CN111770681A - 用营养萌发剂组合物和芽胞孵化法改善水产养殖池塘水质的方法 - Google Patents

用营养萌发剂组合物和芽胞孵化法改善水产养殖池塘水质的方法 Download PDF

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Abstract

一种通过向池塘水中添加使用营养萌发剂组合物优选从芽胞原位萌发的活性细菌来改善水产养殖应用中池塘水质量的方法，以及一种结合硝化增强剂如碳酸钙或钙化的海藻，和任选的反应表面积改性剂，例如钙化的海藻或塑料或金属颗粒或碎片提高芽胞萌发效率的孵化方法。该营养萌发组合物包含L‑氨基酸、D‑葡萄糖和/或D‑果糖、磷酸盐缓冲液、工业防腐剂，并且可以包括细菌芽胞(优选一种或多种芽孢杆菌属物种)或它们可以单独组合以用于萌发。该孵化方法包括将营养萌发剂组合物和细菌芽胞加热到35℃至60℃的温度范围约2至60分钟，以产生排放到水产养殖应用中的经孵化的细菌溶液。

Description

用营养萌发剂组合物和芽胞孵化法改善水产养殖池塘水质的 方法
相关申请的引证
本申请要求2018年2月28日提交的美国申请序号15/907,682的权益。
技术领域
本发明涉及用在营养萌发剂组合物中萌发的细菌处理养殖池塘水，并采用使用点芽胞孵化法来减少水畜牧业应用中的有机废物、氨和疾病压力，并为水产养殖物种提供益生菌。
背景技术
水产养殖是指养殖用作人类或动物食物来源的水生物种。该技术将某些类型的控制应用于饲养物种的自然环境，以改善整体产量。这可能包括人工孵化物种以增加野外动物的商业收成，在封闭池塘中孵化和饲养物种，以及在靠近海岸线的潮汐排水封闭区域中孵化和饲养物种。与该过程相关的问题包括：从饲养场排放的污染将使周围的水质恶化；由于饲养场中水质恶化而造成的产品损失；饲养设施中与病原微生物相关的疾病压力增加。可以通过测试或监视各种参数(包括pH值、电导率、氨、硝酸盐、磷酸盐和碱度)来确定此类问题。电导率是盐含量的指标，大于1200ppm的量不再被认为是淡水；理想的量是700ppm，且范围是300-1200ppm。氨水平衡量鱼类的可用氧气量。高水平的氨会阻止鱼中氧气从鱼鳃到血液的转移；然而，这也是他们代谢废物的产物。尽管鱼废物中的氨通常未浓缩到足以使其本身具有毒性，但由于每个池塘中鱼的高浓度，鱼养殖户必须密切监测氨水平。池塘中的硝化细菌消耗了氧气，这些细菌将有毒的氨分解成无毒形式。然而，大量使用氧气减少了可供鱼类摄取的氧气。氨水平>1ppm被认为对鱼类生命有毒。另外，检查硝酸盐水平以确定水中的植物肥料的量。硝酸盐可从周围土壤中高度浸出，并且可能对小孩和孕妇有害。硝酸盐在胃肠道中变成亚硝酸盐，并与血液的携氧能力相互作用。硝酸盐的最大污染水平为10ppm。碱度是衡量池塘或湖泊中和酸而不改变pH值的能力的量度。由于细菌的影响，碱度会随着时间而降低；然而，理想水平是100ppm，可接受范围是50-200ppm。池塘和湖泊中发现的磷酸盐主要来自人类和动物废物。肥料流失是高尔夫球场和装饰池塘中发现的磷酸盐的主要来源。升高的水平导致富营养化速率的提高，其进而增加污泥产生。适量的磷酸盐可以刺激植物生长，导致海藻产量增加；>0.1ppm的水平表明植物生长加快，被认为超出可接受水平。
解决这些问题的当前技术包括生物修复、抗生素和化学添加剂。典型的生物修复技术包括将补充细菌应用于水中，以增强微生物活性，从而改善水质。还已知使用硝化细菌来增强硝化过程，以将有毒的氨转化为无毒的硝酸盐。添加化学添加剂可改善水质，并通过提供额外的养分和碱度来帮助微生物活性。加入抗生素以抑制病原微生物的生长。与当前技术相关的问题包括：高成本、无活性补充细菌导致水质改善性能差、由于有机废物的存在和硝化细菌生长位点的缺乏而导致的硝化活性低下以及养殖水生物种中抗生素的生物积累。
根据美国申请序列号14/720,088中公开的优选方法，可以使用生物发生器在现场产生活性细菌，以使细菌从固体细菌起始剂材料生长到有用的种群。然后可以将活性细菌从一个或多个生物发生器排放到水产养殖应用中。这样的生物发生器及其使用方法公开于例如，美国专利号6,335,191；7,081,361；7,635,587；8,093,040；和8,551,762，其内容通过引用并入本公开。然而，在水产养殖应用中使用时，有一种从芽胞产生活性细菌的替代方法将是有用的。
芽胞萌发是一种多步骤的致病过程，其中芽胞有效地唤醒或从休眠状态恢复到营养生长状态。第一步骤是通过称为萌发的环境信号激活芽胞并诱导其萌发的步骤。该信号可以是诸如L-氨基酸的营养物。营养萌发剂与芽胞内膜中的受体结合以启动萌发。此外，糖已被证明可增加L-氨基酸对其同源受体的结合亲和力。
然后，萌发信号启动引起吡啶二羧酸(DPA)的释放的级联，其与芽胞核心中的Ca2+(CaDPA)以1:1的比例储存。CaDPA的释放是一个快速的过程，且通常在2分钟内完成>90％。CaDPA释放代表了其中它们致力于萌发过程的芽胞的不归点。本领域技术人员将该步骤称为“定型”步骤。
CaDPA释放后，芽胞部分水合，且核心pH升至约8.0。然后，芽胞的核心膨胀，且皮层(主要由肽聚糖组成)被核心裂解酶降解。芽胞吸收水分，因此失去其折射率。在萌发过程结束时这种折射率的失去允许通过相差显微镜监测芽胞萌发。
萌发的第二阶段是其中芽胞的代谢、生物合成和DNA复制/修复途径开始的外生长步骤。外生长期有几个阶段。第一种被称为成熟期，其中不发生形态变化(例如，细胞生长)，但芽胞的分子机制(例如，转录因子、转译机制、生物合成机制等)被激活。该期间的长度可以根据芽胞形成过程期间使用芽胞包装的初始资源而变化。例如，几种芽孢杆菌物种(包括枯草芽孢杆菌)的优选碳源是苹果酸，且芽孢杆菌芽胞通常含有在复苏过程中使用的大量苹果酸。有趣的是，与野生型芽胞相比，不能利用苹果酸池的缺失突变体显示出延长的成熟期，表明芽胞苹果酸池足以激发初始外生长过程。此外，芽胞储存小的酸溶性蛋白质，酸溶性蛋白质在复苏的前几分钟内降解充当蛋白质合成的直接氨基酸来源。在外生长步骤之后，芽胞复苏完成并且细胞被认为是无性生长的。
已知可以通过热激活诱导芽胞萌发。各种芽孢杆菌属的芽胞在菌株特异性温度下被热激活。例如，枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)芽胞在75℃下热激活30分钟，而地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)芽胞在65℃下热激活20分钟。已显示热激活引起芽胞外壳蛋白的瞬时，可逆展开。然后，可在含有营养萌发剂(例如，L-丙氨酸)的萌发缓冲液中将热激活的芽胞萌发另外的时间。然而，如果不存在营养萌发剂，则芽胞将返回其预热的非萌发状态。
还已知萌发可以在没有热激活和含有营养物的萌发缓冲液的情况下在环境温度(接近典型的室温)下发生，但该过程通常比热激活需要更长的时间。例如，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)芽胞将分别在35℃或37℃下萌发，但在含有营养萌发剂的萌发缓冲液中其需要更长的时间(例如，2小时)。此外，已知枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的非热激活芽胞已在非营养萌发剂条件(例如，CaCl2+Na2DPA)中萌发延长的一段时间。
还已知在实验室环境中通过两步法将热激活和营养萌发剂的使用结合起来萌发芽胞。首先，通过在65-75℃的温度下孵化一段时间(例如，30分钟)来热激活芽胞(该特定温度是物种依赖性的)。然后，将芽胞转移到含有营养萌发剂的缓冲溶液中，例如L-丙氨酸。还已知通过将颗粒化的营养物质(含有糖、酵母提取物和非直接芽胞萌发剂的其它营养物)、细菌起子和水进料到生长室中在控制温度范围为16-40℃，更优选为29-32℃下生长位于使用部位附近的生长室中的细菌，生长期约为24小时，如美国专利号7,081,361中所公开的。
需要一种快速的芽胞孵化和活化方法，其允许在使用点位置在单个步骤中生成活性细菌，例如芽孢杆菌物种，其中细菌将被排放到水产养殖应用中。因此，本发明描述了一种用于芽胞萌发的简单方法，其使用营养萌发剂浓缩物与芽胞组合物组合，或使用营养芽胞组合物，同时在单个步骤中进行热孵化以用于水产养殖应用中。
发明内容
本发明的方法提供了一种经济有效的方法，以将活性细菌输送到水产养殖设施中的池塘水(或养成池)中，以降解有机废物并抑制病原微生物的生长而没有生物积累。本发明的方法降低了水畜的疾病压力，提高了水产养殖操作中养殖物种的收成。作为该方法的一部分，本文公开的硝化增强剂的添加为硝化细菌提供了稳定的碱度源和额外的生长位点，以促进硝化活性和氨还原。
本发明的方法理想地包括将活性细菌，任选地包括益生菌，最优选地由使用液体营养萌发剂浓缩物和芽胞形式的细菌从现场孵化器产生的活性细菌递送到水产养殖应用中。根据本发明一个优选实施方案的营养萌发剂组合物包含许多L-氨基酸中，任选地D-葡萄糖中的一种或组合(其增加L-氨基酸对其芽胞外壳中的同源受体的结合亲和力)，和中性缓冲剂如磷酸盐缓冲剂和工业防腐剂，例如市售的Kathon/Lingaurd CG(其具有包含甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮的活性成分)。根据本发明另一个优选实施方案的营养萌发剂组合物包含两种或多种L-氨基酸中，任选地D-葡萄糖中的一种或组合(其增加L-氨基酸对其芽胞外壳中的同源受体的结合亲和力)、HEPES钠盐(为芽胞萌发提供适当pH的生物缓冲液)和工业防腐剂，例如对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸甲酯或其他美国联邦GRAS(通常认为是安全的)防腐剂的组合。根据另一个优选的实施方案，组合物还包含钾离子源，例如氯化钾或磷酸二氢钾或磷酸氢二钾。根据另一个优选的实施方案，组合物包含D-葡萄糖和D-果糖。
根据另一个优选的实施方案，营养萌发剂组合物还包含一种或多种细菌物种，优选芽孢杆菌属物种的芽胞，但是也可以使用其他细菌，并且包括萌发抑制剂，例如NaCl、工业防腐剂或D-丙氨酸，结合任何上述芽胞组合物成分。萌发抑制剂防止芽胞过早地在营养萌发剂组合物中萌发。萌发抑制剂可包括防止芽胞萌发的化学物质，例如NaCl、工业防腐剂或D-丙氨酸。
或者，可以单独提供细菌芽胞，并在使用点和孵化时将其添加到根据本发明的营养萌发剂组合物中。当单独添加时，优选提供包含一种或多种细菌物种，优选芽孢杆菌物种的稳定的芽胞悬浮液芽胞组合物。根据一个优选的实施方案，一种芽胞组合物包含细菌芽胞，约0.00005至3.0wt％的表面活性剂，约0.002至5.0wt％的增稠剂以及任选地约0.01至2.0wt％的酸化剂、酸或酸的盐(包括用作防腐剂或稳定剂的那些)，其余为水。根据另一个优选的实施方案，一种芽胞组合物包含细菌芽胞，约0.1-5.0wt％的增稠剂，约0.05-0.5wt％的酸或酸的盐，任选地约0.1-20wt％的水活度降低剂，以及任选地约0.1-20wt％的其他酸化剂(酸或酸的盐)，其余为水。
最优选地，在两个优选的芽胞组合物实施方案中，细菌芽胞为组合占芽胞组合物重量的约0.1-10％的40-60％的盐(食盐)和60-40％的细菌芽胞(在添加至芽胞组合物之前)的干燥的粉末共混物。芽胞组合物优选包含约1.0×108至约3.0×108cfu/ml的芽胞组合物(芽胞悬浮液)，当将其用饮用水稀释(用于动物浇水应用)时，在饮用水中提供约104至106cfu/ml的细菌菌株。最优选地，在两个优选实施方案中的增稠剂都是还充当益生元如黄原胶的增稠剂，以提供额外的益处。尽管可以使用其他可商购的芽胞产品，但是用于本发明的优选的芽胞组合物如2014年10月27日提交的美国申请序列号14/524,858中所公开，其通过引用并入本文。
