CN102220266B - 一种枯草芽孢杆菌培养制剂生产方法及其开放式发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌培养制剂生产方法及其开放式发酵方法。该生产方法包括以下步骤：种子培养基的制备、种子培养基的发酵、液体发酵培养基的制备、菌种的液体发酵、枯草芽孢杆菌制剂中培养基成分的配置及灭菌、枯草芽孢杆菌培养制剂的生产。本发明根据菌株的特性，将枯草芽孢杆菌菌种与培养基成分混合制成枯草芽孢杆菌培养制剂，采用无需灭菌、接种和密闭培养条件的开放式液体培养方法进行小规模枯草芽孢杆菌的发酵培养，不仅方便枯草芽孢杆菌制剂用户的使用，更能大幅降低单位活菌数的生产成本，促进我国枯草芽孢杆菌微生态制剂在饲料和水产行业的使用，加速我国发酵床养殖技术的推广。

Description

一种枯草芽孢杆菌培养制剂生产方法及其开放式发酵方法

技术领域

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌培养制剂生产方法及其开放式发酵方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种严格好氧的革兰氏阳性菌，生命力极强，代谢旺盛，枯草芽孢杆菌在成熟期以孢子状态存在，具有极强的抗逆能力，是我国农业部列为安全使用的两种芽孢杆菌之一。

枯草芽孢杆菌具有促进动物营养的消化吸收；颉颃致病微生物，调节消化道健康；刺激动物免疫器官生长发育，提高机体免疫力等作用，所以，该菌在动物饲养和饲料工业应用广泛。除上述作用外，枯草芽孢杆菌还能通过代谢产生性能良好的微生物絮凝剂；以细胞壁吸附、富集水中的重金属离子；消耗水中氨氮，亚硝酸盐和硫化物，减轻水体富营养程度；以及分解水中的大分子有机质为光合细菌、藻类以及其他浮游生物提供营养。因此，该菌用于水产养殖时，还表现出对水质的净化作用。此外，枯草芽孢杆菌还是生物发酵床技术的主要作用菌株。因此，由枯草芽孢杆菌为主制成的微生态制剂，在畜牧业和水产养殖业中有广泛的应用发展前景。

目前，枯草芽孢杆菌的工业化生产常用液体发酵法。因为该菌为严格好氧菌，在液体缺氧环境下，很短时间内就会全部死亡，所以为方便运输使用，必须将该菌培养至抗逆性强的孢子状态，菌体与辅料混合干燥后制成微生态制剂产品。这一过程中微生态制剂产品的活菌含量大幅降低，提高了单位菌数的生产成本和销售价格；同时，枯草芽孢杆菌的孢子需要萌发后才能发挥生理作用，使用效果也不如活菌制剂。而实际上，无论饲料生产、水产养殖还是发酵垫料用户，在使用枯草芽孢杆菌时，希望使用活菌数高的新鲜菌剂，单位活菌数的价格越低越好。这一需求的最佳解决方案就是直接发酵培养，经过12-24小时培养，接种的枯草芽孢杆菌数量可提高数万至数亿倍。但枯草芽孢杆菌的液体发酵过程需要灭菌、接种和通气密闭发酵过程，枯草芽孢杆菌制剂的用户通常都不具备上述仪器和生产能力。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌培养制剂生产方法及其开放式发酵方法。本发明根据菌株的特性，将枯草芽孢杆菌菌种与培养基成分混合制成枯草芽孢杆菌培养制剂；然后将采用开放式液体培养方法进行小规模枯草芽孢杆菌的发酵培养，无需灭菌、接种和密闭培养条件，不仅方便枯草芽孢杆菌制剂用户的使用，更能大幅降低单位活菌数的生产成本，促进我国枯草芽孢杆菌微生态制剂在饲料和水产行业的使用，加速我国发酵床养殖技术的推广。该方法操作方便、无需严格的生产环境和昂贵的发酵设备，顺应枯草芽孢杆菌制剂的市场需求，具有广阔的发展前景。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案：一种枯草芽孢杆菌培养制剂生产方法，其特征是，包括下述步骤：

