JP2015156864A - バイオマス加工方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】セルロース系及び/又はリグノセルロース系材料等を電離放射線照射、化学的酸化、超音波処理、又は熱分解等の方法によって酸化培地中で酸化したバイオマス繊維上に醗酵微生物(S.セレビシエ、P.スチピチス、及びザイモモナス・モビリス)を固定化したシートに低分子量の糖を接触させ、醗酵させる。
【選択図】図1
Description
本願は、2009年4月4日出願の米国特許仮出願第12/417,840号、2009年5月20日出願の米国特許出願第61/180,032号および2009年10月16日出願の米国特許仮出願第61/252,293号に対する優先権を主張する。これらの各特許仮出願の全開示は本明細書中で参照により本明細書に組み入れられる。
セルロース系およびリグノセルロース系材料が多くの用途で大量に生産、加工および使用されている。このような材料は一度使用されると、廃棄物として捨てられるかまたは、例えば、汚水、バガス、おがくずおよびストーバーなど、単に廃棄物とみなされることが多い。
場合によって、プロセス中、例えば発酵中にバイオマスが存在することによって、低分子量の糖の中間体または生成物への変換が促進される。本発明者らは、低分子量の糖、培地、例えば溶媒または溶媒系、および微生物との混合物中にバイオマスを入れることによって、糖の、例えばエタノールまたはブタノールなどのアルコールへの変換により得られる中間体または生成物の収率および産生速度を向上させることができることを見出した。バイオマスを入れることによって、例えば発酵によって、不完全な、遅いまたは「足止め状態の」生成物変換を防ぐこともできる。
バイオマス材料上に固定化されている微生物および/または酵素を使用する、低分子量の糖を生成物に変換することを含む方法。
[本発明1002]
前記バイオマス材料が官能化バイオマス繊維を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
変換が、前記微生物が前記低分子量の糖の少なくとも一部を炭化水素、アルコールまたは水素に変換することを可能にすることを含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記アルコールがエタノールを含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記微生物が酵母を含む、先行する本発明の何れかの方法。
[本発明1006]
前記酵母がS.セレビシエ(S.cerevisiae)およびP.スチピチス(P.stipitis)からなる群から選択される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記微生物が細菌を含む、先行する本発明の何れかの方法。
[本発明1008]
前記細菌がザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)を含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記官能化バイオマス繊維を生成させるためにバイオマス繊維に照射することをさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1010]
照射が、電離放射線で照射することを含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
照射が粒子ビームを用いて行われる、本発明1009の方法。
[本発明1012]
前記バイオマス材料がセルロース系またはリグノセルロース系材料を含む、先行する本発明の何れかの方法。
[本発明1013]
前記バイオマス繊維が0.25m2/gより大きいBET表面積を有する、本発明1002の方法。
[本発明1014]
変換が発酵を含む、先行する本発明の何れかの方法。
[本発明1015]
前記バイオマス繊維が、紙、紙製品、紙くず、木材、削片板、おがくず、農業廃棄物、汚水、サイレージ、草、もみ殻、バガス、ジュート、麻、亜麻、竹、サイザルアサ、マニラアサ、藁、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、スイッチグラス、アルファルファ、乾草、ココナツヘア、綿花、海草、藻およびそれらの混合物からなる群から選択されるバイオマスに由来する、本発明1002の方法。
[本発明1016]
前記バイオマス繊維が、内部繊維を有するバイオマス原料由来であり、その内部繊維が実質的に露出される程度に剪断されている、本発明1002の方法。
[本発明1017]
前記バイオマス繊維が70%を超える気孔率を有する、本発明1002の方法。
[本発明1018]
前記変換の工程が少なくとも140%の%パフォーマンスを示す、先行する本発明の何れかの方法。
[本発明1019]
変換後に前記バイオマス繊維を回収し、第2の後続の変換プロセスにおいて該繊維を再使用することをさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1020]
前記バイオマス繊維が単層または多層シートの形態で提供される、本発明1002の方法。
[本発明1021]
前記バイオマス繊維が、重なり、折り畳まれている繊維性材料の形態でまたはスクリーンもしくはメッシュの形態で提供される、本発明1002の方法。
[本発明1022]
前記バイオマス繊維が、押出されるかまたは共押出されている、本発明1002の方法。
[本発明1023]
前記繊維がナノスケールの平均粒径を有する、本発明1002の方法。
[本発明1024]
変換が、前記低分子量の糖およびバイオマスを液体培地に導入することを含み、前記繊維または前記繊維を含有する繊維性材料を微生物および/または酵素で前処理してから、該繊維または材料を該培地に導入することをさらに含む、先行する本発明の何れかの方法。
[本発明1025]
極性官能基を有するバイオマス材料と、
相補的な官能基を有する微生物および/または酵素と、
液体培地と
を含む混合物。
[本発明1026]
バイオマス繊維と、バイオマス繊維上に固定化されている微生物および/または酵素とを含む、組成物。
[本発明1027]
前記繊維が官能基を有し、前記微生物および/または酵素が相補的官能基を有する、本発明1026の組成物。
本発明のその他の特性および長所は以下の詳細な説明から明らかとなり、特許請求の範囲を形成する。
