BR112020013121B1

BR112020013121B1 - Método para adicionar bactérias a água usada em uma aplicação em aquacultura

Info

Publication number: BR112020013121B1
Application number: BR112020013121-0A
Authority: BR
Inventors: Charles J. Greenwald; Gabriel F. K. Everett; Judy Pruitt; Amanda Rosmarin; Jordan E. Church; Daniel Aberle; George Aboagye; Skylar Rae White; Haibo CAO; Christopher Zetena; Kelly Gillespie
Original assignee: Nch Corporation
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2023-03-14
Also published as: BR112020013121A2; PH12020500607A1; MX2020008635A; EP3758475A1; TW201940063A; CN111770681A; WO2019168627A1; CA3088139A1; EP3758475A4; TWI826421B; CA3088139C; CO2020011856A2

Abstract

Um método para melhorar a qualidade de água do tanque usado em aplicações em aquaculturas, adicionando à água do tanque bactérias ativas que são preferivelmente germinadas de esporos no local usando uma composição de nutriente germinante e um método de incubação para maior eficiência de germinação do esporo, em combinação com um agente de intensificação de nitrificação, tal como carbonato de cálcio ou alga marinha calcificada, e um modificador de área superficial de reação opcional, tal como alga marinha calcificada ou partículas ou fragmentos de plástico ou metal. A composição de nutriente germinante compreende L-aminoácidos, D-glicose e/ou D- frutose, um tampão de fosfato, um conservante industrial, e pode incluir esporos de bactérias (preferivelmente de uma ou mais espécies de Bacillus) ou eles podem ser separadamente combinados para germinação. O método de incubação compreende aquecer uma composição de nutriente germinante e esporos de bactérias a uma faixa de temperatura de 35°C a 60°C por cerca de 2 a 60 minutos para produzir uma solução de bactérias incubada que é descarregada na aplicação em aquacultura.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido dos EUA N° de série 15/907.682 depositado em 28 de fevereiro de 2018.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção

[002] Esta invenção se refere ao tratamento de água de tanque de aquacultura com bactérias germinadas em uma composição de nutriente germinante e ao uso de um método de incubação de esporo no ponto de uso para reduzir resíduo orgânico, amônia, e pressão da doença em uma aplicação de criação em água e para prover probióticos às espécies de aquacultura.

2. Descrição da Técnica Relacionada

[003] Aquacultura se refere à criação de espécies aquáticas que são usadas como uma fonte de alimento para seres humanos ou animal. A técnica aplica alguns tipos de controle ao ambiente natural das espécies cultivadas para melhorar a colheita total. Isto pode incluir a incubação artificial das espécies para aumentar a colheita comercial de animais no ambiente selvagem, incubação e cultivo das espécies em tanques fechados, e a incubação e cultivo das espécies em pares fechadas drenadas gravitacionalmente adjacentes ao litoral. Os problemas associados a esse processo incluem: poluição que é descarregada pela unidade de criação e que deteriorará a qualidade da água circundante; perda de produto devido à qualidade deteriorada da água na unidade de criação; e maiores pressões da doença associadas a micro-organismos patogênicos na unidade de criação. Tais problemas podem ser identificados por meio de teste ou monitoramento de uma variedade de parâmetros, incluindo pH, condutividade, amônia, nitrato, fosfato e alcalinidade. A condutividade é um indicador do teor de sal, quantidades maiores que 1.200 ppm não são mais consideradas água doce; uma quantidade ideal é 700 ppm e varia de 300 a 1.200 ppm. Os níveis de amônia medem a quantidade de oxigênio disponível para peixes. Altos níveis de amônia bloqueiam a transferência de oxigênio no peixe das brânquias para o sangue; entretanto ele também é um produto de seu resíduo metabólico. Embora a amônia de resíduo de peixe não seja frequentemente concentrada o suficiente para ser tóxica em si, os piscicultores devem monitorar rigorosamente os níveis de amônia devido à alta concentração de peixe por tanque. O oxigênio é consumido pela nitrificação de bactérias no tanque que quebra a amônia tóxica em uma forma não tóxica; entretanto, este uso massivo de oxigênio reduz o oxigênio disponível para absorção pelo peixe. Níveis de amônia >1 ppm são considerados tóxicos para a vida do peixe. Adicionalmente, os níveis de nitrato são examinados para determinar a quantidade de adubo de planta na água. O nitrato é altamente lixiviável do solo no entorno e pode ser prejudicial para crianças pequenas e gestantes. O nitrato se transforma em nitrito no TG e interage com a capacidade do sangue de transportar oxigênio. O nível máximo de contaminação para nitrato é 10 ppm. A alcalinidade é a medida da capacidade do tanque ou lago de neutralizar o ácido sem uma mudança no pH. A alcalinidade diminuirá com o tempo devido às bactérias; entretanto, um nível ideal é 100 ppm com faixa aceitável de 50 a 200 ppm. O fosfato encontrado nos tanques e lagos é, em grande parte, de resíduo de seres humanos e animal. O escoamento de adubo é uma principal fonte de fosfato encontrada em campo de golfe e lagos decorativos. Os níveis elevados causam uma maior taxa de eutroficação que, por sua vez, aumenta a produção de lodo. Níveis moderados de fosfato podem estimular o crescimento de planta causando um aumento na produção de algas; níveis >0,1 ppm são uma indicação do crescimento acelerado de plantas e são considerados fora dos níveis aceitáveis.

[004] As tecnologias atuais para abordar estes problemas incluem biorremediação, antibióticos e aditivos químicos. Tecnologias de biorremediação típicas incluem a aplicação de bactérias suplementares à água para intensificar as atividades microbiológicas para melhorar a qualidade da água. Também sabe-se usar nitrificantes para melhorar o processo de nitrificação para converter a amônia tóxica em nitrato não tóxico. Os aditivos químicos são adicionados para melhorar a qualidade da água e auxiliar nas atividades microbiológicas, fornecendo nutrientes extras e alcalinidade. Os antibióticos são adicionados para inibir o crescimento dos micro-organismos patogênicos. Os problemas associados às tecnologias atuais incluem alto custo e baixo desempenho de melhoria da qualidade da água com as bactérias suplementares inativas, baixas atividades de nitrificação devido à existência de resíduo orgânico e falta de locais de crescimento de nitrificante, e bioacumulação de antibióticos nas espécies aquáticas cultivadas.

[005] De acordo com os métodos preferidos descritos no Pedido dos EUA N° de série 14/720.088, bactérias ativas podem ser geradas no local usando um biogerador para crescer as bactérias em uma população útil a partir de um material de partida de bactérias sólidas. As bactérias ativas podem então ser descarregadas em uma aplicação em aquacultura de um ou mais biogeradores. Tais biogeradores e seus métodos de uso são descritos, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos N° 6.335.191, 7.081.361, 7.635.587, 8.093.040 e 8.551.762, cujos conteúdos estão incorporados por referência nesta divulgação. Entretanto, seria útil ter um método alternativo para gerar bactérias ativas a partir de esporos no ponto de uso em uma aplicação em aquacultura.

[006] A germinação de esporo é um processo etiológico de várias etapas em que os esporos eficazmente despertam ou são recuperados a partir de um estado dormente para um estado de crescimento vegetativo. A primeira etapa é uma pela qual os esporos são ativados e são induzidos a germinar, tipicamente por um sinal ambiental chamado um germinante. Este sinal pode ser um nutriente, tal como um L-aminoácido. Nutrientes germinantes se ligam aos receptores na membrana interna do esporo para iniciar a germinação. Adicionalmente, os açúcares mostraram aumentar a afinidade de ligação de L- aminoácidos aos seus receptores cognatos.

[007] O sinal germinante então inicia uma cascata que causa a liberação de Ácido Dipicolínico (DPA), que é armazenado em uma razão 1:1 com Ca2+ (CaDPA) no núcleo do esporo. A liberação de CaDPA é um processo rápido e é tipicamente >90% completa em 2 minutos. A liberação de CaDPA representa um ponto sem retorno para os esporos nos quais ele está comprometido com o processo de germinação. Os versados na técnica se referem a esta etapa como etapa de “comprometimento”.

[008] Após a liberação de CaDPA, o esporo é parcialmente hidratado e o pH do núcleo aumenta para aproximadamente 8,0. O núcleo do esporo então se expande e o córtex (composto principalmente de peptidoglicano) é degradado pelas enzimas líticas do núcleo. O esporo absorve água e consequentemente perde sua refratividade. Esta perda de refratividade em direção ao fim do processo de germinação permite que a germinação do esporo seja monitorada por meio de microscopia de contraste de fases.

[009] A segunda fase de germinação é uma etapa de emergência na qual os caminhos metabólicos, biossintéticos e de replicação/reparo de DNA do esporo iniciam. O período de emergência tem várias fases. O primeiro é conhecido como um período de maturação no qual nenhuma mudança morfológica (tal como crescimento celular) ocorre, mas o maquinário molecular do esporo (por exemplo, fatores de transcrição, maquinário de tradução, maquinário biossintético, etc.) é ativado. Este período pode variar de duração com base nos recursos iniciais que são empacotados com o esporo durante o processo de esporulação. Por exemplo, a fonte de carbono preferida de várias espécies de Bacillus (incluindo subtilis) é malato e os esporos de Bacillus tipicamente contêm um grande agrupamento de malato que é usado durante o processo de despertar. De forma interessante, mutantes de deleção que não podem utilizar o agrupamento de malato apresentam um período de maturação estendido em comparação aos esporos tipo selvagem indicando que o agrupamento de malato do esporo é suficiente para energizar o processo de emergência inicial. Adicionalmente, os esporos armazenam pequenas proteínas solúveis em ácido que são degradadas nos primeiros vários minutos de despertar que servem como uma fonte imediata de aminoácidos para a síntese de proteína. Após a etapa de emergência, o despertar do esporo é finalizado e as células são consideradas como crescendo vegetativamente.

[0010] Sabe-se que os esporos podem ser induzidos para germinar por meio de ativação térmica. Os esporos de várias espécies de Bacillus foram ativados termicamente em temperaturas específicas da cepa. Por exemplo, esporos de B. subtilis foram termicamente ativados a 75°C por 30 minutos, enquanto que esporos de B. licheniformis foram termicamente ativados a 65°C por 20 minutos. Foi mostrado que a ativação térmica causa um desdobramento reversível e transitório das proteínas que revestem o esporo. Os esporos ativados termicamente então podem ser germinados por um tempo adicional em tampão de germinação contendo nutrientes germinantes, tal como L-alanina. Se nenhum nutriente germinante estiver presente, entretanto, os esporos retornarão ao seu estado pré-aquecido e não germinado.

[0011] Sabe-se que germinação pode ocorrer a temperaturas ambientes (próximo à temperatura ambiente típica) sem ativação térmica e com um tampão de germinação contendo nutrientes, mas o processo normalmente leva um tempo maior do que com ativação térmica. Por exemplo, esporos de B. licheniformis e B. subtilis germinarão a 35°C ou 37°C, respectivamente, mas eles levam um maior período de tempo (por exemplo, 2 horas) em um tampão de germinação contendo nutrientes germinantes. Adicionalmente, sabe-se que esporos ativados não termicamente de B. subtilis germinaram em condições germinantes sem nutrientes (por exemplo, CaCl2 + Na2DPA) por um período de tempo prolongado.

[0012] É também conhecido para combinar o uso de ativação térmica e um nutriente germinante para germinar esporos em um processo de duas etapas em ambientes laboratoriais. Os esporos são primeiro ativados termicamente incubando por um período de tempo (por exemplo, 30 minutos) a uma temperatura na faixa de 65 a 75°C (essa temperatura específica é dependente da espécie). Então, os esporos são transferidos para uma solução tampão que contém um nutriente germinante, tal como L-alanina. É também de conhecimento crescer bactérias em uma câmara de crescimento localizada próximo a um local de uso alimentando material nutriente peletizado (contendo açúcar, extrato de levedura, e outros nutrientes que não são germinantes de esporo diretos), bactérias iniciantes, e água em uma câmara de crescimento a uma temperatura controlada varia de 16 a 40°C, e mais preferivelmente entre 29 a 32°C, por um período de crescimento de cerca de 24 horas como descrito na Patente dos EUA N° 7.081.361.

[0013] Existe uma necessidade de um método de incubação e ativação de esporo rápida que permitirá geração de bactérias ativas, tal como espécie de Bacillus, em uma única etapa em uma localização de ponto de uso onde as bactérias serão descarregadas em uma aplicação em aquacultura. Dessa maneira, essa invenção descreve um método simples para germinação do esporo usando um concentrado de nutriente germinante combinado com uma composição de esporo, ou usando uma composição de nutriente esporo, simultaneamente com incubação térmica em uma única etapa para uso em aplicação em aquaculturas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] O método da invenção fornece uma abordagem de baixo custo- benefício para dispensar bactérias ativas na água do tanque (ou um tanque de crescimento) em uma instalação de aquacultura para degradar o resíduo orgânico e inibir o crescimento de miro-organismos patogênicos sem bioacumulação. O método da invenção reduz a pressão da doença na criação em água, resultando em colheitas melhoradas da espécie criadas na operação de aquacultura. A adição de um agente de intensificação de nitrificação como descrito aqui como parte do método fornece uma fonte de alcalinidade estável e locais de extra crescimento para o nitrificante para promover a atividade de nitrificação e redução de amônia.

[0015] O método da invenção inclui desejavelmente a dispensação de bactérias ativas, opcionalmente incluindo bactérias probióticas, acima de tudo preferivelmente geradas de uma incubadora no local usando um concentrado de nutriente germinante líquido e bactérias em forma de esporo, em uma aplicação em aquacultura. Uma composição de nutriente germinante de acordo com uma modalidade preferida da invenção compreende um ou uma combinação de muitos L-aminoácidos, opcionalmente D-glicose (que aumenta a afinidade de ligação de L-aminoácidos por seus receptores cognatos no revestimento do esporo), e um tampão neutro, tal como um tampão de fosfato, e um conservante industrial, tal como os comercialmente disponíveis pela Kathon/Lingaurd CG (que tem ingrediente ativos compreendendo metil cloro isotiazolinona e metil isotiazolinona). Uma composição de nutriente germinante de acordo com uma outra modalidade preferida da invenção compreende um ou uma combinação de dois ou mais L- aminoácidos, opcionalmente D-glicose (que aumenta a afinidade de ligação de L-aminoácidos com seus receptores cognatos no revestimento do esporo), sal de sódio HEPES (um tampão biológico para fornecer o pH adequado para germinação do esporo), e um conservante industrial, tal como uma combinação de propilparabeno e metilparabeno ou outros conservantes da GRAS (Geralmente Reconhecido como Seguro) federal do dos EUA De acordo com uma outra modalidade preferida, a composição de esporo também compreende um fonte de íons de potássio, tal como cloreto de potássio ou fosfato de monopotássio ou fosfato de dipotássio. De acordo com uma outra modalidade preferida, a composição de esporo inclui tanto D-glicose quanto D-frutose.

[0016] De acordo com uma outra modalidade preferida, uma composição de nutriente germinante também compreende esporos de uma ou mais espécie de bactérias, preferivelmente espécie de Bacillus, mas outras bactérias podem também ser usadas, e inclui um inibidor de germinação, tais como NaCl, conservantes industriais, ou D-alanina, em combinação com qualquer um dos ingredientes de composição de esporo previamente descritos. O inibidor de germinação impede que os esporos germinem prematuramente na composição de nutriente germinante. O inibidor de germinação pode incluir produtos químicos que impedem a germinação do esporo, tais como NaCl, conservantes industriais, ou D-alanina.