a枯草芽孢杆菌种子培养基的制备：以三角瓶盛装不高于总容量20％的适于细菌生长的培养基(如LB培养基：酵母粉5g，蛋白胨粉10g，氯化钠10g，加水定容至1000ml，以NaOH溶液调节至pH7.2)，121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温；

b枯草芽孢杆菌种子培养基的发酵：将斜面保存的枯草芽孢杆菌菌种，接种至所述步骤a制备的枯草芽孢杆菌种子培养基中，37℃150rpm摇床振荡培养8-12小时，制成大罐发酵菌种；

c枯草芽孢杆菌液体发酵培养基的制备：发酵罐空消后，加入不高于总容积70％的枯草芽孢杆菌液体发酵培养基(一切适用于枯草芽孢杆菌生长的培养基，如LB培养基或以葡萄糖、玉米粉、豆粕粉和无机盐类为主要成分的培养基)，121℃实消灭菌30min以上，冷却至室温；

d枯草芽孢杆菌菌种的液体发酵：将步骤b中发酵完成的大罐发酵菌种接种至步骤c中制备的枯草芽孢杆菌液体发酵培养基中，接种量为枯草芽孢杆菌液体发酵培养基体积的0.05％-0.15％；发酵罐中37℃发酵24小时，发酵过程中保持通气比≥2，搅拌转数为150rpm，溶氧相对值不低于20，以NaOH溶液调节培养基至pH7.0-8.0，罐压在0.04-0.06Mpa；发酵完成后的枯草芽孢杆菌发酵液即为制备好的枯草芽孢杆菌制剂中的枯草芽孢杆菌菌种；液体培养物应尽快使用，短暂储存时必须保持鼓风通气状态，以降低菌体死亡比例；

e枯草芽孢杆菌菌种干粉的生产：为加工存储方便，也可将步骤d中发酵完成的枯草芽孢杆菌发酵液加入麦芽糊精或其他辅料以喷雾干燥的方法制成菌种干粉；

f枯草芽孢杆菌制剂中培养基成分的配置：包括任何可以用于枯草芽孢杆菌培养的培养基组成，如LB培养基(按质量百分数酵母粉20％、蛋白胨40％、氯化钠40％)，或玉米豆粕无机盐培养基(按质量百分数，玉米52％、豆粕40％、硫酸锰0.05％、硫酸镁1.25％、氯化钠1％，磷酸二氢钠1％、磷酸氢二钠4.7％)，于粉碎搅拌机中粉碎为120目以上的粉状颗粒并搅拌均匀后装袋；

g枯草芽孢杆菌培养制剂中培养基成分的灭菌：采用高压蒸汽灭菌法(121℃高压蒸汽灭菌30分钟以上，冷却干燥，使培养基成分降至室温，含水量降低至12％以下，待用)或者Co60辐照灭菌法(以15-25Gy的剂量Co60辐照灭菌)对所述步骤f中的培养基进行灭菌后待用；

h枯草芽孢杆菌培养制剂混合包装产品的生产：将步骤d中的枯草芽孢杆菌发酵液与步骤g中灭菌后的培养基成分，按照8∶92的质量比混合，控制含水量＜15％，然后，分装为枯草芽孢杆菌培养制剂的真空包装产品，保质期4-9月为3个月，10-3月为6个月；

i将步骤e中的菌种干粉与步骤g中灭菌后的培养基，按照1∶99的质量比混合，控制含水量＜8％，然后分装为枯草芽孢杆菌培养制剂的真空包装产品，保质期可达1年以上。

枯草芽孢杆菌培养制剂开放式发酵方法：开放式培养器消毒后，加入总容积60-70％的自来水并保持鼓风通气状态，倒入自来水重量5％的枯草芽孢杆菌培养制剂搅拌均匀，加热至发酵液沸腾后，根据培养基泡沫情况，向培养器中加入体积为发酵液体积的0.05-0.25％的消泡剂；然后快速冷却至65℃，并于60-65℃通气培养18-24h，即达到微生态菌剂使用标准。培养结束后，活菌浓度达到50-100亿/ml，且培养物中无大肠杆菌和沙门氏菌等致病菌污染。