根据另一个优选的实施方案，根据本发明的营养萌发剂组合物是浓缩形式，并且在使用点在水或另一种稀释剂中稀释至0.01％至10％强度。浓缩制剂的使用降低了运输、储存和包装成本，并且使芽胞组合物在使用点的给药更容易。最优选地，浓缩的芽胞组合物是液体形式，其在使用点与稀释剂混合更容易和更快，但也可以使用固体形式如粒料或砖块或粉末。在芽胞组合物中包含通用的工业防腐剂有助于长期储存和/或萌发抑制，当芽胞组合物为优选的浓缩形式时，这是特别有用的。
在另一个优选的实施方案中，本发明包括在升高的温度下使用与芽胞组合物组合的营养萌发剂组合物或使用营养萌发剂组合物萌发孢杆菌属芽胞的方法；优选地在35-60℃的范围内，更优选在38-50℃的范围内，且最优选地在41℃-44℃的范围内一段时间(孵化期)。根据应用，孵化期优选为2-60分钟或更长。最优选地，根据本发明的优选实施方案的浓缩形式的营养萌发剂或营养芽胞组合物用于本发明的孵化/萌发方法中，但也可以使用其他营养萌发剂组合物和芽胞组合物。优选地，孵化方法在使用点处或附近进行-在其中使用或消耗萌发芽胞的水产养殖地点或水产养殖地点附近，且进一步包括分配萌发的芽胞到使用点/消费。根据本发明的优选方法可以在任何孵化装置中进行，所述孵化装置具有能够容纳一定体积的芽胞(如果单独添加)、液体(通常水作为稀释剂)、营养萌发剂组合物并且能够在孵化期间加热混合物的贮存器。最优选地，在装置中进行所述方法，所述装置还能够混合这些成分，在孵化期结束时自动关闭加热，并将包含细菌的孵化的细菌溶液自动分配到水产养殖的使用点/消费。优选的方法也可以间歇方法或以连续方法进行。尽管优选使用根据本发明的芽胞组合物，但是任何种类的芽胞形式或产物，例如干粉形式、液体悬浮液或重构的含水混合物，可以与本发明的方法一起使用。
本发明的优选实施方案允许在水产养殖使用点快速萌发孢杆菌属的芽胞。从孵化器中排出的活性、营养细菌溶液可以直接供应到生长中的池塘，或者可以在将其排放到养成池之前，用池塘水或其他类似的合适的稀释剂(例如来自市政供水系统的水)进行积累和稀释。或者，孵化器可被配置为在休眠芽胞和营养细菌之间加热营养萌发剂组合物和芽胞，或营养芽胞组合物，持续在亚稳态下产生细菌的孵化期和温度范围。然后将亚稳态细菌溶液排入正在养成池中，在该养成池中细菌能够变成活性的营养细菌。如果孵化器距离养成池一定距离，则稀释可有助于将处理溶液从孵化器流向递送到养成池。活性细菌将降解有机废物并抑制水产养殖设施中水中病原微生物的生长，而无需添加(或减少)养成池中使用的化学处理剂和抗生素的量。
本发明还期望地包括将至少一种硝化增强剂同时施用至养成池。硝化增强剂可提高水中天然存在的硝化细菌的活性，从而降低氨含量。这些硝化剂包括增加水的碱度的碱度增强剂，该碱度对于硝化是必需的(7份碱度对1份氨)和/或表面积改性剂，以增加硝化细菌生长的表面，因为硝化细菌会随着生物膜生长，需要它们可以附着的表面。碱度增强剂可包括例如，碳酸钙、钙化海藻或其他类似有效的添加剂。这些试剂可以高于溶解的量添加，以在它们缓慢溶解时提供连续的碱度源。通过提供碱度和高表面积，某些硝化剂(例如钙化的海藻)既可充当碱度增强剂，也可充当表面积改性剂，为硝化细菌生物膜的生长提供支撑表面。钙化的海藻还可以充当细菌的微量营养素来源。其他硝化增强剂仅充当表面积改性剂，例如塑料或金属件，或其他类似有效材料，以增加可发生有利反应和相互作用的表面积。也可以将一种或多种仅充当表面积改性剂(而不是碱度增强剂)的试剂单独或优选与一种或多种碱度增强剂组合添加到养成池中；然而，仅充当表面积增强剂的试剂不会在养成池中降解，也不会与每批细菌溶液一起添加。这种仅充当表面积改性剂的试剂优选仅添加到养成池中一次。可以定期，例如季节性地(每个季节一次或每年夏季一次、每年两次等))或根据需要，将充当碱度增强剂的试剂与一批细菌同时添加到养成池中。如本文所用，术语“同时的”意图是指将一批营养细菌和其他成分或试剂添加到养成池或其中在水产养殖设施中生长水生动物物种的其他生长介质中的时间“或大约”那个时间。
附图说明
结合以下附图进一步描述和解释本发明的系统和方法
图1是根据本发明的优选实施方案的孵化系统和方法的流程图；
图2是根据本发明的另一优选实施方案的孵化系统和方法的流程图；
图3是根据本发明的另一优选实施方案的孵化系统和方法的流程图；
图4是实验室研究中硝酸盐水平的图表；
图5是实验室研究中正磷酸盐水平的图表；
图6是实验室研究中的浊度的图表
图7显示了与对照载玻片相比的，使用根据本发明的优选实施方案的芽胞组合物和方法的细菌载玻片的照片；
图8是显示与对照测试相比，使用根据本发明的优选实施方案的芽胞组合物和方法证实萌发水平的pO2测试数据的图表；
图9是显示与对照测试相比，使用根据本发明的优选实施方式的芽胞组合物和变化方法证实萌发水平的pO2测试数据的图表；且
图10显示了三个水族箱的图像，每个水族箱都处于控制之下(左)，仅碳酸钙处理(中)或使用活化的营养-芽胞制剂进行处理(右)。
具体实施方式
水产养殖处理方法
根据一个优选的实施方案，活性细菌是由营养萌发剂组合物与芽胞组合物或预混合的营养芽胞组合物原位产生的，优选使用如下所述的孵化器系统和优选的萌发方法，并且在水产养殖应用中将活性细菌周期性地进料到养成池中。同时还将一种或多种硝化增强剂与活性细菌同时地添加到养成池中。
用于本发明的方法的令人满意的细菌生长和递送装置将包括现场孵化器系统，例如空气孵化器、水孵化器，或根据需要在给定温度范围内提供均匀、恒定热量以使芽胞萌发以便排放到水产养殖应用中的任何其他腔室或类似设备。参考图1，优选地，现场孵化器系统10包含一个或多个用于容纳初始量的营养萌发剂组合物12和初始量的细菌芽胞溶液14的罐或容纳容器(如果细菌芽胞不包括在营养萌发剂组合物中)。这些芽胞组合物也可到达可与孵化器流体连通地连接的容器中的使用地点，在这种情况下，不需要单独的罐或容器。在水产养殖地点或附近的水源16也是可选的，但优选地，可与孵化器系统流体连通地连接。井，市政供水源或养成池可将水16提供给孵化器18。孵化器系统10还优选地包括室或容器18，该室或容器被构造成接收营养萌发剂组合物和芽胞的一部分，并使它们被加热以使芽胞萌发；加热器；阀门、油管和泵(如果需要，如果重力流量不足的话)，以使营养萌发剂组合物12、细菌芽胞溶液14和任选的水16从其储存容器/源流入加热室或容器18以及从加热室或容器18中排出孵化的细菌(或活化细菌)溶液20，并将其输送至养成池22；加热室或容器18中的任选的混合器，以及用于激活阀、泵、任选的混合器和加热器的控制器或计时器，以控制营养物和芽胞组合物流入加热室，孵化时间和温度，以及排放到养成塘。最优选地，现场孵化器系统10使用与细菌芽胞组合物组合的营养萌发组合物(如下所述)或使用营养芽胞组合物(也如下所述与细菌芽胞预混合的营养萌发剂组合物)(两者在本文中也称为“起始材料”)，以产生孵化的细菌溶液20，排放到养成池22中。
或者，根据如图2所示的另一优选实施方案，孵化器系统110使用浓缩的营养萌发剂组合物24和浓缩的芽胞组合物30，将其用来自容器/源26的稀释剂或水稀释以形成工作营养萌发剂组合物28和工作芽胞组合物32，各自的一部分进料到孵化器18中以产生一批活化细菌20。代替水源26或除水源26之外，水源16中的水也可用作稀释剂源。另外，营养萌发剂组合物24或芽胞组合物30中的仅一种可以是浓缩形式，并且在进料到孵化器18中之前需要稀释。根据另一优选实施方案，当仅浓缩一种时，除了或代替来自源26和/或源16的水/稀释剂，该非浓缩组合物可用作用于浓缩组合物的稀释剂。根据另一个优选的实施方案，浓缩营养芽胞组合物34与系统210一起使用，如图3所示。在进料到孵化器18中之前，将浓缩的营养芽胞组合物用自源26和/或源16的水/稀释剂稀释以制成工作营养芽胞组合物36，产生一批活化细菌20。或者，营养芽胞组合物可以不是浓缩形式，并且在进料到孵化器18中之前不需要任何稀释剂(类似于图1中的营养萌发剂组合物12的直接进料)，在这种情况下，不需要水/稀释剂源26。在该替代实施方案中，根据需要，仍可任选地将来自源16的水进料到孵化器18中。在任何孵化器系统的实施方案中，可以将稀释剂进料到孵化器18中以稀释孵化器内的浓缩组合物，而不是在进料到孵化器之前。如本领域普通技术人员将理解的，来自系统10、110和210的元件的任何组合可以一起使用。
优选地，根据本文所述的优选的萌发方法，细菌芽胞在孵化器18或其他合适的加热装置中萌发。根据一个优选的实施方案，将营养萌发剂组合物和芽胞组合物(或营养芽胞组合物)在孵化器18中加热至35-55℃，更优选38-50℃，和最优选41℃至44℃的温度。孵化期可以根据最终用途应用而变化，但是优选地在约20分钟至60分钟之间以产生用于水产养殖应用的活性细菌，并且最优选地在约2分钟至5分钟用于产生亚稳态细菌的益生菌应用。为了给营养细菌提供额外的生长时间，孵化期可能为约4至6小时。
取决于细菌在水产养殖应用中的期望用途，例如用于处理水或水生动物物种的益生菌，可以使用不同的孵化期来提供主要仍然是芽胞形式细菌的孵化的细菌溶液，主要是亚稳的细菌(其中芽胞既不休眠也不处于营养生长阶段，在本文中也称为活化状态)，或者主要是完全营养细菌。另外，当需要完全营养的细菌时，可将细菌溶液在孵化期之后在孵化器18或另一个中间容器中保持一段时间，以允许细菌繁殖，然后排放到水产养殖应用中。最优选地，将细菌溶液保持在30至45℃之间的温度，更优选地，将营养细菌溶液根据需要加热以将溶液的温度保持在33至42℃的范围内，并且最优选地36℃至39℃的范围内，以促进在该后孵化生长期期间的生长。当需要益生菌应用时，细菌通过使用较短的孵化期排放到水产养殖应用中时，主要保持芽胞状态或亚稳态，这使细菌有更好的机会存活到水生动物物种肠道，那里是它们作为益生菌最有益的地方。在孵化期结束时，将孵化的细菌溶液20排放到养成池中。根据所用细菌的种类、孵化温度、孵化时间和所用营养物的含量，孵化细菌溶液20可包含完全营养细菌、亚稳态细菌、芽胞或它们的组合。
每一批孵化的细菌溶液20包含约1×108-1×1010cfu/mL的亚稳态、营养细菌物种和/或芽胞。一旦排放到养成池22中，就基于养成池中的水量稀释每批中的细菌量。最优选地，将足够量的细菌溶液20添加到养成池22中，以基于养成池中的稀释度提供有效量的活化细菌。在本文中，“有效量”可以指在施用后可有效改善植物或动物的性能的细菌和/或营养组合物的量。可以通过监测一个或多个特征来衡量或评估性能的改善，这些特征包括但不限于水质：水的澄清度、氨水平、亚硝酸盐水平、硝酸盐水平、疾病发生率、死亡率、收获重量、肉质、个体动物大小、额外重量、抗生素使用和添加剂使用。“有效量”还可以指可减少动物肠中的一种或多种病原性细菌物种(包括但不限于大肠杆菌和沙门氏菌)的量，竞争性排除和/或消除动物肠中的一种或多种病原性细菌物种。“有效量”也可以指可以降低NH3和/或H2S水平的量，例如可以被动物排泄到其环境中的量。
根据用于虾水产养殖应用的一个优选实施方案，养成池中细菌的有效量可为约1至约9×102CFU/mL。根据另一个优选的实施方案，虾水产养殖应用的有效量为约1至约9×102至约108CFU/mL。根据另一个优选的实施方案，在养成池中孵化的细菌的有效量可为养成池中水的总量的约0.001％至约2％v/v，并且可为其中的任何范围或值。作为另一个实例，每天向养成池中投加四次包含约1×109-1×1010cfu/mL的细菌物种的约500mL的孵化的细菌溶液足以处理含100,000加仑的水的养成池。根据池塘的大小、基于池塘的状况、水生生物物种、池塘的温度和其他因素，可以使用其他体积的细菌溶液和给药间隔来处理养成池以在池塘中达到细菌的期望的有效量，如本领域普通技术人员理解的那样。
可以提供多个孵化器系统10、110或210，以向养成池提供大量的孵化的细菌溶液，实现将期望的有效量添加到池塘中，以向养成池提供不同种类的细菌或在不同的时间或速率下，和/或在养成池的周边周围使排放的孵化细菌溶液间隔开，以帮助细菌通过池塘分散。也可以将泵或其他混合装置添加到养成池中(如果尚未安装到位)，以帮助将孵化的细菌溶液(以及硝化增强剂或表面积增强剂)分散到整个养成池中。
