체를 포함하고 있는 시판의 Accellerase(등록상표) 1000에 의해서 두 벌로 시험된다. 해당 플라스크는 12시간 동안 200rpm 부근에서 중간의 진탕하면서 인큐베이트된다. 그 시간 동안, 샘플은 시각 0, 3, 6, 9 및 12시간에서 매 3시간마다 채취되어, 플라스크의 액체 부분에서의 환원당의 농도를 결정한다(Hope and Dean, Biotech J., 1974, 144:403).
실시예 15 - HPLC를 이용한 당 농도 분석
13개의 샘플이 3가지 미생물(피키아 스티피티스, 사카로마이세스 세레비시애 및 지모모나스 모빌리스)에 대해서 당 농도(HPLC) 및 독성에 대해 분석되었다.
표 26은 이들 실험에 이용된 장비를 열거하고 있다. 표 27 및 표 28은 각각 HPLC 표준을 제조하는데 이용된 당(기기 및 로트 번호) 및 HPLC 표준을 제조하는데 이용된 프로토콜의 리스트를 제공한다.
실험에 이용된 장비
장비 제조사, 명칭
pH계 Orion
진탕기(2) B. Braun Biotech, Certomat BS-1
HPLC Waters, 2690 HPLC Module
분광 광도계 Unicam, UV300
YSI 바이오켐 분석기 Interscience, YSI
HPLC 분석에 이용된 당
당 제조사 참조 번호 로트 번호
글루코스

BioChemika


 49140 1284892
자일로스 95731 1304473 51707231
셀로비오스 22150 1303157 14806191
아라비노스 10840 1188979 24105272
만노스 63582 363063/1 22097
갈락토스 48259 46032/1 33197
HPLC 표준의 제조
소망의 농도(㎎/㎖) 당 용액의 체적 나노퓨어수의 체적(㎖) 총 체적(㎖)
4 50㎖(4㎎/㎖) 0 50
3 25㎖(4㎎/㎖) 25 50
1 25㎖(2㎎/㎖) 25 50
0.5 25㎖(1㎎/㎖) 25 50
0.1 5㎖(1㎎/㎖) 20 25
유리화 표준 1.5㎎/㎖ 18.75㎖(4㎎/㎖) 31.25 50
분석
각 샘플(1그람)을 200rpm 및 50℃에서 하룻밤 역삼투수와 혼합하였다. 각 샘플의 pH를 5 내지 6으로 조정하였고, 0.2㎛ 시린지 필터를 통해 여과시켰다. 이들 샘플은 샘플의 무결성을 유지하기 위하여 분석 전에 -20℃에서 보존되었다. 샘플의 제조 동안 행해진 관찰은 표 29에 제시되어 있다.
표준은 6가지 조합된 당, 즉, 글루코스, 자일로스, 셀로비오스, 아라비노스, 만노스 및 갈락토스의 4㎎/㎖ 원액으로부터 새롭게 준비되었다. 상기 원액은 나노퓨어수(nanopure water) 75㎖ 중에 각 당 0.400그람을 용해시킴으로써 제조되었다. 일단 용해되면, 상기 원액은 매스 플라스크를 이용해서 100㎖까지 희석하여 -20℃에서 보존되었다. 0.1, 0.5, 1, 2 및 4 ㎎/㎖의 작업 표준액은 나노퓨어수에 의한 원액의 일련의 희석에 의해 제조되었다. 또한, 1.5 ㎎/㎖의 검증 표준도 상기 원액으로부터 제조되었다.
당 농도는 상기 프로토콜 "Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass"(NREL 바이오매스 Program, 2006)에 따라 분석되었고, 이 프로토콜은 참조로 본 명세서에 포함된다. 증발 광 산란 검출기(Evaporative Light Scattering Detector)를 구비한 SHODEX SUGAR SP0810 칼럼이 이용되었다. 검증 표준(1.5㎎/㎖의 표준)은 칼럼 및 검출기의 무결성이 실험 동안 유지되는 것을 확실하게 하기 위하여 매 8회 주입마다 분석되었다. 편차의 표준 곡선 계수(R2 값)는 적어도 0.989였고, 검증 표준의 농도는 실제 농도의 10% 이내였다. HPLC 조건은 이하의 표 30과 같았다:
HPLC 변수
주입 체적 20㎕
이동상 나누퓨어수*, 0.45㎛ 여과 및 탈기됨
유량 0.5㎖/분
온도 85℃
검출기 온도 증발기 온도 110℃, 분무기 온도 90℃
* 초기 테스트는 이동상 중의 아세토나이트릴:물 15/85보다 나노퓨어수를 이용한 경우 보다 양호한 분리가 관찰되었다(제조사는 이 칼럼을 이용해서 20% 이상의 아세토나이트릴을 이용하는 것을 권장하지 않고 있다).
결과
HPLC 분석의 결과는 표 31, 표 32 및 표 33에 제시되어 있다.
Figure 112016047841285-pat00017
Figure 112016047841285-pat00018
Figure 112016047841285-pat00019
실시예 16 - 독성 연구
12개의 샘플이 3가지 에탄올-생산 배양액의 패널에 대한 독성에 대해서 분석되었다. 이 연구에서, 글루코스가 배양액의 결핍과 샘플의 독성을 구별하기 위하여 샘플에 첨가되었다. 13번째의 샘플은 피키아 스티피티스에 대한 독성에 대해서 테스트되었다. 사용된 프로토콜의 개요는 표 32에 열거되어 있다. 독성 테스트에 이용된 화학약품 및 장비의 설명은 이하의 표 34 내지 표 36에 기록되어 있다.
Figure 112016047841285-pat00020
Figure 112016047841285-pat00021
진탕 플라스크 연구에 이용된 YSI 성분
성분 카탈로그 번호 로트 번호
YSI 에탄올 막 2786 07L100153
YSI 에탄올 표준(3.2g/ℓ) 2790 012711040
YSI 에탄올 완충액 2787 07M1000053, 07100215
테스트는 다음과 같이 3종의 미생물을 이용해서 수행되었다.
사카로마이세스 세레비시애 ATCC 24858(American Type Culture Collection)
S. 세레비시애의 슬랜트(slant)는 ATCC로부터 얻어진 재수화된 동결건조된 배양액으로부터 제조되었다. 상기 슬랜트 재료의 일부를 YM 브로스 + 20g/ℓ 한천(pH 5.0) 상에 칠하고 30℃에서 2일간 배양하였다. 배지(20g/ℓ 글루코스, 3g/ℓ 효모 추출물 및 5.0g/ℓ 펩톤, pH 5.0) 50㎖를 수용하는 250㎖ 엘렌메이어 플라스크에 YM 플레이트로부터 1 콜로니 접종하고, 25℃, 200rpm에서 24시간 배양하였다. 23시간의 증식 후, 샘플을 채취하여 광학밀도(OD)(UV 분광 광도계에서 600㎚) 및 순도(그람염색)에 대해서 분석하였다. 이들 결과에 의거해서, 모든 테스트 플라스크에 접종하기 위하여 OD 14.8, 깨끗한 그람염색을 지닌 하나의 플라스크("시드 플라스크"(Seed Flask)라 지칭됨)를 채택하였다.
테스트 용기는 전술한 멸균 배지 100㎖를 수용하는 500㎖ 엘렌메이어 플라스크였다. 모든 플라스크는 테스트 재료의 첨가 전에 121℃, 15 psi에서 오토클레이브(autoclave)되었다. 테스트 재료는 멸균되지 않았는데, 이는 오토크레이빙이 샘플의 함량을 변화시킬 것이기 때문이다. 테스트 샘플은 오염의 가능성을 줄이기 위하여 접종(전보다는 오히려) 시 첨가하였다. 테스트 샘플에 부가해서, 시드 플라스크 재료 1㎖(1% v/v)를 각 플라스크에 첨가하였다. 이들 플라스크를 36시간 동안 전술한 바와 같이 배양하였다.
피키아 스티피티스 NRRL Y-7124(ARS 컬처 컬렉션(ARS Culture Collection))
P. 스티피티스의 슬랜트는 ARS 컬처 컬렉션으로부터 얻어진 재수화된 동결건조된 배양액으로부터 제조되었다. 상기 슬랜트 재료의 일부를 YM 브로스 + 20g/ℓ 한천(pH 5.0) 상에 칠하고 30℃에서 2일간 배양하였다. 배지(40g/ℓ 글루코스, 1.7g/ℓ 효모 질소 기제, 2.27g/ℓ 유레아, 6.56g/ℓ 펩톤, 40g/ℓ 자일로스, pH 5.0) 100㎖를 수용하는 250㎖ 엘렌메이어 플라스크에 플레이트 재료의 소량을 접종하고, 25℃, 125rpm에서 24시간 배양하였다. 23시간의 증식 후, 샘플을 채취하여 광학밀도(UV 분광 광도계에서 600㎚) 및 순도(그람염색)에 대해서 분석하였다. 이들 결과에 의거해서, 모든 테스트 플라스크에 접종하기 위하여 광학밀도 5.23, 깨끗한 그람염색을 지닌 하나의 플라스크("시드 플라스크"라 지칭됨)를 채택하였다.