所述培养结束后的发酵产物用作动物饲料微生态添加剂时，添加剂量为5L/吨；用于发酵垫料时，添加量为500ml/m³或者垫料干重的0.1-0.5％；用于水产养殖时每7-10天使用一次，池塘成品养殖净水每亩每次添加1-5L，工厂化高密度养殖添加量为每立方水体每次添加10-20ml。

综上，本发明首创了一种枯草芽孢杆菌培养制剂生产方法及其开放式发酵方法。通过实验研究，提出了枯草芽孢杆菌开放式培养制剂的生产和使用技术，为降低发酵垫料、动物饲料微生态和水产养殖等方面对低成本、高活性枯草芽孢杆菌菌剂的需求提供了一种操作方法。

该方法操作简单方便，培养设备要求低，采用该方法能够有效降低枯草芽孢杆菌单位活菌数的生产和使用成本，并且培养物大肠杆菌和沙门氏菌等致病菌污染，其有益效果主要包括以下四点：

1、将菌种与培养基混合制成枯草芽孢杆菌培养制剂，使用该制剂培养枯草芽孢杆菌操作简便无需菌种培养和接种操作，而且对培养设备要求低，一般使用发酵垫料的养殖户、饲料厂和水产养殖户都能满足要求，顺利使用；

2、采用含菌培养基液体发酵的方法，将枯草芽孢杆菌培养制剂中的活菌数量提高数万甚至上亿倍，极大的降低了单位活菌数的生产和使用成本；

3、以在用户处就地培养的方法，在发酵结束后立即使用，最大限度的保留了枯草芽孢杆菌的活性，降低了枯草菌制剂由于加工、运输和存储导致的活性降低；

4、利用枯草芽孢杆菌生长代谢旺盛，孢子能耐受100℃高温和在较高温度下快速增殖的特性，先与培养基快速煮沸，然后在60-65℃下培养，培养物无大肠杆菌或沙门氏菌等致病菌的污染。

附图说明

图1为本发明的生产及使用流程图。

具体实施方式

下面结合具体事例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将随着描述更加清晰。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的技术细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实例1：液体菌种与玉米豆粕型培养基混合生产枯草芽孢杆菌培养制剂

1.1枯草芽孢杆菌培养制剂中菌种发酵液的制作：

1.1.1枯草芽孢杆菌种子培养基的制备：以1000ml三角瓶盛装200ml LB培养基(酵母粉1g，蛋白胨粉2g，氯化钠2g，加水补足至200ml，pH7.2)，121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温；

1.1.2枯草芽孢杆菌种子培养基的发酵：将斜面保存的枯草芽孢杆菌菌种，接种至所述步骤1.1.1中制备的枯草芽孢杆菌种子培养基中，37℃150rpm摇床振荡培养12小时；

1.1.3枯草芽孢杆菌液体发酵培养基的制备：250L发酵罐空消后，加入160L枯草芽孢杆菌液体发酵培养基(酵母粉1kg，蛋白胨粉1.6kg，氯化钠1.6kg，加水补足至160L，pH7.2)，121℃实消灭菌30min以上，冷却至室温；

1.1.4枯草芽孢杆菌培养制剂中发酵菌种制备：将步骤1.1.2中发酵完成的枯草芽孢杆菌种子培养基全部接种至步骤1.1.3中制备的枯草芽孢杆菌液体发酵培养基中，37℃培养24小时，发酵过程中，保持通气比在2以上，搅拌转数为150rpm，溶氧相对值不低于20，以NaOH溶液调节培养基pH7.2，罐压在0.04-0.06MPa之间，发酵完成后即制备好枯草芽孢杆菌制剂中的菌种成分，液体培养物必须保持鼓风通气状态并尽快使用，以降低菌体死亡比例；