现场孵化器优选地被配置为从营养萌发剂组合物/芽胞组合物或营养芽胞组合物的容器中孵化多批次的孵化的细菌溶液，使得在需要补充起始材料之前，多批次的细菌可以在延长的一段时间内以周期性的时间间隔排出。例如，营养萌发剂组合物12的容器最初可以容纳0.3至3升的营养萌发剂组合物，其可以每1至24小时以约10至100mL的增量进料到孵化器中。浓缩的营养萌发剂溶液24的容器最初可容纳0.2到1升的溶液，用来自源26或16的水/稀释剂稀释到浓缩液与水/稀释剂的比例为约1:50至约1:10，以每1到24小时以约0.1至200mL的工作营养萌发剂溶液28的增量进料到孵化器。要分别与营养萌发剂组合物一起进料的细菌芽胞溶液14的容器最初可以容纳0.6到6升的溶液，其可以每1到24小时以约20到200mL的增量进料到孵化器。浓缩的细菌芽胞溶液30的容器最初可容纳0.15到6升的溶液，用来自源26或16的水/稀释剂稀释到浓缩液与水/稀释剂的比例为约1:10至约1:3，以每1到24小时以约5至200mL的工作芽胞溶液32的增量进料到孵化器。营养芽胞组合物的容器最初可以容纳3至6升的营养萌发剂组合物，其可以每1至24小时以约100至200mL的增量进料到孵化器中。浓缩的营养芽胞溶液34的容器最初可容纳0.3到3升的溶液，用来自源26或16的水/稀释剂稀释到浓缩液与水/稀释剂的比例为约1:10至约1:50，以每1到24小时以约10至100mL的工作营养芽胞溶液36的增量进料到孵化器。然后将每批营养萌发剂组合物/细菌芽胞或营养芽胞组合物在孵化器中孵化，如本文所述，以形成被排放到水产养殖应用中的孵化的细菌溶液。
优选地，在处理周期的过程中，每4至6小时一次将孵化的细菌溶液20从一个或多个孵化器18排放到养成池22中。取决于池塘的大小、池塘/水生生物物种的条件和使用类型，可以使用其他的加药间隔。加药之间的时间可以根据需要通过改变向孵化器中添加成分的时间和/或孵化时间来改变。孵化的细菌溶液可能会更频繁地排放到更大的池塘(例如，2000万加仑)上。对于水产养殖水处理应用，优选排出具有营养细菌的孵化溶液。为了获得营养细菌，优选的是孵化至少4至6个小时，然后再排放到养成池，尽管也可以使用更长的孵化时间以使细菌有更多的繁殖时间。对于在水产养殖应用中对水生生物物种的益生菌应用，优选孵化约2至5分钟。在该应用中，如果需要更大的池塘，可以每天多次排出孵化的细菌溶液20，甚至每4至6分钟就排出一次。根据需要定期更换或补充进料孵化器的营养萌发剂组合物/芽胞组合物或营养芽胞组合物的体积。优选地，处理周期是连续的，并且孵化器全年运行(除了为维持或补充营养萌发剂组合物而定期关闭之外)。
如下所述，各种芽孢杆菌属物种优选与根据本发明的水产养殖处理方法一起使用，但是也可以使用其他细菌。例如，认为适合用于本发明的方法的细菌属包括芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteriodes)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、明串珠菌属(Lueconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、巨球形菌属(Megasphaera)、假单胞菌属(Pseudomonas)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)中的任何一种或多种物种。可能在现场产生的益生菌包括以下任何一种或多种：嗜淀粉拟杆菌(Bacillus amylophilus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)、居瘤胃拟杆菌(Bacteriodesruminocola)、猪拟杆菌(Bacterioides suis)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、克氏肠球菌(Enterococcus cremoris)、二丁酮肠球菌(Enterococcus diacetylactis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、中间肠球菌(Enterococcus intermedius)、乳酸肠球菌(Enterococcus lactis)、嗜热肠球菌(Enterococcus thermophiles)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruekii)、法氏乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳酸菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdennii)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilacticii)、啤酒片球菌(Pediococcus cerevisiae)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)、费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)和谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)。
将至少一剂量(或批次)的孵化细菌溶液排放到养成池中，优选地同时添加一种或多种硝化增强剂。包括碳酸钙或钙化海藻在内的碱度增强剂可以定期添加，例如季节性添加或根据需要添加，以减少磷酸盐，而不是与每一剂量的细菌一起添加。这些试剂可以高于溶解的量添加，以在它们缓慢溶解时提供连续的碱度源。缓慢溶解的碱度增强剂(例如，钙化的海藻)也充当表面积调节剂，为硝化细菌生物膜的生长提供支撑表面，并且它们也有助于营养物输送。另外，可以根据需要将仅充当表面积改性剂的试剂(例如，金属或塑料片)添加到养成池中，以减少氮或磷，以及一批或一定剂量的孵化细菌溶液和一种或多种碱度增强剂试剂，但优选地只添加一次，而不与每一剂量的孵化细菌溶液一起添加。这些表面增强剂类似地为添加的细菌的生物膜生长提供支撑表面，这有助于有益细菌的更快发育。最优选地，每750万加仑的养成池塘中添加约100磅的这种硝化增强剂，并且该量可以针对其他养成池的体积进行缩放。用于硝化增强剂的优选分散方法可包括使用自动装置或手动施用于养成池塘中的水。可用于以小丸、小球或颗粒形式广播或以其他方式分散至少一种硝化增强剂的自动化或手动操作的装置可商购获得，并且是本领域技术人员众所周知的。另外，这些硝化增强剂可以使用自分散添加剂系统和方法分散在池塘中，其在水溶性包装中采用泡腾材料和处理剂，如2015年4月17日提交的美国专利申请序列号14/689,790中所述，该申请通过引用并入本文。
用于本发明的方法的合适的应用包括，例如但不限于，各种类型的水产养殖应用，例如孵化场、池塘和潮流水产养殖。优选地，在现场生长的萌发或营养细菌与至少一种硝化增强助剂(如碳酸钙、钙化的海藻)或对水产养殖应用中使用的具有成本效益的水处理以解决有机废物、氨和病原微生物以及一般水质问题的类似有效的另一种材料的组合使用。认为，通过添加钙化的海藻或增加可发生相互作用或反应的可用表面积的其他塑料或金属片、颗粒或碎片，可进一步提高本主题方法达到这些目的的有效性。
进行了一项实验室研究，以评估向池塘水中添加有益细菌和硝化增强剂的益处。该研究的一个目的是评估添加的细菌(可从EcoBionics商购的池塘共混物)对海藻产生的抑制或除草功效。这项研究使用了六个2L的烧杯，每个烧杯装有1.5L的源水，这些水取自存在海藻的现有鱼缸。每个烧杯还包含一条来自鱼缸的金鱼、气泡石、光源，该光源交替开启12小时，然后关闭12小时，和观察玻璃盖以减少蒸发损失。根据下面描述的本发明的优选实施方案，使用37g的池塘加颗粒，而不是使用孵化器和营养萌发剂组合物，在BIO-AmpTM生物发生器中产生池塘共混物细菌溶液。在生物发生器中经过24小时的生长周期后，获得了等分的细菌溶液，并稀释以保持3L的池塘共混物比例：579024加仑的池塘水，然而，在田间使用的优选比例是3升的池塘共混物：100,000加仑的池塘水。根据该比例，将约0.4μL的池塘共混物细菌溶液添加到特定的装有1.5L的鱼缸水的烧杯中。根据制造商的说明，基于澄清的速率将钙化的海藻添加到特定的烧杯中；这相当于每1.5L的水为0.045g的钙化海藻。将等量的碳酸钙添加到一些烧杯中。每个烧杯中的添加剂如下：
表1
烧杯1 仅0.4μL的池塘共混物和1.5L的源水
烧杯2 仅0.045g的钙化海藻和1.5L的源水
烧杯3 0.4μL的池塘共混物、0.045g的钙化海藻和1.5L的源水
烧杯4 仅0.045g的碳酸钙和1.5L的源水
烧杯5 0.4μL的池塘共混物，0.045g的碳酸钙和1.5L的源水
烧杯6 用作阴性对照，仅含1.5L的源水
根据将在本领域中使用的一种优选的给药方案对每个测试烧杯进行处理。装有池塘共混物的烧杯1、3和5每周要用另外的0.4μL池塘共混物进行处理(加药)一次。取决于养成池条件，在田间可以使用其他加药时间表。在本研究开始时，仅添加一次钙化海藻和碳酸钙，然而，该领域可使用其他剂量。
从每个烧杯中取出一个预处理样品(在添加池塘共混物细菌溶液、钙化海藻或碳酸钙之前)并进行分析，以获得与后处理结果进行比较的基线。每周使用来自每个烧杯的200-300mL的样品进行化学分析。这些每周的测量包括pH值、电导率、硝酸盐、正磷酸盐、总碱度和氨水平的分析。每月检查一次浊度，并拍照以评估海藻生长和总体澄清度的变化。烧杯的处理和分析持续总共三个月；再次反映了实地研究的时间长短。
使用Excel 2003进行数据分析，使用两个样品的双尾t检验以95％的置信水平比较处理前和处理后数值。两个样品的双尾t检验检验了处理前和处理后的平均值无差异的零假设，以及平均值存在差异的替代假设。
HO＝μ处理前＝μ处理后
HA＝μ处理前≠μ处理后
基线读数表明所有烧杯中的磷酸盐水平均升高，是指示海藻生长加快的水平的40倍以上。所有其他测量值均在可接受的范围内。
表2–硝酸盐和磷酸盐的两个样品T-检验的结果
Figure BDA0002653252330000141
*表示显著性结果
在三个月的研究期内，仅包含细菌共混物小球的测试烧杯没有统计学上的显着变化。磷酸盐水平在两周后下降，但在一个月内恢复到处理前水平。硝酸盐水平反映磷酸盐的那些水平。在所有测试烧杯中，只有烧杯1具有与阴性对照相似的硝酸盐和磷酸盐水平升高。单独使用细菌时，这表示对池塘健康的主要化学指标影响很小。
含有钙化海藻的两个烧杯在处理前和处理后均值显示出统计学上的显着变化。烧杯2和3中的硝酸盐水平分别显着下降了79％和76％，p值分别为0.01和0.04。烧杯2中的磷酸盐水平也显着下降了74％，p值为0.02。含有钙化海藻和小球的烧杯显示磷酸盐减少了66％，然而，该值并不显着(参见表2)。重要的是，要注意，缺乏统计意义可能受本研究低样品量限制。这项研究没有测试样品中病原细菌的变化，但是可以预期添加池塘共混物细菌溶液通过竞争降低那些数值。另外，认为根据本发明的优选实施方案，使用营养萌发剂组合物将来自孵化器的细菌溶液添加到实际的养成池中将比实验室研究中获得更好的结果，因为细菌溶液中的细菌可以与养成池中已经存在的硝化细菌协同作用，且细菌溶液中添加的细菌可以帮助消耗水中的废物以降低氨水平。与钙化海藻烧杯相似，含有碳酸钙的两个烧杯在处理前和处理后的方式上显示出显着差异。在烧杯4中，硝酸盐含量下降77％，p值为0.03。同时，含有碳酸钙和细菌沉淀的烧杯5显示显着降低72％的磷酸盐水平，p值0.02(参见表2)。碳酸钙可能是水产养殖处理中钙化海藻的合适替代品。没有钙化海藻或碳酸钙的烧杯则没有。含有细菌共混物沉淀和碳酸钙的烧杯5，具有显着较低的磷酸盐水平的后处理平均值，并且对pH的影响最小。然而，烧杯2和5具有磷酸盐水平的统计上显着的下降。