本明細書中に記載の方法を用いて、カルボン酸基、エノール基、アルデヒド基、ケトン基、ニトリル基、ニトロ基またはニトロソ基などの官能基の所望のタイプおよび量を有する官能化バイオマス材料を調製することができる。このような官能化材料は、例えば発酵プロセス中、低分子量の糖の生成物への変換を促進し得る。
本明細書中に記載のプロセスでの使用に好ましいバイオマス材料は、糖の変換において使用しようとする、例えば酵母などの微生物といった作用物質上の官能基と相補的である官能基で官能化することができる繊維を含有する。
図1はバイオマス、特に繊維状バイオマスを処理し、次いで処理したバイオマスを用いて発酵プロセスを促進するためのシステム100を示す。システム100には、バイオマス原料が機械的に処理される、例えば原料の内部繊維を曝露させる、モジュール102が含まれる。機械的処理の例は下記で詳述する。システム100は、機械的に処理した原料が例えば照射により官能化されるモジュール104も含む。官能化後、官能化繊維は、送達モジュール108によって発酵システム106に送り込まれる。
バイオマス材料の形態を変化させるためにおよび/または材料を官能化するために使用され得る物理的プロセスは、機械的処理、化学的処理、照射、超音波処理、酸化、熱分解または蒸気爆発などの本明細書中に記載の何らかの1以上を含み得る。2、3、4またはさらに全てのこれらの技術(順序は問わず。)の組み合わせで処理方法を使用することができる。複数の処理方法を使用する場合、同時にまたは異なる時間にこれらの方法を適用することができる。バイオマス原料を官能化するおよび/またはその形態を変化させるその他の処理も、単独でまたは本明細書中に記載の処理と組み合わせて使用することができる。
場合によっては、バイオマス原料を機械的に処理することが方法に含まれ得る。機械的処理としては、例えば、切断、粉砕、圧搾、研削、剪断および細切が含まれる。粉砕には、例えば、ボールミル粉砕、ハンマーミル粉砕、ローター/ステーター乾式粉砕もしくは湿式粉砕または他のタイプの粉砕が含まれ得る。他の機械的処理としては、例えば、石臼研削、粗砕、機械的剥離もしくは引裂、ピン研削またはエアーアトリッションミル粉砕が挙げられる。
バイオマスを加工するために、例えば材料を官能化するために、1以上の一連の照射処理を使用することができる。放射線は、材料または材料をバイオプロセス処理するのに必要とされる何らかの媒体を滅菌することもできる。
各種放射線は、放射線のエネルギーにより決定されるような特定の相互作用を介して炭素含有材料をイオン化する。重荷電粒子は、主に、クーロン散乱を介して物質をイオン化し、さらに、これらの相互作用によって、物質をさらにイオン化し得る高エネルギー電子が発生する。α粒子はヘリウム原子の核と同一であり、様々な放射性核、例えばビスマス、ポロニウム、アスタチン、ラドン、フランシウム、ラジウム、一部のアクチニド、例えばアクチニウム、トリウム、ウラン、ネプツニウム、キュリウム、カリホルニウム、アメリシウムおよびプルトニウムの同位体など、のα崩壊によって発生する。
本明細書中に記載のバイオマス材料の何れかに照射するために、電子より重い粒子を使用することができる。例えば、プロトン、ヘリウム核、アルゴンイオン、ケイ素イオン、ネオンイオン、炭素イオン、リンイオン、酸素イオンまたは窒素イオンを使用することができる。ある態様において、電子より重い粒子は(電子より軽い粒子と比較して)多量の鎖切断を誘導し得る。場合によっては、正荷電粒子は、その酸性度により、負荷電粒子より多量の鎖切断を誘導し得る。
電磁放射線で照射が行われる態様において、電磁放射線は、例えば、102eVを超える、例えば103、104、105、106またはさらには107eVを超える、エネルギー/光子(電子ボルト)を有し得る。ある態様において、電磁放射線は、104から107eVの間、例えば105から106eVの間のエネルギー/光子を有する。電磁放射線は、例えば、1016hzを超える、1017hz、1018、1019、1020hzを超えるかまたはさらに1021hzを超える周波数を有し得る。ある態様において、電磁放射線は、1018から1022hzの間、例えば1019から1021hzの間の周波数を有する。
電離放射線での処理後、本明細書中に記載の材料または混合物の何れかがイオン化され得;即ち、処理済みの材料は、電子スピン共鳴分光器で検出可能であるレベルでラジカルを含み得る。イオン化バイオマスが大気中に残留する場合、それは、例えば大気中の酸素と反応することによってカルボン酸基が産生される程度に酸化されよう。ある材料での例において、このような酸化は炭水化物含有バイオマスの分子量のさらなる分解を促進し得、酸化基、例えばカルボン酸基は、場合によっては溶解性および微生物利用性を高め得るので、このような酸化が所望される。しかし、照射後、ラジカルは、しばらくの間、例えば、1日、5日、30日、3ヶ月、6ヶ月より長くまたはさらに1年より長く「生きて」いることができるので、材料の特性が経時的に変化し続ける可能性があり、場合によってこれは望ましくないことがある。従って、イオン化材料をクエンチングすることが所望され得る。
場合によっては、約0.25Mrad/秒より大きい線量率、例えば約0.5、0.75、1.0、1.5、2.0より大きいかまたはさらには約2.5Mrad/秒より大きい線量率で照射が行われる。ある態様において、5.0から1500.0キロラド/時間の間、例えば10.0から750.0キロラド/時間の間または50.0から350.0キロラド/時間の間の線量率で照射が行われる。
超音波処理によって、例えば本明細書に記載の材料の何れかの1以上、例えば、1以上の炭水化物供給源、例えば、セルロース系またはリグノセルロース系材料またはデンプン材料などの材料の分子量および/または結晶化度を小さくすることができる。超音波処理は、材料を安定化させるために使用することもできる。
バイオマス材料を物理的に処理するために1以上の一連の熱分解処理を使用することができる。材料を安定化するために熱分解を使用することもできる。
バイオマス材料を物理的に処理するために、1以上の一連の酸化処理を使用することができる。酸化条件は、例えば原料のリグニン含量に応じて異なり、一般に、リグニン含量がより多い原料には大きな酸化度が望ましい。
この段落の処理過程は何れも、本明細書中に記載の処理過程なく単独でまたは本明細書中に記載の処理過程の何れかと(任意の順番で)組み合わせて使用することができる:蒸気爆発、化学的処理(例えば酸処理(硫酸、塩酸および有機酸などの鉱酸、例えばトリフルオロ酢酸を用いた濃酸処理および希酸処理を含む。)および/または塩基処理(例えば石灰または水酸化ナトリウムを用いた処理))、UV処理、スクリュー押出処理(例えば、2008年11月17日出願の米国特許出願第61/115,398号参照)、溶媒処理(例えばイオン性液体を用いた処理)および凍結粉砕(例えば米国特許出願第12/502,629号参照)。