테스트 용기는 전술한 멸균 배지 100㎖를 수용하는 250㎖ 엘렌메이어 플라스크였다. 모든 플라스크는 테스트 재료의 첨가 전에 121℃, 15 psi에서 오토클레이브되었고 또한 필터 멸균된(0.22㎛ 필터) 배지가 플라스크에 첨가되었다. 테스트 재료는 멸균되지 않았는데, 이는 오토크레이빙이 샘플의 함량을 변화시킬 것이고, 필터 멸균은 고형물의 멸균을 위해 적절하지 않을 것이기 때문이다. 테스트 샘플은 오염의 가능성을 줄이기 위하여 접종(전보다는 오히려) 시 첨가하였다. 테스트 샘플에 부가해서, 시드 플라스크 재료 1㎖(1% v/v)를 각 플라스크에 첨가하였다. 이들 플라스크를 48시간 동안 전술한 바와 같이 배양하였다.
지모모나스 모빌리스 ATCC 31821(American Type Culture)
Z. 모빌리스의 슬랜트는 ATTC로부터 얻어진 재수화된 동결건조된 배양액으로부터 제조되었다. 상기 슬랜트 재료의 일부를 DYE 플레이트(글루코스 20g/ℓ, 효모 추출물 10g/ℓ, 한천 20g/ℓ, pH 5.4) 상에 칠하고 30℃, 5% CO2에서 2일간 배양하였다. 배지(25g/ℓ 글루코스, 10g/ℓ 효모 추출물, 1g/ℓ MgSO4·7H2O, 1g/ℓ (NH4)2SO4, 2g/ℓ KH2PO4, pH 5.4) 15㎖를 수용하는 20㎖ 스쿠류-캡 시험관에 1 콜로니 접종하고, 30℃에서 24시간 배양하였다. 23시간의 증식 후, 샘플을 채취하여 광학밀도(UV 분광 광도계에서 600㎚) 및 순도(그람염색)에 대해서 분석하였다. 이들 결과에 의거해서, 제2시드 플라스크를 접종하기 위하여 하나의 관(OD 1.96)을 채택하였다. 상기 제2시드 플라스크는 전술한 바와 같은 배지 70㎖를 수용하는 125㎖ 플라스크였고, 700㎕(1% v/v)를 접종하고, 진탕없이 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 23시간의 증식 후, 샘플을 채취하여 광학밀도(UV 분광 광도계에서 600㎚) 및 순도(그람염색)에 대해서 분석하였다. 이들 결과에 의거해서, 모든 테스트 플라스크에 접종하기 위하여 OD 3.72의 하나의 플라스크("시드 플라스크"라 지칭됨)를 채택하였다.
테스트 용기는 효모 추출물 5g/ℓ를 제외하고 전술한 멸균 배지 100㎖를 수용하는 250㎖ 엘렌메이어 플라스크였다. 모든 플라스크는 테스트 재료의 첨가 전에 121℃, 15 psi에서 오토클레이브되었고 또한 필터 멸균된(0.22㎛ 필터) 배지가 플라스크에 첨가되었다. 테스트 재료는 멸균되지 않았는데, 이는 오토크레이빙이 샘플의 함량을 변화시킬 것이고, 필터 멸균은 고형물의 멸균을 위해 적절하지 않을 것이기 때문이다. 테스트 샘플은 오염의 가능성을 줄이기 위하여 접종 시 첨가하였다. 테스트 샘플에 부가해서, 시드 플라스크 재료 1㎖(1% v/v)를 각 플라스크에 첨가하였다. 이들 플라스크를 36시간 동안 전술한 바와 같이 배양하였다.
분석
두 샘플을 세포 농도(Z. 모빌리스에 대해서 확산 평판법(spread plating)을 이용함) 및 직접 계수(S. 세레비시애 및 P. 스티피티스에 대해서 혈구계 및 현미경을 이용함)에 대해서 분석하였다. 적절하게 희석된 Z. 모빌리스 샘플을 덱스트로스 효모 추출물(글루코스 20g/ℓ, 효모 추출물 10g/ℓ, 한천 20g/ℓ, pH 5.4) 플레이트 상에 확산시키고, 30℃, 5% CO2에서 2일간 배양하고, 콜로니의 수를 계수하였다. 적절하게 희석된 S. 세레비시애 샘플 및 P. 스티피티스 샘플을 0.05% 트립신 블루와 함께 혼합하고, 뉴바우어 혈구계(Neubauer haemocytometer) 내에 장입하였다. 세포를 40배 확대하에 계수하였다.
3가지 샘플을 알코올 탈수소효소 평가법에 의거한 YSI 바이오켐 분석기(YSI, Interscience)를 이용해서 에탄올 농도에 대해서 분석하였다. 샘플을 14,000rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 무결성을 보존하기 위하여 상청액을 -20℃에서 보관하였다. 이들 샘플을 분석 전에 0 내지 3.2g/ℓ 에탄올로 희석하였다. 3.2g/ℓ 에탄올의 표준을, 멤브레인의 무결성이 분석 동안 유지되는 것을 확실하게 하기 위하여 대략 매 30개의 샘플마다 분석하였다. 샘플의 광학밀도(600㎚)는, 고형 테스트 샘플이 샘플의 탁도를 증가시킴으로써 흡광도 측정을 간섭하여 부정확하기 때문에 기록하지 않았다.
에탄올 분석의 결과
성능은 각 미생물의 대조군에 대해서 각 샘플을 비교하기 위하여 이용되었다(표 37 내지 표 39). 그러나, 성능 %는 균주들 간을 비교하는데 이용될 수 없다. 균주들을 비교할 경우, 에탄올의 총 농도가 사용되어야만 한다. 이 데이터를 분석할 경우, 80% 미만의 성능 %가 낮은 세포 수를 수반할 경우 독성을 나타낼 수 있다. 성능 %를 구하는데 이용된 식은 성능 % = (샘플 중 에탄올/대조군 중 에탄올) × 100이다.
Figure 112016047841285-pat00022
Figure 112016047841285-pat00023
Figure 112016047841285-pat00024
세포 농도 분석으로부터의 결과
세포 %는 각 유기체에 대해서 각 샘플을 대조군과 비교하는데 이용된다. 그러나, 세포 %는 균주들 간을 비교하는데 이용될 수 없다. 균주들을 비교할 경우, 세포의 총 농도가 사용되어야만 한다. 이 데이터를 분석할 경우, 70% 미만의 성능 %가 낮은 에탄올 농도를 수반할 경우 독성을 나타낼 수 있다. 세포 %를 구하는데 이용된 식은 세포 % = (샘플 내의 세포 수/대조군 내의 세포 수) × 100이다.
Figure 112016047841285-pat00025
Figure 112016047841285-pat00026
Figure 112016047841285-pat00027
실시예 17 - P. 스티피티스를 이용한 셀룰로스 샘플의 진탕 플라스크 발효
요약
13개의 샘플이 당 첨가 없이 P. 스티피티스 배양에 있어서 에탄올 생산을 위해 테스트되었다. 이들은 셀룰라제(Accellerase 1000(등록상표) 효소 복합체, Genencor)의 존재 유무로 테스트되었다. 실험에 이용된 장비 및 시약은 이하의 표 43 내지 표 45에 열거되어 있다.