在整个该研究过程中检查的浊度表明，所有测试烧杯中持续降低。当比较处理前图片与处理后图片时，所有烧杯中海藻的存在都有所增加，然而，到第二个月，有两个烧杯中有海藻死亡的证据。含有碳酸钙的烧杯4和烧杯6(对照)的颜色均为黄色，表明垂死的海藻系统。海藻死亡是海藻最初繁殖后普遍存在的问题，因为水中的氧气已经耗尽；尽管存在气泡石。随着海藻死亡，硝酸盐水平显着增加。这可以从本月高于处理前的硝酸盐水平的增加明显看出，烧杯4和6中分别增加14％和38％。到最后一个月，烧杯4中的硝酸盐水平恢复并且下降，尽管系统仍然是深绿色、黄色。硝酸盐继续增加到烧杯6中污染水平的6倍。图4-6是显示该实验室研究结果的图。
还在各种池塘中进行了专注于改善池塘总体健康状况和澄清度的田间研究，同时减少污泥。尽管该研究不是水产养殖特异性的(因为该研究中的池塘是观赏性或休闲性的，而不是用于饲养和收获水生生物种)，并且根据本发明的优选实施方案使用了生物发生器而不是孵化器和营养萌发剂组合物，它提供了一些有关添加细菌和硝化增强剂的有用信息。这项研究包括Irving,Texas及其附近的五个池塘；池塘(标识为1-5号池塘)的范围为23,400ft3至720,131ft3。这项研究的时间长度为七个月。每周一到两次，从每个池塘的岸边抽取200-300mL的地表水样品。分析这些样品的pH、碱度、硝酸盐、磷酸盐、氨、电导率、浊度和大肠杆菌属(E.coli spp.)浓度。使用Hach Dr890比色计进行磷酸盐、氨和浊度分析。大肠杆菌属(E.coli spp.)测定使用在35℃下孵化48小时的大肠菌生长的专用培养基(3MPetrifilm 6404)进行。
每个池塘每月取样一次，以评估污泥深度、澄清度和溶解氧(DO)。这些测量值是从一条小船上的两个到四个位置进行，并用GPS坐标标记以获得代表性的采样。使用污泥判断仪以英寸为单位测量污泥深度；每个GPS位置均采样三到四次，取平均值。使用带有HachHQ30d仪表的Hach LDO探针，从底层以ppm为单位测量溶解氧，并在距离表面18”处再次测量。使用Secchi圆盘以％/英尺为单位确定澄清度，其给出经验测量。此外，每月在每个池塘的2至4个位置拍摄一次照片，并用GPS坐标再次标记，以给出顾客对整个表面状况的看法。
在每个位置安装BioAMPTM 750气候可控生物发生器，用于每天现场计量细菌的专门的池塘共混物。使用改良的FREE-FLOWTM制剂将芽孢杆菌属芽胞制成颗粒；颗粒进料到生长容器中，在那里它们在最佳条件下生长24小时，然后直接分散到池塘中。BioAMP 750的维护必须根据标准协议进行修改，因为次氯酸钠(漂白剂)被认为对地表水有毒，欧文市不允许使用。为了获得与标准漂白剂处理相似的增白效果，使用155g的碳酸氢钠(小苏打)去除多余的生物膜并清洁生长容器。除了每月维护之外，还监视生物发生器是否存在任何故障，以及尽管在环境温度超过100°F的情况下仍能保持编程温度的能力。
作为细菌处理的伴侣，钙化海藻也应用于每个池塘。给定的钙化海藻的量取决于比例为100lbs至1,000,000ft3的水的体积。如美国专利申请序列号14/689,790中所述，使用含有泡腾耦合剂和钙化海藻的水溶性包装来计量钙化海藻。
每个研究池塘每天要接受相同数量的细菌(30万亿个CFU)。相关矩阵显示，污泥深度与剂量率成反比。在两个较小的池塘中，观察到的污泥水平和澄清度下降最大，并且每天的最高细菌剂量分别为2×107CFU/L和7×106CFU/L。所观察到的澄清度对所有池塘都显示出积极的影响，而不论大小。在该研究的三个最小的池塘中，澄清度为约100％。相反，到本研究结束时，两个最大的池塘仅实现20％的澄清度。
使用单侧2样品t检验评估处理后污泥水平是否显着降低。P值为0.006，发现统计上显着平均降低为31％。H0：μ处理前＝μ处理后，HA：μ处理前>μ处理后。观察到的该平均减少量等于污泥层的平均3英寸减少。此外，与处理前相比，本研究中的每个池塘的污泥水平均降低了(参见表3)。
表3-池塘中PO4、NO3和污泥的变化
池塘 ％ΔPO4 ％ΔNO3 ％Δ污泥
1 -19 -71 -45
2 -77 -100 -18
3 -40 0 -16
4 -70 -100 -37
5 -48 0 -43
平均值： -52 -91 -31
在大肠杆菌属中观察到的平均变化为减少59％。重要的是要注意整个范围包括145％的增加至100％的减少。如此宽的范围加上较小的样品量使得难以确定对大肠杆菌属物种的治疗效果。五个研究池塘中有三个池塘的大肠杆菌属浓度有所增加；然而，其他两个池塘观察到急剧减少；然而，认为该增加是由于雨水径流流入池塘的结果。
检查了该处理对磷酸盐浓度的总体影响，将处理前与处理后的水平比较。发现该数据是非参数的，并且采用了单侧曼-惠特尼检验来确定处理后磷酸盐浓度是否显着降低。H0：μ处理前＝μ处理后，HA：μ处理前>μ处理后。获得了P值为0.0000，表明处理后的磷酸盐水平总体下降52％具有统计学意义。池塘中磷酸盐水平变化的详细检查也显示出有意义的下降。每个处理的池塘的磷酸盐浓度降低幅度为19％至77％(参见表3)。平均为52％的减少与本研究第一阶段中观察到的57％的减少相似。这表明细菌给药频率的增加可能与磷酸盐浓度的降低无关。此外，在施用钙化海藻后直接观察到磷酸盐水平显着下降。磷酸盐水平于6月开始上升后，第一剂于春季施用，第二剂于夏季施用。粉末产品的非化学、环保特性为控制磷酸盐浓度提供了有希望的结果。
同样，使用单侧曼-惠特尼检验检查硝酸盐水平，以评估治疗后硝酸盐浓度是否显着降低。H0：μ处理前＝μ处理后，HA：μ处理前>μ处理后。P值为0.0000时，确定浓度降低91％具有统计学意义(参见表3)。为此，基线硝酸盐浓度低于建议的水平，因此预计不会减少，更不用说统计学上显着减少91％。此外，到第4个月，每个具有可检测硝酸盐的研究池均显着减少到低于0.01ppm的检测极限。与第一阶段观察到的(约69％)减少相比，这是一个巨大的进步，表明增加细菌投放的频率对这些浓度有直接的影响。总体而言，这项研究表明，通过化学代理和污泥水平的降低，用细菌和钙化的海藻加强处理提高池塘健康。
营养萌发剂组合物
根据本发明的一个优选实施方案的营养萌发剂组合物包含一种或多种L-氨基酸、D-葡萄糖(其增加L-氨基酸对其芽胞外壳中的同源受体的结合亲和力并且是任选的)、D-果糖(任选的，取决于细菌种类)、生物缓冲液为芽胞萌发提供适当的pH值(例如，HEPES钠盐、磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液)、钾离子的任选来源(例如KCl)和工业防腐剂。在另一个优选的实施方案中，营养萌发剂组合物还包含D-葡萄糖和D-果糖。当使用D-葡萄糖和D-果糖时，最优选包括钾离子源，例如KCl。如本领域普通技术人员所理解的，D-果糖，D-葡萄糖和D-果糖的组合以及钾离子源的使用取决于细菌的种类。优选使用与芽胞组合物pH相容的防腐剂，其具有相对中性的pH。根据另一个优选的实施方案，营养芽胞组合物还包含一种或多种芽孢杆菌属物种的芽胞和优选一种或多种萌发抑制剂。包含芽胞的营养萌发剂组合物在本文中称为营养芽胞组合物、制剂或溶液。或者，可以在使用点将芽胞单独添加到根据本发明的营养萌发剂组合物中。当单独添加时，芽胞优选是本文所述的芽胞组合物或芽胞制剂的一部分，但是也可以使用其他可商购的芽胞产物。根据另一个优选的实施方案，营养萌发剂或营养芽胞组合物为浓缩形式，最优选为浓缩液，并在使用点稀释。
优选的L-氨基酸包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-缬氨酸或L-半胱氨酸中的一种或多种。L-氨基酸可以任何合适来源的形式提供，例如它们的纯形式和/或大豆蛋白的水解产物。在浓缩营养萌发剂组合物的另一个实施方案中，L-氨基酸可以大豆蛋白的水解产物形式提供。当为浓缩形式时，芽胞组合物优选包含一种或多种上述L-氨基酸的溶液，其重量范围为约8.9至约133.5g/L，更优选为约13.2至约111.25g/L，且最优选各自为约17.8至约89g/L；D-葡萄糖(任选的)和/或D-果糖(任选的)各自的重量范围为约18至约54g/L，更优选各自为约27至约45g/L，且最优选各自为约30至约40g/L；KCl(任选地，作为钾离子源)的重量范围为约7.4至约22.2g/L，更优选为约11.1至约18.5g/L，且最优选为约14至约16g/L；生物缓冲剂，例如重量范围为约10至约36g/L，更优选为约15至约30g/L，且最优选为约20至约24g/L的磷酸二氢钠，和/或重量范围为约30至约90g/L，更优选为约21.3至约75g/L，且最优选为约28.4至约60g/L的磷酸氢二钠。一种或多种生物缓冲剂有助于将营养萌发剂组合物维持在适当的pH下以使芽胞萌发，约pH 6-8。除了或代替磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液，芽胞组合物可包含其他磷酸盐缓冲剂(多种)，Tris碱，其重量范围为约15至约61g/L，更优选为约24至约43g/L，且最优选为约27至约33g/L；或HEPES缓冲液，其重量范围为约32.5至约97.5g/L，更优选为约48.75至约81.25g/L，且最优选为约60至约70g/L。任选地，磷酸二氢钾也可用作钾离子源，优选地其重量范围为约13.6至约40.8g/L，更优选为约20.4至约34g/L，且最优选为约26至约29g/L。任选地，磷酸氢二钾也可用作钾离子源，优选地其重量范围为约8.7至约26.1g/L，更优选为约13至约21.75g/L，且最优选为约16至约19g/L。根据另一个优选的实施方案，可以调节KCl、磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠的量，使得营养萌发剂溶液和/或营养芽胞溶液中的pH可为约6、约7或约8。
在另一个优选的实施方案中，营养萌发剂组合物还包含一种或多种工业防腐剂，其最终(总)重量范围为0.8-3.3g/L，更优选为1.2-2.7g/L，最优选为1.6-2.2。防腐剂(多种)对于长期储存可能是有益的。合适的防腐剂包括NaCl、D-丙氨酸、山梨酸钾和化学防腐剂。化学防腐剂可以是具有甲基氯异噻唑啉酮(约1.15％至约1.18％v/v)和甲基异噻唑啉酮(约0.35-0.4％v/v)的活性成分的防腐剂；具有重氮烷基脲(约30％)、对羟基苯甲酸甲酯(约11％)和对羟基苯甲酸丙酯(约3％)的活性成分的防腐剂；和仅含对羟基苯甲酸甲酯的活性成分的防腐剂；和含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和重氮烷基脲的其他防腐剂)。以甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮作为活性成分的化学防腐剂的非限制性实例是Linguard ICP and KATHONTM Cg(其活性成分包括约1.15-1.18％的甲基氯异噻唑啉酮和约0.35-0.4％的甲基异噻唑啉酮)。以重氮烷基脲，聚对羟基苯甲酸酯和对羟基苯甲酸甲酯为活性成分的化学防腐剂的非限制性实例包括Germaben II。当化学防腐剂的活性成分是甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮时，化学防腐剂可以约0.8至约3.3g/L，更优选为约1.2至约2.7g/L且最优选为约1.6至约2.2g/L包含在浓缩的营养液中。在化学防腐剂的一种或多种活性成分是重氮烷基脲、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯的情况下，可以约0.3％至约1％(wt/wt)将化学防腐剂包括在浓缩营养液中。在一些方面，在营养制剂中可以约10g/L的量包含具有重氮烷基脲、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯的化学防腐剂的量。在对羟基苯甲酸甲酯的情况下，防腐剂可以约0.27至约1.89g/L，更优选为约0.81至约1.35g/L且最优选为约1.0至约1.18g/L包含在浓缩的营养液中。根据另一个优选的实施方案，在营养制剂可以用于产生对虾或其他贝类的水产养殖应用有效的营养芽胞制剂的情况下，防腐剂可以包括一定量的对羟基苯甲酸甲酯和山梨酸钾。根据另一个优选的实施方案，营养萌发剂溶液可以用于产生对植物和/或废水有效的营养芽胞制剂效果，该营养芽胞制剂可以包括一定量的Linguard ICP或KATHONTM CG。