1.2高压蒸汽灭菌法制作培养菌剂中的玉米豆粕型培养基成分：

1.2.1玉米豆粕型培养基的配置：分别称取玉米粉260kg、豆粕200kg、硫酸锰250g、硫酸镁6.25kg、氯化钠5kg，磷酸二氢钠5kg、磷酸氢二钠23.5kg，充分搅拌均匀，并粉碎为120目-200目，配置成500kg的玉米豆粕型培养基；

1.2.2枯草芽孢杆菌培养制剂中培养基成分的灭菌：所述步骤1.2.1中的培养基121℃高压灭菌30分钟以上，冷却至室温，干燥至含水量＜12％，待用；

1.3枯草芽孢杆菌培养制剂的生产：将发酵完成的新鲜菌种与灭菌后的培养基成分，按照8∶92的质量比混合，分装为1kg/包，即制成开放式枯草芽孢杆菌培养制剂。质保期，4-9月为3个月，10-3月为6个月；

此方法无需液体菌种的干燥过程，工艺简单，生产设备要求低，但培养制剂含水量略高，保质期相对较短。

实例2：LB培养基与菌种干粉混合生产枯草芽孢杆菌培养制剂

2.1枯草芽孢杆菌培养制剂中菌种粉的制作：

2.1.1枯草芽孢杆菌种子培养基的制备：以1000ml三角瓶盛装200ml LB培养基(酵母粉1g，蛋白胨粉2g，氯化钠2g，加水补足至200ml，pH7.2)，121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温；

2.1.2枯草芽孢杆菌种子培养基的发酵：将斜面保存的枯草芽孢杆菌菌种，接种至所述步骤a中制备的枯草芽孢杆菌种子培养基中，37℃150rpm摇床振荡培养12小时；

2.1.3枯草芽孢杆菌液体发酵培养基的制备：200L发酵罐空消后，加入130L枯草芽孢杆菌液体发酵培养基(酵母粉0.7kg，蛋白胨粉1.5kg，氯化钠1.3kg，加水补足至130L，pH7.2)，121℃实消灭菌30min以上，冷却至室温；

2.1.4枯草芽孢杆菌培养制剂中发酵菌液的制备：将步骤2.1.2中发酵完成的枯草芽孢杆菌种子培养基全部接种至步骤2.1.3中制备的枯草芽孢杆菌液体发酵培养基中，37℃培养24小时，发酵过程中，保持通气比在2以上，搅拌转数为150rpm，溶氧相对值不低于20，以NaOH溶液调节培养基酸碱度至pH7.2，罐压在0.04-0.06MPa之间；

2.1.5发酵菌液的喷雾干燥：2.1.4中发酵完成的枯草芽孢杆菌菌液，加入枯草芽孢杆菌菌液重量10％的麦芽糊精搅拌均匀后，立即进行喷雾干燥，条件为：发酵液温度65℃，进口温度为170℃，出口温度为85℃，喷雾压力15MPa，喷嘴直径1.0mm，将发酵菌种制成干粉；

2.2Co60辐照法制作培养菌剂中LB培养基成分：

2.2.1LB发酵培养基干粉的配置：分别称取蛋白栋200kg、酵母粉100kg、氯化钠200kg，充分搅拌均匀，并粉碎为120目-200目，配置成500kg的LB培养基干粉；

2.2.2LB培养基干粉的辐照灭菌：所述2.2.1中配置好的的培养基以15-25Gy的剂量Co60辐照灭菌；

2.3枯草芽孢杆菌培养制剂的生产：将2.1.5中制备的发酵菌粉与2.2.2中辐照灭菌的LB培养基成分，按照1∶99的比例混合，分装为1kg/包，即制成粉状枯草芽孢杆菌培养制剂。质保期12个月；