微生物は、官能化バイオマス材料存在下で低分子量の糖を発酵させることによって、本明細書中に記載のものなどの多くの有用な中間体および生成物を産生することができる。例えば、発酵またはその他のバイオプロセスによって、アルコール、有機酸、炭化水素、水素、タンパク質またはこれらの材料の何れかの混合物が産生され得る。
蒸留
発酵後、エタノールおよびその他のアルコールを殆どの水および固形残渣から分離するために、例えば「ビアカラム(beer column)」を用いて、得られた流体を蒸留することができる。ビアカラム中に存在する蒸気は例えば35%エタノール重量であり得、精留塔に入れることができる。気相分子ふるいを用いて、精留塔からのほぼ共沸性(92.5%)のエタノールおよび水の混合液を純(99.5%)エタノールまで精製することができる。このビアカラムの下部を三重効用蒸発器の第一効用に送ることができる。精留塔還流凝縮器は、この第一効用に対して熱を提供できる。第一効用の後、遠心機を用いて固形物を分離し、回転式乾燥機中で乾燥させることができる。遠心機廃水の一部(25%)を発酵に対して再利用し、残りを第二および第三効用蒸発器に送ることができる。殆どの蒸発器凝縮物を非常に清浄な凝縮物として処理過程に戻すことができ、低沸騰化合物の蓄積を避けるために廃水処理に供する分離物は少量である。
エネルギー、燃料、食物および材料など、1以上の中間体または生成物を産生させるために、本明細書中に記載のプロセスを使用することができる。生成物の具体例としては、水素、アルコール(例えば一価アルコールまたは二価アルコール、例えばエタノール、n-プロパノールまたはn-ブタノールなど)、水和または含水アルコール、例えば、10%、20%、30%を超えるかまたはさらには40%を超える水を含有するもの、キシリトール、糖、バイオディーゼル、有機酸(例えば酢酸および/または乳酸)、炭化水素、副産物(例えばセルロース分解性タンパク質(酵素)または単細胞タンパク質などのタンパク質)および、何らかの組み合わせまたは相対濃度の、および場合によっては、例えば燃料添加剤などの何らかの添加剤と組み合わせられた、これらの何らかの混合物が挙げられるが、これに限定されない。その他の例としては、カルボン酸、例えば酢酸または酪酸など、カルボン酸の塩、カルボン酸およびカルボン酸の塩の混合物ならびにカルボン酸のエステル(例えばメチルエステル、エチルエステルおよびn-プロピルエステル)、ケトン(例えばアセトン)、アルデヒド(例えばアセトアルデヒド)、α、β不飽和酸、例えばアクリル酸などおよびオレフィン、例えばエチレンなどが挙げられる。その他のアルコールおよびアルコール誘導体としては、プロパノール、プロピレングリコール、1,4-ブタンジオール、1,3-プロパンジオール、これらのアルコールの何れかのメチルエステルまたはエチルエステルが挙げられる。その他の生成物としては、アクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、乳酸、プロピオン酸、酪酸、コハク酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、何れかの酸の塩ならびに何れかの酸およびそれぞれの塩の混合物が挙げられる。
20lb/ft3のかさ密度を有する印刷されていないポリコーティング白色クラフトボールから作製された未使用の半ガロンジュース容器パックの1500ポンドスキッドをInternational Paperから入手した。各容器パックを平坦になるように折り畳み、次いで、1時間におよそ15から20ポンドの速度で3 hp Flinch Baughシュレッダーに入れた。シュレッダーには2枚の12インチ回転ブレード、2枚の固定ブレードおよび0.30インチの排出スクリーンが備えられていた。回転ブレードと固定ブレードとの間の間隔を0.10インチに調整した。シュレッダーからの産出物は、幅が0.1インチから0.5インチの間、長さが0.25インチから1インチの間であり、出発物質と同等の厚み(約0.075インチ)を有する紙吹雪状であった。
30lb/ft3のかさ密度を有する未使用の晒白色クラフトボールの1500ポンドスキッドをInternational Paperから入手した。材料を平坦になるように折り畳み、次いで、1時間あたりおよそ15から20ポンドの速度で3 hp Flinch Baughシュレッダーに入れた。シュレッダーには2枚の12インチ回転ブレード、2枚の固定ブレードおよび0.30インチの排出スクリーンが備えられていた。回転ブレードと固定ブレードとの間の間隔は0.10インチに調整した。シュレッダーからの産出物は、0.1インチから0.5インチの間の幅、0.25インチから1インチの間の長さおよび出発材料と同等の厚み(約0.075インチ)を有する紙吹雪状であった。この紙吹雪状材料をMunsonロータリーナイフカッター、モデルSC30に供した。排出スクリーンの孔は1/8インチであった。回転ブレードと固定ブレードとの間の間隔はおよそ0.020インチに設定した。このロータリーナイフカッターは紙吹雪状小片を剪断し、1時間あたり約1ポンドの速度で繊維状材料を放出した。繊維状材料のBET表面積は1.1316m2/g+/-0.0103m2/g、気孔率は88.3285%であり、かさ密度は0.1497g/mL(@0.53psia)であった。繊維の平均長は1.063mmであり、繊維の平均幅は0.0245mmであり、平均L/Dは43:1となった。
30lb/ft3のかさ密度を有する未使用の晒白色クラフトボールの1500ポンドスキッドをInternational Paperから入手した。材料を平坦に折り畳み、次いで、1時間あたりおよそ15から20ポンドの速度で3 hp Flinch Baughシュレッダーに入れた。このシュレッダーには2枚の12インチ回転ブレード、2枚の固定ブレードおよび0.30インチの排出スクリーンが備えられていた。回転ブレードと固定ブレードとの間の間隔を0.10インチに調整した。シュレッダーからの産出物は紙吹雪状であった(上記と同様)。この紙吹雪状材料をMunsonロータリーナイフカッター、モデルSC30に入れた。排出スクリーンの孔は1/16インチであった。回転ブレードと固定ブレードとの間の間隔はおよそ0.020インチに設定した。ロータリーナイフカッターは紙吹雪状小片を剪断し、1時間あたり約1ポンドの速度で繊維状材料を放出した。第一の剪断から得られた材料を上記で述べた同一設定に供給し戻し、再度剪断した。得られた繊維状材料のBET表面積は1.4408m2/g+/-0.0156m2/gであり、気孔率は90.8998%であり、かさ密度は0.1298g/mL(@0.53psia)であった。繊維の平均長は0.891mmであり、繊維の平均幅は0.026mmであり、平均L/Dは34:1となった。