[0017] Alternativamente, esporos bacterianos podem ser fornecidos separadamente e adicionados a uma composição de nutriente germinante de acordo com a invenção no ponto de uso e incubação. Quando adicionados separadamente, prefere-se fornecer uma composição de esporo de suspensão de esporo estável compreendendo uma ou mais espécie de bactérias, preferivelmente espécie de Bacillus. De acordo com uma modalidade preferida, uma composição de esporo compreende esporos de bactérias, cerca de 0,00005 a 3,0% em peso de tensoativo, cerca de 0,002 a 5,0% em peso de espessante, e opcionalmente cerca de 0,01 a 2,0% em peso de acidificantes, ácidos, ou sais de ácidos (incluindo os usados como um conservante ou estabilizante), com o equilíbrio sendo água. De acordo com uma outra modalidade preferida, uma composição de esporo compreende esporos bacterianos, cerca de 0,1 a 5,0% em peso de espessante, cerca de 0,05 a 0,5% em peso de ácidos ou sais de ácidos, opcionalmente cerca de 0,1 a 20% em peso de redutores de atividade de água, e opcionalmente cerca de 0,1% a 20% de acidificante adicional (ácidos ou sais de ácidos), com o equilíbrio sendo água.

[0018] Acima de tudo preferivelmente, os esporos bacterianos em ambas as modalidades de composição de esporo preferidas são em uma mistura de pó seco de 40 a 60% de sal (sal de mesa) e 60 a 40% de esporos de bactérias (antes de adicionar na composição de esporo) que combinadas constituem cerca de 0,1 a 10% em peso da composição de esporo. As composições de esporo preferivelmente compreendem cerca de 1,0 X 108 a cerca de 3,0 X 108 cfu/ml da composição de esporo (suspensão de esporo), que quando diluída com água potável (aplicações para hidratação de animal) fornecem cerca de 104 a 106 cfu/ml de cepas bacterianas na água potável. Acima de tudo preferivelmente, o espessante em ambas as modalidades preferidas é um que também atua como um prebiótico, tal como goma xantana, para fornecer benefícios adicionais. Embora outros produtos de esporo comercialmente disponíveis possam ser usados, composições de esporo preferidas para uso com a invenção são como descritas no Pedido dos EUA N° de série 14/524.858 depositado em 27 de outubro de 2014, que está incorporado aqui pela referência.

[0019] De acordo com uma outra modalidade preferida, uma composição de nutriente germinante de acordo com a invenção é em forma concentrada e é diluída em 0,01% a 10% de concentração em água ou um outro diluente no ponto de uso. O uso de uma fórmula concentrada reduz os custos de transporte, armazenamento, e embalagem e torna a dosagem da composição de esporo no ponto de uso mais fácil de usar. Acima de tudo preferivelmente, a composição de esporo concentrada é em uma forma líquida, que é mais fácil e mais rápido de misturar com diluente no ponto de uso, mas formas sólidas, tais como pelotas ou tijolos ou pó, podem também ser usadas. A inclusão de um conservante industrial geral na composição de esporo auxilia na inibição armazenamento e/ou germinação a longo prazo, que é particularmente útil quando a composição de esporo é na forma concentrada preferida.

[0020] Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção compreende um método para germinar esporos da espécie de Bacillus usando uma composição de nutriente germinante combinada com uma composição de esporo ou usando uma composição de nutriente esporo a uma temperatura elevada; preferivelmente em uma faixa de 35 a 60°C, mais preferivelmente na faixa de 38 a 50°C, e acima de tudo preferivelmente na faixa de 41°C a 44°C por um período de tempo (um período de incubação). O período de incubação preferivelmente varia de 2 a 60 minutos ou mais, dependendo da aplicação. Acima de tudo preferivelmente, uma composição de nutriente germinante ou composição de nutriente esporo em forma concentrada de acordo com as modalidades preferidas da invenção é usada nos métodos de incubação/germinação da invenção, mas outras composições de nutriente germinante e composições de esporo podem também ser usadas. Preferivelmente, o método de incubação é realizado em ou próximo ao ponto de uso - o local de aquacultura ou próximo ao local de aquacultura onde os esporos germinados serão usados ou consumidos e compreende adicionalmente dispensar os esporos germinados no ponto de uso/consumo. Os métodos preferidos de acordo com a invenção podem ser realizados em qualquer dispositivo de incubação que tem um reservatório capaz de conter um volume de esporos (se adicionados separadamente), líquidos (tipicamente água como um diluente), a composição de nutriente germinante e aquela que é capaz de aquecer a mistura durante um período de incubação. Acima de tudo preferivelmente, os métodos são realizados em um dispositivo que é também capaz de misturar os ingredientes, desligando o aquecimento automaticamente no final do período de incubação, e dispensando automaticamente uma solução de bactérias incubada compreendendo as bactérias em um ponto de uso/consumo de aquacultura. Métodos preferidos podem também ser realizados como um processo em batelada ou como um processo contínuo. Embora as composições de esporo de acordo com a invenção sejam preferivelmente usadas, qualquer variedade de forma de esporos ou produtos, tais como forma de pó seco, uma suspensão líquida, ou uma mistura aquosa reconstituída, podem ser usadas com o método da invenção.

[0021] As modalidades preferidas da invenção permitem germinação rápida de esporos da espécie de Bacillus em um ponto de uso de aquacultura. A solução vegetativa ativa de bactérias descarregadas da incubadora pode ser suprida diretamente nos tanques de crescimento ou pode ser acumulada e diluída com água do tanque ou um outro diluente similarmente adequado, tal como água de um sistema de rede de abastecimento de água, antes de descarregá-la em tanques de crescimento. Alternativamente, a incubadora pode ser configurada para aquecer uma composição de nutriente germinante e esporos, ou uma composição de nutriente esporo, por um período de incubação e faixa de temperatura que produzirá bactérias em um estado metaestável, entre esporos dormentes e bactérias vegetativas. A solução metaestável de bactérias é então descarregada dentro do tanque de crescimento onde as bactérias podem se tornar bactérias vegetativas ativas. A diluição pode auxiliar na dispensação da solução de tratamento que escoa da incubadora para o tanque de crescimento, se a incubadora for localizada a alguma distância do tanque de crescimento. As bactérias ativas degradarão o resíduo orgânico e inibirão o crescimento dos miro-organismos patogênicos na água nas unidades de aquacultura, sem exigir a adição (ou redução da quantidade) de tratamentos químicos e antibióticos usados no tanque de crescimento.

[0022] A invenção também inclui desejavelmente aplicação contemporânea de pelo menos um agente de intensificação de nitrificação nos tanques de crescimento. Os agentes de intensificação de nitrificação aumentam a atividade de nitrificação de bactérias naturalmente encontradas na água para diminuir o nível de amônia. Esses agentes de nitrificação compreendem agentes de intensificação de alcalinidade que aumentam a alcalinidade da água, que é necessária para nitrificação (7 partes de alcalinidade para 1 parte de amônia) e/ou agentes de modificação de área superficial para aumentar as superfícies para as bactérias nitrificantes crescerem, uma vez que as bactérias nitrificantes crescem como biopelículas e precisam de superfícies nas quais elas possam se afixar. Os agentes de intensificação de alcalinidade podem incluir, por exemplo, carbonato de cálcio, alga marinha calcificada ou outros aditivos similarmente eficazes. Esses agentes podem ser adicionados em uma quantidade superior à dissolução para fornecer uma continuidade da fonte de alcalinidade uma vez que eles dissolvem lentamente. Certos agentes de nitrificação, tal como alga marinha calcificada atuam tanto como um agente de intensificação de alcalinidade quanto como um agente de modificação de área superficial fornecendo ambos alcalinidade e alta área superficial, fornecendo uma superfície de suporte para as biopelículas de nitrificantes crescerem. Alga marinha calcificada também atua como uma fonte de micronutrientes para as bactérias. Outros agentes de intensificação de nitrificação atuam apenas como agentes de modificação de área superficial, tais como peças de plástico ou metal, ou outros materiais similarmente eficazes para aumentar a área superficial sobre a qual reações e interações favoráveis podem ocorrer. Um ou mais agentes que atuam apenas como modificadores de área superficial (e não intensificadores de alcalinidade) podem também ser adicionados ao tanque de crescimento, tanto sozinhos quanto preferivelmente em combinação com um ou mais agentes de intensificação de alcalinidade; entretanto, um agente que atua apenas como um intensificador de área superficial não degradaria no tanque de crescimento e não seria adicionado com cada batelada de solução de bactérias. Tais agentes que atuam apenas como modificadores de área superficial preferivelmente seriam adicionados a um tanque de crescimento apenas uma vez. Os agentes que atuam como agentes de intensificação de alcalinidade seriam adicionados ao tanque de crescimento simultaneamente a uma batelada de bactérias em uma base periódica, tal como sazonalmente (uma vez por estação ou uma vez a cada verão, duas vezes por ano, etc.) ou como necessário. Como usado aqui, o termo “contemporâneo” pretende significar “em ou cerca de” o tempo em que uma batelada de bactérias vegetativas e outros componentes ou agentes são adicionados ao tanque de crescimento ou outro meio de crescimento no qual espécies aquáticas são crescidas em uma instalação de aquacultura.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0023] O sistema e método da invenção são descritos e explicados adicionalmente em relação às seguintes figuras.

[0024] A FIG. 1 é um fluxograma para um sistema e método de incubação de acordo com uma modalidade preferida da invenção; a FIG. 2 é um fluxograma para um sistema e método de incubação de acordo com uma outra modalidade preferida da invenção; a FIG. 3 é um fluxograma para um sistema e método de incubação de acordo com uma outra modalidade preferida da invenção; a FIG. 4 é um gráfico de níveis de nitrato em um estudo de laboratório; a FIG. 5 é um gráfico de níveis de ortofosfato em um estudo de laboratório; a FIG. 6 é um gráfico de turbidez em um estudo de laboratório; a FIG. 7 mostra fotografias de lâminas de bactérias usando uma composição de esporo e método de acordo com uma modalidade preferida da invenção comparadas com lâminas de controle; a FIG. 8 é um gráfico mostrando dados de teste de pO2 para demonstrar os níveis de germinação usando uma composição de esporo e método de acordo com uma modalidade preferida da invenção comparados aos testes de controle; a FIG. 9 é um gráfico mostrando dados de teste de pO2 para demonstrar os níveis de germinação usando uma composição de esporo e métodos variados de acordo com as modalidades preferidas da invenção comparados com os testes de controle; e a FIG. 10 mostra uma imagem de três aquários, um sob controle (esquerda), tratamento apenas com carbonato de cálcio (centro), ou tratamento com uma formulação de esporo de nutriente ativada (direita).

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERIDAS Métodos de Tratamento de Aquacultura

[0025] De acordo com uma modalidade preferida, as bactérias ativas são geradas no local a partir de uma composição de nutriente germinante combinada com uma composição de esporo ou de uma composição de nutriente esporo pré-misturada, preferivelmente usando um sistema de incubadora e um método de germinação preferido como descrito a seguir, e as bactérias ativas são periodicamente alimentadas dentro de um tanque de crescimento em uma aplicação em aquacultura. Um ou mais agentes de intensificação de nitrificação são também contemporaneamente adicionados ao tanque de crescimento com as bactérias ativas.

[0026] Um dispositivo de crescimento e dispensação de bactérias satisfatório para uso no método da invenção incluirá um sistema de incubadora no local, tal como uma incubadora de ar, uma incubadora de água, ou qualquer outra câmara ou dispositivo similar que forneça calor constante uniforme em uma dada faixa de temperatura como necessário para germinar os esporos para descarga na aplicação em aquacultura. Com referência à FIG. 1, preferivelmente, o sistema de incubadora no local 10 contém um ou mais tanques ou recipientes de contenção para conter um volume inicial de composição de nutriente germinante 12 e um volume inicial de solução de esporo de bactérias 14 (se os esporos bacterianos não estiverem incluídos na composição de nutriente germinante). Essas composições de esporo podem também chegar no local de uso em recipientes que são conectáveis em comunicação fluídica com a incubadora, em cujo caso tanques ou recipientes separados não são necessários. Uma fonte de água 16 em ou próximo ao local de aquacultura é também opcionalmente, mas preferivelmente, conectável em comunicação fluídica com o sistema de incubadora. Um poço, fonte de suprimento de água de rede de abastecimento, ou o tanque de crescimento pode fornecer água 16 para a incubadora 18. Um sistema de incubadora 10 também preferivelmente compreende uma câmara ou recipiente 18 configurado para receber uma porção da composição de nutriente germinante e esporos e permitir que eles sejam aquecidos para germinar os esporos; um aquecedor; válvulas, tubulação, e bombas (como necessário, se o fluxo de gravidade não for suficiente) para permitir que a composição de nutriente germinante 12, solução de esporo de bactérias 14, e opcionalmente água 16 escoem de seus recipientes/fonte de armazenamento para uma câmara ou recipiente de aquecimento 18 e para descarregar uma solução de bactérias incubada (ou bactérias ativadas) 20 da câmara ou recipiente de aquecimento 18 e dispensá-la no tanque de crescimento 22; um misturador opcional dentro da câmara ou recipiente de aquecimento 18, e um controlador ou cronômetro para ativar as válvulas, bombas, misturador opcional, e aquecedor para controlar influxo do nutriente e composições de esporo na câmara de aquecimento, tempo e temperatura de incubação, e descarga no tanque de crescimento. Acima de tudo preferivelmente, o sistema de incubadora no local 10 usa uma composição de nutriente germinado combinada com uma composição de esporo de bactérias (como descrito a seguir) ou usa uma composição de nutriente esporo (uma composição de nutriente germinante pré-misturada com esporos de bactérias, também como descrito a seguir) (ambas são também referidas aqui como “material de partida”), para gerar uma solução de bactérias incubada 20 a ser descarregada dentro do tanque de crescimento 22.

[0027] Alternativamente, de acordo com uma outra modalidade preferida como mostrado na FIG. 2, sistema de incubadora 110 usa composição de nutriente germinante concentrada 24 e composição de esporo concentrada 30, que são diluídas com um diluente ou água do recipiente/fonte 26 para formar uma composição de nutriente germinante funcional 28 e uma composição de esporo funcional 32, uma porção de cada uma sendo alimentada na incubadora 18 para gerar uma batelada de bactérias ativadas 20. Água da fonte 16 pode também ser usada como uma fonte de diluente no lugar de ou em adição à fonte 26. Adicionalmente, apenas uma da composição de nutriente germinante 24 ou composição de esporo 30 pode ser em forma concentrada e exige diluição antes de alimentação na incubadora 18. De acordo com uma outra modalidade preferida, quando apenas uma é concentrada, a composição não concentrada pode ser usada como um diluente para a composição concentrada em adição a ou no lugar de água/diluente da fonte 26 e/ou fonte 16. De acordo com uma outra modalidade preferida, uma composição de nutriente esporo concentrada 34 é usada com o sistema 210 como mostrado na FIG. 3. A composição de nutriente esporo concentrada é diluída com água/diluente da fonte 26 e/ou fonte 16 para fazer uma composição de nutriente esporo funcional 36 antes de alimentação na incubadora 18 para gerar uma batelada de bactérias ativadas 20. Alternativamente, uma composição de nutriente esporo pode não ser em forma concentrada e não exigir nenhum diluente antes de alimentação na incubadora 18 (similar à alimentação direta de composição de nutriente germinante 12 na FIG. 1), em cujo caso a fonte de água/diluente 26 não é necessária. A água da fonte 16 pode ainda ser opcionalmente alimentada na incubadora 18 como necessário nessa modalidade alternativa. Com qualquer uma das modalidades de sistema de incubadora, o diluente pode ser alimentado na incubadora 18 para diluir uma composição concentrada dentro da incubadora em vez de antes de alimentar a incubadora. Qualquer combinação de elementos dos sistemas 10, 110 e 210 pode ser usada conjuntamente, como técnicos no assunto poderão entender.

[0028] Preferivelmente, esporos de bactérias são germinados dentro da incubadora 18 ou outro dispositivo de aquecimento adequado de acordo com métodos de germinação preferidos descritos aqui. De acordo com uma modalidade preferida, uma composição de nutriente germinante e composição de esporo (ou composição de nutriente esporo) são aquecidas dentro da incubadora 18 a uma temperatura em uma faixa de 35 a 55°C, mais preferivelmente na faixa de 38 a 50°C, e acima de tudo preferivelmente na faixa de 41°C a 44°C. O período de incubação pode variar dependendo da aplicação de uso final, mas é preferivelmente entre cerca de 20 minutos e 60 minutos para gerar bactérias ativas para uma aplicação em aquacultura e acima de tudo preferivelmente cerca de 2 minutos e 5 minutos para uma aplicação de probiótico para gerar bactérias em estado metaestável. Para fornecer tempo de crescimento adicional para bactérias vegetativas, o período de incubação pode ser cerca de 4 a 6 horas.

