CN109762769B

CN109762769B - 一种厌氧秸秆降解菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109762769B
Application number: CN201910138965.XA
Authority: CN
Inventors: 叶小梅; 孔祥平; 王宇欣; 奚永兰; 张敏; 靳红梅; 杜静; 朱宁
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2039-02-25
Also published as: CN109762769A

Abstract

本发明公开了一种厌氧秸秆降解菌剂及其制备方法和应用，所述菌剂包含纤维梭菌(Clostridium cellulosi)，热纤梭菌(Ruminiclostridium thermocellum)，克莱弗雷梭菌(Clostridium clariflavum)，热解糖嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)，嗜热产丁酸梭菌(Clostridium thermosuccinogenes)，粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)，哈尔滨毛螺菌(Herbinix luporum)7种厌氧菌。本发明所提供的厌氧秸秆降解菌剂具有优良的秸秆降解能力，且制备方法简单，成本低，生产周期短；用于秸秆降解操作简单、降解效率高，相比单一嗜热接种菌剂具有适应性强和性能稳定的优势，在厌氧发酵过程强化和秸秆资源生物转化等方面具有广阔的应用前景。

Description

一种厌氧秸秆降解菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种厌氧秸秆降解菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

秸秆原料在厌氧消化过程中依靠微生物进行降解，先由水解菌将秸秆降解为多糖，然后再由产酸菌将糖进一步代谢成有机酸(主要途径)，最终在产甲烷菌的作用下生成甲烷。然而，厌氧消化产甲烷过程中存在秸秆原料利用率低、产气慢和发酵周期长等问题，不利于实现该绿色过程的规模化应用。秸秆原料主是由纤维素和半纤维素等多聚糖和芳香多聚物木质素组成。三大成分相互交联形成复杂的结构，其中半纤维素以氢键等非共价形式和纤维素紧密相连，木质素以多种共价键与半纤维素相连，同时纤维素自身由D-葡萄糖以β-1,4糖苷键连接形成结构致密的网状骨架(结晶区)。从纤维素和半纤维素到糖的转化速率较糖到挥发性脂肪酸的转化速率要慢得多，这使得秸秆的水解成为甲烷发酵过程的关键限速步骤。

通过适当预处理破坏纤维素、半纤维素和木质素之间的复杂结构(如降低结晶度、聚合度、增加比较面积等)可以增加微生物分泌的酶对纤维素及半纤维素的水解能力，进而提高秸秆的利用率和产气速率。目前已报道的秸秆预处理技术包括物理法预处理技术、化学法预处理技术以及生物法预处理技术。相较于化学法和物理法，生物法降解秸秆具有成本低、条件温和、环境友好等特点，这些优势使得生物法预处理秸秆成为甲烷发酵过程的重要途径。与单菌的生物预处理技术相比，微生物菌群在降解秸秆过程中存在高度的协同作用。由于具有成本低和效率高的优势，近年来利用微生物菌群预处理秸秆以强化甲烷发酵受到极大的关注。Yuan等人研究了秸秆降解菌群MC1预处理棉花秸秆对产甲烷过程的影响，甲烷收率达到118mL/gVS，比未处理棉花秸秆提高了136％(Bioresource Technology,207,293-301.)。Wen等人研究了三种不同秸秆降解菌群MC1、WSD-5、XDC-2对狼尾草预处理过程，结果表明通过三种菌群的预处理能够使甲烷的收率提高32％～49.2％(BioresourceTechnology,175,102-111.)。锯木屑是一种不易于生物利用的废弃资源，而Ali等人从锯木屑中筛选到一种秸秆降解菌群LCDC，利用该菌群预处理锯木屑后，甲烷产量从90mL/g VS提高到155ml/g VS，收率得到显著提高(Bioresource Technology.238,425-432.)。利用微生物菌群预处理秸秆的关键是筛选到高秸秆降解活性的菌群。从反刍动物瘤胃、秸秆堆肥区、厌氧发酵池等环境中可以筛选到秸秆高效降解的微生物菌群。目前已报道的秸秆降解菌群以有氧菌群为主，且大多数菌群无法高效降解未处理的秸秆，仍然需要额外的预处理。