根据又一个优选的实施方案，营养萌发剂组合物可以进一步任选地包含渗透保护剂化合物。一个优选的实施方案中可以包括由某些细菌产生的天然的渗透保护剂，四氢嘧啶。浓缩的营养萌发剂组合物中的四氢嘧啶(任选的)的量可在约0.625至约4.375g/L的范围内，更优选为1.875-3.125g/L，最优选的量为约2-3g/L。根据另一个优选的实施方案，营养萌发剂组合物可进一步包含其他标准成分，包括但不限于有助于分散活性成分的表面活性剂，另外的防腐剂确保芽胞组合物、缓冲液、稀释剂和/或营养制剂和/或芽胞制剂中通常包含的其他成分的保质期。
上述成分的量是本发明的重要方面，因为较高浓度会使一些成分不溶，且较低浓度对萌发芽胞无效。
根据另一个优选的实施方案，根据本发明的实施方案的营养萌发剂浓缩物组合物为浓缩形式，并在如下文进一步所述的使用点在萌发之前稀释成水中的工作溶液、芽胞组合物或任何其他合适的稀释剂或它们的组合。根据各种优选的实施方案，可以通过以0.01％至50％(v/v)的浓缩营养萌发剂与稀释剂的比例用水或其他合适的稀释剂稀释根据本发明优选实施方案的浓缩营养萌发剂组合物来制备工作营养萌发剂溶液，但也可以使用其他量。可以将根据本发明的浓缩的营养萌发剂组合物稀释至2-1×106倍或其中的任何范围或值，以产生工作营养萌发剂溶液。最优选地，稀释度为浓缩物和余量的水或其他合适的稀释剂的约0.1％至约10％。存在于工作营养液(来自浓缩制剂的稀释溶液)中的上述成分的量可以基于上述稀释因子和浓缩量来计算。
浓缩营养萌发剂组合物的使用降低了运输、储存和包装成本，并且使芽胞组合物在使用点的给药更容易。最优选地，浓缩营养萌发剂组合物是液体形式，其在使用点与稀释剂混合更容易和更快，但也可以使用固体形式如粒料或砖块或粉末。营养萌发剂组合物中包含一般的工业防腐剂有助于长期保存。
最优选地，根据本发明或与本发明的方法一起使用的营养萌发剂组合物中的所有成分均符合美国联邦GRAS标准。
营养芽胞组合物
根据另一个优选的实施方案，该组合物是营养芽胞组合物，其包含上述用于营养萌发剂组合物的成分和预先混合在一起的芽胞。根据一个优选的实施方案，营养芽胞组合物优选包含按重量计10％至90％的一种或多种芽孢杆菌芽胞或芽胞共混物(包含40-60％的芽胞粉与一种或多种芽孢杆菌物种和60-40％的盐)。根据另一个优选的实施方案，营养芽胞组合物包含约5wt％的一种或多种芽孢杆菌芽胞或芽胞共混物。营养芽胞组合物中的芽胞的总浓度可以在约1×105CFU/mL或芽胞/g至1×1014CFU/mL或芽胞/g或其中的任何特定浓度或范围的范围内。
营养芽胞组合物优选还包含一种或多种萌发抑制剂和/或防腐剂。用于浓缩的营养芽胞组合物的优选的萌发抑制剂或防腐剂包括范围为约29至约117g/L，更优选为约43至约88g/L，且最优选为约52至约71g/L的相对高浓度的NaCl；和/或约8至约116g/L，更优选为约26至约89g/L，且最优选为约40至约50g/L的量的D-丙氨酸；和/或约1.25至约8.75g/L，更优选为约3.75至约6.25g/L，最优选为约4.5至约5.5g的量的山梨酸钾。上述具有优选的营养萌发剂组合物的其他化学防腐剂也可以与根据本发明的营养芽胞组合物一起使用。这些萌发抑制剂或防腐剂使芽胞保持无活性状态，并防止芽胞在其使用点稀释和活化之前过早萌发。当根据本实施方案的芽胞组合物与本发明的优选方法一起使用时，使用萌发抑制剂是特别优选的，其中萌发在使用点发生。当包括芽胞时，上述营养萌发剂组合物的其他成分(例如L-氨基酸、生物缓冲剂等)的量弥补了芽胞组合物的余量成比例减少以对应于上述优选范围。优选的营养芽胞组合物也为浓缩形式，并且如上文关于营养萌发剂组合物所述并在下文进一步描述，在使用点时稀释成工作溶液。
根据本发明的优选实施方案的用于营养芽胞组合物中的优选芽孢杆菌芽胞包括以下物种：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquiefaciens)、多粘芽胞杆菌(Bacilluspolymyxa)、苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)、巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)、凝固芽胞杆菌(Bacillus coagulans)、缓芽胞杆菌(Bacillus lentus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)、强固芽胞杆菌(Bacillus firmus)、乳杆菌(Bacillus lactis)、侧孢芽胞杆菌(Bacilluslaterosporus)、左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)、多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)。如本领域普通技术人员所理解的，也可以使用其它芽孢杆菌芽胞物种。优选地，营养芽胞组合物包含1至20或多种芽孢杆菌物种，更优选为3至12种芽孢杆菌物种。根据另一个优选的实施方案，营养芽胞组合物包含3种芽孢杆菌属细菌菌株，最优选2种芽孢杆菌属(Bacillus)细菌的菌株，各自可以是物种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的菌株，且第三菌株是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的物种。根据另一个优选的实施方案，芽胞共混物中的芽胞包含约80％的地衣芽孢杆菌(每种菌株的40％)和20％的枯草芽孢杆菌。
在另一个优选的实施方案中，用作益生菌的营养芽胞组合物包含一种或多种本质上是益生菌的芽孢杆菌菌株，因为它们有助于营养物在消费者消化道中的分解。菌株优选产生以下酶中的一种或多种：水解蛋白质的蛋白酶、水解淀粉和其它碳水化合物的淀粉酶、水解脂肪的脂肪酶、帮助复合糖中的糖苷键水解并帮助纤维素降解的糖苷酶、将纤维素降解为葡萄糖的纤维素酶、酯酶(类似于脂肪酶的酶)和降解木聚糖的木聚糖酶、在植物细胞壁中发现的多糖。产生这些酶的芽孢杆菌菌株是本领域熟知的。
根据另一个优选的实施方案，营养芽胞组合物为浓缩形式，并在如下文进一步所述的使用点在萌发之前稀释成水中的工作溶液、或任何其他合适的稀释剂或它们的组合。根据各种优选的实施方案，可以通过以0.01％至50％(v/v)的浓缩营养萌发剂与稀释剂的比例用水或其他合适的稀释剂稀释根据本文的优选实施方案的浓缩营养芽胞组合物来制备工作营养芽胞溶液，但也可以使用其他量。可以将根据本发明的浓缩的营养芽胞组合物稀释至2-1×1013倍或其中的任何范围或值，以产生工作营养萌发剂溶液。最优选地，稀释度为浓缩物和余量的水或其他合适的稀释剂的约0.1％至约10％。存在于工作营养液(来自浓缩制剂的稀释溶液)中的上述成分(例如L-氨基酸和萌发抑制剂)的量可以基于上述稀释因子和浓缩量来计算。
最优选地，根据本发明或与本发明的方法一起使用的营养芽胞组合物中的所有成分均符合美国联邦GRAS标准。
芽胞组合物
根据本发明一个优选实施方案的益生菌芽胞组合物包含一种或多种细菌物种、任选的表面活性剂、增稠剂、以及任选地一种或多种酸化剂、酸或酸的盐以充当防腐剂。根据另一个优选的实施方案，芽胞组合物进一步包含一种或多种益生元，就增稠剂也不是益生元而言，或者除了是益生元的任何增稠剂之外。根据另一个优选的实施方案，芽胞组合物还包含一种或多种水活度降低剂。最优选地，根据本发明的芽胞组合物包含各种悬浮的益生菌芽胞物种，如下文更详细地描述的。以芽胞形式使用这些物种提高了益生菌在恶劣环境条件下(在水产养殖应用场所附近发现的)的稳定性。芽胞组合物中的芽胞的总浓度可以在约1×105CFU/mL或芽胞/g至1×1014CFU/mL或芽胞/g或其中的任何特定浓度或范围的范围内。
根据优选的实施方案，合适的增稠剂包括在芽胞组合物中。增稠剂优选是在通常在非气候控制的水产养殖环境中发现的变化温度下不会分离或降解的增稠剂。增稠剂有助于稳定悬浮液，因此细菌混合物保持均匀并分散在一定体积的芽胞组合物中，不会从悬浮液中沉降出来。当与本文所述的本发明优选实施方案的孵化系统和水产养殖处理方法一起使用时，这可确保益生菌材料的浓度均匀分布在整个容器中，从而使递送至孵化器的芽胞剂量保持一致或相对一致(取决于整个治疗周期中使用的具体递送方法和控制机制)。
最优选的增稠剂是黄原胶，其是由葡萄糖、甘露糖和葡糖醛酸和已知的益生元的五糖重复单元组成的多糖。与一些其他树胶不同，黄原胶在很宽的温度和pH范围内都非常稳定。另一优选的增稠剂是阿拉伯树胶，其也是已知的益生元。其他优选的增稠剂包括刺槐豆胶、瓜尔豆胶和阿拉伯树胶，它们也被认为是益生元。除了益生元的益处外，这些纤维不会与矿物质和维生素结合，因此不会限制或干扰其吸收，甚至可能会改善水生生物物种对某些矿物质(例如，钙)的吸收。也可以使用不被视为益生元的其他增稠剂。
优选的实施方案可以任选地包括一种或多种益生元，如果所用的增稠剂不是益生元，则优选使用，但除了益生元增稠剂之外，还可以使用。益生元分为二糖、低聚糖和多糖，并且可包括菊粉、低聚果糖、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、反式低聚半乳糖(TOS)和短链低聚果糖(scFOS)、大豆低聚果糖(soyFOS)、低聚果糖、Glyco-oligosaccharide、乳糖醇、低聚麦芽糖、低聚木糖、水苏糖、乳果糖、棉子糖。甘露寡糖(MOS)是益生元，可能不会丰富益生菌细菌数量，但会与肠道结合并从肠道中去除病原体，并被认为可以刺激免疫系统。
优选的实施方案还优选包括一种或多种酸化剂、酸或酸的盐，以充当防腐剂或酸化芽胞组合物。优选的防腐剂是乙酸、柠檬酸、富马酸、丙酸、丙酸钠、丙酸钙、甲酸、甲酸钠、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾和山梨酸钙。也可以使用其他已知的防腐剂，优选通常被认为是安全的(GRAS)食品防腐剂。优选地，芽胞组合物的pH为约4.0至7.0。更优选地，其为约4.0至5.5，最优选地为约4.5以在如下所述使用或添加到孵化器之前防止芽胞的过早萌发。降低芽胞组合物的pH还可以对酵母、霉菌和病原菌具有抗微生物活性。
根据任一优选的实施方案，一种或多种水活度降低剂，例如氯化钠、氯化钾或玉米糖浆(玉米糖浆的70％溶液)任选地包括在芽胞组合物中。水活度降低剂有助于抑制微生物的生长，使得细菌芽胞不会过早萌发，同时在将芽胞组合物排放到被待治疗的动物或植物食用点的时间之前或在排放到养成池塘的使用点之前进行储存。它们还有助于抑制污染微生物的生长。
任选的表面活性剂优选是可被动物安全摄取的表面活性剂，尽管其他表面活性剂可用于其他应用，例如递送至植物。最优选地，表面活性剂是聚山梨醇酯80。尽管任何一个实施方案都可以使用任何GRAS或AAFCO批准的表面活性剂或乳化剂，但仍存在一些动物可能不能很好耐受所有批准的表面活性剂的担忧。由于表面活性剂在稳定悬浮液方面的益处，因此细菌混合物保持均质并且不会沉降，也可以通过使用增稠剂来实现，因此不必添加表面活性剂。如果在根据该第二实施方案的芽胞组合物中使用表面活性剂，则优选以与第一实施方案相同的重量百分比范围使用表面活性剂。