30lb/ft3のかさ密度を有する未使用の晒白色クラフトボールの1500ポンドスキッドをInternational Paperから入手した。材料を平坦に折り畳み、次いで、1時間あたりおよそ15から20ポンドの速度で3 hp Flinch Baughシュレッダーに入れた。このシュレッダーには2枚の12インチ回転ブレード、2枚の固定ブレードおよび0.30インチの排出スクリーンが備えられていた。回転ブレードと固定ブレードとの間の間隔を0.10インチに調整した。シュレッダーからの産出物は紙吹雪状であった(上記と同様)。この紙吹雪状材料をMunsonロータリーナイフカッター、モデルSC30に入れた。排出スクリーンの孔は1/8インチであった。回転ブレードと固定ブレードとの間の間隔はおよそ0.020インチに設定した。ロータリーナイフカッターはナイフの刃を横切る紙吹雪状小片を剪断した。第一の剪断から得られた材料を同一設定に供給し戻し、スクリーンを1/16インチのスクリーンに交換した。この材料を剪断した。第二の剪断から得られた材料を同一設定に供給し戻し、スクリーンを1/32インチのスクリーンに交換した。この材料を剪断した。得られた繊維状材料のBET表面積は1.6897m2/g+/-0.0155m2/gであり、気孔率は87.7163%であり、かさ密度は0.1448g/mL(@0.53psia)であった。繊維の平均長は0.824mmであり、繊維の平均幅は0.0262mmであり、平均L/Dは32:1となった。
出力80kWで5MeVの電子を送達するアーチ状のRhodotron(登録商標)TT200連続波加速器を用いて電子線で試料を処理した。表1は使用したパラメーターを記載する。表2は、試料IDに対して使用した公称線量(単位Mrad)および試料に送達される対応する線量(単位kgy)を報告する。
分析用のセルロース系およびリグノセルロース系材料を実施例4に従って処理した。以下の表に挙げる試料材料は、クラフト紙(P)、麦藁(WS)、アルファルファ(A)、セルロース(C)、スイッチグラス(SG)、草(G)およびデンプン(ST)およびスクロース(S)を含む。試料IDの番号「132」とは、1/32インチスクリーンに通した剪断後の材料の粒子サイズを指す。ダッシュ後の数字は放射線の線量(MRad)を指し、「US」は超音波処理を指す。例えば、試料ID「P132-10」とは、132メッシュの粒子サイズまで剪断され、10Mradを照射したクラフト紙を指す。
**低線量の放射線は一部の材料の分子量を増加させるように見える。
1線量率=1MRad/時間
2水に分散させた材料を用い、再循環条件下で1000Wホーンを使用する20kHzの超音波による30分間の処理
*処理後にピークは合体する。
**低線量の放射線は一部の材料の分子量を増加させると思われる。
1線量率=1MRad/時間
2水に分散させた材料を用い、再循環条件下で1000Wホーンを使用した20kHz超音波による30分間の処理
飛行時間二次イオン質量分析法(ToF-SIMS)は、試料のまさに最外部表面から分子を脱離させるためにパルスイオンビーム(Csまたは微小焦点Ga)を使用する表面敏感分光法である。表面の単原子層から粒子を脱離させる(二次イオン)。次に、これらの粒子を加速して「飛行管」に導き、それらが検出器に到達する正確な時間(即ち飛行時間)を測定することによってそれらの質量を決定する。ToF-SIMSは、表面、薄層、試料の界面に関する詳細な元素および分子情報を提供し、完全な三次元分析を可能にする。これは、半導体、ポリマー、塗料、コーティング、ガラス、紙、金属、セラミック、生体材料、医薬品および有機組織を含め、広く使用されている。ToF-SIMSは探査技術なので、Hを含め周期表の元素は全て検出される。ToF-SIMSデータを表8〜11で与える。使用したパラメーターを表12で報告する。
水銀細孔サイズおよび細孔容積分析(表21)は、密に制御された圧力下で水銀(非湿潤性液体)を強制的に多孔性構造に浸入させることにより行う。水銀は殆どの物質を湿らせず、毛細管作用によって自然に細孔に浸入することがないので、外部圧力をかけることによって試料の孔隙に強制的に浸入させなければならない。孔隙を満たすのに必要な圧力は細孔サイズに逆比例する。大きな孔隙を満たすためには小さな力または圧力しか必要とせず、一方、非常に小さな細孔の孔隙を満たすにはかなり大きな圧力が必要となる。
静的光散乱による粒度測定技術は(フラウンホーファー理論も含む)ミー散乱に基づく。ミー散乱は、他の系の変数が分かっており、一定に保持されることを条件に、球状散乱粒子に対する大きさの関数として、強度対角度関係を予測する。これらの変数は入射光の波長および試料材料の相対的屈折率である。ミー散乱を適用することによって、詳細な粒径の情報が得られる。表23は、メディアン径、平均径およびモード径をパラメーターとして用いて粒径についてまとめる。
供給率:35%
ディスパーサー圧力:4バール
光学モデル:(2.610、1.000i)、1.000
Micromeritics ASAP 2420 Accelerated Surface AreaおよびPorosimetry Systemを用いて各試料の表面積を分析した。最初に40℃にて16時間脱気することによって、試料を調製した。次に、ヘリウムを含む自由空間(温および冷空間の両方)を計算し、次いで、ヘリウムを除去するために試料チューブを再度脱気する。データ収集はこの第二の脱気後に開始し、どの程度の気体が試料上に与えられるかを調節する標的圧力を規定することから構成される。各標的圧力において、吸着された気体の量および実際の圧力を調べ、記録する。試料チューブ内側の圧力は圧力トランスデューサで測定する。標的圧力が達成され、平衡となるまで、さらなる量の気体を継続して入れる。吸着された気体の量は試料上への複数回の適用量を合計することによって調べる。圧力および量により気体吸着等温線が規定され、これを使用してBET表面積(表24)を含む多数のパラメーターを計算する。
Techpap MorFi LB01システムを用いて、提示された試料において三つ組で繊維長分布試験を行った。平均長および幅は表25で報告する。
Nicolet/Impact 400でFT-IR分析を行った。結果から、試料P132、P132-10、P132-100、P-1e、P-5e、P-10e、P-30e、P-70eおよびP-100eがセルロースベースの材料に相応することが示される。