[0029] Dependendo do uso das bactérias na aplicação em aquacultura, tal como uso para tratar a água ou um probiótico pelas espécies aquáticas, diferentes períodos incubação podem ser usados para fornecer uma solução de bactérias incubada que é basicamente ainda bactérias em forma de esporo, basicamente bactérias em estado metaestável (no qual os esporos não são nem adormecidos nem na fase de crescimento vegetativo, também referido aqui como um estado ativado), ou basicamente bactérias totalmente vegetativas. Adicionalmente, quando bactérias totalmente vegetativas são desejadas, a solução de bactérias pode ser retida dentro da incubadora 18 ou um outro recipiente intermediário por um período de tempo após o período de incubação para permitir que as bactérias multipliquem antes de descarregar na aplicação em aquacultura. Acima de tudo preferivelmente, a solução de bactérias será mantida a uma temperatura entre 30 e 45°C, mais preferivelmente, a solução de bactérias vegetativas será aquecida como necessário para manter a temperatura da solução na faixa de 33 a 42°C, e acima de tudo preferivelmente na faixa de 36°C a 39°C para facilitar o crescimento durante esse período de crescimento pós incubação. Quando uma aplicação probiótica é desejada, as bactérias permanecem basicamente no estado de esporo ou estado metaestável quando descarregadas na aplicação em aquacultura usando um menor período de incubação, que dá às bactérias uma melhor chance de sobrevivência através do trato intestinal das espécies aquáticas onde elas são mais benéficas como probióticos. No final de um período de incubação, uma solução de bactérias incubada 20 é descarregada no tanque de crescimento. Uma solução de bactérias incubada 20 pode compreender bactérias totalmente vegetativas, bactérias em estado metaestável, esporos, ou uma combinação dos mesmos dependendo da espécie de bactérias usada, temperatura de incubação, tempo de incubação, e teor dos nutrientes usados.

[0030] Cada batelada de solução de bactérias incubada 20 compreende cerca de 1x108 - 1 x 1010 cfu/mL de espécie de bactérias vegetativas em estado metaestável, e/ou esporos. Uma vez descarregadas no tanque de crescimento 22, a quantidade de bactérias em cada batelada é diluída com base na quantidade de água no tanque de crescimento. Acima de tudo preferivelmente, quantidades suficientes de solução de bactérias 20 são adicionadas ao tanque de crescimento 22 para fornecer uma quantidade eficaz de bactérias ativadas com base na diluição no tanque de crescimento. Neste contexto, “quantidade eficaz” pode se referir a quantidade de bactérias e/ou composição de nutriente que pode ser eficaz para melhorar o desempenho de uma planta ou animal após administração. Uma melhoria no desempenho pode ser medida ou avaliada monitorando uma ou mais características, incluindo, mas não se limitando a qualidade da água: limpidez de água, níveis de amônia, níveis de nitrito, níveis de nitrato, incidência de doença, mortalidade, peso de colheita, qualidade da carne, tamanho do animal individual, pesos de prêmio, uso de antibiótico, e uso de aditivo. “Quantidade eficaz” pode também se referir à quantidade que pode reduzir a quantidade de, competitivamente excluir, e/ou eliminar uma ou mais espécie de bactérias patogênicas (incluindo, mas não se limitando a Escherichia coli e Salmonella) nos intestinos de um animal. “Quantidade eficaz” pode também se referir quantidade que pode reduzir os níveis de NH3 e/ou H2S, tal como aqueles que podem ser excretados por um animal no seu ambiente.

[0031] De acordo com uma modalidade preferida para uso em aplicação em aquaculturas de camarão, a quantidade eficaz das bactérias no tanque de crescimento pode ser cerca de 1 a cerca de 9 x 102 CFU/mL. De acordo com uma outra modalidade preferida, a quantidade eficaz para aplicações em aquaculturas de camarão é cerca de 1 a cerca de 9 x 102 a cerca de 108 CFU/mL. De acordo com uma outra modalidade preferida, a quantidade eficaz das bactérias incubadas no tanque de crescimento pode variar de cerca de 0,001% a cerca de 2% em v/v da quantidade total de água no tanque de crescimento e qualquer faixa ou valor destes. Como um outro exemplo, cerca de 500 mL de solução de bactérias incubada compreendendo cerca de 1x109 - 1 x 1010 cfu/mL de espécies de bactéria dosadas em um tanque de crescimento quatro vezes por dia serão suficientes para tratar um tanque de crescimento contendo 100.000 galões de água. Outros volumes de solução de bactérias e intervalos de dosagem podem ser usados para tratar tanques de crescimento, dependendo do tamanho do tanque, com base em condições do tanque, espécies aquáticas, temperatura do tanque, e outros fatores para obter uma quantidade eficaz desejada de bactérias no tanque como técnicos no assunto poderão entender.

[0032] Os múltiplos sistemas de incubadora 10, 110 ou 210 podem ser fornecidos para fornecer maiores quantidades de solução de bactérias incubada ao tanque de crescimento para obter a quantidade eficaz desejada que está sendo adicionada ao tanque, para fornecer diferentes espécies de bactérias ao tanque de crescimento ou em diferentes tempos ou taxas, e/ou para espaçar a descarga de solução de bactérias incubada em torno do perímetro do tanque de crescimento para auxiliar na dispensação das bactérias através do tanque. Uma bomba ou outro dispositivo de mistura pode também ser adicionado ao tanque de crescimento (se não já no lugar) para auxiliar na dispensação da solução de bactérias incubada (e intensificadores de nitrificação ou intensificadores de área superficial) por todo o tanque de crescimento.

[0033] A incubadora no local é preferivelmente configurada para incubar múltiplas bateladas de solução de bactérias incubada de um recipiente de uma composição de nutriente germinante/composição de esporo ou composição de nutriente esporo, de maneira que múltiplas bateladas de bactérias possam ser descarregadas em intervalos periódicos por um período de tempo prolongado antes de o material de partida precisar ser reabastecido. Por exemplo, um recipiente de composição de nutriente germinante 12 pode inicialmente conter 0,3 a 3 litros de composição de nutriente germinante que pode ser alimentada em uma incubadora em quantidades incrementais de cerca de 10 a 100 mL a cada 1 a 24 horas. Um recipiente de solução de nutriente germinante concentrada 24 pode inicialmente conter 0,2 a 1 litro de solução, ser diluída com água/diluente da fonte 26 ou 16 a uma razão de cerca de 1:50 a cerca de 1:10 concentrada em água/diluente para alimentar uma incubadora em quantidades incrementais de cerca de 0,1 a 200 mL de solução funcional de nutriente germinante 28 a cada 1 a 24 horas. Um recipiente de solução de esporo de bactérias 14 a ser alimentada separadamente com uma composição de nutriente germinante pode inicialmente conter 0,6 a 6 litros de solução que pode ser alimentada em uma incubadora em quantidades incrementais de cerca de 20 a 200 mL a cada 1 a 24 horas. Um recipiente de solução de esporo de bactérias concentrada 30 pode inicialmente conter 0,15 a 6 litros de solução, ser diluída com água/diluente da fonte 26 ou 16 em uma razão de cerca de 1:10 a cerca de 1:3 concentrada em água/diluente para alimentar uma incubadora em quantidades incrementais de cerca de 5 a 200 mL de solução de esporo funcional 32 a cada 1 a 24 horas. Um recipiente de composição de nutriente esporo pode inicialmente conter 3 a 6 litros de composição de nutriente germinante que pode ser alimentada em uma incubadora em quantidades incrementais de cerca de 100 a 200 mL a cada 1 a 24 horas. Um recipiente de solução de esporo de nutriente concentrada 34 pode inicialmente conter 0,3 a 3 litros de solução, ser diluída com água/diluente da fonte 26 ou 16 a uma razão de cerca de 1:10 a cerca de 1:50 concentrada em água/diluente para alimentar uma incubadora em quantidades incrementais de cerca de 10 a 100 mL de solução de esporo de nutriente funcional 36 a cada 1 a 24 horas. Cada batelada de composição de nutriente germinante/esporos de bactérias ou composição de nutriente esporo é então incubada na incubadora, como discutido aqui, para formar uma solução de bactérias incubada que é descarregada em uma aplicação em aquacultura.

[0034] Uma solução de bactérias incubada 20 é preferivelmente descarregada de uma ou mais incubadoras 18 no tanque de crescimento 22 uma vez a cada 4 a 6 horas no curso de um ciclo de tratamento. Outros intervalos de dosagem podem ser usados dependendo do tamanho do tanque, condições do tanque/espécies aquáticas, e tipo de aplicação. O tempo entre doses pode ser variado como desejado variando a cronometragem de adição de ingredientes na incubadora e/ou tempo de incubação. Uma solução bacteriana incubada pode ser descarregada mais frequentemente em um tanque maior (por exemplo, 20 milhões de galões). Para uma aplicação de tratamento de água em aquacultura, é preferido descarregar uma solução incubada tendo bactérias vegetativas. Para obter bactérias vegetativas, é preferido incubar por pelo menos 4 a 6 horas antes de descarregar no tanque de crescimento, embora maiores tempos de incubação para permitir mais tempo para as bactérias se multiplicarem possam também ser usados. Para uma aplicação de probiótico para espécies aquáticas em uma aplicação em aquacultura, é preferido incubar por cerca de 2 a 5 minutos. Nessa aplicação, uma solução de bactérias incubada 20 pode ser descarregada múltiplas vezes ao dia, mesmo tão frequentemente quanto a cada 4 a 6 minutos, se necessário para um tanque grande. O volume de composição de nutriente germinante/composição de esporo ou composição de nutriente esporo que alimenta a incubadora é periodicamente substituída ou reabastecida como necessário. Um ciclo de tratamento é preferivelmente contínuo com a incubadora funcionando por todo o ano (em vez de desligamento periódico para manutenção ou reabastecimento da composição de nutriente germinante).

[0035] Várias espécies de Bacillus, como descrito a seguir, são preferivelmente usadas com métodos de tratamento de aquacultura de acordo com a invenção, mas outras bactérias podem também ser usadas. Por exemplo, acredita-se que o gênero de bactérias adequado para uso no método da invenção inclua qualquer uma ou mais espécies nos gêneros Bacillus, Bacteriodes, Bifidobacterium, Lueconostoc, Pediococcus, Enterococcus, LactoBacillus, Megasphaera, Pseudomonas e Propionibacterium. As bactérias probióticas que podem ser geradas no local incluem qualquer uma ou mais das seguintes: Bacillus amylophilus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacteriodes ruminocola, Bacteriodes ruminocola, Bacterioides suis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium thermophilum, Enterococcus cremoris, Enterococcus diacetylactis, Enterococcus faecium, Enterococcus intermedius, Enterococcus lactis, Enterococcus thermophiles, LactoBacillus brevis, LactoBacillus buchneri, LactoBacillus bulgaricus, LactoBacillus casei, LactoBacillus cellobiosus, LactoBacillus curvatus, LactoBacillus delbruekii, LactoBacillus farciminis, LactoBacillus fermentum, LactoBacillus helveticus, LactoBacillus lactis, LactoBacillus plantarum, LactoBacillus reuteri, Leuconostoc mesenteroides, Megasphaera elsdennii, Pediococcus acidilacticii, Pediococcus cerevisiae, Pediococcus pentosaceus, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium freudenreichii, e Propionibacterium shermanii.

[0036] Com pelo menos uma dose (ou batelada) de solução de bactérias incubada descarregada no tanque de crescimento, um ou mais agentes de intensificação de nitrificação são preferivelmente adicionados contemporaneamente. Os agentes de intensificação de alcalinidade, incluindo carbonato de cálcio ou alga marinha calcificada, podem ser adicionados periodicamente, tal como sazonalmente ou como necessário para reduzir fosfatos, e não com cada dose de bactérias. Os agentes podem ser adicionados a uma quantidade superior à dissolução para fornecer uma continuidade da fonte de alcalinidade uma vez que eles dissolvem lentamente. Os agentes de intensificação de alcalinidade que dissolvem lentamente, tal como alga marinha calcificada, também atuam como um modificador de área superficial, fornecendo uma superfície de suporte para biopelículas de bactérias de nitrificação crescerem e eles também auxiliam na dispensação de nutriente. Adicionalmente, os agentes que atuam apenas como modificadores de área superficial (tais como peças de metal ou plástico) podem ser adicionados ao tanque de crescimento como necessário para reduzir nitrogênio ou fósforo, junto com uma batelada ou dose de solução de bactérias incubada e um ou mais agentes de intensificação de alcalinidade, mas eles são preferivelmente adicionados apenas uma vez, e não com cada dose de solução de bactérias incubada. Esses agentes de intensificação de superfície similarmente fornecem uma superfície de suporte para as biopelículas das bactérias adicionadas crescerem, que auxilia em desenvolvimento mais rápido das bactérias benéficas. Acima de tudo preferivelmente, cerca de 100 libras de tais agentes de intensificação de nitrificação são adicionados por 7,5 milhões de galões de tanque de crescimento, e essa quantidade pode ser ajustada para outros volumes de tanque de crescimento. Os métodos de dispersão preferidos para os agentes de intensificação de nitrificação podem incluir o uso de diapositivos automáticos ou aplicação manual para a água nos tanques de crescimento. Os diapositivos automáticos ou operados manualmente úteis para difundir ou de outra forma dispersar pelo menos um agente de intensificação de nitrificação na forma de grânulos, pelotas ou grânulos são comercialmente disponíveis e são bem conhecidos pelos versados na técnica. Adicionalmente, esses agentes de intensificação de nitrificação podem ser dispersos através de um tanque usando o sistema e método de aditivo autodispersante, que emprega materiais efervescentes junto com o agente de tratamento em embalagem solúvel em água, descrito no Pedido de Patente dos EUA N° de Série 14/689.790 depositado em 17 de abril de 2015, que está incorporado aqui por referência.

[0037] Aplicações adequadas para o método da invenção incluem, por exemplo, e sem limitação vários tipos de aplicação em aquacultura, tais como incubadoras, tanques, e aquacultura de fluxo das marés. O uso combinado de bactérias germinadas ou vegetativas, preferivelmente crescidas no local, e pelo menos um auxiliar de intensificação de nitrificação, tais como carbonato de cálcio, alga marinha calcificada ou um outro material que seja similarmente eficaz para tratamento de baixo custo-benefício de água usado em aplicação em aquaculturas para tratar resíduo orgânico, amônia, e microorganismo patogênico bem como problemas de qualidade geral da água. Acredita-se que a efetividade do método em questão para alcançar esses objetivos seja intensificada adicionalmente pela adição de alga marinha calcificada, ou outras peças de plástico ou metal, partículas ou fragmentos que aumentam a área superficial disponível sobre os quais interações ou reações podem ocorrer.