장비 및 유지보수 빈도
장비 제조사 유지보수 빈도
진탕기(2) B. Braun Biotech, Certomat BS-1 연 4회
분광 광도계 Unicam, UV300 연 2회
YSI 바이오캠 분석기 Interscience, YSI 월 1회
진탕 플라스크 연구에 이용된 YSI 성분
성분 카탈로그 번호 로트 번호
YSI 에탄올 막 2786 07L100153
YSI 에탄올 표준(3.2g/ℓ) 2790 012711040
YSI 에탄올 완충액 2787 07M1000053, 07100215
Figure 112016047841285-pat00028
P. 스티피티스 NRRL Y-7124의 슬랜트는, ARS 컬처 컬렉션으로부터 얻어진 재수화된 동결건조된 배양액으로부터 제조되었다. 상기 슬랜트 재료의 일부를 YM 브로스 + 20g/ℓ 한천(pH 5.0) 상에 칠하고 30℃에서 2일간 배양하였다. 배지(40g/ℓ 글루코스, 1.7g/ℓ 효모 질소 기제, 2.27g/ℓ 유레아, 6.56g/ℓ 펩톤, 40g/ℓ 자일로스, pH 5.0) 100㎖를 수용하는 250㎖ 엘렌메이어 플라스크에 1콜로니 접종하고, 25℃, 125rpm에서 24시간 배양하였다. 23시간의 증식 후, 샘플을 채취하여 광학밀도(UV 분광 광도계에서 600㎚) 및 순도(그람염색)에 대해서 분석하였다. 이들 결과에 의거해서, 모든 테스트 플라스크에 접종하기 위하여 광학밀도 6.79, 깨끗한 그람염색을 지닌 하나의 플라스크("시드 플라스크"라 지칭됨)를 채택하였다.
테스트 용기는 배지(1.7g/ℓ 효모 질소 기제, 2.27g/ℓ 유레아 및 6.56g/ℓ 펩톤) 100㎖를 수용하는 250㎖ 엘렌메이어 플라스크였다. 이 성장 플라스크 배지에 당(글루코스 혹은 자일로스)은 첨가되지 않았다. 모든 플라스크는 테스트 재료의 첨가 전에 121℃, 15 psi에서 비어 있는 상태로 오토클레이브되었고 또한 필터 멸균된(0.22㎛ 필터) 배지가 플라스크에 첨가되었다. 테스트 재료는 멸균되지 않았는데, 이는 오토크레이빙이 샘플의 함량을 변화시킬 것이고, 필터 멸균은 고형물의 멸균을 위해 적절하지 않을 것이기 때문이다. 테스트 샘플(표 46에 열거됨)은 오염의 가능성을 줄이기 위하여 접종(전보다는 오히려) 시 첨가하였다. 테스트 샘플에 부가해서, 시드 플라스크 재료 1㎖(1% v/v)를 각 플라스크에 첨가하였다. 샘플 P 132-100을 수용하고 있는 플라스크는 pH를 5.0으로 조정하는 데 0.4㎖ 1M NaOH의 첨가를 필요로 하였다. 이들 플라스크를 96시간 동안 30℃, 150rpm에서 배양하였다.
공급원료 당 두 벌의 플라스크 1세트는 동시 당화 및 발효(SSF)를 시도하기 위하여 Accellerase(등록상표) 효소 복합체(플라스크당 1.25㎖, 최고 권장 용량은 바이오매스 1그람당 0.25㎖임, Genencor)를 포함하고 있었다. 두 벌의 플라스크의 다른 세트는 Accellerase(등록상표) 효소 복합체를 포함하고 있지 않았다. 총 52개의 플라스크가 분석되었다.
6개의 대조 플라스크도 분석되었다. 양성 대조 플라스크는 Accellerase(등록상표) 효소 복합체의 첨가 없이 100㎖ 플라스크 당 2.5그람의 농도(25g/ℓ)로 SolkaFloc 200 NF 분체화된 셀룰로스(로트번호 UA158072, International Fiber Corporation)를 포함하였다. 또한, 당(글루코스 및 자일로스)만을 포함하고 있는 대조군이 이용되었다.
Figure 112016047841285-pat00029
분석
샘플은 알코올 탈수소효소 평가법에 의거한 YSI 바이오켐 분석기(YSI, Interscience)를 이용해서 에탄올 농도(표 47, 표 48 및 표 49)에 대해서 분석되었다. 샘플을 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하고 상청액은 -20℃에서 보관하였다. 샘플은 분석 전에 0 내지 3.2g/ℓ 에탄올로 희석되었다. 2.0g/ℓ 에탄올의 표준은, 멤브레인의 무결성이 분석 동안 유지되는 것을 확실하게 하기 위하여 대략 매 30개의 샘플마다 분석되었다.
결과
대조 플라스크의 결과
대조군 에탄올 농도(g/ℓ)
24시간 36시간 48시간 96시간
글루코스 함유하지만, 셀룰로스나 효소는 함유하지 않음 13.20 19.00 20.60 21.60
결정성 셀룰로스(Solk Floc)는 함유하지만, 당이나 효소는 함유하지 않음 0.00 0.00 0.00 0.00
결정성 셀룰로스(Solk Floc)를 25g/ℓ 함유하지만, 당은 함유하지 않고, Accellerase(등록상표)는 첨가됨
6.56
7.88
9.80
8.65
Figure 112016047841285-pat00030
Figure 112016047841285-pat00031
실시예 18 - 셀룰라제 평가법
요약
13개의 샘플이 온도와 pH의 최적 조건 하에 공업용 셀룰라제(Accellerase(등록상표) 1000, Genencor)를 이용해서 셀룰라제 감도에 대해서 테스트되었다.
프로토콜
프로토콜은 NREL "Laboratory Analytical Procedure LAP-009 Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass"의 변형이다. 재료의 샘플을 50㎖ 관에 두 벌로 0.1M 구연산나트륨 완충액(pH 4.8) 10㎖ 및 테트라사이클린(박테리아의 증식을 방지하기 위하여) 40㎎/㎖에 첨가하였다. 각 관에 첨가된 샘플의 양은 표 50에 열거되어 있다. 몇몇 샘플(P132, P132-10, P132-100)은 혼합하기 어려웠으므로 보다 낮은 농도에서 첨가되었다. 양성 대조군인 0.2그람 SolkaFloc 200 NF 분체화된 셀룰로스(로트번호 UA158072, International Fiber Corporation) 및 음성 대조군(샘플 없음)도 포함되었다. 이들 관에 체적을 총 20㎖로 하기 위하여 충분한 역삼투수를 첨가하였다. 구연산나트륨 완충액과 물은 모두 사용 전에 50℃까지 가열되었다.
Accellerase(등록상표) 1000 효소는 각 관에 바이오매스의 그람당 0.25㎖의 용량(Genencor에 의해 권장되는 최고 용량)으로 첨가되었다. 이들 관을 150rpm 및 50℃, 45° 각도에서(Genencor에 의해 권장됨) 72시간 동안 배양하였다. 샘플을 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 48 및 72시간(표 52 및 표 53)에 채취하여, 14,000rpm에서 20분 동안 원심분리하고 상청액을 -20℃에서 동결시켰다. 샘플 중의 글루코스 농도는 표 51에 기재된 조건을 이용해서 YSI 바이오켐 분석기(Interscience)를 이용하여 분석되었다. 2.5g/ℓ의 글루코스 표준 용액은 증류수에 글루코스(Sigma Cat# G7528-5KG, Lot#:107H0245)를 2.500그람 용해시켜서 준비하였다. 일단 용해되면, 전체 체적은, 매스 플라스크 내에서 증류수에 의해 1ℓ로 되었다. 상기 표준 용액은 주 1회 새로운 것으로 준비되었고 4℃에서 보존되었다.
Figure 112016047841285-pat00032
진탕 플라스크 연구에 이용된 YSI 성분
성분 카탈로그 번호 로트 번호
YSI 글루코스 막 2365 07D100124
YSI 글루코스 완충액 2357 014614A
결과
Figure 112016047841285-pat00033
Figure 112016047841285-pat00034
관 내에서 소화된 셀룰로스의 양은 다음과 같이 계산되었다:
글루코스 g/㎖ × 20㎖ (샘플의 체적) × 0.9 ( 셀룰로스의 가수분해 시 첨가된 물 분자에 대해서 보정하기 위함)
글루코스로서 방출된 총 샘플의 퍼센트(이하의 표 53)는 다음과 같이 계산되었다:
소화된 셀룰로스의 g/첨가된 샘플의 g(상세는 표 5 참조) * 100
Figure 112016047841285-pat00035
실시예 19 - 피키아 스티피티스를 이용한 진탕 플라스크 발효
요약
피키아 스티피티스를 이용한 진탕 플라스크 발효는 표 36으로부터의 최고 성능 %를 지니는 4가지 셀룰로스 재료를 이용해서 수행되었다.
프로토콜
실험은 표 54 내지 표 56에 개략적으로 나타낸 변수 하에 수행되었다.