試料調製
2%フッ化テトラブチルアンモニウム三水和物を含むDMSO-d6で溶解することによって、分析用に試料P132、P132-10、P132-100、P-1e、P-5e、P-10e、P-30e、P-70eおよびP-100eを調製した。低レベル照射を受けた試料は高レベル照射を受けた試料よりも溶解度が顕著に低かった。非照射試料は、この溶媒混合液中でゲルを形成したが、60℃に加熱することによって、NMRスペクトルにおけるピークが分解された。より高レベルの照射を受けた試料は10%wt/wtの濃度で可溶性であった。
15mg/mLの試料の1H-NMRスペクトルは、明らかな16ppmを中心とする非常に幅広い共鳴ピークを示した(図5A-5J)。このピークはエノールに対する交換性-OHプロトンの特徴であり、「d2Oシェイク」により確認された。モデル化合物(アセチルアセトン、グルクロン酸およびケト-グロン酸)を分析し、このピークが実際に交換性エノールプロトンであったことが説得力のあるものとなった。提案されるこのエノールピークは、濃度の影響に非常に敏感であり、本発明者らは、この共鳴がエノールまたはおそらくカルボン酸によるものであったか否かを結論付けることができなかった。
試料P-100eおよびP132-100(1g)を脱イオン化水(25mL)中で縣濁した。指示薬アリザリンイエローを攪拌しながら各試料に添加した。P-100eは湿らせることがより困難であった。0.2M NaOH溶液で両試料を滴定した。終点は非常に微妙であり、pH紙を用いることによって確認した。試料の開始pHは両試料とも〜4であった。P132-100は0.4ミリ当量の水酸化物を必要とし、これは2500amuのカルボン酸に対する分子量を与える。モノマーに対して180amuが使用される場合、これは、13.9モノマー単位に対して1個のカルボン酸基があることを示す。同様に、P-100eは3.2ミリ当量の水酸化物を必要とし、これは、計算すると、17.4モノマー単位ごとに1カルボン酸基となる。
セルロースのC-6炭素は、この酸化においてカルボン酸(グルクロン酸誘導体)に酸化されると思われ、これは驚くべきことに特異的である。この酸化は、〜1740cm-1での照射によりIR域が大きくなることと一致し、これは脂肪族カルボン酸に対応する。滴定結果は定量的13C NMRと一致する。高レベルの照射を行うほど、試料の溶解度が向上することは、カルボン酸プロトン数が増加することとよく相関する。「C-6酸化セルロース」の分解に対するメカニズムの仮説を下記スキーム1で提供する。
エタノール産生における発酵工程のためにバイオ燃料業界で用いられる酵母および細菌の一般的な株に対する毒性について、本明細書に記載のように前処理した特定のリグノセルロース系材料を分析する。さらに、プロセスの実行可能性を調べるために、糖含量およびセルラーゼ酵素との適合性を調べる。前処理した材料の試験は以下のように2つの相で行う。
酵母サッカロミセス-セレビジエ(ワイン酵母)およびピキア・スチピチス(ATCC 66278)ならびに細菌ザイモモナス・モビリス(ATCC 31821)およびクロストリジウム・サーモセラム(ATCC 31924)において、前処理した草および紙原料の毒性を測定する。インキュベーションおよび試料採取の最適時間を調べるために、各微生物を用いて増殖試験を行う。
リグノセルロース系バイオマスを発酵可能な糖に還元する酵素複合体を含有する市販のAccellerase(登録商標)1000を用い、エレンマイヤーフラスコ中で推奨温度および濃度で、原料を二つ組で試験する。200rpm前後で穏やかに振盪しながらフラスコを12時間インキュベートする。その間、フラスコの液体部中の還元糖の濃度を測定するために、0、3、6、9および12時間の時点で3時間ごとに試料を採取する(Hope and Dean, Biotech J. 1974, 144:403)。
糖濃度(HPLC)および3種類の微生物(ピキア・スチピチス、サッカロミセス・セレビシエおよびザイモモナス・モビリス)に対する毒性について、13種類の試料を分析した。表26はこれらの実験のために使用した装置を挙げる。表27および28は、HPLC標準物質を調製するために使用した糖のリスト(製造供給元およびロット番号を含む。)およびHPLC標準物質を調製するために使用したプロトコールをそれぞれ提供する。
各試料(1グラム)を逆浸透水と200rpmおよび50℃で一晩混合した。試料のpHを5から6の間に調整し、0.2μmシリンジフィルターに通してろ過した。試料の完全性を維持するために、分析前に試料を-20℃で保存した。試料調製中に行った観察を表29で与える。
*最初の試験から、移動相中で15/85アセトニトリル:水よりもナノピュア水を使用した際に良好な分離が観察されたことが示された(製造者は、このカラムで20%を超えるアセトニトリルを使用することを推奨していない。)。
表31、32および33でHPLC分析の結果を与える。
3種類のエタノール産生培養物パネルに対する毒性について12種類の試料を分析した。この実験において、培養物の飢餓と試料の毒性とを区別するために、試料にグルコースを添加した。ピキア・スチピチスに対する毒性について13種類の試料を試験した。使用したプロトコールの要約を表32で挙げる。毒性試験で使用した化学物質および装置の説明を表34〜36で報告する。
ATCCから得た再水和した凍結乾燥培養物から、S.セレビシエの斜面培地を調製した。YMブロス+20g/L寒天(pH5.0)上に斜面培地材料の一部を画線し、30℃で2日間インキュベートした。50mLの培地(20g/Lグルコース、3g/L酵母抽出物および5.0g/Lペプトン、pH5.0)を含有する250mLエレンマイヤーフラスコにYMプレートからの1個のコロニーを接種し、25℃および200rpmで24時間インキュベートした。増殖23時間後、試料を採取し、光学密度(UV分光光度計で600nm)および純度(グラム染色)について分析した。これらの結果に基づき、OD14.8であり、混入なくグラム染色された1本のフラスコ(種フラスコと呼ぶ。)を選択し、試験フラスコ全てに接種した。
ARS Culture Collectionから得た再水和凍結乾燥培養物から、P.スチピチスの斜面培地を調製した。YMブロス+20g/L寒天(pH5.0)上に斜面培地材料の一部を画線し、30℃で2日間インキュベートした。100mLの培地(40g/Lグルコース、1.7g/L酵母窒素原基礎培地、2.27g/L尿素、6.56g/Lペプトン、40g/Lキシロース、pH5.0)を含有する250mLエレンマイヤーフラスコに少量のプレート材料を接種し、25℃および125rpmで24時間インキュベートした。増殖23時間後に試料を採取し、光学密度(UV分光光度計で600nm)および純度(グラム染色)について分析した。これらの結果に基づき、光学密度が5.23で、混入なくグラム染色された1本のフラスコ(種フラスコと呼ぶ。)を選択し、試験フラスコ全てに接種した。