[0038] Um estudo de laboratório foi conduzido para avaliar os benefícios de adicionar bactérias benéficas e agentes de intensificação de nitrificação à água do tanque. Um objetivo do estudo foi avaliar a eficácia de bactérias adicionadas (mistura de tanque comercialmente disponível pela EcoBionics) como inibidor ou herbicida contra produção de algas. Este estudo empregou o uso de seis béquers de 2 L, cada um cheio com 1,5 L de água da fonte tirada de um tanque de peixe estabelecido com algas presentes. Cada béquer também continha um peixe dourado de um tanque da fonte, pedra do ar, fonte de luz que alternaram 12 horas ligados, então 12 horas desligados, e cobertura de vidro de observação para reduzir perda por evaporação. Uma solução de bactérias da mistura de tanque foi gerada em um biogerador BIOAmp™ usando 37 g de pelotas Pond Plus, em vez de usar uma incubadora e composição de nutriente germinante de acordo com as modalidades preferidas da invenção descritas a seguir. Após um ciclo de crescimento de 24 horas no biogerador, uma alíquota de solução de bactérias foi obtida e diluída para manter uma razão de 3 L de mistura do tanque: 579.024 galões de água do tanque, entretanto, uma razão preferida a ser empregada no campo é 3L de mistura do tanque:100.000 galões de água do tanque. Com base nessa razão, cerca de 0,4 μL de solução de bactérias da mistura do tanque foi adicionado a aos béquers específicos tendo 1,5 L de água do tanque de peixe. Alga marinha calcificada foi adicionada para especificar béquers de acordo com as instruções do fabricante com base nas taxas para clarificação; isso foi igual a 0,045g de alga marinha calcificada por 1,5 L de água. Uma quantidade igual de carbonato de cálcio foi adicionada a alguns dos béquers. Os aditivos em cada béquer foram como a seguir: TABELA 1

[0039] Cada béquer de teste foi tratado de acordo com um programa de dosagem preferido que seria utilizado no campo. Os béquers 1, 3 e 5 com mistura do tanque seriam tratados (dosados) uma vez por semana com um adicional de 0,4 μL de mistura do tanque. Dependendo das condições do tanque de crescimento, outros programas de dosagem podem ser usados no campo. Alga marinha calcificada e carbonato de cálcio foram adicionados apenas uma vez no início desse estudo, entretanto, dosagem adicional pode ser usada no campo.

[0040] Uma amostra de pré-tratamento (antes da adição de solução de bactérias da mistura do tanque, alga marinha calcificada ou carbonato de cálcio) foi tirada de cada béquer e analisada para obter uma linha de base para comparação com os resultados pós-tratamento. Análise química foi realizada uma vez por semana usando amostras de 200 - 300 mL de cada béquer. Essas medições semanalmente incluíram análise de pH, condutividade, nitrato, orto fosfato, alcalinidade total e níveis de amônia. Uma vez por mês a turbidez foi examinada e fotografias foram tiradas para avaliar mudanças em crescimento de alga e clareza geral. O tratamento e análise dos béquers continuou por um total de três meses; novamente para espelhar a duração do estudo de campo.

[0041] Análise de dados foi realizada usando Excel 2003, usando um teste t bicaudal de duas amostras comparando os números de pré-tratamento vs. pós-tratamento a 95% de nível de confidência. O teste t bicaudal de amostras testou a hipótese nula de nenhuma diferença na média de pré e pós- tratamento com uma hipótese alternativa de existir uma diferença nas médias. HO = μ pré-tratamento = μ pós-tratamento HA = μ pré-tratamento / μ pós-tratamento

[0042] Leituras de linha de base indicaram níveis de fosfato elevados em todos os béquers, acima de 40 vezes o nível indicativo de crescimento de alga acelerado. Todas as outras medições foram dentro de faixas aceitáveis. TABELA 2 - Resultados de Teste T de Duas Amostra para Nitrato e Fosfato

* Indica um resultado significante

[0043] O béquer de teste contendo apenas as pelotas de mistura bacteriana não mostraram nenhuma mudança estatisticamente significante no período de estudo de três meses. Os níveis de fosfato caíram após duas semanas, mas em um mês retornaram para os níveis de pré-tratamento. Os níveis de nitrato espelharam os de fosfato. De todos os béquers de teste, apenas o béquer 1 teve aumento nos níveis de nitrato e fosfato similares ao controle negativo. Isso indica um efeito mínimo nos principais indicadores químicos de saúde do tanque quando se usa bactérias sozinhas.

[0044] Os dois béquers contendo alga marinha calcificada mostraram mudanças estatisticamente significantes nas médias de pré vs. pós-tratamento. Houve uma queda significante nos níveis de nitrato de 79% e 76% com valores p 0,01 e 0,04 no béquer 2 e 3, respectivamente. Os níveis de fosfato também caíram significativamente no Béquer 2 por 74% com um valor p de 0,02. O béquer contendo alga marinha calcificada e pelotas mostrou uma redução de fosfato de 66%, entretanto, esse valor não foi significante (vide Tabela 2). É importante notar que esta falta de significância estatística pode ser submetida a essa limitação de baixo tamanho da amostra do estudo. Esse estudo não testou mudanças em bactérias patogênicas nas amostras, mas seria esperado que a adição da solução de bactérias da mistura do tanque reduzisse os números através de competição. Adicionalmente, acredita-se que a adição de uma solução de bactérias de uma incubadora usando uma composição de nutriente germinante em um tanque de crescimento real de acordo com uma modalidade preferida da invenção alcançaria melhores resultados que no estudo de laboratório em virtude de as bactérias na solução de bactérias poderem agir sinergisticamente com as bactérias nitrificantes já presentes no tanque de crescimento e as bactérias adicionadas na solução de bactérias poderem auxiliar no consumo de resíduo na água para reduzir os níveis de amônia. Similar aos béquers de alga marinha calcificada, os dois béquers que continham carbonato de cálcio mostraram uma diferença significante nas médias de pré versus pós-tratamento. No béquer 4, os níveis de nitrato caíram 77% com um valor p de 0,03. Por outro lado, o béquer 5 que continha carbonato de cálcio e pelotas bacterianas mostrou uma diminuição significante nos níveis de fosfato de 72%, valor p 0,02 (vide Tabela 2). Carbonato de cálcio pode ser um substituto adequado para alga marinha calcificada em tratamento de aquacultura. Os béquers com alga marinha calcificada ou carbonato de cálcio teve melhor desempenho do que o sem a mesma. O béquer 5, que continha pelotas de mistura bacteriana e carbonato de cálcio, teve uma média pós-tratamento significativamente inferior dos níveis de fosfato e o menor efeito em pH. Entretanto, os béquers 2 e 5 tiveram quedas estatisticamente significantes nos níveis de fosfato.

[0045] A turbidez examinada por todo esse estudo mostrou uma diminuição contínua em todos os béquers de teste. Quando se compara imagens de pré- com pós- tratamento, existe um aumento na presença de algas em todos os béquers, entretanto, pelo segundo mês houve evidência de morte de alga em dois béquers. O béquer 4 contendo carbonato de cálcio e a béquer 6 (controle) ambos aparecerem com cor amarela indicando um sistema de algas morrendo. Morte de alga é um problema comum experimentado após uma eflorescência algal inicial, uma vez que oxigênio na água é esgotado; apesar da presença da pedra do ar. Com as algas morreram, houve um aumento acentuado nos níveis de nitrato. Isso foi evidente pelo aumento nos níveis de nitrato acima do pré-tratamento nesse mês, aumentando 14% e 38% nos béquers 4 e 6 respectivamente. No último mês, os níveis de nitrato no Béquer 4 recuperaram e diminuíram embora o sistema ainda tivesse uma cor verde escuro, amarelo. O nitrato continuou a aumentar a 6x o nível de contaminação no Béquer 6. As FIGS. 4-6 são gráficos mostrando os resultados desse estudo de laboratório.

[0046] Um estudo de campo focando na melhoria da saúde do tanque geral e clareza, ao mesmo tempo reduzindo lodo, foi também conduzido em vários tanques. Embora esse estudo não tenha sido específico de aquacultura (uma vez que os tanques no estudo foram ornamentais ou recreativos e não para criar e colher espécies aquáticas) e usado um biogerador em vez de uma incubadora e uma composição de nutriente germinante de acordo com uma modalidade preferida da invenção, ele fornece alguma informação útil com relação a adição de bactérias e agentes de intensificação de nitrificação. O estudo incluiu cinco tanques em e nos arredores de Irving, Texas; os tanques, identificados como Tanques 1 a 5 variaram de 23.400 ft3 a 720.131 ft3. A duração desse estudo foi sete meses. Uma a duas vezes por semana, uma amostra de água da superfície de 200 a 300 mL foi tirado do lado do banco de cada tanque. Essas amostras foram analisadas com relação a pH, alcalinidade, nitrato, fosfato, amônia, condutividade, turbidez e concentrações de E. coli spp.. Análise de fosfato, amônia e turbidez foi realizada usando um colorímetro Hach DR890. A determinação de E. coli spp. foi realizada usando meio especializado para crescimento de coliforme (3M Petrifilm 6404) incubado a 35°C por 48 horas.

[0047] Uma vez por mês cada tanque foi amostrado para profundidade de lodo, clareza e oxigênio dissolvido (DO). Essas medições foram feitas de um barco pequeno em duas a quatro localizações, marcadas por coordenadas de GPS para obter amostragem representativa. A profundidade de lodo foi medida em polegadas usando um amostrador de lodo; cada localização por GPS foi amostrada três a quatro vezes com a média calculada. O oxigênio dissolvido foi medido em ppm da camada da base e novamente a 18” da superfície usando uma sonda Hach LDO com um medidor Hach HQ30d. Clareza foi determinada em %/pés usando um Secchi Disk, que deu uma medição empírica. Adicionalmente, uma vez por mês fotografias foram tiradas em cada tanque em duas a quatro localizações, novamente marcadas por coordenadas de GPS, para dar um ponto de vista do usuário das condições da superfície geral.

[0048] Um biogerador climatizado BioAMP™ 750 foi instalado em cada localização para dosagem diária no local de uma mistura do tanque de especializada de bactérias. Esporos de Bacillus spp. foram peletizados usando uma fórmula REE-FLOW™ modificada; as pelotas foram alimentadas no vaso de crescimento onde elas cresceram em condições ideais por 24 horas e foram então dispersas diretamente no tanque. A manutenção do BioAMP 750 teve de ser modificada pelo protocolo padrão uma vez que hipoclorito de sódio (clareamento) é considerado tóxico para água da superfície e não permitido pela cidade de Irving para uso. Para obter um similar efeito de alvejamento como o tratamento de clareamento padrão, 155g de bicarbonato de sódio (bicarbonato de padaria) foram usados para remover excesso de biopelícula e limpar os vasos de crescimento. Além da manutenção mensalmente, os biogeradores foram monitorados com relação a quaisquer falhas e capacidade de manter a temperatura programada apesar de umas temperaturas ambientes excederem 37°C (100°F).

[0049] Como um acompanhante para o tratamento bacteriano, alga marinha calcificada foi também aplicada a cada tanque. A quantidade de alga marinha calcificada dada foi dependente do volume a uma razão de 100 lbs a 1.000.000 ft3 de água. A alga marinha calcificada foi dosada usando embalagens solúveis em água contendo um par efervescente e a alga marinha calcificada como descrito no Pedido de Patente dos EUA N° de Série 14/689.790.

[0050] Cada tanque de estudo recebeu a mesma quantidade de bactérias diariamente (30 trilhões CFUs). Uma matriz de correlação revelou que a profundidade de lodo foi inversamente relacionada à taxa de dose. Dois dos tanques menores tiveram a maior redução observada em níveis de lodo e clareza, bem como a mais alta dose de bactérias diariamente a 2 x107 CFU/L e 7 x 106 CFU/L respectivamente. A clareza como observado mostrou efeitos positivos em todos os tanques, indiferentemente do tamanho. A clareza foi aproximadamente 100% nos três tanques menores desse estudo. Ao contrário, os dois tanques maiores apenas alcançaram clareza de 20% pelo final desse estudo.

[0051] Um teste t unilateral de 2 amostras foi usado para avaliar se os níveis de lodo diminuíram significativamente após tratamento. Um valor p de 0,006 constatou uma diminuição média estatisticamente significante de 31%. H0: μ pré-tratamento = μ pós-tratamento, HA: μ pré-tratamento > μ pós- tratamento. Essa redução média observada é igual a uma redução média de 3 polegadas da camada de lodo. Adicionalmente, cada tanque nesse estudo experimentou uma diminuição no nível de lodo quando comparado ao pré- tratamento (vide Tabela 3). TABELA 3 - Mudanças em PO4, NO3 & Lodo por Tanque

[0052] A mudança observada média em E. coli spp. foi uma redução de 59%. É importante notar que a faixa total incluiu um aumento de 145% a uma diminuição de 100%. Uma ampla faixa como essa junto com um pequeno tamanho da amostra torna difícil determinar a efetividade do tratamento em concentração de E. coli spp.. Três dos cinco tanques de estudo experimentaram um aumento em concentrações de E. coli spp.; entretanto, os outros dois tanques apresentaram uma diminuição drástica; entretanto, acredita-se que o aumento seja o resultado de escoamento de água de chuva nos tanques.

[0053] O efeito geral desse tratamento em concentrações de fosfato foi examinado, comparando os níveis de pré-tratamento com pós-tratamento. Observou-se que os dados eram não paramétricos e um teste Mann-Whitney unilateral foi empregado para determinar se as concentrações de fosfato diminuíram significativamente após o tratamento. H0: μ pré-tratamento = μ pós-tratamento, HA: μ pré-tratamento > μ pós-tratamento. Um valor p de 0,0000 foi obtido indicando que a diminuição geral de 52% nos níveis de fosfato após tratamento foi estatisticamente significante. Exames detalhados de mudanças no nível de fosfato por tanque também revelaram diminuição significativa. Cada tanque tratado apresentou uma diminuição nas concentrações de fosfato variando de 19% a 77% (vide Tabela 3). A média de 52% de redução foi similar à redução de 57% observada na fase I desse estudo. Isso indica que o aumento na frequência de dosagem bacteriana pode não estar associado com a diminuição em concentrações de fosfato. Além disso, uma diminuição marcante nos níveis de fosfato foi observada diretamente após uma aplicação de alga marinha calcificada. A primeira dose foi administrada na primavera com a segunda dada no verão após os níveis de fosfato começarem a subir em junho. A natureza não química corretamente ecológica do produto pulverizado oferece resultados promissores para controle de concentrações de fosfato.

[0054] Similarmente, os níveis de nitrato foram examinados usando um teste Mann-Whitney unilateral para avaliar se as concentrações de nitrato diminuíram significativamente após tratamento. H0: μ pré-tratamento = μ pós- tratamento, HA: μ pré-tratamento > μ pós-tratamento. Com um valor p de 0,0000 determinou-se que a redução de 91% na concentração foi estatisticamente significante (vide Tabela 3). Com essa finalidade, concentrações de nitrato de linha de base foram abaixo dos níveis recomendados de maneira que não foram antecipadas reduções muito menos uma redução estatisticamente significante de 91%. Além disso, cada tanque de estudo que teve nitrato detectável foi significativamente reduzido abaixo dos limites de detecção de 0,01 ppm por 4 meses. Isso foi uma vasta melhoria na redução observado na Fase I (~69%) e indica que a frequência aumentada de dosagem bacteriana teve um efeito direto nessas concentrações. No geral esse estudo demonstrou que o tratamento intensificado com bactérias e alga marinha calcificada aumentou a saúde do tanque, medida por substitutos químicos e uma diminuição em nível de lodo.

Composições de Nutriente germinante

[0055] Uma composição de nutriente germinante de acordo com uma modalidade preferida da invenção compreende um ou mais L-aminoácidos, D-glicose (que aumenta a afinidade de ligação de L-aminoácidos para seus receptores cognatos no revestimento de esporo e é opcional), D-frutose (opcional, dependendo da espécie de bactérias), um tampão biológico para fornecer o pH adequado para germinação do esporo tais como sal de sódio HEPES, um tampão de fosfato, ou um tampão Tris), uma fonte opcional de íons de potássio tal como KCl), e um conservante industrial. Em uma outra modalidade preferida, uma composição de nutriente germinante compreende adicionalmente tanto D-glicose quanto D-frutose. Acima de tudo prefere-se incluir uma fonte de íons de potássio, tal como KCl, quando tanto D-glicose quanto D-frutose são usados. O uso de D-frutose, uma combinação de D- glicose e D-frutose, e uma fonte de íons de potássio são dependentes da espécie de bactérias como técnicos no assunto poderão entender. Prefere-se usar um conservante que tem pH compatível com a composição de esporo, que tem um pH relativamente neutro. De acordo com uma outra modalidade preferida, a composição de nutriente esporo também compreende esporos de uma ou mais espécies de Bacillus e preferivelmente um ou mais inibidores de germinação. Uma composição de nutriente germinante compreendendo esporos é referida aqui como uma composição fórmula, ou solução de nutriente-esporo. Alternativamente, esporos podem ser adicionados separadamente à composição de nutriente germinante de acordo com a invenção no ponto de uso. Quando adicionados separadamente, os esporos são preferivelmente parte de uma composição de esporo ou formulação de esporo descrita aqui, mas outros produtos de esporo comercialmente disponíveis podem também ser usados. De acordo com uma outra modalidade preferida, o nutriente germinante ou composição de nutriente esporo é em uma forma concentrada, acima de tudo preferivelmente como um líquido concentrado, e é diluído no ponto de uso.