장비 및 유지보수 빈도
장비 제조사 유지보수 빈도
진탕기(2) B. Braun Biotech, Certomat BS-1 연 4회
분광 광도계 Unicam, UV300 연 2회
YSI 바이오캠 분석기 Interscience, YSI 월 1회
진탕 플라스크 연구에 이용된 YSI 성분
성분 카탈로그 번호 로트 번호
YSI 에탄올 막 2786 07M100361
YSI 에탄올 표준(3.2g/ℓ) 2790 1271040
YSI 에탄올 완충액 2787 07J100215
Figure 112016047841285-pat00036
시드 발육
이하의 진탕 플라스크 실험 모두를 위하여, 시드 플라스크는 다음의 절차를 이용해서 준비되었다.
P. 스티피티스 NRRL Y-7124의 작업 세포 뱅크(working cell bank)는 ARS 컬처 컬렉션으로부터 얻어진 재수화된 동결건조된 배양액으로부터 제조되었다. 15% v/v 글라이세롤 중에 P. 스티피티스 배양액을 수용하는 냉동병(cryovial)을 -75℃에서 보존하였다. 해동된 작업 세포 뱅크 재료의 일부를 YM 브로스 + 20g/ℓ 한천(pH 5.0) 상에 칠하고 30℃에서 2일간 배양하였다. 플레이트는 사용 전에 4℃에서 2일 동안 유지되었다. 배지(40g/ℓ 글루코스, 1.7g/ℓ 효모 질소 기제, 2.27g/ℓ 유레아, 6.56g/ℓ 펩톤, 40g/ℓ 자일로스, pH 5.0) 100㎖를 수용하는 250㎖ 엘렌메이어 플라스크에 1 콜로니 접종하고, 25℃, 100rpm에서 24시간 배양하였다. 23시간의 증식 후, 샘플을 채취하여 광학밀도(UV 분광 광도계에서 600㎚) 및 순도(그람염색)에 대해서 분석하였다. 이들 결과에 의거해서, 모든 테스트 플라스크에 접종하기 위하여 광학밀도 4 내지 8, 깨끗한 그람염색을 지닌 하나의 플라스크("시드 플라스크"라 지칭됨)를 채택하였다.
이들 실험은 샘플 A132-10, A132-100, G132-10 및 G132-100을 이용해서 수행되었다. 실험 번호 1은 글루코스의 농도를 일정하게 하고 자일로스의 농도를 변화시키면서 에탄올 농도에 대해서 4개의 샘플을 테스트하였다. 실험 번호 2는 표 36의 실험에서 이용된 공급원료의 농도를 2배로 해서 에탄올 농도에 대해서 4개의 샘플을 테스트하였다. 최종적으로, 실험 번호 3은 자일로스 농도와 글루코스 농도를 양쪽 모두 동시에 변화시키면서 에탄올 농도에 대해서 4개의 샘플을 테스트하였다.
실험 번호 1 - 자일로스 농도의 변화
4가지 셀룰로스 샘플(A132-10, A132-100, G132-10 및 G132-100)에 대해서 이하의 표 57에 열거된 바와 같이 자일로스 농도를 변화시키면서 테스트하였다.
Figure 112016047841285-pat00037
테스트 용기(총 40개의 250㎖ 엘렌메이어 플라스크)는 배지 100㎖를 수용하였다. 5개의 상이한 유형의 배지가 표 57에 개략적으로 표시된 자일로스 및 글루코스의 양으로 준비되었다. 또한, 해당 배지는 1.7g/ℓ 효모 질소 기제(Becton Dickinson # 291940), 2.27g/ℓ 유레아(ScholAR Chemistry #9472706) 및 6.56g/ℓ 펩톤(Becton Dickinson #211677)을 포함하였다. 모든 플라스크는 테스트 재료의 첨가 전에 121℃, 15 psi에서 빈 상태에서 오토클레이브되었고 또한 필터 멸균된(0.22㎛ 필터) 배지가 플라스크에 첨가되었다. 플라스크는 실온에서 4일간 유지되었고, 사용 전에 오염(흐림도)에 대해서 검사되었다. 테스트 재료는 멸균되지 않았는데, 이는 오토크레이빙이 샘플의 함량을 변화시킬 것이고, 필터 멸균은 고형물의 멸균을 위해 적절하지 않을 것이기 때문이다. 테스트 샘플(5g/100㎖에서 A132-10, A132-100, G132-10 및 G 132-100)은 오염의 가능성을 줄이기 위하여 접종(전보다는 오히려) 시 첨가하였다. 테스트 샘플에 부가해서, 시드 플라스크 재료 1㎖(1% v/v)를 각 플라스크에 첨가하였다. 이들 플라스크를 30℃, 150 rpm에서 72시간 동안 배양하였다.
불행하게도, 하나의 플라스크(100% 자일로스를 지니는 샘플 A132-100)는 테스트 동안 파손되었다. 따라서, 배양 24시간이 경과된 모든 결과가 단일 플라스크로서 기록되어 있다. 배양 72시간 후, 셀룰로스 재료(5.0 g)의 원래의 양의 100%가 100% 자일로스 플라스크(총 7개의 플라스크, 샘플 A132-100를 수용하고 있던 하나의 플라스크가 파손되었음)에 첨가되었고, 추가의 48시간 동안 상기와 같이 배양되었다.
배양 시간 72시간에서의 100% 자일로스 플라스크에의 공급원료의 첨가
공급원료 72시간에서 첨가된 양(g)
A132-10 5
A132-100 5
G132-10 5
G132-100 5
샘플을 0, 6, 12, 24, 36, 48 및 72시간의 배양 시간에 40개의 테스트 플라스크로부터 채취하였다. 또, 샘플을 100% 자일로스 플라스크 내에 제2공급원료량의 후첨가 24 및 48시간째에 채취하였다(표 58 참조).
총 292개의 샘플이 알코올 탈수소효소 평가법에 의거한 YSI 바이오켐 분석기(YSI, Interscience)를 이용해서 에탄올 농도에 대해서 분석되었다. 샘플을 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하고 상청액은 -20℃에서 보관하였다. 단, 시간 0 샘플은 0.45㎛ 시린지 필터를 통한 여과를 필요로 하였다. 샘플은 분석 전에 0 내지 3.2g/ℓ 에탄올로 희석되었다. 2.0g/ℓ 에탄올의 표준은, 멤브레인의 무결성이 분석 동안 유지되는 것을 확실하게 하기 위하여 대략 매 30개의 샘플마다 분석되었다.
총 47개의 샘플이 셀 계수치에 대해서 분석되었다. 샘플은 72시간 배양 및 더 많은 셀룰로스 재료의 48시간 후첨가 시 채취될 것이다. 적절하게 희석된 샘플을 0.05% 트립신 블로와 혼합하고, 뉴바우어 혈구계 내로 장입하였다. 세포는 40배 확대 하에 계수하였다.
실험 번호 2 - 2배 공급원료 농도의 분석
테스트 용기(총 8개의 250㎖ 엘렌메이어 플라스크)는 배지 100㎖를 포함하고 있었다. 상기 배지는 40g/ℓ 글루코스, 40g/ℓ 자일로스, 1.7g/ℓ 효모 질소 기제(Becton Dickinson # 291940), 2.27g/ℓ 유레아(ScholAR Chemistry #9472706) 및 6.56g/ℓ 펩톤(Becton Dickinson #211677)을 포함하고 있었다. 플라스크는 실험 번호 1에서와 마찬가지로 준비되었다. 테스트 샘플(10g/100㎖에서 A132-10, A132-100, G132-10 및 G132-100)은 오염의 가능성을 줄이기 위하여 접종(전보다는 오히려) 시 첨가하였다. 테스트 샘플에 부가해서, 시드 플라스크 재료 1㎖(1% v/v)를 각 플라스크에 첨가하였다. 이들 플라스크를 30℃, 150rpm에서 72시간 동안 배양하였다.
분석
샘플은 0, 6, 12, 24, 36, 48 및 72시간의 배양 시간에 8개의 테스트 플라스크로부터 얻었다. 56개의 샘플의 에탄올 분석은 실험 번호 1에 대해 수행되었고, 표 59에 기록되어 있다. 세포 계수치는 실험 번호 1에 대해서 72시간 샘플에 대해 수행되었고, 표 60에 제시되어 있다.
Figure 112016047841285-pat00038
Figure 112016047841285-pat00039
실험 번호 3 - 자일로스 농도 및 글루코스 농도의 변화
4가지 셀룰로스 샘플(A132-10, A132-100, G132-10 및 G132-100)에 대해서 이하의 표 61에 열거된 바와 같이 자일로스 농도와 글루코스 농도를 변화시키면서 테스트하였다.