ATCCから得た再水和凍結乾燥培養物から、Z.モビリスの斜面培地を調製した。DYEプレート(グルコース20g/L、酵母抽出物10g/L、寒天20g/L、pH5.4)上に斜面培地材料の一部を画線し、30℃および5%CO2で2日間インキュベートした。15mLの培地(25g/Lグルコース、10g/L酵母抽出物、1g/L MgSO4・7H2O、1g/L (NH4)2SO4、2g/L KH2PO4、pH5.4)を含有する20mLスクリューキャップ試験管に1個のコロニーを接種し、振盪せずに30℃で24時間インキュベートした。増殖23時間後に試料を採取し、光学密度(UV分光光度計で600nm)および純度(グラム染色)について分析した。これらの結果に基づき、1本の試験管(OD1.96)を選択して、第二の種フラスコに接種した。第二の種フラスコは上述の培地70mLを含有する125mLフラスコであり、700μL(1%v/v)を接種し、振盪せずに30℃で24時間インキュベートした。増殖23時間後に試料を採取し、光学密度(UV分光光度計で600nm)および純度(グラム染色)について分析した。これらの結果に基づき、ODが3.72である1本のフラスコ(種フラスコと呼ぶ。)を選択し、試験フラスコ全てに接種した。
2種類の試料を細胞濃度について分析した(Z.モビリスの場合は塗布接種を使用し、直接計数し(S.セレビシエおよびP.スチピチスの場合は血球計算盤および顕微鏡で計数)。適切に希釈したZ.モビリスの試料をデキストロース酵母抽出物(グルコース20g/L、酵母抽出物10g/L、寒天20g/L、pH5.4)プレート上に広げ、30℃および5%CO2で2日間インキュベートし、コロニー数を計数した。適切に希釈したS.セレビシエおよびP.スチピチスの試料を0.05%トリパンブルーと混合し、ノイバウエル血球計算盤に載せた。40Xの倍率で細胞を計数した。
各微生物に対して、対照と各試料を比較するために、パフォーマンスを使用した(表37-39)。しかし、株間の比較を行うためには%パフォーマンスを使用することができない。株を比較する場合、エタノールの総濃度を使用すべきである。データを分析する際、80%未満の%パフォーマンスは、細胞数も低い場合は毒性を示し得る。%パフォーマンスを決定するために使用した式は、以下である:
% パフォーマンス = (試料中のエタノール/対照中のエタノール)x100
*後に振盪フラスコ実験で分析
各生物に対して、対照と各試料を比較するために、%細胞を使用する(表40-42)。しかし、株間の比較を行うためには%細胞を使用することができない。株を比較する場合、細胞の総濃度を使用すべきである。データを分析する際、70%未満の%パフォーマンスは、エタノール濃度も低い場合、毒性を示し得る。%パフォーマンスを決定するために使用した式は、以下である:
% 細胞 = (試料中の細胞数/対照中の細胞数)x100
要約
糖添加せずにP.スチピチス培養物におけるエタノール産生について13種類の試料を試験した。セルラーゼ(Accellerase 1000(登録商標)酵素複合体、Genencor)の存在下および非存在下でこれらを試験した。この実験に対して使用した装置および試薬を下記表43〜45で挙げる。
アルコール脱水素酵素アッセイに基づき、YSI生化学分析装置を用いて(YSI、Interscience)、エタノール濃度について試料を分析した(表47、48および49)。14,000rpmで20分間試料を遠心し、-20℃で上清を保存した。分析前にエタノールが0〜3.2g/Lの間となるようにこの試料を希釈した。分析中に膜の完全性が維持されていることを確認するために、およそ30試料ごとに2.0g/Lエタノールの標準物質を分析した。
要約
温度およびpHの至適条件下で工業用セルラーゼ(Accellerase(登録商標)1000、Genencor)を用いて、セルラーゼ感受性について13種類の試料を試験した。
本プロトコールはNREL「Laboratory Analytical Procedure LAP-009 Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass」の改変法である。2本組みで、50mL試験管中の10mLの0.1Mクエン酸緩衝液(pH4.8)および40mg/mLテトラサイクリン(細菌増殖防止のため)に材料の試料を添加した。各試験管に添加した試料の量は表50で挙げる。一部の試料は混合困難であったので(P132、P132-10、P132-100)、より低い濃度で添加した。0.2グラムのSolkaFloc 200NF粉末セルロース(ロット#UA158072、International Fiber Corporation)の陽性対照および陰性対照(試料なし)も加えた。体積を総量で20mLにするのに十分な逆浸透(RO)水を試験管に添加した。クエン酸緩衝液および水の両方を使用前に50℃に加熱した。
g/mLグルコースx20mL(試料体積)x0.9(セルロース加水分解時に添加した水分子に対する補正のため)。
消化されたセルロースg/添加した試料g(詳細については表5参照)*100
要約
表36からの最大の%パフォーマンスを有する4種類のセルロース系材料を用いて、ピキア・スチピチスを用いた振盪フラスコ発酵を行った。
表54〜56で概説するパラメーターの元で実験を行った。
次の振盪フラスコ実験全てに対して、次の手順を用いて種フラスコを調製した。
下記表57で挙げるとおりの様々なキシロース濃度で4種類のセルロース系試料(A132-10、A132-100、G132-10およびG132-100)を試験した。
インキュベーション時間0、6、12、24、36、48および72時間に、40本の試験フラスコから試料を採取した。さらに、100%キシロースフラスコ中での原料の第二の量の添加後24および48時間で試料を採取した(表58参照)。
試験容器(全部で8本、250mLエレンマイヤーフラスコ)には100mLの培地を入れた。この培地には、40g/Lグルコース、40g/Lキシロース、1.7g/L酵母窒素原基礎培地(Becton Dickinson #291940)、2.27g/L尿素(ScholAR Chemistry #9472706)および6.56g/Lペプトン(Becton Dickinson #211677)が含有されていた。実験#1のようにフラスコを準備した。雑菌混入の可能性を抑えるために、(接種前ではなく)接種時に試験試料(10g/100mLのA132-10、A132-100、G132-10およびG132-100)を添加した。試験試料に加えて、種フラスコ材料1mL(1%v/v)を各フラスコに添加した。このフラスコを30℃および150rpmで72時間以上インキュベートした。