[0056] L-aminoácidos preferidos incluem um ou mais de L-alanina, L-asparagina L-valina ou L-cisteína. Os L-aminoácidos podem ser fornecidos na forma de qualquer fonte adequada, tais como suas formas puras e/ou um hidrolisato de proteína de soja. Em uma modalidade adicional da composição de nutriente germinante concentrada, L-aminoácidos podem ser fornecidos como um hidrolisato de proteína de soja. Quando em uma forma concentrada, a composição de esporo preferivelmente compreende uma solução de um ou mais do L-aminoácidos mencionado anteriormente na faixa de peso de cerca de 8,9 a cerca de 133,5 g/L, mais preferivelmente cerca de 13,2 a cerca de 111,25 g/L, e acima de tudo preferivelmente cerca de 17,8 a cerca de 89 g/L cada; D-glicose (opcional) e/ou D-frutose (opcional) na faixa de peso de cerca de 18 a cerca de 54 g/L cada, mais preferivelmente cerca de 27 a cerca de 45 g/L cada, e acima de tudo preferivelmente cerca de 30 a cerca de 40 g/L cada; KCl (opcional, como uma fonte de íons de potássio) na faixa de peso de cerca de 7,4 a cerca de 22,2 g/L, mais preferivelmente cerca de 11,1 a cerca de 18,5 g/L, e acima de tudo preferivelmente cerca de 14 a cerca de 16 g/L; um tampão biológico, tal como fosfato de monossódio em uma faixa de peso de cerca de 10 a cerca de 36 g/L, mais preferivelmente cerca de 15 a cerca de 30 g/L, e acima de tudo preferivelmente cerca de 20 a cerca de 24 g/L e/ou fosfato de dissódio em uma faixa de peso de cerca de 30 a cerca de 90 g/L, mais preferivelmente cerca de 21,3 a cerca de 75 g/L, e acima de tudo preferivelmente cerca de 28,4 a cerca de 60 g/L. Um ou mais tampões biológicos auxiliam na manutenção da composição de nutriente germinante no pH adequado para germinação do esporo, cerca de pH 6 a 8. Além de ou no lugar de tampão fosfato de monossódio/dissódio, a composição de esporo pode compreender outros(s) tampão(ões) de fosfato, base Tris em uma faixa de peso de cerca de 15 a cerca de 61 g/L, mais preferivelmente cerca de 24 a cerca de 43 g/L, e acima de tudo preferivelmente cerca de 27 a cerca de 33 g/L; ou tampão HEPES em uma faixa de peso de cerca de 32,5 a cerca de 97,5g/L, mais preferivelmente cerca de 48,75 a cerca de 81,25 g/L, e acima de tudo preferivelmente cerca de 60 a cerca de 70 g/L. Opcionalmente, fosfato de monopotássio pode também ser usado como uma fonte de íons de potássio, preferivelmente em uma faixa de peso de cerca de 13,6 a cerca de 40,8 g/L, mais preferivelmente cerca de 20,4 a cerca de 34 g/L, e acima de tudo preferivelmente cerca de 26 a cerca de 29 g/L. Opcionalmente, fosfato de dipotássio pode também ser usado como uma fonte de íons de potássio, preferivelmente em uma faixa de peso de cerca de 8,7 a cerca de 26,1 g/L, mais preferivelmente cerca de 13 a cerca de 21,75 g/L, e acima de tudo preferivelmente cerca de 16 a cerca de 19 g/L. De acordo com uma outra modalidade preferida, as quantidades de KCl, fosfato de monossódio, e/ou fosfato de dissódio podem ser ajustadas de maneira que o pH na solução de germinante de solução de nutriente germinante e/ou nutriente-esporo pode ser cerca de 6, cerca de 7, ou cerca de 8.

[0057] Em uma outra modalidade preferida, a composição de nutriente germinante compreende adicionalmente um ou mais conservantes industriais a uma faixa de peso final (total) de 0,8 a 3,3 g/L, mais preferivelmente 1,2 a 2,7 g/L, acima de tudo preferivelmente 1,6 a 2,2. O(s) conservante(s) pode(m) ser benéfico(s) para armazenamento a longo prazo. Conservantes adequados incluem, NaCl, D-alanina, sorbato de potássio, e conservantes químicos. Conservantes químicos podem ser conservantes com ingredientes ativos de metil cloro isotiazolinona (cerca de 1,15% a cerca de 1,18% em v/v) e metil isotiazolinona (cerca de 0,35-0,4% em v/v); conservantes com os ingredientes ativos de diazolidinil ureia (cerca de 30%), metilparabeno (cerca de 11%), e propilparabeno (cerca de 3%); e conservantes com apenas o ingrediente ativo de metilparabeno; e outros conservantes com o metil parabeno, propilparabeno, e diazolidinil ureia). Exemplos não limitantes de conservantes químicos com metil cloro isotiazolinona e metil isotiazolinona como ingredientes ativos são Linguard ICP e KATHON™ CG (que têm ingredientes ativos compreendendo metil cloro isotiazolinona, cerca de 1,15 a 1,18% e metil isotiazolinona, cerca de 0,35 a 0,4%). Um exemplo não limitante de um conservante químico com diazolidinil ureia, poliparabeno, e metilparabeno como ingredientes ativos inclui Germaben II. Onde os ingredientes ativos do conservante químico são metil cloro isotiazolinona e metil isotiazolinona, o conservante químico pode ser incluído em uma solução de nutriente concentrada a cerca de 0,8 a cerca de 3,3 g/L, mais preferivelmente de cerca de 1,2 a cerca de 2,7 g/L, e acima de tudo preferivelmente de cerca de 1,6 a cerca de 2,2 g/L. Onde o(s) ingrediente(s) ativo(s) do conservante químico é(são) diazolidinil ureia, metilparabeno, e/ou propilparabeno, o conservante químico pode ser incluído em uma solução de nutriente concentrada a cerca de 0,3 a cerca de 1% (p/p). Em alguns aspectos, a quantidade de um conservante químico tendo diazolidinil ureia, metilparabeno, e propilparabeno pode ser incluída na formulação de nutriente a cerca de 10 g/L. No caso de metilparabeno, o conservante pode ser incluído em uma solução de nutriente concentrada a cerca de 0,27 a cerca de 1,89 g/L, mais preferivelmente de cerca de 0,81 a cerca de 1,35 g/L, e acima de tudo preferivelmente de cerca de 1,0 a cerca de 1,18 g/L. De acordo com uma outra modalidade preferida, onde a formulação de nutriente pode ser usada para gerar uma formulação de nutriente-esporo eficaz para aplicação em aquaculturas envolvendo camarão, ou outro marisco, o conservante pode incluir uma quantidade de metilparabeno e sorbato de potássio. De acordo com uma outra modalidade preferida, uma solução de nutriente germinante pode ser usada para gerar um efeito de formulação de nutriente-esporo para plantas e/ou água residual, a formulação de nutriente- esporo pode incluir uma quantidade de Linguard ICP ou KATHON™ CG.

[0058] Ainda de acordo com uma outra modalidade preferida, uma composição de nutriente germinante pode opcionalmente compreender adicionalmente um composto osmoprotetor. Ectoína um osmoprotetor natural produzido por alguma espécie de bactérias, pode ser incluída em uma modalidade preferida. A quantidade de ectoína (opcional) em uma composição de nutriente germinante concentrada pode variar de cerca de 0,625 a cerca de 4,375 g/L, mais preferivelmente de cerca de 1,875 a 3,125 g/L, e acima de tudo preferivelmente em uma quantidade de cerca de 2 a 3 g/L. De acordo com uma outra modalidade preferida, uma composição de nutriente germinante pode compreender adicionalmente outros ingredientes padrões incluindo, mas não se limitando a, tensoativos que auxiliam na dispersão de ingredientes ativos, conservantes adicionais asseguram o prazo de validade da composição de esporo, tampões, diluentes, e/ou outros ingredientes que são tipicamente incluídos em uma formulação de nutriente e/ou formulação de esporo.

[0059] As quantidades dos ingredientes anteriores são aspectos importantes da invenção porque concentrações mais altas tornariam alguns ingredientes insolúveis e concentrações mais baixas seriam ineficientes na germinação de esporos.

[0060] De acordo com uma outra modalidade preferida, uma composição concentrada de nutriente germinante de acordo com as modalidades da invenção é em forma concentrada e é diluída em uma solução em água funcional, uma composição de esporo, ou qualquer outro diluente apropriado, ou uma combinação dos mesmos antes da germinação em um ponto de uso como descrito adicionalmente a seguir. De acordo com várias modalidades preferidas, uma solução funcional de nutriente germinante pode ser produzida diluindo uma composição de nutriente germinante concentrada de acordo com uma modalidade preferida aqui com água ou outro diluente adequado em uma razão entre 0,01% e 50% (v/v) de composição de nutriente germinante concentrada em diluente, mas outras quantidades podem também ser usadas. As composições de nutriente germinante concentradas de acordo com a invenção podem ser diluídas em qualquer valor de 2 a 1 X 106 vezes ou qualquer faixa ou valor aí, para produzir uma solução funcional de nutriente germinante. Acima de tudo preferivelmente, a diluição é em uma faixa de cerca de 0,1 a cerca de 10% do concentrado e a água de equilíbrio ou outro diluente adequado. As quantidades dos ingredientes descritos anteriormente presentes em uma solução funcional de nutriente (uma solução diluída de uma fórmula concentrada) podem ser calculadas com base no fator de diluição e nas quantidades concentradas descritos anteriormente.

[0061] O uso de uma composição de nutriente germinante concentrada reduz os custos de transporte, armazenamento e embalagem e torna a dosagem da composição de esporo no ponto de uso mais fácil. Acima de tudo preferivelmente, a composição de nutriente germinante concentrada é em uma forma líquida, que é mais fácil e mais rápida para misturar com diluente no ponto de uso, mas formas sólidas, tais como pelotas ou tijolos ou pó podem também ser usadas. A inclusão de um conservante industrial geral na composição de nutriente germinante auxilia no armazenamento a longo prazo.

[0062] Acima de tudo preferivelmente, todos os ingredientes em composições de nutriente germinante de acordo com a invenção ou usados com métodos da invenção atendem aos padrões da dos EUA federal GRAS.

Composições de Nutriente-esporo

[0063] De acordo com uma outra modalidade preferida, a composição é uma composição de nutriente esporo compreendendo ingredientes descritos anteriormente para uma composição de nutriente germinante e esporos pré- misturados conjuntamente. De acordo com uma modalidade preferida, uma composição de nutriente esporo preferivelmente compreende 10% a 90% em peso de um ou mais esporos de Bacillus ou uma mistura de esporo (compreendendo 40 a 60% pó de esporo com uma ou mais espécie de Bacillus e 60 a 40% sal). De acordo com uma outra modalidade preferida, uma composição de nutriente esporo compreende cerca de 5% em peso de um ou mais esporos de Bacillus ou uma mistura de esporo. A concentração total de esporos na composição de nutriente esporo pode variar de cerca de 1 x 105 CFU/mL ou esporos/g a 1 x 1014 CFU/mL ou esporos/g ou qualquer concentração específica ou faixa da mesma.

[0064] Uma composição de nutriente esporo preferivelmente também compreende um ou mais inibidores de germinação e/ou conservantes. Os inibidores de germinação ou conservantes preferidos para uma composição de nutriente esporo concentrada incluem NaCl a uma concentração relativamente alta variando de cerca de 29 a cerca de 117 g/L, mais preferivelmente de cerca de 43 a cerca de 88 g/L, e acima de tudo preferivelmente de cerca de 52 a cerca de 71 g/L; e/ou D-alanina em uma quantidade variando de cerca de 8 a cerca de 116 g/L, mais preferivelmente de cerca de 26 a cerca de 89 g/L, e acima de tudo preferivelmente de cerca de 40 a cerca de 50 g/L; e/ou sorbato de potássio em uma quantidade variando de cerca de 1,25 a cerca de 8,75 g/L, mais preferivelmente de cerca de 3,75 a cerca de 6,25 g/L, e acima de tudo preferivelmente de cerca de 4,5 a cerca de 5,5 g. Outros conservantes químicos descritos anteriormente com composição de nutriente germinante preferida podem também ser usados com composições de nutriente-esporo de acordo com a invenção. Esses inibidores de germinação ou conservantes mantêm os esporos em um estado inativo e impedem germinação prematura dos esporos antes de sua diluição e ativação no ponto de uso. O uso de inibidores de germinação é particularmente preferido quando a composição de esporo de acordo com essa modalidade é usada com o método preferido da invenção, onde a germinação ocorre no ponto de uso. Quando os esporos são incluídos, as quantidades de outros ingredientes para a composição de nutriente germinante descritos anteriormente tais como L-aminoácidos, tampões biológicos, etc.) constituem o equilíbrio da composição de esporo proporcionalmente reduzida para corresponder às faixas preferidas descritas anteriormente. As composições de nutriente-esporo preferidas são também em forma concentrada e diluídas em uma solução funcional em um ponto de uso como descrito anteriormente com respeito à composição de nutriente germinante e descritas adicionalmente a seguir.

[0065] Os esporos de Bacillus preferidos para uso em uma composição de nutriente esporo de acordo com modalidades preferidas da invenção incluem as seguintes espécies: Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquiefaciens, Bacillus polimyxa, Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus lentus, Bacillus clausii, Bacillus circulans, Bacillus firmus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus, Bacillus laevolacticus, Bacillus polimyxa, Bacillus pumilus, Bacillus simplex, e Bacillus sphaericus. Outras espécies de esporo de Bacillus podem também ser usadas como técnicos no assunto poderão entender. Preferivelmente, uma composição de nutriente esporo compreende 1 a 20 ou mais espécies de Bacillus, mais preferivelmente entre 3 a 12 espécies de Bacillus. De acordo com uma outra modalidade preferida, uma composição de nutriente esporo compreende 3 cepas de bactérias de Bacillus, acima de tudo preferivelmente 2 cepas de bactérias de Bacillus podem uma cada ser uma cepa da espécie de Bacillus licheniformis e a terceira cepa é uma espécie de Bacillus subtilis. De acordo com uma outra modalidade preferida, os esporos em uma mistura de esporo compreendem cerca de 80% de Bacillus licheniformis (40% de cada cepa) e 20% de Bacillus subtilis.

[0066] Em uma outra modalidade preferida, uma composição de nutriente esporo para uso como um probiótico compreende uma ou mais cepas de Bacillus que são probióticas em natureza em que elas auxiliam na quebra de nutrientes no trato digestivo do consumidor. As cepas preferivelmente produzem um ou mais das seguintes enzimas: proteases para hidrolisar proteínas, amilases para hidrolisar amidos e outros carboidratos, lipases para hidrolisar gorduras, glicosidases para auxiliar na hidrólise de ligações glicosídicas em açúcares complexos e para auxiliar na degradação de celulose, celulases para degradar celulose em glicose, esterase que é uma enzima tipo lipase, e xilanases que degradam xilano, um polissacarídeo encontrado em paredes celulares de planta. As cepas de Bacillius que produzem essas enzimas são bem conhecidas na técnica.