Figure 112016047841285-pat00040
테스트 용기(총 32개의 250㎖ 엘렌메이어 플라스크)는 배지 100㎖를 포함하고 있었다. 4종의 상이한 배지는 표 61에 개략적으로 표시된 자일로스 및 글루코스의 양으로 준비되었다. 또한, 배지는 1.7g/ℓ 효모 질소 기제(Becton Dickinson # 291940), 2.27g/ℓ 유레아(ScholAR Chemistry #9472706) 및 6.56g/ℓ 펩톤(Becton Dickinson #211677)을 포함하고 있었다. 플라스크는 실험 번호 1에서와 마찬가지로 준비되었다. 테스트 샘플(A132-10, A132-100, G132-10 및 G132-100)은 오염의 가능성을 줄이기 위하여 접종(전보다는 오히려) 시 첨가하였다. 테스트 샘플에 부가해서, 시드 플라스크 재료 1㎖(1% v/v)를 각 플라스크에 첨가하였다. 이들 플라스크를 30℃, 150rpm에서 72시간 동안 배양하였다.
분석
샘플을 0, 6, 12, 24, 36, 48 및 72시간(표 62 내지 표 65 참조)의 배양 시간에 32개의 32 테스트 플라스크로부터 채취하였다. 총 224개의 샘플은 알코올 탈수소효소 평가법에 의거한 YSI 바이오켐 분석기(YSI, Interscience)를 이용해서 에탄올 농도에 대해서 분석되었다. 샘플을 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하고 상청액은 -20℃에서 보관하였다. 단, 몇몇 샘플은 원심분리 및 0.45㎛ 시린지 필터를 통한 여과를 필요로 하였다. 샘플은 분석 전에 0 내지 3.2g/ℓ 에탄올로 희석되었다. 2.0g/ℓ 에탄올의 표준은, 멤브레인의 무결성이 분석 동안 유지되는 것을 확실하게 하기 위하여 대략 매 30개의 샘플마다 분석되었다.
Figure 112016047841285-pat00041
Figure 112016047841285-pat00042
Figure 112016047841285-pat00043
Figure 112016047841285-pat00044
샘플을 세포 계수치(표 66 내지 67)를 위하여 72시간에 채취하였다. 적절하게 희석된 샘플을 0.05% 트립신 블루와 혼합하고, 뉴바우어 혈구계에 장입하였다. 세포는 40배 확대 하에 계수하였다.
결과
하나의 시드 플라스크가 실험 번호 1 및 2의 테스트 플라스크 모두를 접종하는데 이용되었다. 시드 플라스크의 광학밀도(600㎚)는 5.14인 것으로 측정되었고, 세포 농도는 4.65×108 세포/㎖였다(표 65 내지 표 66). 따라서, 테스트 플라스크 내의 세포의 초기 농도는 대략 4.65×106 세포/㎖였다.
두번째 시드 플라스크는 실험 번호 3 플라스크를 접종하는데 이용되었다. 해당 시드 플라스크의 광학밀도(600㎚)는 5.78이었고, 세포 농도는 3.75×108 세포/㎖였다. 따라서, 테스트 플라스크 내의 세포의 초기 농도는 대략 3.75×106 세포/㎖였다.
Figure 112016047841285-pat00045
Figure 112016047841285-pat00046
실시예 20 - P. 스티피티스 및 S. 세레비시애에 대한 리그노셀룰로스 샘플의 독성 테스트
요약
37개의 샘플이 2개의 에탄올-생산 배양액인 사카로마이세스 세레비시아 및 피키아 스티피티스에 대한 독성에 대해서 분석되었다. 이 연구에 있어서, 글루코스는 배양액의 결핍과 샘플의 독성 간에 구별하기 위하여 샘플에 첨가되었다.
Figure 112016047841285-pat00047
프로토콜
사용된 프로토콜의 요약은 표 68에 열거되어 있다. 독성 테스트에 이용된 화학약품의 설명은 표 69에 열거되어 있다. 2개의 대조 플라스크(샘플 무첨가)가 테스트하는 각 주 동안 각 미생물에 대해서 수행되었다. 총 82개의 플라스크가 분석되었다.
실험 동안, 처음 배양 24시간에 샘플 C, C-1e, C-5e 및 C-10e를 포함하는 P. 스티피티스 플라스크에서는 에탄올이나 세포는 보이지 않았다. 결과를 확인하기 위하여, 테스트를 반복해서 행하였다. 두번째 테스트는 샘플 C, C1E, C5E 및 C10E가 플라스크에 첨가된 경우 P. 스티피티스 증식의 소정의 저해를 확인하였다.
Figure 112016047841285-pat00048
독성 연구에 이용된 YSI 성분
성분 카탈로그 번호
YSI 에탄올 막 2786
YSI 에탄올 표준(3.2g/ℓ) 2790
YSI 에탄올 완충액 2787
테스트 샘플
7개의 테스트 샘플(모두 C 명칭을 지님)을 작은 샘플에 적합한 커피 그라인더를 이용해서 분쇄하였다. 이들 샘플은 맨 눈으로 (샘플들 간에) 일정한 입자 크기로 되도록 분쇄하였다. 샘플 번호 C-100e는 작은 입자 크기로 용이하게 분쇄되었다.
모든 샘플은 6개의 P 샘플(25g/ℓ)을 제외하고 50g/ℓ의 농도에서 플라스크에 첨가하였다. 이들 샘플은 회색을 띤 백색으로 되었고, 육안으로 솜털 형상이 보였으며, 이들 플라스크는 50g/ℓ 농도에서 (유리 액체가 충분하지 않아) 적절하게 혼합되지 않았다. 샘플들 S는 용이하게 용해되어, 장래에 보다 높은 농도에서 플라스크에 첨가될 수 있었다. 샘플들 A 및 G는 장래에 100g/ℓ로 첨가될 수 있었다.
테스트는 다음과 같이 두 종의 미생물을 이용해서 수행되었다.
사카로마이세스 세레비시애 ATCC 24858(American Type Culture Collection)
S. 세레비시애 ATCC 24858의 작업 세포 뱅크는 ATCC로부터 얻어진 재수화된 동결건조된 배양액으로부터 제조되었다. 15% v/v 글라이세롤 중에 S. 세레비시애 배양액을 수용하는 냉동병을 -75℃에서 보존하였다. 해동된 작업 세포 뱅크 재료의 일부를 YM 브로스 + 20g/ℓ 한천(pH 5.0) 상에 칠하고 30℃에서 2일간 배양하였다. 배지(20g/ℓ 글루코스, 3g/ℓ 효모 추출물 및 5.0g/ℓ 펩톤, pH 5.0) 100㎖를 수용하는 250㎖ 엘렌메이어 플라스크에 YM 플레이트로부터 1 콜로니 접종하고, 25℃, 200rpm에서 24시간 배양하였다. 23시간의 증식 후, 샘플을 채취하여 광학밀도(UV 분광 광도계에서 600㎚) 및 순도(그람염색)에 대해서 분석하였다. 이들 결과에 의거해서, 증식 플라스크에 접종하기 위하여 광학밀도 9 내지 15, 깨끗한 그람염색을 지닌 하나의 플라스크("시드 플라스크"라 지칭됨)를 채택하였다. 23시간의 증식 후, 시드 플라스크는 낮은 OD(5.14)와 세포 계수치(1.35×108 세포/㎖)를 지녔다. 단, 시드 플레이트로부터 채취한 콜로니는 통상보다 작았다. 따라서, 시드 재료 0.5㎖(계획된 0.1㎖과 대조적임)를 각 테스트 용기에 첨가하였다.
테스트 용기는 전술한 멸균 배지 100㎖를 수용하는 500㎖ 엘렌메이어 플라스크였다. 모든 플라스크는 테스트 재료의 첨가 전에 121℃, 15 psi에서 오토클레이브되었다. 테스트 재료는 멸균되지 않았는데, 이는 오토크레이빙이 샘플의 함량을 변화시킬 것이기 때문이다. 테스트 샘플은 오염의 가능성을 줄이기 위하여 접종(전보다는 오히려) 시 첨가하였다. 테스트 샘플에 부가해서, 시드 플라스크 재료 0.5 내지 1.0㎖(0.5 내지 1.0% v/v)를 각 플라스크에 첨가하였다. 이들 플라스크를 72시간 동안 전술한 바와 같이 배양하였다.
