CN101558763B - 枯草芽孢杆菌制剂的制作方法 - Google Patents
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Abstract
枯草芽孢杆菌制剂的制作方法，它涉及一种微生物制剂的制作方法。本发明的方法解决了现有的枯草芽孢杆菌制剂的制作方法存在的制作成本高及制作得到的有效成分含量低、保存期短的问题。方法：一、枯草芽孢杆菌B10经发酵后得到发酵液；二、发酵液经超滤膜分离得到抗生素溶液和芽孢溶液；三、抗生素溶液经超滤膜过滤得抗生素透过液；四、抗生素透过液再经纳滤膜过滤得抗生素浓缩液；五、将抗生素浓缩液和步骤二中的芽孢溶液混合经喷雾干燥制成粉末，即制作得到枯草芽孢杆菌制剂。本发明的制作方法成本低，制作得到的产品质量好，保质期长，密封条件下可保存2年以上不变质。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物制剂的制作方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌制剂为活菌类广谱刹虫剂，其主要成分为抗生素和枯草芽孢杆菌的芽孢，是一种新型的生物环保农药，对水稻稻瘟病、马铃薯晚疫病、棉花黄枯萎病、蔬菜灰霉病、蔬菜白粉病、小麦白粉病等有优异防效。枯草芽孢杆菌制剂是国内外发展绿色食品、无公害农产品、保护环境安全的生物农药，其市场前景非常好，目前已经在广东、云南、山东、四川、河北、浙江、湖北、湖南、江西等地农田广泛使用。现在多采用2007年《果树学报》上赵妍发表的一篇名为《枯草芽孢杆菌(Bacillus subtils)B10对采后草莓果实病害的抑制效果》中所述的枯草芽孢杆菌B10来制作枯草芽孢杆菌制剂，传统的方法为：将枯草芽孢杆菌B10发酵培养后，其发酵液经过板框过滤，过滤后的滤液在经过流化床干燥，再经过粉碎即制得枯草芽孢杆菌制剂。但是该方法还存在以下问题：1、由于板框过滤不能有效的去除可溶性蛋白、糖类、色素等杂质，制作得到的枯草芽孢杆菌制剂产品的中的有效成分含量较低，该方法制作得到的枯草芽孢杆菌制剂中的芽孢数仅为800亿/克，抗生素在芽孢杆菌制剂产品中的质量百分比仅为0.05％左右；2、在板框过滤操作时需要加入助滤剂以提高滤速，且板框过滤需要大量的人力进行操作，该法的成本高；3、由于该法对发酵液中糖类的去除率低，使制作得到的枯草芽孢杆菌制剂产品极易吸潮，产品的保存期短。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的枯草芽孢杆菌制剂的制作方法存在的制作成本高及制作得到的有效成分含量低、保存期短的问题，而提供了一种枯草芽孢杆菌制剂的制作方法。
本发明枯草芽孢杆菌制剂按照以下步骤进行：一、枯草芽孢杆菌B10经发酵后得到发酵液；二、将发酵液通过截流分子量为30000～100000k的超滤膜过滤分离，操作压力为3～6bar，温度20～45℃，膜通量为55～65LMH，通过超滤膜的溶液为抗生素溶液，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为5～7倍，水的洗涤用量为发酵液体积的20％～40％；三、将步骤二中的抗生素溶液通过截流分子量为3000～10000k的超滤膜过滤得到抗生素透过液，操作压力为10～26bar，温度为20～45℃，膜通量为45～55LMH，浓缩倍数为7～10倍，其中通过超滤膜的溶液为抗生素透过液；四、将步骤三中的抗生素透过液通过截流分子量为400～600k的纳滤膜过滤得到抗生素浓缩液，操作压力为15～30bar，温度为20～45℃，膜通量为35～45LMH，浓缩倍数为10～15倍，其中被截留在膜的进液侧的溶液为抗生素浓缩液；五、将步骤四中抗生素浓缩液和步骤二中的芽孢溶液混合均匀，再进行喷雾干燥制成粉末即制作得到枯草芽孢杆菌制剂，喷雾干燥的进口温度为190～210℃，出口温度为80～100℃。
本发明的方法中的膜过滤的方法自动化程度高，操作简单，减少了人力成本，且不需要使用过滤剂进行过滤，本发明的制作方法成本低；本发明中膜过滤的方法与现有的板框过滤相比较，本发明的方法有效的去除掉了发酵液中的可溶性蛋白、糖类及色素，本发明制作得到的枯草芽孢杆菌制剂中的有效成分含量高，本发明制作得到的枯草芽孢杆菌制剂中的芽孢数达到1500亿/克左右，抗生素在枯草芽孢杆菌制剂的质量百分比为0.1％左右；本发明的方法对发酵液中糖类的去除率达到80％以上，制作得到的枯草芽孢杆菌制剂不易吸潮，保质期长，在空气中放置3个月，增重率仅为3％。