利用好氧菌群预处理秸秆将会增加设备投入，延长发酵周期，且秸秆干物质损失大，不利于甲烷收率的提高。而厌氧秸秆降解菌群可直接接种至甲烷发酵体系强化秸秆水解步骤，因而无需额外设备投入，同时主要降解产物为有机酸，可为甲烷发酵过程提供前体。相比于有氧秸秆降解菌群，厌氧菌群在设备投入、过程能耗和甲烷收率方面均具有明显的优势。然而，目前厌氧秸秆降解菌群在实际生产中需要使用大量还原剂和氮气为培养基除氧，实际操作过程复杂且成本高，严重限制了厌氧秸秆降解菌群在实际生产中的应用。

发明内容

本发明提供一种厌氧秸秆降解菌剂及其制备方法和应用。

为实现上述技术目的，本发明采取以下技术方案：

一种厌氧秸秆降解菌剂，所述菌剂包含纤维梭菌(Clostridium cellulosi)，热纤梭菌(Ruminiclostridium thermocellum)，克莱弗雷梭菌(Clostridium clariflavum)，热解糖嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)，嗜热产丁酸梭菌(Clostridium thermosuccinogenes)，粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)，哈尔滨毛螺菌(Herbinix luporum)7种厌氧菌。

本发明的上述菌剂由所述7种厌氧菌等比例接种后发酵培养制得。

本发明的另一目的在于提供上述菌剂的制备方法。

本发明的菌剂制备方法为，在发酵培养基中加入樟绒枝霉除氧，之后再接种活化的7种厌氧菌进行发酵培养。

具体包括如下步骤：

1)分别活化樟绒枝霉和所述7种厌氧菌；

2)挑取樟绒枝霉菌体稀释后接种于发酵培养基培养，至培养基发酵液红色退去；

3)接种所述7种厌氧菌，45℃～60℃条件下发酵培养，获取培养液，即为所述复合菌剂。

进一步的，所述步骤3)中，接种液的活菌量大于1×10⁶CFU/g。复合菌剂中微生物含量大于1×10⁶CFU/g。

本发明的又一目的在于提供上述厌氧秸秆降解菌剂在秸秆降解中的应用。

本发明提供了一种具体的应用方式，包括：在PCS培养基中加入秸秆作为底物，之后厌氧状态下加入所述厌氧秸秆降解菌剂，厌氧状态下密闭静置培养。

进一步的，将秸秆加入培养基前，对秸秆采用NaOH碱处理处理。

本发明所提供的厌氧秸秆降解菌剂具有优良的秸秆降解能力，且制备方法简单，成本低，生产周期短；用于秸秆降解操作简单、降解效率高，相比单一嗜热接种菌剂具有适应性强和性能稳定的优势，在厌氧发酵过程强化和秸秆资源生物转化等方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是复合菌剂对秸秆的降解效果示意图。

具体实施方式

本发明中提供的实施例是对本发明内容的进一步说明，不应理解成对本发明的限制。

实施例中的樟绒枝霉为Malbranchea cinnamomea ATCC42825，购自美国模式培养物保藏中心。

实施例选用的7种厌氧菌分别为纤维梭菌(Clostridium cellulosi)DG5；热纤梭菌(Ruminiclostridium thermocellum)M3；克莱弗雷梭菌(Clostridium clariflavumi)DSM 19732；热解糖嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)DSM571；嗜热产丁酸梭菌(Clostridium thermosuccinogenes)DSM 5807；粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)DSM 8532；哈尔滨毛螺菌(Herbinix luporum)SD1D，购自德国微生物保藏中心。

实施例1

本实施例说明利用好氧真菌樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)去除发酵培养基中氧气的方法。

具体操作步骤如下：

1.樟绒枝霉种子液的制备

将樟绒枝霉菌株接种于PDA平板于37℃～45℃培养3天后，挑取孢子于无菌水中混匀制成混悬液，用无菌水稀释至10⁶CFU/mL。

2.接种樟绒枝霉除去PCS培养基氧气

配置液体PCS培养基，成分为蛋白胨5.0g/L、酵母粉1.0g/L，氯化钠5.0g/L，碳酸钙3.0g/L，微晶纤维素5.0g/L。发酵罐中液体PCS培养基装液量为80％。以终浓度1.0mg/L的刃天青作为氧含量指示剂。按照1.0‰、1.0％、5.0％v/v的接种量分别接种混悬液于液体PCS培养基培养。于37℃～45℃静置密闭培养，记录培养基发酵液颜色变化时间点。