피키아 스티피티스 (ARS 컬처 컬렉션)
P. 스티피티스 NRRL Y-7124의 작업 세포 뱅크는 ARS 컬처 컬렉션으로부터 얻어진 재수화된 동결건조된 배양액으로부터 제조되었다. 15% v/v 글라이세롤 중에 P. 스티피티스 배양액을 수용하는 냉동병을 -75℃에서 보존하였다. 해동된 작업 세포 뱅크 재료의 일부를 YM 브로스 + 20g/ℓ 한천(pH 5.0) 상에 칠하고 30℃에서 2일간 배양하였다. 플레이트는 사용 전에 4℃에서 5일까지 동안 유지되었다. 배지(40g/ℓ 글루코스, 1.7g/ℓ 효모 질소 기제, 2.27g/ℓ 유레아, 6.56g/ℓ 펩톤, 40g/ℓ 자일로스, pH 5.0) 100㎖를 수용하는 250㎖ 엘렌메이어 플라스크에 1 콜로니 접종하고, 25℃, 125rpm에서 24시간 배양하였다. 23시간의 증식 후, 샘플을 채취하여 광학밀도(UV 분광 광도계에서 600㎚) 및 순도(그람염색)에 대해서 분석하였다. 이들 결과에 의거해서, 모든 테스트 플라스크에 접종하기 위하여 광학밀도 5 내지 9, 깨끗한 그람염색을 지닌 하나의 플라스크("시드 플라스크"라 지칭됨)를 채택하였다.
테스트 용기는 전술한 멸균 배지 100㎖를 수용하는 250㎖ 엘렌메이어 플라스크였다. 모든 플라스크는 테스트 재료의 첨가 전에 121℃, 15 psi에서 오토클레이브되었고 또한 필터 멸균된(0.22㎛ 필터) 배지가 테스트 재료의 첨가 전에 플라스크에 첨가되었다. 테스트 재료는 멸균되지 않았는데, 이는 오토크레이빙이 샘플의 함량을 변화시킬 것이고, 필터 멸균은 고형물의 멸균을 위해 적절하지 않을 것이기 때문이다. 테스트 샘플은 오염의 가능성을 줄이기 위하여 접종(전보다는 오히려) 시 첨가하였다. 테스트 샘플에 부가해서, 시드 플라스크 재료 1㎖(1% v/v)를 각 플라스크에 첨가하였다. 이들 플라스크를 72시간 동안 전술한 바와 같이 배양하였다.
분석
샘플을 접종 직전에 시드 플라스크로부터 그리고, 24시간 및 72시간에 각 테스트 플라스크로부터 채취하고, 직접 계수치를 이용해서 세포 농도에 대해서 분석하였다. S. 세레비시애 및 P. 스티피티스의 적절하게 희석된 샘플을 0.05% 트립신 블루와 혼합하고, 뉴바우어 혈구계 내로 장입하였다. 세포를 40배 확대 하에 계수하였다.
샘플을 0, 6, 12, 24, 36, 48 및 72시간에 각 플라스크로부터 채취하고, 알코올 탈수소효소 평가법에 의거한 YSI 바이오켐 분석기(YSI, Interscience)를 이용해서 에탄올 농도에 대해서 분석하였다. 샘플을 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하고 상청액은 -20℃에서 보관하였다. 샘플은 분석 전에 0 내지 3.2g/ℓ 에탄올로 희석되었다. 2.0g/ℓ 에탄올의 표준은, 멤브레인의 무결성이 분석 동안 유지되는 것을 확실하게 하기 위하여 대략 매 30개의 샘플마다 분석되었다.
계산
세포 계수치 및 에탄올 농도를 대조 플라스크와 비교하는데 이하의 계산이 이용되었다.
성능 % = (테스트 플라스크 내의 에탄올의 농도/대조군 내의 에탄올 농도)*100
세포 % = (테스트 플라스크 내의 세포 수/대조 플라스크 내의 세포 수)*100
결과
S. 세레비시애 시드 플라스크는 광학밀도(600㎚)가 5.14, 세포 농도가 1.35×108 세포/㎖였다. 시드 플라스크 재료 ½㎖를 각 테스트 플라스크에 첨가하였다. 따라서, 각 플라스크 내의 출발 세포 농도는 6.75×105/㎖였다. 테스트하는 2주 동안, S. 세레비시애 시드 플라스크는 광학밀도(600㎚)가 4.87, 세포 농도가 3.15×107 세포/㎖였다. 시드 플라스크 재료 1㎖를 각 테스트 플라스크에 첨가하였다. 따라서, 각 플라스크 내의 출발 세포 농도는 6.30×105/㎖였다. 샘플 시간 0시간에서의 S. 세레비시애 플라스크의 pH는 표 71에 제시되어 있다. 플라스크 내용물의 pH는 S. 세레비시애 증식을 위한 최적 pH(pH 4-6) 내였다. 어떠한 pH 조정도 필요로 하지 않았다.
Figure 112016047841285-pat00049
S. 세레비시애 플라스크 내의 에탄올 농도 및 성능은 표 72 및 표 73에 제시되어 있다. 최고 에탄올 농도는 S 시리즈에 의해 생산되었다.
Figure 112016047841285-pat00050
Figure 112016047841285-pat00051
S. 세레비시애 플라스크 내의 세포 농도 및 세포 %는 표 74에 제시되어 있다. 높은 세포 계수치가 모든 플라스크에서 관찰되었지만, 모든 세포가 에탄올을 제조하는 것은 아니었다.
Figure 112016047841285-pat00052
P. 스티피티스 시드 플라스크는 광학밀도(600㎚)가 5.01, 세포 농도가 3.30×108 세포/㎖였다. 시드 플라스크 재료 1㎖를 각 테스트 플라스크에 첨가하였다. 따라서, 각 플라스크 내의 출발 세포 농도는 3.30×106/㎖였다. 테스트하는 2주 동안, P. 스티피티스 시드 플라스크는 광학밀도(600㎚)가 5.45, 세포 농도가 3.83×108 세포/㎖였다. 시드 플라스크 재료 1㎖를 각 테스트 플라스크에 첨가하였다. 따라서, 각 플라스크 내의 출발 세포 농도는 3.83×106/㎖였다. 샘플 시간 0시간에서의 P. 스티피티스 플라스크의 pH는 표 75에 제시되어 있다. 플라스크 내용물의 pH는 P. 스티피티스 증식을 위한 최적 pH 내(pH 4 내지 7)였다. pH 조정은 하등 필요하지 않았다.
Figure 112016047841285-pat00053
P. 스티피티스 플라스크에서의 에탄올 농도 및 성능은 표 76 및 표 77에 제시되어 있다. 최고 에탄올 농도는 G 및 A 시리즈였다. 플라스크 C-30e, C-50e 및 C-100e는 또한 높은 농도의 에탄올을 함유하였다. P. 스티피티스 플라스크 내의 세포 농도 및 세포 %는 표 78에 제시되어 있다. 낮은 세포 농도는 S 명칭을 지닌 플라스크에서 관찰되었다. 낮은 세포 계수치는 또한 24시간 샘플 시간에서 샘플 C, C1E, C5E 및 C10E를 포함하고 있는 플라스크에서 관찰되었다.
Figure 112016047841285-pat00054
Figure 112016047841285-pat00055
Figure 112016047841285-pat00056
세포 독성 결과 요약
지모모나스 모빌리스
차트 1A에 표시된 바와 같이, 상승된 세포 수(예컨대, 대조군보다 큼)가 24시간 시점에서 P-132-10, G-132-10 및 WS-132-10을 함유하는 샘플에서 관찰되었다. 다른 모든 샘플의 존재에서의 셀 수는 대조군과 필적할만하였다. 이 관찰은 기질이 파종 후 24시간까지 Z. 모빌리스를 향하여 독성이 없었던 것을 나타낸다.
36시간 시점에서, (예컨대, 세포의 손실 혹은 세포 사멸로 인한) 셀 수의 저감이 대조군을 비롯한 모든 샘플에 대해서 관찰되었다. 셀 수의 가장 큰 저감은 P-132-10, G-132-10를 함유하는 샘플들에 대해서 관찰되었다. 이 효과의 마찬가지 원인은 대조군을 비롯한 모든 샘플에 대해서 공통이다. 따라서, 이 효과의 원인은 테스트 기질이 아닌데, 그 이유는 이들이 각 샘플에 있어서 다양하고 대조군에서는 제공되지 않았기 때문이다. 이 관찰에 대한 가능한 설명은 부적절한 배양 조건(예컨대, 온도, 배지 조성물) 혹은 샘플 내의 에탄올 농도를 포함한다.
Figure 112016047841285-pat00057
차트 1B에 표시된 바와 같이, 모든 세포는 기질에 관계없이, 각 시점에서 필적하는 양의 에탄올(예컨대, 5 내지 10g/ℓ)을 생산하였다. 차트 1A에 제시된 세포수 데이터와 일치하여, 각 샘플 내의 에탄올 농도는 24시간 시점에서 피크를 이루었다. 세포수 데이터와 대조적으로, 에탄올 농도는 후속의 시점에서 감소되지 않았다. 이것은 에탄올이 그 계로부터 제거되지 않았기 때문인 것으로 예상되었다. 또한, 이 데이터는 이들 샘플 내의 에탄올 생산이 배지 내의 글루코스의 발효에 기인될 수 있는 것을 시사한다. 테스트된 어느 기질도 에탄올 생산을 증가시키는 것으로 보이지 않았다.