[0067] De acordo com uma outra modalidade preferida, uma composição de nutriente esporo é em uma forma concentrada e é diluída com uma solução funcional em água ou qualquer outro diluente apropriado, ou uma combinação da mesma, antes de germinação em um ponto de uso como descrito adicionalmente a seguir. De acordo com várias modalidades preferidas, uma solução funcional de nutriente-esporo pode ser produzida diluindo uma composição de nutriente esporo concentrada de acordo com uma modalidade preferida aqui com água ou outro diluente adequado em uma razão entre 0,01% a 50% (v/v) de composição de nutriente germinante concentrada para diluir, mas outras quantidades podem também ser usadas. As composições de nutriente-esporo concentradas de acordo com a invenção podem ser diluídas qualquer valor de 2 a 1 X 1013 vezes ou qualquer faixa ou valor aí, para produzir uma solução funcional de nutriente germinante. Acima de tudo preferivelmente, a diluição é em uma faixa de cerca de 0,1 a cerca de 10% do concentrado e a água de equilíbrio ou outro diluente adequado. As quantidades dos ingredientes descritos anteriormente (tais como L- aminoácidos e inibidores de germinação) presentes em uma solução funcional de nutriente (uma solução diluída de uma fórmula concentrada) podem ser calculadas com base no fator de diluição e nas quantidades concentradas descritas anteriormente.

[0068] Acima de tudo preferivelmente, todos os ingredientes nas composições de nutriente-esporo de acordo com a invenção ou usados com métodos da invenção atendem aos padrões da dos EUA federal GRAS.

Composições de esporo

[0069] Uma composição probiótica de esporo de acordo com uma modalidade preferida da invenção compreende uma ou mais espécies bacterianas, um tensoativo opcional, um espessante, e opcionalmente um ou mais acidificantes, ácidos ou sais ou ácidos para agir como um conservante. De acordo com uma outra modalidade preferida, uma composição de esporo compreende adicionalmente um ou mais prebióticos, até o ponto em que o espessante não é também um prebiótico, ou além de qualquer espessante que é um prebiótico. De acordo com uma outra modalidade preferida, uma composição de esporo compreende adicionalmente um ou mais redutores de atividade de água. Acima de tudo preferivelmente, as composições de esporo de acordo com a invenção compreendem várias espécies de esporos probióticos suspensos, como descrito com mais detalhe a seguir. O uso de dessas espécies em forma de esporo aumenta a estabilidade dos probióticos nas condições ambientais agressivas que podem ser encontradas próximas aos locais de aplicação em aquacultura. A concentração total de esporos na composição de esporo pode variar de cerca de 1 x 105 CFU/mL ou esporos/g a 1 x 1014 CFU/mL ou esporos/g ou qualquer concentração ou faixa específica dos mesmos.

[0070] Um espessante adequado é incluído na composição de esporo de acordo com as modalidades preferidas. O espessante é preferivelmente um que não separa ou degrada em temperaturas variadas tipicamente encontradas em ambientes de aquacultura não climatizados. O espessante auxilia na estabilização da suspensão de maneira que a mistura bacteriana continue homogênea e disperse através de um volume da composição de esporo e não decante da suspensão. Quando usado com um sistema de incubação e métodos de tratamento de aquacultura de acordo com as modalidades preferidas da invenção descritas aqui, isso assegura que a concentração de materiais probióticos seja uniformemente distribuída por todo o recipiente de maneira que a dosagem de esporos dispensada em uma incubadora permaneça consistente ou relativamente consistente (dependendo do método de dispensação e mecanismo de controle específicos usados) por todo um ciclo de tratamento.

[0071] O espessante acima de tudo preferido é goma xantana, que é um polissacarídeo composto de unidades de repetição pentassacarídeo de glicose, manose, e ácido glicurônico e um prebiótico conhecido. Diferente de algumas outras gomas, goma xantana é muito estável em uma ampla faixa de temperaturas e pH. Um outro espessante preferido é goma acácia, que é também um prebiótico conhecido. Outros espessantes preferidos incluem goma de semente de alfarroba, goma guar e goma arábica, que se acredita ser também prebióticos. Além dos benefícios prebióticos, essas fibras não se ligam a minerais e vitaminas, e portanto, não restringe ou interfere com sua absorção e podem ainda melhorar a absorção de certos minerais, tal como cálcio, por espécies aquáticas. Outros espessantes que não são considerados prebióticos podem também ser usados.

[0072] A modalidade preferida pode opcionalmente incluir um ou mais prebióticos, que são preferivelmente usados se o espessante usado não for um prebiótico, mas pode também ser usado além de um espessante prebiótico. Os prebióticos são classificados como dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos, e podem incluir Inulina, Oligofrutose, Fruto-oligossacarídeos (FOS), Galacto-oligossacarídeo (GOS), trans-Glacto- Oligossacarídeos (TOS) e Fruto-oligossacarídeos de Cadeia Curta (scFOS), Fruto-oligossacarídeo de soja (soyFOS), Gluco-oligossacarídeos, Glico- oligossacarídeos, Lactitol, Malto-oligossacarídeos, Xilo-oligossacarídeos, Estaquiose, Lactulose, Rafinose. Manano-oligossacarídeo (MOS) são prebióticos podem não enriquecer populações bacterianas probióticas, mas se ligarão a e removerão patógenos do trato intestinal e acredita-se que estimulem o sistema imune.

[0073] As modalidades preferidas também preferivelmente incluem um ou mais acidificantes, ácidos, ou sais de ácidos para agir como um conservante ou acidificar a composição de esporo. Os conservantes preferidos são ácido acético, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido propiônico, propionato de sódio, propionato de cálcio, ácido fórmico, formato de sódio, ácido benzoico, benzoato de sódio, ácido sórbico, sorbato de potássio, e sorbato de cálcio. Outros conservantes conhecidos, preferivelmente no geral conservantes de alimento considerados seguros (GRAS), podem também ser usados. Preferivelmente, o pH da composição de esporo é entre cerca de 4,0 e 7,0, mais preferivelmente ele é entre cerca de 4,0 e 5,5 e acima de tudo preferivelmente cerca de 4,5 para impedir germinação prematura dos esporos antes de uso ou adição a uma incubadora como descrito a seguir. A redução do pH da composição de esporo pode também ter atividade antimicrobiana com relação a levedura, mofos, e bactérias patogênicas.

[0074] Um ou mais redutores de atividade de água, tal como cloreto de sódio, cloreto de potássio, ou xarope de milho (uma solução 70% de xarope de milho), são opcionalmente incluídos na composição de esporo de acordo com qualquer modalidade preferida. O redutor de atividade de água auxilia na inibição de crescimento de micro-organismo, de maneira que os esporos bacterianos não germinem prematuramente enquanto a composição de esporo está sendo armazenada antes do momento em que ela é descarregada no ponto de consumo pelos animais ou plantas a ser tratados ou ponto de uso na descarga em um tanque de crescimento. Eles também auxiliam na inibição de crescimento de contaminação micro-organismos.

[0075] O tensoativo opcional é preferivelmente um que seja seguro para ingestão por animais, embora outros tensoativos possam ser usados com outras aplicações, tal como dispensação em plantas. Acima de tudo preferivelmente, o tensoativo é Polissorbato 80. Embora quaisquer tensoativos ou emulsificantes aprovados por GRAS ou AAFCO possam ser usados com qualquer modalidade, existem preocupações de que alguns animais possam não tolerar todos os tensoativos aprovados igualmente. Em virtude de os benefícios do tensoativo na estabilização da suspensão de maneira que a mistura bacteriana permaneça homogênea e não decante poderem também ser obtidos pelo uso do espessante, não é necessário adicionar o tensoativo. Se um tensoativo for usado na composição de esporo de acordo com essa segunda modalidade, ele é preferivelmente usado em torno da mesma faixa de porcentagem em peso que a primeira modalidade.

[0076] As bactérias preferidas para uso com uma composição de esporo de acordo com a invenção são das descritas anteriormente para uma composição preferida de nutriente-esporo. Acima de tudo preferivelmente, as espécies bacterianas usadas em uma composição de esporo são uma ou mais espécies do gênero de Bacillus. As espécies acima de tudo preferidas para as bactérias probióticas incluem as seguintes: Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus amylophilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus clausii, Bacillus firmus, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis var. natto, ou Bacillus toyonensis, mas qualquer espécie de Bacillus aprovada como um probiótico no país de uso pode também ser usada. Prefere-se que as bactérias sejam em forma de esporo, uma vez que a forma de esporo é mais estável em flutuações ambientais, tais como mudanças de temperatura ambiente. Acima de tudo preferivelmente, os esporos usados nas composições de esporo de acordo com a invenção são uma mistura de pó seco que compreende cerca de 40 a 60% de sal (sal de mesa) e 60 a 40% de esporos bacterianos. Os esporos são preferivelmente seco por pulverização de um concentrado de fermentação líquida. Sal é usado para diluir o pó de esporo seco por pulverização puro a uma contagem de esporo padrão na mistura final de esporo de pó. Durante a fermentação da produção, diferentes cepas de Bacillus crescerão em diferentes taxas, resultando em variados números de contagem final para o licor de fermentação em batelada. O licor de fermentação é centrifugado para concentrar os esporos no licor. Então, o licor concentrado é seco por pulverização que resulta em um pó contendo apenas esporos de Bacillus. A adição de sal ao pó de esporo de Bacillus seco por pulverização auxilia na padronização da contagem de mistura de esporo por grama de batelada a batelada. Outras formas de esporos bacterianos ou mistura de esporos podem também ser usadas. Acima de tudo preferivelmente, a mistura seca de esporo é pré-misturada com uma porção da água usada na composição de esporo, cerca de 3 a 30% da água total, e a solução resultante de esporo de bactérias é adicionada aos outros ingredientes, incluindo a água restante. Isso auxilia na dispensação dos esporos de bactérias por toda a composição de esporo.

[0077] Uma composição probiótica de esporo de acordo com uma primeira modalidade preferida da invenção preferivelmente compreende esporos bacterianos que fornecem 108 cfu/ml da suspensão de esporo (acima de tudo preferivelmente cerca de 1,0 X 108 a cerca de 3,0 X 108 cfu/ml de composição de esporo, que, quando diluída em crescimento água do tanque fornece aproximadamente 101 a 104 cfu/ml água do tanque), 0,00005 a 3,0% de tensoativo, e 0,002 a 5,0% de espessante, e opcionalmente o cerca de 0,01 a 2,0% de um ou mais ácidos ou sais de ácidos como um conservante, todas as porcentagens em peso da composição de esporo. Uma composição probiótica de esporo de acordo com uma outra modalidade preferida da invenção compreende esporos bacterianos que fornecem 109 cfu/ml da suspensão de esporo (que, quando diluída em água do tanque fornece aproximadamente 101 a 104 cfu/ml água do tanque), cerca de 0,1 a 5,0% de espessante (preferivelmente um que também aja como um prebiótico), cerca de 0,05 a 0,5% de um ou mais conservantes, opcionalmente cerca de 0,1 a 20% de um ou mais redutores de atividade de água, e opcionalmente 0,1 a 20% de um ou mais acidificantes, todas as porcentagens em peso da composição. O equilíbrio da composição de esporo em ambas as modalidades preferidas é água e as porcentagens aqui são em peso. É preferível usar água deionizada ou destilada para remover sais ou bactérias externas, mas água potável ou outras fontes de água podem também ser usadas.

[0078] De acordo com uma outra modalidade preferida, uma composição de esporo compreende cerca de 1% a 10% de um esporo de bactérias mistura contendo sal e um ou mais de Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus amylophilus, Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis var. natto, ou Bacillus toyonensis em forma de esporo; cerca de 0,3% a 1% total de um ou mais ácidos ou sais de ácidos; cerca de 0,2% a 0,5% de um espessante; cerca de 0,1 a 0,3% de cloreto de sódio, cloreto de potássio, ou uma combinação dos mesmos; cerca de 0,00005% a 3,0% de um tensoativo; e 86,2% a 98,4% de água. De acordo com uma outra modalidade preferida, uma composição de esporo compreende cerca de 0,01% a 10% de mistura de esporo de bactérias; cerca de 0,1 a 0,33% de ácido sórbico, seu sal, ou uma combinação dos mesmos; cerca de 0,1 a 0,34% de ácido cítrico, seu sal, ou uma combinação dos mesmos; cerca de 0,1 a 0,33% de ácido benzoico, seu sal, ou uma combinação dos mesmos; cerca de 0,2 a 0,5% de goma xantana; cerca de 0,00005% a 3,0% de um tensoativo; e cerca de 0,1 a 0,3% de cloreto de sódio, cloreto de potássio, ou uma combinação dos mesmos, todas as porcentagens em peso da composição. Ainda de acordo com uma outra modalidade preferida, uma composição de esporo compreende cerca de 5% de esporos de bactérias ou uma mistura de esporo; cerca de 0,25% de espessante; cerca de 0,3% total de um ou mais ácidos ou sais de ácidos; cerca de 0,1% de tensoativo; cerca de 0,2% de cloreto de sódio, cloreto de potássio, ou uma combinação dos mesmos (além de qualquer sal na mistura de esporo); e água. De acordo com uma outra modalidade preferida, os ácidos ou sais de ácidos são um ou mais de sorbato de potássio, benzoato de sódio, e ácido cítrico anidro.

[0079] Diversos exemplos de composições de esporo probiótico de acordo com modalidades preferidas da invenção foram feitos e testados para diferentes parâmetros. Essas composições de esporo são apresentadas na Tabela 4 a seguir. TABELA 4

[0080] O equilíbrio de cada composição de esporo é água (cerca de 1 L nessas amostras). Água deionizada foi usada em cada composição de esporo, exceto a composição de esporo N° 1, que usou água potável. As porcentagens indicadas são em peso. Cada fórmula objetivou um pH entre cerca de 4,0 e 5,5, mas observou-se que algumas fórmulas tinham valores de pH real bem aquém do esperado. A Fórmula N° 1 foi visada ter um pH entre 5,0 e 5,5, mas seu pH real foi cerca de 2,1 a 2,3, que é muito baixo e pode ser prejudicial aos esporos, criar problemas de estabilidade com embalagem, e ser submetido a regulamentos de transporte mais restritivos. A Fórmula N° 1 também exibiu espessamento fraco. A Fórmula N° 2 é a mesma que a do N° 1, exceto que a fonte de água é diferente. A Fórmula N° 2 teve um pH real de cerca de 2,2 a 2,3 e também exibiu espessamento fraco. A quantidade de ácidos e sais de ácidos na Fórmula N° 3 foi diminuída para aumentar o pH e para determinar se o espessante melhorou durante o uso da mesma quantidade de espessante que nos Nos. 1 e 2. Embora a Fórmula N° 3 tenha tido uma melhoria com relação aos Nos. 1 e 2, ela ainda exibiu espessamento fraco e seu pH real foi 6,6, acima da faixa de valor alvo. Ácidos adicionais foram adicionados na Fórmula N° 4 para diminuir o pH e espessante adicional foi adicionado. A Fórmula N° 4 teve espessamento melhorado, mas melhorias adicionais em espessamento seriam benéficas. A quantidade de ácido na Fórmula N° 5 foi substancialmente aumentada, o que resultou em um pH real de cerca de 1,0. A quantidade de ácido na Fórmula N° 6 foi diminuída e o espessante aumentado, o que resultou em uma composição de esporo que ficou muito espessa para pingar. A Fórmula N° 7 aumentou o espessante e quantidade de redutores de atividade de água, mas exibiu problemas com mistura de ácido benzoico e ácido sórbico. O ácido benzoico e ácido sórbico foram removidos na Fórmula N° 8. As Fórmula Nos. 1 a 7 forneceram 2 X 1011 cfu/gm e N° 8 forneceu 1 X 1011 cfu/gm de esporos de bactérias. Dessas fórmulas de amostra, a de N° 8 é a mais preferida uma vez que ela exibiu espessamento adequado e teve um pH real de cerca de 4,5 +/- 0,2, e usou menos mistura de esporo.

[0081] Prefere-se que as composições de esporo de acordo com as modalidades da invenção usem cerca de 0,01% a cerca de 0,3% de mistura de esporo de bactérias e mais preferivelmente entre cerca de 0,03% a 0,1% de mistura de esporo de bactérias. Uma redução na quantidade de mistura de esporo usada reduz substancialmente os custos da composição de esporo. Dependendo da aplicação de uso final, diferentes quantidades de mistura de esporo podem ser usadas nas composições de esporo de acordo com a invenção. Por exemplo, porcentagens menores de mistura de esporo podem ser usadas nas composições de esporo para uso com galinhas, enquanto que maiores porcentagens seriam usadas em composição de esporo para uso com porcos.