该方法需要喷雾干燥设备，但生产的枯草芽孢杆菌培养制剂含水量低，保质期长达一年以上。

实例3：在简易培养器中以枯草芽孢杆菌培养制剂进行开放式发酵：

3.1培养器的消毒。开放式发酵采用具有加热和控温功能的开放式培养器，发酵前以二氧化氯消毒剂对开放式发酵器进行消毒，然后将发酵器冲洗干净。

3.2培养制剂的稀释配置。向30L培养器中加入20L的自来水，以通气泵向水中鼓风，加入1kg枯草芽孢杆菌培养制剂搅拌均匀，加热至培养基沸腾后尽快使培养液冷却至65℃，并根据培养基泡沫情况，向培养器中加入30-50ml消泡剂；

3.3枯草芽孢杆菌的开放式发酵。将配置好的培养制剂在60-65℃通气培养18h，活菌浓度达到50-100亿/ml时，即达到微生态菌剂使用标准。此时，培养物中无大肠杆菌和沙门氏菌等致病菌污染；

实例4：无特定设备情况下，枯草芽孢杆菌培养制剂的开放式发酵：

4.1培养器的消毒：以二氧化氯消毒剂对容积为50L的不锈钢桶进行消毒，然后冲洗干净。

4.2培养制剂的配置和煮沸：向不锈钢桶中加入30L的自来水，以导管连接小型鼓风机向水中鼓风，加入1.5kg枯草芽孢杆菌培养制剂搅拌均匀，将不锈钢桶转移至火炉上加热至沸腾，关火使培养液冷却至65℃，并加入50ml消泡剂；

4.3枯草芽孢杆菌的开放式发酵：间歇加热，使培养制剂保持在60-65℃下通气培养18h，活菌浓度达到50-100亿/ml时，即可使用。此时，培养物中无大肠杆菌和沙门氏菌等致病菌污染；

实例5：枯草芽孢杆菌开放式发酵产物的使用：

5.1用作动物饲料微生态添加剂：在配置鸡、鸭、猪等动物的全价饲料时，每吨饲料同时添加5L新鲜发酵完成的枯草芽孢杆菌培养物，即可起到促进动物营养的消化吸收、调节消化道健康和提高动物机体免疫力等作用；

5.2用作发酵垫料接种剂：将5L新鲜发酵完成的枯草芽孢杆菌培养物与950L水混合，然后加入430kg锯末+430kg稻壳+140kg猪或鸡的粪便中充分搅拌均匀，堆积成1.2米高的料堆发酵，使堆料中心的温度在65℃以上保持7天，之后即可用作猪鸡舍内发酵垫料；

5.3用于水产养殖时，池塘成品养殖净水为每亩3L，工厂化高密度养殖添加量为每立方水体15ml，均为每7天使用一次，并同时配合使用增氧泵。可起到消耗水中氨氮、亚硝酸盐和硫化物，减轻水体富营养程度，净化水质，以及分解水中的大分子有机质为光合细菌、藻类以及其他浮游生物提供营养的作用。

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌培养制剂生产方法，其特征是，包括下述步骤：

a枯草芽孢杆菌种子培养基的制备：以三角瓶盛装不高于总容量20%的适于细菌生长的培养基，121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温；

b枯草芽孢杆菌种子培养基的发酵：将斜面保存的枯草芽孢杆菌菌种，接种至所述步骤a制备的枯草芽孢杆菌种子培养基中，37℃ 150rpm摇床振荡培养8-12小时，制成大罐发酵菌种；

c枯草芽孢杆菌液体发酵培养基的制备：发酵罐空消后，加入不高于总容积70%的枯草芽孢杆菌液体发酵培养基，121℃实消灭菌30min以上，冷却至室温；

d枯草芽孢杆菌菌种的液体发酵：将步骤b中发酵完成的大罐发酵菌种接种至步骤c中制备的枯草芽孢杆菌液体发酵培养基中，接种量为枯草芽孢杆菌液体发酵培养基体积的0.05%-0.15%；发酵罐中37℃发酵24小时；发酵完成后的枯草芽孢杆菌发酵液即为制备好的枯草芽孢杆菌制剂中的枯草芽孢杆菌菌种；或者将发酵完成的枯草芽孢杆菌发酵液加入辅料以喷雾干燥的方法制成菌种干粉；