表1不同接种量樟绒枝霉接种量对培养基除氧效果的影响

接种量	由蓝变红时间	红色退去时间
			1.0‰v/v	3.5h	5.0h
1.0％v/v	2.0h	3.0h
			5.0％v/v	1.0h	1.5h

刃天青指示剂红色退去说明培养基内氧气浓度低于0.1％，该氧气浓度可满足严格厌氧菌的生长要求。根据不同樟绒枝霉的接种量，可选定接种厌氧菌剂的时间点。

实施例2

本实施例具体说明本发明厌氧秸秆降解菌剂的制备方法。

分别接种7种活化的厌氧菌至除氧的液体PCS培养基中，55℃静置培养48h，获取培养液，即为所述复合菌剂。

实施例3

不同发酵温度对厌氧秸秆降解菌剂酶活性的影响。

具体操作步骤如下：

将7种厌氧菌等体积接种至用樟绒枝霉除氧的液体PCS培养基中，底物为1.0wt％麦秸，温度控制45℃，50℃，55℃，60℃。静置发酵48h。

具体操作步骤如下：

表2不同温度对厌氧菌剂菌体生长和木质纤维素酶活的影响

由结果可见，45℃～60℃均可满足该厌氧秸秆降解菌剂的培养，在45℃～55℃培养条件下，温度升高有利于菌体生长和木质纤维素酶活的提高。高于55℃，菌体生长和酶活较55℃略有下降，因此55℃为本发明厌氧秸秆降解菌剂的最佳发酵温度。

实施例4

本实施例中研究了厌氧秸秆降解菌剂降解不同秸秆的效果以及氢氧化钠处理对降解效果的影响。

秸秆的前处理：秸秆在105℃下烘干至恒重用密封袋密闭存储备用。

秸秆碱处理：采用1.0％的NaOH溶液按照10％的秸秆添加量处理稻秸和麦秸24h。用100目滤袋收集秸秆并充分纯水洗至流出液为近中性。将处理后的秸秆在105℃下烘干至恒重用密封袋密闭存储备用。

具体秸秆厌氧降解操作步骤如下：

称取50mLPCS培养基成分，用纯水定容至45mL，加入1.0wt％的不同秸秆(0.5g)作为底物，秸秆原料为先过100目筛的上层秸秆再过20目筛的下层秸秆，121℃灭菌15分钟，冷却至室温备用。向PCS培养基中通高纯度除氧氮气2分钟，随后立即加入5mL实施例2制备的厌氧秸秆降解菌剂，继续通入高纯氮气2分钟，用带铝盖的胶塞密闭。55℃下静置培养。

经过15天降解后，用100目纱网过滤收集剩余秸秆，秸秆用50mL纯水清洗3次后置于105℃烘箱中，烘干至恒重，记录重量并计算秸秆降解率。

结果如图1所示，可见，本发明中的复合菌剂能够对常见的稻麦秸秆具有非常好的降解效果，在不进行任何预处理的情况下稻秸和麦秸的降解率分别达到46.7％和54.47％。适当的预处理可显著提高秸秆的降解率，NaOH碱处理后，稻秸和麦秸降解率分别达到68.6％和80.1％。

Claims

1.一种厌氧秸秆降解菌剂，其特征在于，所述菌剂由纤维梭菌（Clostridium cellulosi）DG5，热纤梭菌（Ruminiclostridium thermocellum）M3，克莱弗雷梭菌（Clostridium clariflavum）DSM 19732，热解糖嗜热厌氧菌（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum）DSM 571，嗜热产丁酸梭菌（Clostridium thermosuccinogenes）DSM 5807，粪堆梭菌（Clostridium stercorarium）DSM 8532，哈尔滨毛螺菌（Herbinix luporum）SD1D 7种厌氧菌等比例接种后发酵制得。

2.权利要求1所述厌氧秸秆降解菌剂的制备方法，其特征在于，在发酵培养基中加入樟绒枝霉除氧，之后再接种活化的7种厌氧菌进行发酵培养。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：

1）分别活化樟绒枝霉和所述7种厌氧菌；

2）挑取樟绒枝霉菌体稀释后接种于发酵培养基培养，至培养基发酵液红色退去；

3）接种所述7种厌氧菌，45℃~60℃条件下发酵培养，获取培养液，即为所述厌氧秸秆降解菌剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中，接种液的活菌量大于1×10⁶ CFU/g。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中，所述厌氧秸秆降解菌剂中微生物含量大于1×10⁶ CFU/g。

6.权利要求1所述厌氧秸秆降解菌剂在秸秆降解中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在PCS培养基中加入秸秆作为底物，之后厌氧状态下加入所述厌氧秸秆降解菌剂，厌氧状态下密闭静置培养。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，将秸秆加入培养基前，对秸秆采用NaOH碱处理处理。