[0082] Uma composição de esporo de acordo com a fórmula N° 8 foi testada quanto a validade em várias temperaturas. As amostras da Fórmula N° 8 foram vedadas em um saco plástico, tal como um usado em um sistema de dispensação preferido como descrito a seguir, e armazenadas por dois meses a temperaturas cerca de 4 a 8°CC (39 a 46°F), 30°C (86°F), e 35°C (95°F) para estimular faixa típica de temperaturas nas quais a composição probiótica de esporo pode ser armazenada e usada em ambientes agrícolas. No final do primeiro mês do período de armazenamento, cada amostra foi observada e testada. Todas as três amostras tiveram um pH de cerca de 4,5 e não houve sedimentação, formação de camada ou mudança de aparência em nenhuma das três amostras, indicando que os esporos de bactérias permaneceram suspensos e dispersos por toda a composição de esporo durante o período de armazenamento. Nenhuma das amostras conteve nenhuma contaminação fúngica ou contaminação por bactérias gram-negativas. No momento de contagem zero (quando as amostras foram inicialmente armazenadas), cada amostra conteve esporos de bactérias de cerca de 2,12 X 108 cfu/mL. No final de armazenamento do período de um mês, as amostras continham esporos de bactérias de cerca de 2,09 X 108 cfu/mL de suspensão de esporo (amostra de temperatura mais baixa), 1,99 X 108 cfu/mL (amostra de temperatura média), e 2,15 108 cfu/mL (amostra de temperatura alta). As contagens de bactérias são um pouco variáveis em diferentes amostras, especialmente amostras espessas; entretanto, essas são consideradas contagens comparáveis. Cada amostra foi testada novamente após dois meses em armazenamento. As amostras continham esporos de bactérias de cerca de 2,08 X 108 cfu/ml (amostra de temperatura mais baixa); 2,01 X 108 cfu/ml (amostra de temperatura média); e 2,0 X 108 cfu/ml (amostra de temperatura alta). A validade alvo é cerca de 2 X 108 cfu/ml de suspensão de esporo, de maneira que as amostras ficam dentro da validade alvo após dois meses de armazenamento. Esses resultados de teste demonstraram que as composições de esporo probiótico de acordo com uma modalidade preferida da invenção são estáveis em uma faixa de temperaturas, com os esporos de bactérias permanecendo viáveis, suspensos, e dispersos por toda a composição de esporo. A mistura de esporo (40 a 60% de pó de esporo e 60 a 40% de sal) usada em cada fórmula de amostra foi a mesma, fornecendo pelo menos cerca de 2 X 1011 de esporos/grama. A espécie de esporo na mistura foram múltiplas cepas de Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis. A mistura de pó de esporo foi pré-misturadas com 100 mL de água com agitação por 30 minutos antes de adicionar aos outros ingredientes. Pré-mistura com água ajuda a misturar a mistura de esporo com os outros ingredientes e dispersar os esporos por toda a composição de esporo.

[0083] Embora seja preferido usar composições de esporo probiótico compreendendo uma ou mais espécies de Bacillus de acordo com as composições de esporo da invenção, os métodos da invenção podem ser usados com composições de esporo compreendendo outros gêneros de bactérias e outras espécies. Por exemplo, uma ou mais espécies dos seguintes gêneros: Bacillus, Bacteriodes, Bifidobacterium, Pediococcus, Enterococcus, LactoBacillus, e Propionibacterium (incluindo Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus amylophilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis var. natto, ou Bacillus toyonensis Bacteriodes ruminocola, Bacteriodes ruminocola, Bacterioides suis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium thermophilum, Pediococcus acidilacticii, Pediococcus cerevisiae, Pediococcus pentosaceus, Enterococcus cremoris, Enterococcus diacetylactis, Enterococcus faecium, Enterococcus intermedius, Enterococcus lactis, Enterococcus thermophilus, LactoBacillus delbruekii, LactoBacillus fermentum, LactoBacillus helveticus, LactoBacillus lactis, LactoBacillus plantarum, LactoBacillus reuteri, LactoBacillus brevis, LactoBacillus buchneri, LactoBacillus bulgaricus, LactoBacillus casei, LactoBacillus farciminis, LactoBacillus cellobiosus, LactoBacillus curvatus, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium shermanii) e/ou um ou mais das seguintes espécies: Leuconostoc mesenteroides, Megasphaera elsdennii podem ser usadas com composições e método da invenção.

[0084] Composições de esporo pode também ser em uma forma concentrada, usando menos água com um aumento proporcional nas quantidades de outros ingredientes como descrito anteriormente. Tais composições concentradas de esporo podem ser diluídas no ponto de uso com uma composição de nutriente germinante, água, outros diluentes adequados ou uma combinação dos mesmos antes da germinação. Acima de tudo preferivelmente, todos os ingredientes nas composições de esporo de acordo com a invenção ou usados com métodos da invenção atendem aos padrões da dos EUA federal GRAS.

Métodos de Germinação

[0085] De acordo com uma modalidade preferida, um método para germinar esporos em um ponto de uso de acordo com a invenção compreende fornecer nutrientes e esporos (preferivelmente fornecer uma composição de nutriente germinante e uma composição de esporo ou fornecer uma composição de nutriente esporo de acordo com a invenção, mas outros produtos comercialmente disponíveis contendo esporos e nutrientes, juntos ou separadamente, podem ser usados) e aquecê-los a uma temperatura, ou faixas de temperaturas, elevadas e mantê-las nessa temperatura ou dentro dessa faixa por um período de tempo (período de incubação) para permitir a germinação em uma localização de ponto de uso próximo a um ponto de consumo. O aquecimento durante o período de incubação ocorre em uma única etapa tanto com os nutrientes quanto com esporos juntos. O método também preferivelmente compreende a etapa de dispensar os esporos germinados em uma aplicação em aquacultura como previamente discutido. Preferivelmente, a composição de nutriente germinante e composição de esporo (ou composição de nutriente esporo) são aquecidas a uma temperatura em uma faixa de 35 a 55°C, mais preferivelmente na faixa de 38 a 50°C, e acima de tudo preferivelmente na faixa de 41°C a 44°C. O período de incubação pode variar dependendo da aplicação de uso final. Para uma aplicação de probiótico, onde as espécies aquáticas com um sistema digestivo (por exemplo, peixe ou enguias) ingerirão as bactérias, prefere-se que o período de incubação dure não mais que 10 minutos. Acima de tudo preferivelmente, em uma aplicação de probiótico, o período de incubação é entre 2 a 5 minutos. Dessa maneira, esporos são libados no tanque de crescimento antes dos esporos terem germinado completamente e significam uma melhor mudança de sobrevivência através de trato intestinal das espécies aquáticas onde elas são mais benéficas. Para tratar a água em uma aplicação em aquacultura, tal como pode ser feito com uma aplicação em aquacultura de camarão, o tempo de incubação preferido é pelo menos uma hora para permitir que os esporos germinem completamente antes de descarga na água, mais preferivelmente 4 a 6 horas, para permitir que as bactérias se tornem vegetativas antes de descarregar na água. Acima de tudo preferivelmente, uma composição de nutriente germinante e uma composição de esporo (ou uma composição de nutriente esporo), preferivelmente de acordo com uma modalidade da invenção discutido aqui, são adicionadas a uma incubadora para incubar os esporos nas faixas e durações de temperatura preferidas para produzir uma solução de bactérias tendo bactérias em um estado vegetativo. A incubação pode ser em uma incubadora de ar, uma incubadora de água, ou qualquer outra câmara que forneça calor constante uniforme em dada faixa de temperatura. A solução de bactérias é então descarregada em uma aplicação em aquacultura como previamente discutido. Se uma composição de nutriente germinante concentrada for usada, água diluente é preferivelmente adicionada à incubadora com a composição de nutriente germinante.

[0086] Várias composições de nutriente germinante de acordo com as modalidades preferidas da invenção foram testadas de acordo com métodos preferidos da invenção. As composições, métodos, e resultados são descritos a seguir.

[0087] EXEMPLO 1 - Para germinar esporos, Probiótico FreeFlow LF-88 (fórmula líquida de esporo comercialmente disponível pela NCH Corporation) foi adicionado a 1mL de água potável a uma concentração final de aproximadamente 1 x 109 CFU/mL, onde CFU significa unidade de formação de colônia. Uma composição concentrada de nutriente germinante de acordo com uma modalidade preferida da invenção compreendendo L- alanina (89 g/L), fosfato de monossódio (20 g/L), fosfato de dissódio (60 g/L), e Linguard CP (total 1,6 g/L) foi adicionada à mistura de água e bactérias para fornecer um 4% de concentração final de composição de nutriente germinante em peso total da mistura. Para comparação, reações de controle negativo foram preparadas com a mesma quantidade de Probiótico FreeFlow LF-88 e água, mas sem adição da composição concentrada de nutriente germinante. Ambas as misturas (germinante e controle negativo sem a composição de nutriente germinante) foram misturadas e incubadas por 60 minutos em um bloco de aquecimento pré-incubado ajustado a 42°C ou à temperatura ambiente do local (cerca de 23°C).

[0088] Esporos de cada reação foram observados usando microscopia de contraste de fase. Lâminas foram preparadas usando procedimentos padrões. Os esporos foram observados em um microscópio Olympus BX41 (objetiva como emersão em óleo 100X) e formados em imagem usando uma câmera Olympus UC30 controlada pelo pacote de software cellSens Dimension.

[0089] As imagens foram tomadas e os esporos germinados foram contados como uma porcentagem dos esporos totais no campo. Um total de 10 imagens representativas foram analisadas para cada condição (mistura de teste). Os esporos germinados perderam sua refratividade devido ao influxo de água e são fase escura enquanto esporos não germinados são fase clara.

[0090] A FIG. 7 mostra imagens representativas desses testes. A imagem A representa esporos que foram germinados usando uma composição de nutriente germinante e aquecidos durante o período de incubação a 42°C de acordo com uma composição preferida de esporo e método preferido da invenção. Os pontos mais escuros mostram esporos germinados, os pontos mais claros mostram esporos não germinados. A imagem B representa esporos que foram germinados usando uma composição de nutriente germinante de acordo com uma modalidade preferida da invenção, mas foram incubados à temperatura ambiente (23°C). As imagens C-D representam esporos de controle que não foram tratados com uma composição de nutriente germinante de acordo com a invenção, um tendo sido incubado a 42°C e um incubado à temperatura ambiente (23°C).

[0091] Como pode ser visto na FIG. 7, a imagem “A” mostra esporos significativamente mais germinados (pontos escuros) do que as outras imagens. Esporos incubados com uma composição de nutriente germinante de acordo com uma modalidade preferida invenção em combinação com um método de germinação de acordo com uma modalidade preferida da invenção mostram uma eficiência de germinação aparente de 96,8% (Exemplo 1, Figura 7A). os esporos de controle que foram incubados com uma composição de nutriente germinante de acordo com uma modalidade preferida da invenção, mas sem usar um método de germinação de acordo com uma modalidade preferida da invenção mostraram uma eficiência de germinação aparente de 2,3% (Exemplo 1, Figura 7B). Similarmente, os esporos que não foram incubados com uma composição de nutriente germinante de acordo com a invenção mostraram uma eficiência de ativação aparente de 1,2% e 2,6% a 42°C e 23°C, respectivamente (Exemplo 1, Figuras 7C e 7D). Os esporos germinados nas amostras não tratadas por modalidades preferidas do presente método representam a pequena porcentagem de esporos já germinados na solução de Probiótico FreeFlow LF-88. Esse exemplo demonstra que germinação do esporo é significativamente aumentada quando uma composição de nutriente germinante e método de incubação de acordo com as modalidades preferidas da invenção são usados conjuntamente.

[0092] EXEMPLO 2 - Um outro conjunto de testes de incubação foi corrido usando a mesma mistura de teste/método de incubação (usando a mesma composição de nutriente germinante e incubação aquecida, “Esporos Tratado, 42°C”) e mistura de controle/método de incubação (sem composição de nutriente germinante e sem calor, “Esporos não Tratado, 23°C”) como descrito anteriormente no Exemplo 1 foram repetidos, mas diferentes testes foram corridos para comparar a eficácia da mistura de teste de acordo com as modalidades preferidas da invenção comparada com a mistura de controle. Adicionalmente, duas outras misturas foram testadas - uma na qual a composição de nutriente germinante do Exemplo 1 foi usada, mas sem aquecimento (“Esporos Tratado, 23°C”) e uma na qual nenhum nutriente germinante foi usado, mas os esporos foram aquecidos (“Esporos não Tratado, 42°C”). Resumidamente, os esporos foram incubados a 42°C ou 23°C por 1 hora com ou sem tratamento com uma composição de nutriente germinante preferida. Após incubação, os esporos de 1mL de cada reação foram peletizados a 14K RPM por 3 minutos a 23°C e ressuspensos em 1 mL de tampão de Butterfield. Aproximadamente 6 x 105 CFUs (0,02mL) foram adicionados a 0,980 mL de média mínima de Davis (contendo 3% de glicose como uma fonte de carbono e elementos traços) com um excesso de D- alanina. D-alanina é um inibidor potente de germinação mediada por L- aminoácido.

[0093] Aproximadamente 1,2 x 105 CFUs foram adicionados a cada um dos quatro poços de um PreSens OxoPlate. PreSens OxoPlates uso sensores ópticos de oxigênio para medir fluorescentemente o teor de oxigênio da amostra usando dois pares de filtro (excitação: 540nm, emissão: 650nm e excitação: 540, emissão: 590nm). Controles foram realizados como descrito pelo fabricante e medições foram feitas em uma leitora de placa de fluorescência BioTek 800FLx. Pontos de tempo foram tomados a cada 10 minutos por 24 horas a 37°C com agitação contínua e dados foram processados para determinar a pressão parcial de oxigênio (pO2) usando a seguinte fórmula: pO2 = 100*[(K0/IR)-1(K0/K100)-1]

[0094] Os esporos que foram germinados e continuaram a dividir e crescer como células vegetativas consumem oxigênio como parte de seu crescimento metabólico. O consumo oxigênio é representado por uma queda em pO2. Presumivelmente, o crescimento que é observado é devido à emergência e crescimento vegetativo de esporos germinados pela presente invenção. Os níveis de pO2 para esses testes são mostrados na FIG. 8.

[0095] Como mostrado na FIG. 8, incubação com a mistura e método de teste de acordo com as modalidades preferidas da invenção (Esporos tratados 42°C, usando tanto a composição de nutriente germinante quanto aquecimento) resultou em esporos que começaram crescimento vegetativo 4 horas mais rápido do que a mistura de controle de esporos que não foram tratados ou aquecidos de acordo com as modalidades preferidas da invenção ou foram tanto tratados com uma composição de nutriente germinante quanto aquecidos, mas não ambos conjuntamente. O crescimento visto nos experimentos de controle presumivelmente representa aproximadamente os 2% de esporos germinados presentes em Probiótico FreeFlow LF-88 (vide EXEMPLO 1). Esse exemplo indica adicionalmente que germinação do esporo é significativamente aumentada quando uma composição de nutriente germinante e método de incubação de acordo com as modalidades preferidas da invenção são usados.

[0096] EXEMPLO 3 - Um outro conjunto de testes de incubação foi corrido usando um teste similar e mistura de controle e método de incubação como descrito anteriormente no Exemplo 1. Resumidamente, LF-88 foi adicionado a 10mL de água destilada a uma concentração final de aproximadamente 108 CFU/mL. As amostras foram incubadas em várias temperaturas para mostrar a eficácia do método de teste de acordo com as modalidades preferidas da invenção comparada como a mistura de controle. Reações foram preparadas com a composição de nutriente germinante descrita no Exemplo 1 (“Esporos tratados” na FIG. 9) e incubadas a 23°C (temperatura ambiente, sem aquecimento), 32°C, 42°C, ou 60°C. Uma reação de controle foi incubada à temperatura ambiente local sem composição de nutriente germinante. Após uma hora de incubação, 1mL de cada reação foi peletizado a 14K RPM por 3 minutos a 23°C e ressuspenso em tampão de Butterfield. Aproximadamente 6 x 105 CFUs (0,02mL) foram adicionados a 0,980 mL de média mínima de Davis (contendo 3% de glicose como uma fonte de carbono e elementos traços) com um excesso de D-alanina.