e枯草芽孢杆菌制剂中培养基成分的配置：配置用于枯草芽孢杆菌培养的培养基，于粉碎搅拌机中粉碎为120目以上的粉状颗粒并搅拌均匀后装袋；

f枯草芽孢杆菌培养制剂中培养基成分的灭菌：采用高压蒸汽灭菌法或者Co60辐照灭菌法对所述步骤e中的培养基进行灭菌后待用；

g枯草芽孢杆菌培养制剂混合包装产品的生产：将步骤d中的枯草芽孢杆菌发酵液与步骤f中灭菌后的培养基，按照8：92的质量比混合，控制含水量<15%，然后分装为枯草芽孢杆菌培养制剂的真空包装产品；或者将步骤d中的菌种干粉与步骤f中灭菌后的培养基，按照1:99的质量比混合，控制含水量<8%，然后分装为枯草芽孢杆菌培养制剂的真空包装产品；

所述步骤a适于细菌生长的培养基为LB培养基，所述LB培养基为：酵母粉5g，蛋白胨粉10g，氯化钠10g，加水定容至1000ml，以NaOH溶液调节至pH7.2；

所述步骤d发酵过程中保持通气比≧2，搅拌转数为150rpm，溶氧相对值不低于20，以NaOH溶液调节培养基至pH7.0-8.0，罐压在0.04-0.06Mpa；

所述步骤e用于枯草芽孢杆菌培养的培养基为玉米豆粕无机盐培养基；所述玉米豆粕无机盐培养基组成为：按质量百分数玉米52%、豆粕40%、硫酸锰0.05%、硫酸镁1.25%、氯化钠1%，磷酸二氢钠1%、磷酸氢二钠4.7%。

2.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌培养制剂生产方法，其特征是，所述步骤f高压蒸汽灭菌法为：121℃高压蒸汽灭菌30分钟以上，冷却干燥，使培养基成分降至室温，含水量降低至12%以下，待用；所述Co60辐照灭菌法为以15-25Gy的剂量Co60辐照灭菌。

3.权利要求1或2制备的枯草芽孢杆菌培养制剂的开放式发酵方法，其特征是，开放式培养器消毒后，加入总容积60-70%的自来水并保持鼓风通气状态，倒入自来水重量5%的枯草芽孢杆菌培养制剂搅拌均匀，加热至发酵液沸腾后，向培养器中加入体积为发酵液体积0.05-0.25%的消泡剂；然后冷却至65℃，并于60-65℃通气培养18-24h，得到枯草芽孢杆菌开放式液体发酵制剂。

4.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌培养制剂的开放式发酵方法，其特征是，其特征是，所述枯草芽孢杆菌开放式液体发酵制剂用于动物饲料、发酵垫料或用于水产养殖。

5.如权利要求4所述的枯草芽孢杆菌培养制剂的开放式发酵方法，其特征是，所述枯草芽孢杆菌开放式液体发酵制剂用于动物饲料作为微生态添加剂，添加剂量为5L/吨。

6.如权利要求4所述的枯草芽孢杆菌培养制剂的开放式发酵方法，其特征是，所述枯草芽孢杆菌开放式液体发酵制剂用于发酵垫料，添加量为500ml/m³或者发酵垫料干重的0.1-0.5%。

7.如权利要求4所述的枯草芽孢杆菌培养制剂的开放式发酵方法，其特征是，所述枯草芽孢杆菌开放式液体发酵制剂用于水产养殖，每7-10天使用一次，池塘成品养殖净水每亩每次添加1-5L，工厂化高密度养殖添加量为每立方水体每次添加10-20ml。