0、6、12、24、36、48および72時間のインキュベーション時間で、8本の試験フラスコから試料を得た。実験#1のように、56種類の試料のエタノール分析を行い、表59で報告する。実験#1と同様に72時間の試料に対して細胞計数を行い、表60で示す。
下記の表(表60)で挙げるとおりの様々なキシロースおよびグルコース濃度で、4種類のセルロース系試料(A132-10、A132-100、G132-10およびG132-100)を試験した。
0、6、12、24、36、48および72時間のインキュベーション時間に、32本の試験フラスコから試料を採取した(表62-65参照)。アルコール脱水素酵素アッセイに基づきYSI生化学分析装置を用いて(YSI、Interscience)、エタノール濃度について全部で224種類の試料を分析した。14,000rpmで20分間試料を遠心し、上清を-20℃で保存した。注目すべきことに、一部の試料は、遠心および、次に、0.45μmシリンジフィルターによるろ過を必要とした。分析前にエタノールが0〜3.2g/Lの間となるようにこの試料を希釈した。YSI膜の完全性が維持されていることを確認するために、2.0g/Lエタノールの標準物質をおよそ30試料ごとに分析した。
1本の種フラスコを使用して、全ての実験#1および#2試験フラスコに接種した。種フラスコの光学密度(600nm)を測定したところ、5.14となり、その細胞濃度は4.65x108個細胞/mLとなった(表65-66)。従って、試験フラスコ中の最初の細胞濃度はおよそ4.65x106個細胞/mLであった。
*増殖72時間後、試料への雑菌混入が激しかった。これは、糖添加なしではピキアがあまり増殖せず、混入雑菌(非滅菌試料由来)がピキアより多く増殖することできたからと予想される。
要約
2種類のエタノール産生培養物、サッカロミセス・セレビシエおよびピキア・スチピチスに対する毒性について、37種類の試料を分析した。この実験において、培養物の飢餓と試料の毒性を区別するために、試料にグルコースを添加した。
使用したプロトコールの要約を表68で挙げる。毒性試験で使用した化学物質の説明は表69で挙げる。試験の各週に、各微生物に対して2本の対照フラスコ(試料添加なし)を行った。全部で82本のフラスコを分析した。
少量の試料に適切なコーヒーグラインダーを用いて7種類の試験試料(全てCの記号表示を有する。)を研削した。肉眼で見て適応する粒径(試料間)になるようにこの試料を研削した。試料番号C-100eは容易に小さな粒径に研削された。
American Type Culture Collectionから入手した再水和凍結乾燥培養物から、S.セレビシエATCC24858の作業用細胞バンクを調製した。15%v/vグリセロール中のS.セレビシエ培養物を含有する凍結バイアルを-75℃で凍結した。凍結融解した作業用細胞バンク材料の一部をYeast Mold(YM)ブロス+20g/L寒天(pH5.0)上に画線し、30℃で2日間インキュベートした。培地(20g/Lグルコース、3g/L酵母抽出物および5.0g/Lペプトン、pH5.0)50mLを含有する250mLエレンマイヤーフラスコにYMプレートから1個のコロニーを接種し、25℃および200rpmで24時間インキュベートした。増殖23時間後に試料を採取し、光学密度(UV分光光度計で600nm)および純度(グラム染色)について分析した。これらの結果に基づき、ODが9-15であり、混入なくグラム染色された1本のフラスコ(種フラスコと呼ぶ。)を増殖フラスコに接種するために使用するものとした。増殖23時間後、種フラスコのODは低く(5.14)、細胞数が少なかった(1.35x108個細胞/mL)。注目すべきことに、種プレートから採取したコロニーは通常より小さかった。従って、0.5mLの種材料(計画した0.1mLではない。)を各試験容器に添加した。
ARS Culture Collectionから入手した再水和凍結乾燥培養物から、P.スチピチスNRRL Y-7124の作業用細胞バンクを調製した。15%v/vグリセロール中のP.スチピチス培養物を含有する凍結バイアルを-75℃で凍結する。凍結融解した作業用細胞バンク材料の一部をYeast Mold(YM)ブロス+20g/L寒天(pH5.0)上に画線し、30℃で2日間インキュベートした。使用前にこのプレートを4℃で最長5日間維持した。100mLの培地(40g/Lグルコース、1.7g/L酵母窒素原基礎培地、2.27g/L尿素、6.56g/Lペプトン、40g/Lキシロース、pH5.0)を含有する250mLエレンマイヤーフラスコに1個のコロニーを接種し、25℃および125rpmで24時間インキュベートした。増殖23時間後に試料を採取し、光学密度(UV分光光度計で600nm)および純度(グラム染色)について分析した。これらの結果に基づき、光学密度が5-9であり、混入なくグラム染色された1本のフラスコ(種フラスコと呼ぶ。)を使用して、試験フラスコ全てに接種した。
接種直前に種フラスコから試料を採取し、24および72時間にそれぞれフラスコを試験し、直接計数することにより細胞濃度について分析した。適切に希釈したS.セレビシエおよびP.スチピチスの試料を0.05%トリパンブルーと混合し、ノイバウエル血球計算盤に載せた。40Xの倍率で細胞を計数した。
対照フラスコと細胞数およびエタノール濃度を比較するために、次の計算を使用した。
%パフォーマンス=(試験フラスコ中のエタノール濃度/対照中のエタノール)*100%
細胞=(試験フラスコ中の細胞数/対照フラスコ中の細胞数)*100
S.セレビシエの種フラスコの光学密度(600nm)は5.14であり、細胞濃度は1.35x108個細胞/mLであった。0.5mLの種フラスコ材料を各試験フラスコに添加した。従って、各フラスコ中の出発細胞濃度は6.75x105/mLであった。試験第2週の間、S.セレビシエの種フラスコの光学密度(600nm)は4.87であり、細胞濃度は3.15x107個細胞/mLであった。1mLの種フラスコ材料を各試験フラスコに添加した。従って、各フラスコの出発細胞濃度は6.30x105/mLであった。0時間の試料採取時間のS.セレビシエのフラスコのpHは表71で示す。フラスコ内容物のpHは、S.セレビシエ増殖に対する至適pHの範囲内(pH4-6)であった。pH調整は必要なかった。