[0097] Aproximadamente 1,2 x 105 CFUs foram adicionados a cada um dos quatro poços de um PreSens OxoPlate. Controles foram realizados como descrito pelo fabricante e medições foram feitas em uma leitora de placa de fluorescência BioTek 800FLx usando dois pares de filtro (excitação: 540nm, emissão: 650nm e excitação: 540, emissão: 590nm). Pontos de tempo foram tomados a cada 10 minutos por 24 horas a 37°C com agitação contínua e dados foram processados para determinar a pressão de oxigênio parcial (pO2). Os níveis de pO2 para esses testes são mostrados na FIG. 9.

[0098] Como mostrado na FIG. 9, incubação usando uma composição de nutriente germinante e aquecimento de acordo com as modalidades preferidas da invenção resultou em esporos que começaram crescimento vegetativo horas antes do controle. Os esporos tratados com a composição de nutriente germinante, mas não aquecidos, são equiparáveis à mistura de controle. Os esporos tratados com a composição de nutriente germinante que foram incubados a uma temperatura abaixo da faixa preferida de faixa de 35 a 55°C de acordo com uma modalidade da invenção (representados pela “curva de Esporos tratados 32°C”) começaram crescimento vegetativo mais rápido do que os experimentos de controle, mas não tão rápido quanto os esporos tratados a temperaturas elevadas dentro das faixas preferidas de acordo com a invenção. Os esporos tratados com uma composição de nutriente germinante e incubados a uma temperatura dentro da faixa mais preferida de 41°C a 44°C de acordo com uma modalidade da invenção mostraram os melhores resultados, sendo os primeiro a começar o crescimento vegetativo e começando o crescimento 4 horas mais rápido do que o controle. Como visto em exemplos anteriores, crescimento visto em o experimento de controle sem tratamento presumivelmente representa aproximadamente os 2% de esporos germinados presentes em Probiótico FreeFlow LF-88 (vide EXEMPLO 1). Esse exemplo indica adicionalmente que germinação do esporo é significativamente aumentada quando uma composição de nutriente germinante e método de incubação de acordo com as modalidades preferidas da invenção são usados.

Estudo de Aquacultura Usando Composição de Nutriente Germinante e Composição de Esporo.

[0099] Um outro estudo foi conduzido para avaliar o uso de composições de nutriente germinante e de esporo preferidas com um método de tratamento de germinação e aquacultura preferido de acordo com a invenção. Três aquários foram usados para esse estudo como aplicações de aquacultura representativas. Cada um conteve 55 galões de água e 25 pitus da Malásia para simular as densidades de estocagem de fazendas de camarão comercial. Cada aquário continha o mesmo tipo de tela e substrato composto de tubo PVC fornecidos para habitação e repouso de camarão. Todos os aquários foram revestidos com areia viva do Caribe para desencorajar crescimento de alga, reduzir nitratos, tamponar o sistema do aquário, e garantir ciclagem segura do aquário. Pedras de aeração foram usadas em todos os três aquários para melhorar filtração biológica e aumentar teor de oxigênio dissolvido para camarão e bactérias benéficas. Todos os três aquários usaram o mesmo de filtro e filtros foram enxaguados, como necessário, e reutilizados. Todos os três aquários foram recarregados com água deionizada (DI) como necessário. Água DI foi usada para controlar teor de mineral da água.

[00100] Quando grandes quantidades de água precisaram ser removidas de um aquário, a mesma quantidade de água foi removida de todos os aquários e substituída com a mesma quantidade de água DI. Carbonato de cálcio foi usado nos aquários 2 e 3 para substituição de água para imitar o uso de um Pó de Tanque, tal como Pó de Tanque ECOChargerTM disponível pela NCH Life Science. Quando água foi substituída nos aquários 2 ou 3, cerca de 0,5 g de carbonato de cálcio foi adicionado à água do tanque. Cerca de 1 mL de uma solução de bactérias incubada ou ativada foi aplicada uma vez diariamente segunda-feira a sexta-feira no aquário 3. O aquário 1 foi o aquário de controle. Resumidamente, 20 μL de uma solução de partida de esporo (contendo cerca de 1010 CFU/mL) foram misturados com 20 μL de uma solução de partida concentrada de nutriente e 960 μL de água para formar uma solução funcional que continha cerca de 2 X 108 CFU/mL de esporos (Tabela 6). A solução de partida de esporo continha cerca de 1010 CFU/mL de esporos de uma mistura de esporo. A mistura de esporo continha 3 cepas de bactérias de Bacillus: 2 cepas foram cada uma cepa da espécie Bacillus licheniformis e a terceira cepa foi uma espécie de Bacillus subtilis. Cerca de 80% da formulação da mistura de esporo foram esporos de Bacillus licheniformis (40% de cada cepa) e 20% dos esporos na formulação de mistura de esporo foram Bacillus subtilis. A composição de esporo também incluiu água, espessante, e sais orgânicos, de acordo com uma modalidade preferida descrita anteriormente.

[00101] A solução funcional combinada (contendo composição de nutriente germinante, composição de esporo, e água) foi incubada a cerca de 42°C por cerca de 1 hora para produzir uma solução de bactérias ativada. Após essa incubação, toda a solução de bactérias ativada (cerca de 1 mL) foi adicionada ao aquário 3. A mistura foi realizada por meio de aeração misturando pedra. A Tabela 5 mostra a composição da formulação de partida de nutriente germinante. A Tabela 6 mostra a composição da solução funcional que foi incubada. Após a mistura da solução de bactérias incubada em 55 galões do aquário 3, a concentração das bactérias foi cerca de 9,6 x 102 CFU/mL e a porcentagem final da composição de nutriente germinante no aquário 3 foi cerca de 9,6 x 10 a 6% em v/v. Os conteúdos de cada aquário após seus respectivos tratamentos que foram aplicados são mostrados na Tabela 7. O experimento continuou por 120 dias. Tabela 5 - Componentes de uma Formulação de Nutriente.

Tabela 6 - Formulação Funcional de Nutriente-esporo.

Tabela 7 - Conteúdos do Aquário (Grupos de Tratamento)

[00102] A Tabela 8 mostra o peso final e medições corpóreas dos grupos de experimento médio bem como desvios padrões. O grupo de controle no aquário 1 teve o menor peso e medições corpóreas de camarão comparados aos grupos de tratamento nos aquários 2 e 3. O aquário 3 teve o maior camarão e teve os melhores resultados em termos de tamanho de camarão comparados aos camarões grandes nos aquários 2 e 1. O peso final médio de camarão no aquário 3 foi 6,48 g. O peso final médio dos camarões grandes no aquário 2 foi 4,87 g em média. O peso final médio dos camarões grandes no aquário 1 (o controle) foi 3,43 g. O comprimento total médio para camarões grandes no aquário 3 foi também o maior a 7,98 cm. O comprimento total médio para camarões grandes no aquário 2 foi 7,41. O comprimento total médio para camarões grandes no aquário 1 (o grupo de controle) foi 6,95. O comprimento médio da cauda de camarões grandes no aquário 3 foi 4,67 cm. O comprimento médio da cauda de camarões grandes no aquário 2 foi 4,26 cm. O comprimento médio da cauda de camarões grandes no aquário 1 (controle) foi o menor a 3,87 cm. Tabela 8 - Efeito de Tratamento no Desempenho de Crescimento.

[00103] A FIG. 10 mostra uma imagem dos três aquários que pode demonstrar a clareza da água em cada grupo pelo pelo final do experimento de 120 dias. Em termos de clareza da água, o aquário 3 foi observado ser mais limpa. O aquário 1, o controle, foi observado ter a maior quantidade de crescimento de alga cobrindo a paredes do aquário comparado aos aquários 2 e 3. O aquário 2 foi observado ter apenas crescimento moderado de alga nas paredes do aquário comparado ao controle e aquário 3.

[00104] Durante o experimento de dia 120, todos os três aquários começaram com pouca a nenhuma alga nos lados dos aquários. À medida que o experimento progrediu, o aquário de controle (aquário 1) acumulou mais crescimento de alga nos lados do aquário (vide, por exemplo, FIG. 10). O aquário 2 teve menos crescimento de alga do que o aquário 1. O aquário 3 teve pouca a nenhum crescimento de alga comparado aos aquários 1 e 2.

[00105] Os parâmetros de água foram consistentes por todo o experimento. Os níveis de amônia foram zero para todos os três aquários. Nitrito/nitrato foram também dentro de faixas de segurança enquanto durou do experimento. O pH também ficou dentro das faixas normais de cerca de 7,5 a 8,5 para todos os aquários. Não houve picos de parâmetro de água observados que poderiam ter prejudicado os camarões grandes já que a ciclagem do aquário ocorreu seguramente e os parâmetros ficaram consistentes para o comprimento total do experimento do dia 120.

[00106] Os técnicos no assunto também perceberão mediante leitura dessa especificação e da descrição de modalidades preferidas aqui que modificações e alterações nos métodos e composições de nutriente germinante e de esporo podem ser feitas no escopo da invenção, e pretende-se que o escopo da invenção descrito aqui seja limitado apenas pela interpretação mais ampla das reivindicações anexas nas quais os inventores são legalmente intitulados.

Claims

1. Método para adicionar bactérias a água usada em uma aplicação em aquacultura, o método caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer uma composição de nutriente esporo compreendendo uma composição de nutriente germinante e esporos de bactérias; aquecer a composição de nutriente esporo a uma temperatura em uma faixa de 38°C a 60°C em ou próximo a um local da aplicação em aquacultura; manter a temperatura na faixa por um período de incubação de 2 minutos a 6 horas para formar uma batelada de solução de bactérias germinadas; repetir periodicamente as etapas de aquecimento e manutenção para formar bateladas adicionais de solução de bactérias germinadas no curso de um ciclo de tratamento; dispersar cada batelada de solução de bactérias germinadas na água usada na aplicação em aquacultura; fornecer um agente de intensificação de nitrificação que aumentam a alcalinidade da água ou fornecem uma superfície para bactérias nitrificantes crescerem ou ambos; dispersar o agente de intensificação de nitrificação na água simultaneamente a uma das bateladas de solução de bactérias germinadas; em que as bactérias são úteis para remediar a água pela degradação de resíduo orgânico e inibição do crescimento de bactérias patogênicas ou as bactérias são probióticas para uma espécie na aplicação em aquacultura; e em que a composição de nutriente germinante compreende: (1) um L-aminoácido; (2) um ou mais tampões compreendendo um tampão de fosfato, HEPES, base Tris, ou uma combinação dos mesmos; e (3) um conservante industrial.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os esporos de bactérias são selecionadas dos gêneros de Bacillus, e em que a composição de nutriente esporo compreende adicionalmente bactérias selecionadas do grupo que consiste de Bacteriodes, Bifidobacterium, Lueconostoc, Pediococcus, Enterococcus, LactoBacillus, Megasphaera, Pseudomonas e Propionibacterium.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os esporos de bactérias são uma ou mais espécies de Bacillus licheniformis e Bacillus subtilis.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição de nutriente germinante compreende adicionalmente: D-glicose, ou D-frutose, ou tanto D-glicose quanto D-frutose; e uma fonte de íons de potássio.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é L-alanina, L-asparagina L- valina L-cisteína um hidrolisato de proteína de soja, ou uma combinação dos mesmos; em que a composição de nutriente germinante compreende cerca de 17,8g/L a 89 g/L total de um ou mais L-aminoácidos; e em que o tampão de fosfato compreende cerca de 10 a 36 g/L de fosfato de monossódio e cerca de 30 a 90 g/L de fosfato de dissódio.

6. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 4, caracterizado pelo fato de que a composição de nutriente esporo compreende adicionalmente um inibidor de germinação e os esporos de bactérias compreendem uma espécie Bacillus; e em que o inibidor de germinação compreende cloreto de sódio, D-alanina, ou uma combinação dos mesmos.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o inibidor de germinação compreende 29 g/L a 117 g/L de cloreto de sódio e 8 g/L a 116 g/L de D-alanina.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de fornecer compreende fornecer a composição de nutriente germinante e os esporos de bactérias separadamente e misturar a composição de nutriente germinante e os esporos de bactérias conjuntamente para formar a composição de nutriente esporo e em que a composição de nutriente germinante é um líquido concentrado compreendendo: 8,9 a 133,5 g/L de um ou mais L-aminoácidos; 0,8 a 3,3 g/L total de um ou mais conservantes industriais; 40 a 126 g/L total de um ou mais tampões de fosfato, 15 a 61 g/L de base Tris, ou 32,5 a 97,5g/L de HEPES, ou uma combinação dos mesmos.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: diluir à composição de nutriente germinante antes ou durante a etapa de mistura.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que uma concentração da composição de nutriente germinante após a etapa de diluição é 0,1% a 10% do líquido concentrado.

11. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a composição de nutriente germinante compreende adicionalmente: 18 a 54 g/L de D-glicose, D-frutose, ou uma combinação dos mesmos; 7,4 a 22,2 g/L de KCl; ou ambos.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente de intensificação de nitrificação é carbonato de cálcio, alga marinha calcificada, ou ambos na forma de glóbulos, pelotas ou partículas e em que o agente de intensificação de nitrificação é disperso na água simultaneamente a uma batelada de solução de bactérias germinadas em uma base sazonal.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente fornecer e dispersar partículas ou fragmentos de plástico ou metal na água simultaneamente a uma batelada da solução de bactérias para fornecer área superficial adicional para bactérias nitrificantes crescerem.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o período de incubação é 2 minutos a 5 minutos e em que os esporos de bactérias são selecionados do grupo consistindo em Bacillus amylophilus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, e Bacillus subtilis; e em que a aplicação em aquacultura é um tanque de crescimento contendo peixe ou enguia.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o período de incubação é 4 a 6 horas.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a aplicação em aquacultura é um tanque de crescimento contendo camarão.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, 3 ou 8, caracterizado pelo fato de que os esporos de bactérias compreendem uma ou mais espécies de Bacillus licheniformis e Bacillus subtilis.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que os esporos de bactérias compreendem duas cepas de Bacillus licheniformis e uma cepa de Bacillus subtilis.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a temperatura é na faixa de 38°C a 50°C.

20. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os esporos de bactérias são em uma composição de esporo separada compreendendo: (1) uma ou mais espécies de Bacillus em forma de esporo, (2) 0,002 a 5,0% em peso de espessante, (3) 0,01 a 2,0% em peso total de um ou mais ácidos ou sais de ácidos, em que as porcentagens são em peso da composição de esporo.

21. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que os esporos de bactérias são em uma composição de esporo compreendendo: uma ou mais espécies de Bacillus em forma de esporo; um ou mais ácidos ou sais de ácidos; e um espessante; e em que a etapa de fornecer compreende fornecer a composição de nutriente germinante e a composição de esporo separadamente e misturar a composição de nutriente germinante e a composição de esporo conjuntamente para formar a composição de nutriente esporo.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que umas ou mais espécies de Bacillus na forma de esporo compreendem um ou mais de: Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus amylophilus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus clausii, Bacillus firmus, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis var. natto, ou Bacillus toyonensis.

23. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a composição de esporo tem um pH de 4,5 a 5,5 antes da mistura com a composição de nutriente germinante e em que os ácidos ou sais de ácidos são um ou mais de ácido acético, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido propiônico, propionato de sódio, propionato de cálcio, ácido fórmico, formato de sódio, ácido benzoico, benzoato de sódio, ácido sórbico, sorbato de potássio, ou sorbato de cálcio.

24. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a composição de esporo compreende: 0,002 a 5,0% em peso de espessante; 0,01 a 2,0% em peso total de um ou mais ácidos ou sais de ácidos; e 0,00005 a 3,0% em peso de um tensoativo; em que as porcentagens são em peso da composição de esporo.