用于根据本发明的芽胞组合物的优选细菌与以上对于优选的营养芽胞组合物所述的细菌相同。最优选地，芽胞组合物中使用的细菌种类是来自芽孢杆菌属的一种或多种物种。益生菌的最优选的物种包括下列：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、坚定芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、马铃薯杆菌(Bacillus mesentericus)、纳豆枯草杆菌变种(Bacillus subtilis var.natto)或东洋芽孢杆菌(Bacillustoyonensis)，但也可以使用在使用国家认可为益生菌的任何芽孢杆菌物种。优选的是细菌是芽胞形式，因为芽胞形式对于环境波动例如环境温度变化更稳定。最优选地，用于根据本发明的芽胞组合物中的芽胞是包含约40-60％的盐(食盐)和60-40％的细菌芽胞的干粉共混物。优选地，从液体发酵浓缩物喷雾干燥芽胞。用盐将纯的喷雾干燥的芽胞粉末稀释到最终芽胞粉末混合物中的标准芽胞计数。在生产发酵过程中，不同的芽孢杆菌菌株将以不同的速率生长，从而导致发酵批液的最终计数数发生变化。将发酵液离心以浓缩液体中的芽胞。然后，将浓缩液喷雾干燥，其得到仅含有芽孢杆菌芽胞的粉末。在喷雾干燥的芽孢杆菌芽胞粉末中添加盐有助于标准化批次之间的每克的芽胞共混物计数。也可以使用其他形式的细菌芽胞或芽胞共混物。最优选地，将干燥的芽胞共混物与芽胞组合物中使用的一部分水预混合，约3-30％的总水量，并将所得的细菌芽胞溶液添加到其他成分中，包括剩余的水。这有助于将细菌芽胞分散在整个芽胞组合物中。
根据本发明的第一个优选实施方案的益生菌芽胞组合物优选包含细菌芽胞，其提供108cfu/ml的芽胞悬浮液(最优选约1.0×108至约3.0×108cfu/ml的芽胞组合物，当在养成池中稀释时其提供约101至104cfu/ml的池塘水)，0.00005至3.0％的表面活性剂和0.002至5.0％的增稠剂，以及任选地约0.01至2.0％的一种或多种酸或酸的盐作为防腐剂，芽胞组合物的所有重量百分比。根据本发明另一个优选实施方案的益生菌芽胞组合物包含细菌芽胞，其提供109cfu/ml的芽胞悬浮液(当在池塘水中稀释时其提供约101至104cfu/ml的池塘水)，约0.1至5.0％的增稠剂(优选地还充当益生元的增稠剂)，约0.05-0.5％的一种或多种防腐剂，任选地约0.1-20％的一种或多种水活度降低剂，以及任选地0.1-20％的一种或多种酸化剂，组合物的所有重量百分比。在两个优选实施方案中，芽胞组合物的余量为水，并且本文中的百分数为重量百分数。优选使用去离子水或蒸馏水以去除盐或外部细菌，但是也可以使用自来水或其他水源。
根据另一个优选的实施方案，一种芽胞组合物包含约1％至10％的细菌芽胞共混物，其包含盐和芽胞形式的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚定芽孢杆菌(Bacillus firmus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、马铃薯杆菌(Bacillus mesentericus)、纳豆枯草杆菌变种(Bacillus subtilis var.natto)或东洋芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)中的一种或多种；酸或酸的盐的总量的约0.3％至1％；约0.2％至0.5％的增稠剂；约0.1-0.3％的氯化钠、氯化钾或它们的组合；约0.00005％至3.0％的表面活性剂；和86.2％至98.4％的水。根据另一个优选的实施方案，芽胞组合物包含约0.01％至10％的细菌芽胞共混物；约0.1-0.33％的山梨酸、其盐或它们的组合；约0.1-0.34％的柠檬酸、其盐或它们的组合；约0.1-0.33％的苯甲酸、其盐或它们的组合；约0.2-0.5％的黄原胶；约0.00005％至3.0％的表面活性剂；和约0.1-0.3％的氯化钠、氯化钾或它们的组合，组合物的所有重量百分比。根据又一个优选的实施方案，芽胞组合物包含约5％的细菌芽胞或芽胞共混物；和约0.25％的增稠剂；约0.3％的一种或多种酸或酸的盐的总量；约0.1％的表面活性剂；约0.2％的氯化钠、氯化钾或它们的组合(除了芽胞共混物中的任何盐之外)；和水。根据另一个优选的实施方案，酸或酸的盐是山梨酸钾、苯甲酸钠和无水柠檬酸中的一种或多种。
制备了根据本发明的优选实施方案的益生菌芽胞组合物的几个实例，并测试了不同参数。这些芽胞组合物在下表4中列出。
表4
Figure BDA0002653252330000251
每个芽胞组合物的其余部分是水(在这些样品中为约1L)。除使用自来水的1号芽胞组合物外，每种芽胞组合物中均使用去离子水。所示的百分比是重量百分比。每个制剂目标具有4.0至5.5的pH，但是发现某些制剂的实际pH值远低于预期。制剂1目标具有5.0至5.5的pH，但其实际pH为约2.1-2.3，该值太低并且可能对芽胞有害，在包装中产生稳定性问题，并且遵守更严格的运输规则。制剂1也表现出弱的增稠性。制剂2与制剂1相同，除了水的来源不同之外。制剂2的实际pH为约2.2-2.3，并且还表现出弱的增稠性。减少制剂编号3中的酸和酸的盐的量以提高pH，并确定在使用与制剂编号1和2中相同的增稠剂的同时厚度是否有所改进。尽管制剂3是对制剂编号1和2的改进，但其仍显示出较弱的增稠性，并且其实际pH值为6.6，在目标值范围内。将另外的酸添加到制剂编号4以降低pH，并添加另外的增稠剂。制剂编号4具有改善的增稠性，但是增稠性的进一步改进将是有益的。制剂编号5中的酸的量显着增加，其导致实际pH为约为1.0。制剂编号6中的酸的量减少并且增稠剂增加，这导致芽胞组合物太稠而不能滴落。制剂编号7增加了增稠剂和水活度降低剂的量，但是在苯甲酸和山梨酸的混合中表现出问题。在制剂编号8中去除了苯甲酸和山梨酸。制剂编号1-7提供了2×1011cfu/gm，制剂编号8提供了1×1011cfu/gm细菌芽胞。在这些样品制剂中，编号8号是最优选的，因为它显示出足够的增稠性，实际pH值为约4.5+/-0.2，并且使用较少的芽胞共混物。
优选地，根据本发明的实施方案的芽胞组合物使用约0.01％至约0.3％的细菌芽胞共混物，更优选地为约0.03％至0.1％的细菌芽胞共混物。减少芽胞共混物的用量可大大降低芽胞组合物的成本。根据最终用途的应用，可以在根据本发明的芽胞组合物中使用不同量的芽胞共混物。例如，在用于鸡的芽胞组合物中可以使用较小百分比的芽胞共混物，而在用于猪的芽胞组合物中可以使用较大百分比。
测试了根据制剂编号8的芽胞组合物在各种温度下的保质期。将制剂编号8的样品密封在一个塑料袋中，例如用在如下所述的优选输送系统中的塑料袋中，并在约4-8℃(39-46°F)，30℃(86°F)和35℃(95°F)的温度下保存两个月来模拟典型的温度范围，其中可以储存益生菌芽胞组合物并用于农业环境。在储存期的第一个月结束时，观察并测试每个样品。所有三个样品的pH都为约4.5，并且三个样品中的任何一个都没有沉降、分层或外观变化，表明在储存期间细菌芽胞保持悬浮并分散在整个芽胞组合物中。所有样品均不含任何真菌污染或革兰氏阴性细菌污染。在时间计数零(最初储存样品时)时，每个样品包含为约2.12×108cfu/mL的细菌芽胞。在一个月的存储期结束时，样品中包含约2.09×108cfu/mL芽胞悬浮液(最低温度样品)的细菌芽胞，1.99×108cfu/mL(中温样品)和2.15×108cfu/mL(高温样品)。在不同的样品中，特别是在增稠的样品中，细菌计数有些变化；然而，这些被认为是可比较的计数。储存两个月后再次测试每个样品。样品包含约2.08×108cfu/ml(最低温度样品)；2.01×108cfu/ml(中温样品)；和2.0×108cfu/ml(高温样品)的细菌芽胞。目标保质期为约2×108cfu/ml芽胞悬浮液，因此样品在储存两个月后处于目标保质期内。这些测试结果表明，根据本发明的优选实施方案的益生菌芽胞组合物在一定温度范围内是稳定的，细菌芽胞在整个芽胞组合物中保持活力、悬浮和分散。每个样品制剂中使用的芽胞共混物(40-60％的芽胞粉末和60-40％的盐)是相同的，提供至少约2×1011芽胞/克。共混物中的芽胞物种是多个枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)菌株。在搅拌下将芽胞共混物粉末与100mL的水预混合30分钟，然后添加到其他成分中。与水预混合有助于将芽胞共混物与其他成分混合并使芽胞分散在整个芽胞组合物中。
尽管根据本发明的芽胞组合物优选使用包含一种或多种芽孢杆菌属物种的益生菌芽胞组合物，但是本发明的方法可以与包含其他细菌属和其他物种的芽胞组合物一起使用.例如，以下属中的一种或多种物种：芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteriodes)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)(包括短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜淀粉芽孢杆菌(Bacillusamylophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚定芽孢杆菌(Bacillus firmus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、马铃薯杆菌(Bacillus mesentericus)、纳豆枯草杆菌变种(Bacillus subtilis var.natto)或东洋芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)、居瘤胃拟杆菌(Bacteriodes ruminocola)、居瘤胃拟杆菌(Bacteriodes ruminocola)、(Bacterioides suis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilacticii)、啤酒片球菌(Pediococcus cerevisiae)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、克氏肠球菌(Enterococcus cremoris)、二丁酮肠球菌(Enterococcus diacetylactis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、中间肠球菌(Enterococcus intermedius)、乳酸肠球菌(Enterococcus lactis)、嗜热肠球菌(Enterococcus thermophilus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbruekii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus curvatus)、产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)、费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)和/或以下物种中的一种或多种：肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdennii)可以与本发明的组合物和方法一起使用。
芽胞组合物也可以是浓缩形式，使用较少的水，如上所述的其他成分的量成比例地增加。可以在萌发前在使用时用营养萌发剂组合物、水、其他合适的稀释剂或它们的组合稀释此类浓缩的芽胞组合物。最优选地，根据本发明或与本发明的方法一起使用的芽胞组合物中的所有成分均符合美国联邦GRAS标准。
萌发方法