ザイモモナス・モビリス
チャート1Aで示されるように、24時間の時点で、P-132-10、G-132-10およびWS-132-10を含有する試料において、細胞数増加(例えば対照よりも多い。)が認められた。その他の全ての試料存在下の細胞数は対照と同等であった。この観察から、播種後最長24時間まで、基質がZ.モビリスに対して毒性がなかったことが示される。
チャート2Aで示されるように、細胞数は対照と同等であった。さらに、G-132およびWS-132を含有する試料中で細胞数が僅かに減少していたが、G-132-10、G-132-100、A-132-10またはA-132-100の場合は細胞数の減少は観察されなかった。従って、基質GまたはAは毒性がないと思われる。むしろ、G-132およびWS-132の場合に観察された細胞数減少は、実験上の例外によるかまたは、何らかの形で細胞増殖を妨げる未処理の基質の存在によるものであったと思われる。全体的に、このデータから、対照および実験試料に存在するグルコースは、至適なP.スチピチス増殖を促進するために十分であると思われ、試料中にさらなる基質が存在してもこの増殖速度は向上しないことが示唆される。これらの結果から、P.スチピチスにおいて毒性がある試料がないことも示唆される。
チャート3Aで示されるように、G-132-100、A-132、A-132-10、A-132-100およびWS-132は、対照と比較して細胞数増加を僅かに促進した。何れの試料に対しても細胞数の顕著な減少は観察されなかった。これらの結果から、S.セレビシエにおいて毒性がある試料はないことが示唆される。
本発明の多くの態様を記載してきた。しかし、当然のことながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変をなし得る。
Claims (22)
- 酸化されたバイオマス繊維および該酸化されたバイオマス繊維上に固定化されている発酵微生物を含むシートに、培地中で低分子量の糖を接触させること;ならびに
該発酵微生物を使用して該低分子量の糖を発酵させること
を含む、生成物への低分子量の糖の変換を促進する方法であって、
該バイオマス繊維が、5Mradから60Mradでの電離放射線の照射、化学的酸化、超音波処理、および熱分解からなる群より選択される方法によって酸化培地中で酸化されたものである、
生成物への低分子量の糖の変換を促進する方法。 - 発酵が、前記低分子量の糖の少なくとも一部を炭化水素、アルコールまたは水素に変換する、請求項1記載の方法。
- 前記アルコールがエタノールを含む、請求項2記載の方法。
- 前記微生物が酵母である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 前記酵母がS.セレビシエ(S.cerevisiae)およびP.スチピチス(P.stipitis)からなる群から選択される、請求項4記載の方法。
- 前記微生物が細菌である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 前記細菌がザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)を含む、請求項6記載の方法。
- 前記バイオマス繊維が、電離放射線で照射することにより酸化環境において酸化されたものである、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 照射が粒子ビームを用いて行われる、請求項8記載の方法。
- 前記バイオマス繊維がセルロース系またはリグノセルロース系材料を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 前記バイオマス繊維が0.25m2/gより大きいBET表面積を有する、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 前記バイオマス繊維が、紙、紙製品、紙くず、木材、削片板、おがくず、農業廃棄物、汚水、サイレージ、草、もみ殻、バガス、ジュート、麻、亜麻、竹、サイザルアサ、マニラアサ、藁、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ茎葉、スイッチグラス、アルファルファ、乾草、ココナツヘア、綿花、海草、藻およびそれらの混合物からなる群から選択されるバイオマスに由来する、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- 前記バイオマス繊維が、内部繊維を有するバイオマス原料由来であり、その内部繊維が露出される程度に剪断されている、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
- 前記バイオマス繊維が70%を超える気孔率を有する、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
- 発酵後に前記バイオマス繊維を回収し、第2の後続の発酵プロセスにおいて該繊維を再使用することをさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 前記シートが多層シートを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- 前記シートが、重なっている、折り畳まれている、またはスクリーンもしくはメッシュの形態である、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- 前記バイオマス繊維が、押出されるかまたは共押出されている、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- 前記繊維がナノスケールの平均粒径を有する、請求項1記載の方法。
- 酸化されたバイオマス繊維および該酸化されたバイオマス繊維上に固定化されている発酵微生物からなるシートに、培地中で低分子量の糖を接触させること;ならびに該発酵微生物を使用して該低分子量の糖を発酵させることを含む方法であって、
該バイオマス繊維が、5Mradから60Mradでの電離放射線の照射、酸化、超音波処理、および熱分解からなる群より選択される方法により、酸化環境において酸化されたものである、
方法。 - 前記酸化されたバイオマス繊維が、電離放射線を照射することにより酸化環境において酸化されたものである、請求項20記載の方法。
- 照射が粒子ビームを用いて行われる、請求項21記載の方法。
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