Figure 112016047841285-pat00058
차트 1A 및 1B는 함께 약 6g/ℓ 이상의 에탄올 농도가 Z. 모빌리스에 대해서 독성이 있을 수 있는 것을 시사한다. 이 데이터는 또한, 차트 1C에 표시된 바와 같이, 대조군에 대해서 정규화된 퍼센트로서 제시되어 있다.
Figure 112016047841285-pat00059
피키아 스티피티스
차트 2A에 표시된 바와 같이, 세포 수는 대조군에 대해서 필적할 만하였다. 또한, 다소 저감된 세포 수가 G-132 및 WS-132를 함유하는 세포에서 제공되었지만, 감소된 세포 수는 G-132-10, G-132-100, A-132-10 혹은 A-132-100에 대해서 관찰되지 않았다. 이와 같이 해서, 기질 G 혹은 A가 독성이 있는 것 같지는 않다. 오히려, G-132 및 WS-132에 대해서 관찰된 감소된 세포 수는 실험적인 예외에 의해 혹은 아무튼 세포 증식을 방해하는 비처리된 기질의 존재에 의해 초래되는 것으로 여겨진다. 종합적으로, 이 데이터는, 대조군 및 실험 샘플에 존재하는 글루코스가 최적의 P. 스티피티스 증식을 촉진시키는데 충분히 안성맞춤이고, 또한 샘플 내의 추가의 기질의 존재가 이 증식률을 증가시키지 않는 것을 시사하고 있다. 이들 결과는 또한 어떠한 샘플도 P. 스티피티스에서 독성이 없다는 것을 시사한다.
Figure 112016047841285-pat00060
차트 2B에 표시된 바와 같이, 차트 2B에 보고된 유사한 세포 수에도 불구하고, 크게 증가된 에탄올 생산이 실험 기질을 포함하는 모든 샘플에 있어서 관찰되었다. 에탄올 농도는 테스트된 3가지 시점의 각각에서 시간 경과에 따라 증가되었다. 에탄올의 최고 농도는 48시간 시점에서 A-132-10(예컨대, 대략 26.0g/ℓ)에 대해서 관찰되었다. 차트 2B에 제시된 세포수 데이터를 지니는 최고 레벨의 에탄올 생산을 지니는 기질 농도와 비교함으로써, P. 스티피티스는 에탄올 농도 증가에 민감한 것으로 보이지 않는 것을 알 수 있다. 또한, 에탄올 생산은 세포 수와 관련된 것으로 보이지 않고, 오히려 샘플에 존재하는 기질의 유형과 관련된 것으로 보인다.
Figure 112016047841285-pat00061
차트 2A 및 2B에 제시된 결과는 함께, 실험적 기질들이 증가된 P. 스티피티스 증식을 촉진하지 않지만, 이들은 이 세포 유형에 의해 생산된 에탄올의 양을 크게 증가시키는 것을 시사한다. 이 데이터는 또한 차트 2C에 표시된 바와 같이, 대조군에 대해서 정규화된 퍼센트로서 제시되어 있다.
Figure 112016047841285-pat00062
사카로마이세스 세레비시애
차트 3A에 표시된 바와 같이, G-132-100, A-132, A-132-10, A-132-100 및 WS-132는 대조군에 비해서 셀 수의 다소의 상승을 촉진하였다. 어떠한 샘플에 대해서도 셀 수의 유의한 감소는 관찰되지 않았다. 이들 결과는 어떠한 샘플도 S. 세레비시애에서 독성이 없다는 것을 시사한다.
Figure 112016047841285-pat00063
차트 3B에 표시된 바와 같이, 증가된 에탄올 생산은 대조군에 비해서 각 세포 종류로 처리된 세포에서 관찰되었다. 차트 3A에 제시된 세포수 데이터를 지니는 최고량의 에탄올을 함유하는 이들 샘플의 비교는, 5g/ℓ를 초과한 에탄올 농도가 셀 수에 역효과를 지닐 수 있다는 것을 시사한다. 그러나, 이 관찰은 모든 샘플에 대해서 그러한 것은 아니다.
Figure 112016047841285-pat00064
이 데이터는 또한, 차트 3C에 표시된 바와 같이, 대조군에 대해서 정규화된 퍼센트로서 제시되어 있다.
Figure 112016047841285-pat00065
결론적으로, 테스트된 샘플의 어느 것도 Z. 모빌리스, P. 스티피티스 또는 S. 세레비시애에 대해서 독성을 보이지 않았다. 또한, P. 스티피티스는 테스트된 실험 기질로부터 에탄올을 생산하기 위하여 3종의 세포 종류가 가장 효율적이라는 것을 나타내고 있었다.
기타 실시형태
본 발명의 많은 실시형태가 기술되어 있지만, 본 발명의 정신과 범위로부터 벗어나는 일없이 각종 변경이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
예를 들어, 상기 섬유는 임의의 소망의 형태일 수 있고, 다양한 상이한 형태를 지닐 수 있다. 일반적으로, 셀룰로스 재료는 높은 표면적을 지니는 것이 바람직하다. 몇몇 경우에, 상기 섬유는 단층 혹은 다층 시트 내로 편입될 수 있고, 예컨대, 섬유는 HEPA 필터 등의 일부일 수 있다. 해당 시트 재료는, 예를 들어, 약 1 내지 500㎡/g의 표면적을 지닐 수 있다. 상기 섬유 재료는, 적층되거나, 예컨대, 용융분사(meltblown)되거나, 접히거나 또는 체 혹은 망의 형태일 수 있거나, 또는 다른 기하학적 형태로 제공될 수 있다. 섬유는 압출되거나 공압출될 수 있다.
섬유는 나노-규모, 예컨대, 약 1000㎚ 이하, 예컨대, 500㎚, 250㎚, 100㎚, 50㎚, 25㎚ 이하, 혹은 심지어 1㎚ 이하에서부터, 보다 큰 입자 크기, 예컨대, 100㎛, 200㎛, 500㎛ 이상 또는 심지어 1000㎛ 이상, 또는 입자들의 응집체까지 임의의 소망의 입자 크기를 지닐 수 있다.
바이오매스 기질이 본 명세서에 기재되어 있지만, 이러한 기질은 다른 기질, 예를 들어, 미국 특허 가출원 제61/252,300호(출원일: 2009년 10월 16일)에 개시된 무기 및 합성 기질과 조합하여 이용될 수 있으며, 해당 문헌의 전체 개시내용은 참조로 본 명세서에 포함된다.
섬유 혹은 해당 섬유를 함유하는 섬유 재료는 미생물 및/또는 효소로 전처리될 수 있고/있거나, 해당 섬유 혹은 섬유 재료는 당화 혹은 발효 등과 같은 바이오처리 동안 미생물 및/또는 효소와 접촉될 수 있다.
전술한 바와 같이, 효소는 미생물 대신에 혹은 미생물에 부가해서 섬유 상에 고정화될 수 있다.
효소, 및 바이오매스의 셀룰로스 및/또는 리그닌 부분 등과 같은 바이오매스를 파괴하는 바이오매스-파괴 유기체는 각종 셀룰로스 분해효소(셀룰라제), 리그닌분해효소 혹은 각종 소분자 바이오매스-파괴 대사산물을 포함하거나 만든다. 이들 효소는 바이오매스의 결정성 셀룰로스 혹은 리그닌 부분을 분해시키는데 상승적으로 작용하는 효소의 복합체일 수 있다. 셀룰로스 분해 효소의 예로는 엔도글루카나제류, 셀로바이오하이드롤라제류 및 셀로비아제류(β-글루코시다제류)를 들 수 있다. 당화 동안, 셀룰로스 기질은 초기에 랜덤 개소에서 엔도글루카나제에 의해 가수분해되어 올리고머 중간생성물을 생성한다. 이들 중간생성물은 이어서 셀룰로스 폴리머의 말단으로부터 셀로비오스를 생산하기 위한 셀로비오하이드롤라제 등과 같은 엑소-스플리팅(exo-splitting) 글루카나제용의 기질이다. 셀로비오스는 글루코스의 수용성 1,4-결합된 이량체이다. 최종적으로 셀로비아제는 셀로비오스를 쪼개어 글루코스를 수득한다.