根据一个优选的实施方案，一种根据本发明的在使用点的萌发芽胞的方法包括提供营养物和芽胞(优选地提供营养萌发剂组合物和芽胞组合物或提供根据本发明的营养芽胞组合物，但是可以同时使用或单独使用含有芽胞和营养物的其他市售产品)并将其加热到高温或高温范围，并将其在该温度或该范围内保持一段时间(孵化期)以允许在消费点附近的使用点位置的萌发。孵化期期间的加热在一步中进行，将营养物和芽胞一起加热。该方法还优选地包括将萌发的芽胞分配到如前所述的水产养殖应用中的步骤。优选地，将营养萌发剂组合物和芽胞组合物(或营养芽胞组合物)加热至35-55℃范围内的温度，更优选为38-50℃范围内的温度，最优选为41℃-44℃范围内的温度。孵化期可根据最终用途应用而变化。对于益生菌应用，在具有消化系统的水生物种(例如鱼或鳗鱼)将摄取细菌的情况下，优选的是孵化时间持续不超过10分钟。最优选地，在益生菌应用中，孵化期为2-5分钟。通过这种方式，芽胞在芽胞完全萌发之前释放到养成池中，并且有更大的机会存活到水生动物物种的肠道，在那里它们是最有益的。为了在水产养殖应用中处理水，例如可以在虾类水产养殖应用中进行，优选的孵化时间为至少一小时，以使芽胞在排放到水中之前完全萌发，更优选为4至6小时以允许细菌在排放到水中之前变成营养的。最优选地，优选根据本文讨论的本发明的一个实施方案，将营养萌发剂组合物和芽胞组合物(或营养芽胞组合物)添加至孵化期，以在上述优选的温度范围和持续时间下孵化芽胞以产生具有细菌处于营养状态的细菌溶液。可以在空气孵化期、水孵化期或在给定温度范围内提供均匀、恒定热量的任何其他室内进行。然后如前所述，将细菌溶液排放到水产养殖应用中。如果使用浓缩的营养萌发剂组合物，则优选将稀释水与营养萌发剂组合物一起添加到孵化器中。
根据本发明的优选方法测试根据本发明的优选实施方案的各种营养萌发剂组合物。组合物、方法和结果如下所述。
实施例1-为了使芽胞萌发，将FreeFlow LF-88益生菌(可从NCH公司商购的芽胞液体制剂)以终浓度为约1×109CFU/mL加入到1mL的自来水中，其中CFU代表菌落形成单位。将包含L-丙氨酸(89g/L)、磷酸二氢钠(20g/L)、磷酸氢二钠(60g/L)和Linguard CP(总计1.6g/L)的根据本发明的优选实施方案的营养萌发剂浓缩物组合物加入到水和细菌混合物中以提供以混合物的总重量计为4％终浓度的营养萌发剂组合物。为了比较，用相同量的自由流LF-88益生菌和水制备阴性对照反应，但不添加营养萌发剂浓缩物组合物。将两种混合物(没有营养萌发剂组合物的萌发剂和阴性对照)共混并在设定为42℃的预孵化加热模块中或在环境室温(约23℃)下孵化60分钟。
使用相差显微镜观察来自每个反应的芽胞。使用标准程序制备载玻片。在OlympusBx41显微镜(100倍油浸物镜)上观察芽胞，并使用由cellSens Dimension软件包控制的Olympus UC30相机成像。
拍摄图像并将萌发的芽胞计数为场中的总芽胞的百分比。针对每种条件(测试混合物)分析总共10个代表性图像。萌发的芽胞由于水的流入而失去其折射率并且是相暗的，而未萌发的芽胞是相亮的。
图7显示来自这些测试的代表性图像。图像A表示根据本发明的优选芽胞组合物和优选方法，使用营养萌发剂组合物萌发并在42℃下的孵化期间加热的芽胞。较暗的斑点显示萌发的芽胞，较亮的斑点显示未萌发的芽胞。图像B表示使用根据本发明的优选实施方案的营养萌发剂组合物萌发的芽胞，但是在环境温度(23℃)下孵化。图像C-D表示未用根据本发明的营养萌发剂组合物处理的对照芽胞，其中一种已在42℃下孵化，一种在环境温度(23℃)下孵化。
如图7中可见，“A”图像显示比其他图像显着更多的萌发芽胞(暗点)。用根据本发明的优选实施方案的营养萌发剂组合物结合根据本发明的优选实施方案的萌发方法孵化的芽胞显示出96.8％的表观萌发效率(实施例1，图7A)。用根据本发明的优选实施方案的营养萌发剂组合物但未使用根据本发明的优选实施方案的萌发方法孵化的对照芽胞显示出2.3％的表观萌发效率(实施例1，图7B)。类似地，未使用根据本发明的营养萌发剂组合物孵化的芽胞在42℃和23℃下分别显示出1.2％和2.6％的表观激活效率(实施例1，图7C和图7D)。未通过本方法的优选实施方案处理的样品中的萌发芽胞表示在FreeFlow LF-88益生菌溶液中已经萌发的小百分比的芽胞。该实施例表明，当一起使用根据本发明的优选实施方案的营养萌发组合物和孵化方法时，芽胞萌发显着增加。
实施例2-使用相同的测试混合物/孵化方法(使用相同的营养萌发剂组合物和加热的孵化，“处理的芽胞，42℃”)进行另一组孵化测试并重复在上述实施例1中所述的对照混合物/孵化方法(没有营养萌发剂组合物和没有加热，未处理的芽胞，23℃)，但进行不同的测试以比较根据本发明的优选实施方案的测试混合物与对照混合物相比的功效。此外，测试了两种其它混合物-其中一种使用实施例1的营养萌发剂组合物但没有加热(“处理的芽胞，23℃”)，，且另一种没有使用营养萌发剂但是芽胞被加热(“未处理的芽胞，42℃”)。简而言之，在用或不用优选的营养萌发剂组合物处理的情况下，将芽胞在42℃或23℃下孵化1小时。孵化后，将来自1mL的每个反应的芽胞在23℃下以14K RPM沉淀3分钟，并重悬于1mL的Butterfield缓冲液中。将约6×105CFU(0.02mL)加入到0.980mL的含有过量D-丙氨酸的Davis基本培养基(含有3％的葡萄糖作为碳源和微量元素)中。D-丙氨酸是L-氨基酸介导的萌发的有效抑制剂。
将约1.2×105CFU加入到PreSens Oxo板的四个孔中的每个孔中。PreSens Oxo板使用光学氧传感器以使用两个滤光片对来荧光测量样品的氧含量(激发：540nm，发射：650nm和激发：540，发射：590nm)。如制造商所述进行对照，并在BioTek 800FLx荧光酶标仪上进行测量。伴随连续摇动，在37℃下每隔10分钟采集时间点持续24小时，并使用以下公式处理数据以确定氧分压(pO2)：
pO2＝100*[(K0/IR)-1(K0/K100)-1]
已萌发并继续分裂和生长为营养细胞的芽胞消耗氧气作为其代谢生长的一部分。氧气消耗由pO2下降表示。据推测，观察到的生长是由于通过本发明萌发的芽胞的外生长和营养生长所致。这些测试的pO2水平如图8所示。
如图8所示，使用根据本发明的优选实施方案的测试混合物和方法孵化(处理的芽胞42℃，使用营养物萌发剂组合物和加热二者)导致芽胞开始营养生长比对照芽胞共混物快4小时，所述对照芽胞共混物根据本发明的优选实施方案未经处理或加热，或者已用营养萌发剂组合物处理或加热，但不是两者一起。在对照实验中看到的增长可能代表约2％的萌发芽胞存在于自由流Lf-88益生菌中(参见实施例1)。该实施例还表明当使用根据本发明的优选实施方案的营养萌发组合物和孵化方法时，芽胞萌发显着增加。
实施例3-使用如上文实施例1中所述的类似测试和对照混合物以及孵化方法进行另一组孵化测试。简言之，将LF-88以约108CFU/mL的终浓度加入到10mL的蒸馏水中。将样品在各种温度下孵化，以显示与对照混合物相比，根据本发明的优选实施方案的测试方法的功效。用实施例1中描述的营养萌发剂组合物制备反应(图9中的“处理的芽胞”)并在23℃(环境温度，不加热)、32℃、42℃或60℃下孵化。将对照反应在环境室温下孵化，不含营养萌发剂组合物。在孵化1小时后，将1mL的每种反应在23℃下以14K RPM沉淀3分钟，并重悬于Butterfield缓冲液中。将约.6x105CFU(0.02mL)加入到0.980mL的含有过量D-丙氨酸的Davis基本培养基(含有3％的葡萄糖作为碳源和微量元素)中。
将约1.2×105CFU加入到PreSens Oxo板的四个孔中的每个孔中。如制造商所述进行对照，并使用两个滤光片对在BioTek 800Flx荧光酶标仪上进行测量(激发：540nm，发射：650nm和激发：540，发射：590nm)。伴随连续摇动，在37℃下每隔10分钟采集时间点持续24小时，并处理数据以确定氧分压(pO2)。这些测试的pO2水平如图9所示。
如图9所示，根据本发明的优选实施方案的使用营养萌发剂组合物的孵化和加热导致芽胞在对照之前开始营养生长数小时。用营养萌发剂组合物处理但未加热的芽胞与对照混合物相当。与对照实验相比，根据本发明的一个实施方案(由“经处理的芽胞32℃”曲线表示)在低于35-55℃的优选范围的温度下孵化的营养萌发剂组合物处理的芽胞开始更快地营养生长，但不如在根据本发明的优选范围内的升高的温度下处理的芽胞快。根据本发明的一个实施方案，用营养萌发剂组合物处理并在41℃至44℃的最优选范围内的温度下孵化的芽胞显示出最佳结果，是第一个开始营养生长并且开始生长比对照快4小时。如在先前的实施例中所见，在未处理的对照实验中看到的生长可能代表约2％的萌发芽胞存在于自由流LF-88益生菌中(参见实施例1)。该实施例还表明当使用根据本发明的优选实施方案的营养萌发组合物和孵化方法时，芽胞萌发显着增加。
使用营养萌发剂组合物
和芽胞组合物的水产养殖研究
进行了另一项研究以评估优选的营养萌发剂和芽胞组合物与根据本发明的优选的萌发和水产养殖处理方法的使用。三个水族箱被用作本研究的代表性水产养殖应用。每个水族箱装有55加仑水和25个马来西亚虾，以模仿商业虾养殖场的放养密度。每个水族箱包含相同类型的网和由PVC管组成的底物，用于虾的栖息和休息。所有水族箱都衬有加勒比活砂，以抑制海藻生长，减少硝酸盐，帮助缓冲水族箱系统并确保更安全的水族箱循环。在所有三个水族箱中都使用了曝气石，以改善生物过滤并增加虾和有益细菌的溶解氧含量。所有三个水族箱都使用相同类型的过滤器，并根据需要冲洗掉过滤器，然后重新使用。根据需要，所有三个水族箱都重新注入去离子(DI)水。去离子水用于控制水中的矿物质含量。
当需要从水族箱中去除大量水时，从所有水族箱中去除相同量的水，并用相同量的去离子水代替。在水族箱2和3中使用碳酸钙替代水以模仿池塘粉的使用，例如可从NCHLife Science获得的ECOChargerTM池塘粉。当在水族箱2或3中更换水时，将约0.5g的碳酸钙添加到水箱水中。周一至周五每天一次将约1mL的孵化或活化的细菌溶液施用于水族箱3。水族箱1是对照水族箱。简而言之，将20μL的起始芽胞溶液(含约1010CFU/mL)与20μL起始浓缩营养液和960μL的水混合，形成含有约2×108CFU/mL芽胞的工作溶液(表6)。起始芽胞溶液包含来自芽胞共混物的约1010CFU/mL的芽胞。芽胞共混物包含3种芽孢杆菌细菌菌株：2个菌株分别是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)物种的菌株，第三个菌株是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)物种。约80％的芽胞共混物制剂是地衣芽孢杆菌(每种菌株的40％)，而芽胞共混物制剂中约20％的芽胞是枯草芽孢杆菌。根据上述优选的实施方案，芽胞组合物还包括水、增稠剂和有机盐。
将合并的工作溶液(包含营养萌发剂组合物、芽胞组合物和水)在约42℃下孵化约1小时，以产生活化的细菌溶液。在该孵化后，将整个活化细菌溶液(约1mL)添加到水族箱3中。混合是通过混合石头通过曝气完成的。表5显示了起始营养萌发剂制剂的组成。表6显示了孵化的工作溶液的组成。将孵化的细菌溶液混合到55加仑水族箱3中后，细菌的浓度为约9.6×102CFU/mL，水族箱3中营养萌发剂组合物的最终百分比为约9.6 x 10-6％v/v。表7显示了应用了各自处理后的每个水族箱的含量。试验持续了120天。
表5-营养制剂的组分。
Figure BDA0002653252330000331
表6-工作营养芽胞制剂。
Figure BDA0002653252330000341
表7-水族箱内容物(处理组)
Figure BDA0002653252330000342
表8显示了平均试验组的最终重量和体尺测量以及标准偏差。与水族箱2和3中的处理组相比，水族箱1中的对照组具有最小的虾重和体尺测量。与水族箱2和1中的对虾相比，水族箱3的虾最大，并且在虾的大小方面具有最好结果。水族箱3中虾的平均最终重量为6.48g。水族箱2中对虾的平均最终重量平均为4.87g。在水族箱1(对照)中，对虾的平均最终重量为3.43g。水族箱3中对虾的平均总长度也最大，为7.98cm。水族箱2中对虾的平均总长度为7.41。水族箱1(对照组)中对虾的平均总长度为6.95。水族箱3中对虾的平均尾巴长度为4.67cm。水族箱2中对虾的平均尾巴长度为4.26cm。水族箱1(对照)中对虾的平均尾巴长度最小，为3.87cm。
表8-处理对生长性能的影响。
Figure BDA0002653252330000343
图10显示了三个水族箱的图像，这些图像可以在120天试验结束时表现出每组中的水澄清度。就水澄清度而言，观察到水族箱3是最澄清的。与水族箱2和3相比，观察到水族箱1(作为对照)具有覆盖水族箱壁的最大的藻类生长量。与对照组和水族箱3相比，观察到水族箱2在水族箱壁上仅具有适度的藻类生长。
在120天的试验期间，所有三个水族箱的开端都是在水族箱两侧有很少甚至没有藻类。随着试验进行，对照水族箱(水族箱1)在水族箱的侧面积累了更多的藻类生长(参见例如图10)。水族箱2的藻类生长少于水族箱1的藻类生长。与水族箱1和2相比，水族箱3有很少到没有藻类生长。
在整个试验中，水参数是一致的。所有三个水族箱的氨水平均为零。在试验期间，亚硝酸盐/硝酸盐也处于安全范围内。所有水族箱的pH值也都保持在约7.5至8.5的正常范围内。没有观察到可能会损害对虾的水参数峰值，因为水族箱循环安全进行，并且在长达120天的试验过程中参数保持一致。
本领域普通技术人员在阅读本说明书和本文的优选实施方案的描述后也将理解，可以在本发明的范围内进行对方法、营养萌发剂和芽胞组合物的修改和改变，并且本文公开的本发明的范围旨在仅受发明人合法授权的所附权利要求的最广泛解释的限制。

Claims (31)

1.一种向用于水产养殖应用的水中添加细菌的方法，所述方法包括：
提供一定体积的营养萌发剂组合物和一定体积的细菌芽胞，它们可以作为营养芽胞组合物预先混合在一起或分开；
任选地，如果分开的话，将一部分所述营养萌发剂组合物和一部分所述细菌芽胞混合以形成所述营养芽胞组合物；
在水产养殖应用场所处或附近将一部分所述营养芽胞组合物加热至约35℃至60℃的温度范围内；
将温度维持在约2分钟至约6小时的孵化期范围内，以形成一个批次的萌发的细菌溶液；
在处理循环过程中，定期重复加热和维持步骤，以形成另外批次的萌发细菌溶液；
将每个批次的萌发细菌溶液分散到用于所述水产养殖应用的水中；
提供硝化增强剂；
将所述硝化增强剂与至少一个批次的萌发细菌溶液同时分散在水中；和
其中所述细菌用于通过降解有机废物并抑制病原菌的生长来修复所述水，或者所述细菌是用于所述水产养殖应用中的物种的益生菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌选自芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteriodes)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、明串珠菌属(Lueconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、巨球形菌属(Megasphaera)、假单胞菌属(Pseudomonas)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细菌是地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的一种或多种物种。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述益生菌选自嗜淀粉拟杆菌(Bacillusamylophilus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)、居瘤胃拟杆菌(Bacteriodes ruminocola)、猪拟杆菌(Bacterioides suis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、克氏肠球菌(Enterococcus cremoris)、二丁酮肠球菌(Enterococcus diacetylactis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、中间肠球菌(Enterococcus intermedius)、乳酸肠球菌(Enterococcus lactis)、嗜热肠球菌(Enterococcus thermophiles)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruekii)、法氏乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳酸杆菌(Lactobacillus helveticus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、植物乳酸菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdennii)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilacticii)、啤酒片球菌(Pediococcus cerevisiae)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)和谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中1其中所述营养萌发剂组合物包括：
L-氨基酸；
一种或多种缓冲液，其包括磷酸盐缓冲液、HEPES、Tris碱或它们的组合；
工业防腐剂；
任选地D-葡萄糖，或任选地D-果糖，或任选地D-葡萄糖和D-果糖二者；和
任选地钾离子源。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、大豆蛋白的水解产物或它们的组合。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述营养物萌发剂组合物包含总共约17.8g/L至89g/L的一种或多种L-氨基酸。
8.根据权利要求5所述的方法，其中将所述营养萌发剂组合物和芽胞预混合，并且所述营养芽胞组合物还包含芽孢杆菌属(Bacillus)物种的芽胞和萌发抑制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述萌发抑制剂或防腐剂包括氯化钠、D-丙氨酸或它们的组合。
10.根据权利要求9所述的方法，其中预混合的所述营养芽胞组合物包含约29g/L至117g/L的氯化钠。
11.根据权利要求9所述的方法，其中预混合的所述营养芽胞组合物包含约8g/L至116g/L的D-丙氨酸。
12.根据权利要求7所述的组合物，其中所述磷酸盐缓冲液包含约10-36g/L的磷酸二氢钠和约30-90g/L的磷酸二钠。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述营养萌发剂组合物或如果预混合的所述营养芽胞组合物是浓缩液，其包括：
约8.9-133.5g/L的一种或多种L-氨基酸；
总共为约0.8-3.3g/L的一种或多种工业防腐剂；
总共为约40-126的一种或多种磷酸盐缓冲液，约15-61g/L的Tris碱，或约32.5-97.5g/L的HEPES，或它们的组合；
任选地，约18-54g/L的D-葡萄糖、D-果糖或它们的组合；
任选地约7.4-22.2g/L的KCl；和
任选地一种或多种芽胞形式的细菌。
14.根据权利要求13所述的方法，还包括：
在加热之前或加热期间，向所述营养萌发剂组合物或如果预混合的营养芽胞组合物中添加稀释剂；和
在所述孵化期期间将稀释的所述营养萌发剂组合物和所述细菌芽胞或稀释的所述营养芽胞组合物混合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中稀释的所述营养萌发剂组合物的浓度为约0.1％至10％。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述硝化增强剂增加水的碱度，为硝化细菌的生物膜生长提供增加的表面积，或两者。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述硝化增强剂是碳酸钙、钙化的海藻，或两者。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述硝化增强剂以小丸、小球或颗粒的形式提供。
19.根据权利要求16所述的方法，其进一步包括将另外的表面积改性剂与至少一个批次的活性细菌同时提供并分散在水中。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述表面积改性剂选自由塑料或金属的颗粒或碎片组成的组。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述硝化增强剂包括碱度增强剂，并且其中所述碱度增强剂在季节性的基础上与一个批次的萌发细菌溶液同时分散在水中。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌芽胞在单独的芽胞组合物中，所述芽胞组合物包括：
一种或多种芽胞形式的芽孢杆菌属(Bacillus)物种；
约0.002-5.0wt％的增稠剂；
总重量为约0.01-2.0wt％的一种或多种酸或酸的盐；和
任选地约0.00005-3.0wt％的表面活性剂；
其中百分比是以所述芽胞组合物的重量计。
23.根据权利要求5所述的方法，其中所述细菌芽胞在单独的芽胞组合物中，所述芽胞组合物包括：
一种或多种芽胞形式的芽孢杆菌属(Bacillus)物种；
一种或多种酸或酸的盐；和
增稠剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述芽孢杆菌属物种是一种或多种其中所述细菌物种包括以下一种或多种：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜淀粉拟杆菌(Bacillus amylophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、坚定芽孢杆菌(Bacillus firmus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、马铃薯杆菌(Bacillus mesentericus)、纳豆枯草杆菌变种(Bacillus subtilis var.natto)或东洋芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述芽胞组合物的pH为约4.5至约5.5。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述酸或酸的盐为乙酸、柠檬酸、富马酸、丙酸、丙酸钠、丙酸钙、甲酸、甲酸钠、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾或山梨酸钙中的一种或多种。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述芽胞组合物包括：
约0.002-5.0wt％的增稠剂；
总重量为约0.01-2.0wt％的一种或多种酸或酸的盐；和
任选地约0.00005-3.0wt％的表面活性剂；
其中百分比是以所述芽胞组合物的重量计。
28.根据权利要求4所述的方法，其中所述孵化期为约2分钟至约5分钟。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述水产养殖应用是包含鱼或鳗鱼的养成池。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述孵化期为约4至6小时。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述水产养殖应用是包含虾的养成池。
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