셀룰라제는 바이오매스를 분해시키는 능력을 지니며, 진균 혹은 박테리아로부터 유래될 수 있다. 적절한 효소로는 바실러스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 후미콜라(Humicola), 푸사륨(Fusarium), 티엘라비아(Thielavia), 아크레모늄(Acremonium), 크리소스포륨(Chrysosporium) 및 트리코더마(Trichoderma) 속으로부터의 셀룰라제를 들 수 있고, 또한 후미콜라(Humicola), 코프리누스(Coprinus), 티엘라비아(Thielavia), 푸사륨(Fusarium), 마이셀리오프토라(Myceliophthora), 아크레모늄(Acremonium), 세팔로스포륨(Cephalosporium), 스키탈리듐(Scytalidium), 페니실륨(Penicillium) 혹은 아스페르길루스(Aspergillus) 속(예를 들어, EP 458162 참조), 특히 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens)(스키탈리듐 써모필룸(Scytalidium thermophilum)으로서 재분류됨, 예를 들어, 미국 특허 제4,435,307호 참조), 코프리너스 시네레우스 ( Coprinus cinereus), 푸사륨 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 마이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila), 메리필루스 기간테우스(Meripilus giganteus), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 아크레모늄 종(Acremonium sp.), 아크레모늄 페르시시넘(Acremonium persicinum), 아크레모늄 아크레모늄(Acremonium acremonium), 아크레모늄 브라키페늄(Acremonium brachypenium), 아크레모늄 디크로모스포룸(Acremonium dichromosporum), 아크레모늄 오브클라바툼(Acremonium obclavatum), 아크레모늄 핀커토니애(Acremonium pinkertoniae), 아크레모늄 로세오그리세움(Acremonium roseogriseum), 아크레모늄 인콜로라툼(Acremonium incoloratum) 및 아크레모늄 푸라툼(Acremonium furatum)종으로부터; 바람직하게는, 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) DSM 1800, 후미콜라 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) DSM 2672, 마이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila) CBS 117.65, 세팔로스포륨 종(Cephalosporium sp .) RYM-202, 아크레모늄 종 CBS 478.94, 아크레모늄 종 CBS 265.95, 아크레모늄 페르시시넘 CBS 169.65, 아크레모늄 아크레모늄 AHU 9519, 세팔로스포륨 종 CBS 535.71, 아크레모늄 브라키페늄 CBS 866.73, 아크레모늄 디크로모스포룸 CBS 683.73, 아크레모늄 오브클라바툼 CBS 311.74, 아크레모늄 핀커토니애 CBS 157.70, 아크레모늄 로세오그리세움 CBS 134.56, 아크레모늄 인콜로라툼 CBS 146.62 및 아크레모늄 푸라툼 CBS 299.70H 종으로부터 선택된 균주에 의해 생산된 것들을 들 수 있다. 셀룰로스 분해 효소는 또한 크리소스포륨, 바람직하게는 크리소스포륨 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense)의 균주로부터 얻어질 수도 있다. 또한, 트리코더마(특히 트리코더마 비리데(Trichoderma viride), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei) 및 트리코더마 코닌기이(Trichoderma koningii)), 호알칼리성 바실러스(alkalophilic Bacillus)(예를 들어, 미국 특허 제3,844,890호 및 EP 458162 참조) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)(예를 들어, EP 458162 참조)가 이용될 수 있다.
적절한 셀로비아제는 상표명 NOVOZYME 188™ 하에 판매되고 있는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)로부터의 셀로비아제를 포함한다.
상표명 ACCELLERASE(등록상표), 예를 들어, Accellerase(등록상표) 1500 효소 복합체 하에 시판되고 있는 것들과 같은 효소 복합체가 이용될 수 있다. Accellerase(등록상표) 1500 효소 복합체는 다수의 효소 활성, 주로 엑소글루카나제, 엔도글루카나제(2200-2800 CMC U/g), 헤미-셀룰라제 및 베타-글루코시다제(525-775 pNPG U/g)를 함유하며, 그의 pH는 4.6 내지 5.0이다. 상기 효소 복합체의 엔도글루카나제 활성은 카복시메틸세룰로스 활성 유닛(carboxymethylcellulose activity unit: CMC U)으로 표현되는 한편, 베타-글루코시다제 활성은 pNP-글루코사이드 활성 단위(pNP-glucoside activity unit: pNPG U)로 기재되어 있다. 일 실시형태에서, Accellerase(등록상표) 1500 효소 복합체와 NOVOZYME™ 188 셀로비아제의 배합물이 이용된다.
따라서, 기타 실시형태는 이하의 특허청구범위의 범주 내이다.

Claims (21)

  1. 작용화된(functionalized) 바이오매스를 생성하는, 작용화 모듈;
    상기 작용화된 바이오매스에 미생물을 고정시키는 기질 제공 모듈로서, 상기 작용화된 바이오매스와 상기 미생물 상의 상보적인 하전된 작용기(complementary charged group)의 이온 결합에 의해 고정화된 미생물을 갖는 섬유 시트의 형태로 상기 기질을 생성하는, 기질 제공 모듈;
    발효 탱크;
    상기 기질을 상기 발효 탱크로 전달하는, 전달 모듈;
    저분자량 당이 용해된 용액을 상기 발효 탱크로 전달하는, 저분자량 당 제공 모듈을 포함하고,
    상기 작용화 모듈은 바이오매스 공급원료에 방사선을 조사하고 작용기를 형성하는 입자빔 가속기를 포함하는, 발효 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시트는 다층 시트인, 발효 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 상기 시트는 적층되거나 접히거나 또는 체 혹은 망의 형태인, 발효 시스템.
  4. 제1항에 있어서, 상기 바이오매스 공급원료는 내부 섬유를 지니고 해당 내부 섬유는 노출되고 전단된 내부 섬유를 포함하는, 발효 시스템.
  5. 제4항에 있어서, 상기 바이오매스 섬유는 70% 이상의 다공도(porosity)를 갖는 것인, 발효 시스템.
  6. 제4항에 있어서, 상기 바이오매스 섬유는 압출되거나 공압출된 것인, 발효 시스템.
  7. 제1항에 있어서, 상기 바이오매스 공급원료를 기계적으로 처리하는 모듈을 더 포함하는, 발효 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 상기 기계적 처리를 위한 모듈은 상기 바이오매스 공급원료의 형태를 변화시키도록 하는 것이고, 상기 변화되는 형태는 표면적, 다공도, 벌크 밀도, 및 기계적으로 처리된 섬유의 폭에 대한 길이의 비로 이루어진 군으로부터 선택되는, 발효 시스템.
  9. 제8항에 있어서, 상기 기계적으로 처리된 섬유는 0.5mm 내지 2.5mm의 평균 길이를 가지며, 상기 폭에 대한 길이의 비는 8 이상인, 발효 시스템.
  10. 제1항에 있어서, 상기 작용화 모듈은 1 내지 100 MRad의 방사선 선량을 전달하는, 발효 시스템.
  11. 제1항에 있어서, 상기 시스템은 하나 이상의 유지 탱크, 스트립 탑, 증류 유닛, 혼합기, 건조 유닛을 포함하는, 발효 시스템.
  12. 제1항에 있어서, 상기 작용화 모듈은 상기 기질 제공 모듈 및 발효 탱크와 다른 장소에 위치되고, 상기 시스템은 철도, 트럭, 또는 해양 선박으로부터 선택되는 다른 장소 간의 수송 방법을 포함하는, 발효 시스템.
  13. 제1항에 있어서, 상기 발효 시스템은 발효 공정 이후에 상기 기질을 회수하는 회수 모듈을 포함하고,
    상기 회수 모듈은 상기 기질을 하나 이상의 발효를 위해 재사용할 수 있는 조건으로 상기 미생물을 갖는 기질을 회수하는, 발효 시스템.
  14. 제1항에 있어서, 상기 입자빔 가속기는 전자보다 무거운 입자를 전달하는, 발효 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 상기 전자보다 무거운 입자는 질소 원자 또는 산소 원자인, 발효 시스템.
  16. 제14항에 있어서, 상기 전자보다 무거운 입자는 인 원자인, 발효 시스템.
  17. 제14항에 있어서, 상기 전자보다 무거운 입자는 황 원자인, 발효 시스템.
  18. 제14항에 있어서, 상기 전자보다 무거운 입자는 양자, 헬륨 핵, 아르곤 이온, 규소 이온, 네온 이온, 탄소 이온, 인 이온, 산소 이온 및 질소 이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 발효 시스템.
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  20. 삭제
  21. 삭제
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