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式枯草芽孢杆菌制剂的制作按照以下步骤进行：一、枯草芽孢杆菌B10经发酵后得到发酵液；二、将发酵液通过截流分子量为30000～100000k的超滤膜过滤分离，操作压力为3～6bar，温度20～45℃，膜通量为55～65LMH，通过超滤膜的溶液为抗生素溶液，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为5～7倍，水的洗涤用量为发酵液体积的20％～40％；三、将步骤二中的抗生素溶液通过截流分子量为3000～10000k的超滤膜过滤得到抗生素透过液，操作压力为10～26bar，温度为20～45℃，膜通量为45～55LMH，浓缩倍数为7～10倍，其中通过超滤膜的溶液为抗生素透过液；四、将步骤三中的抗生素透过液通过截流分子量为400～600k的纳滤膜过滤得到抗生素浓缩液，操作压力为15～30bar，温度为20～45℃，膜通量为35～45LMH，浓缩倍数为10～15倍，其中被截留在膜的进液侧的溶液为抗生素浓缩液；五、将步骤四中抗生素浓缩液和步骤二中的芽孢溶液混合均匀，再进行喷雾干燥制成粉末即制作得到枯草芽孢杆菌制剂，喷雾干燥的进口温度为190～210℃，出口温度为80～100℃。
本实施方式步骤一中的枯草芽孢杆菌B10可通过全俄罗斯植物保护研究所购买得到。
本实施方式步骤二中芽孢溶液中枯草芽孢杆菌B10耐高温，在250℃的条件下存活60min，芽孢的直径为0.3～0.6μm，长1.5μm～2.0μm。
本实施方式步骤二中抗生素溶液的主要成份为抗生素、大分子多糖、大分子色素及可溶性蛋白，其中抗生素耐高温，抗生素在200℃的条件下，持续30分钟，仍然有84％的残留；抗生素的分子量为1000～2000k。
本实施方式步骤二中抗生素溶液为深黄色。
本实施方式步骤三中的超滤膜过滤掉抗生素溶液中的大分子多糖、大分子色素及可溶性蛋白，所得到的抗生素透过液为淡黄色。
本实施方式步骤四被截留在膜的进液侧的抗生素浓缩液中的主要成份为抗生素，而通过纳滤膜的为单糖、无机盐等小分子杂质，达到了去除单糖、无机盐等小分子杂质的目的。
本实施方式制作得到的枯草芽孢杆菌制剂中的芽孢数达到1500亿/克左右，抗生素在枯草芽孢杆菌制剂的质量百分比为0.1％左右。
本实施方式制作得到的枯草芽孢杆菌制剂的保质期为2年以上。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中将枯草芽孢杆菌B10接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为36～39℃，发酵时间为65～75h。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
本实施方式枯草芽孢杆菌B10将发酵培养后，发酵液中的有效活芽孢含量为200～400亿/克。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤二中芽孢溶液浓缩倍数为6倍。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是步骤四中滤液通过截流分子量为500k的纳滤膜过滤。其它步骤及参数与具体实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤五中喷雾干燥的进口温度为210℃，出口温度为90℃。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二不同的是枯草芽孢杆菌B10接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为37℃，发酵时间为70h。其它步骤及参数与具体实施方式二相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中将发酵液通过截流分子量为50000～80000k的超滤膜过滤。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中操作压力为4～5bar，温度28～38℃，膜通量为57～63LMH，芽孢溶液浓缩倍数为5～6倍，水的洗涤用量为发酵液体积的25％～35％。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中透过液通过截流分子量为5000～8000k的超滤膜过滤。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式十：本实施方式枯草芽孢杆菌制剂的制作按照以下步骤进行：一、枯草芽孢杆菌B10经发酵后得到发酵液；二、将发酵液通过截流分子量为60000k的超滤膜过滤分离，操作压力为5bar，温度35℃，膜通量为60LMH，通过超滤膜的溶液为抗生素溶液，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为5～7倍，水的洗涤用量为发酵液体积的30％；三、将步骤二中的抗生素溶液通过截流分子量为6000k的超滤膜过滤得到抗生素透过液，操作压力为22bar，温度为35℃，膜通量为50LMH，浓缩倍数为8倍；其中通过超滤膜的溶液为抗生素透过液；四、将步骤三中的抗生素透过液通过截流分子量为500k的纳滤膜过滤得到抗生素浓缩液，操作压力为25bar，温度为35℃，膜通量为40LMH，浓缩倍数为12倍，其中被截留在膜的进液侧的溶液为抗生素浓缩液；五、将步骤四中抗生素浓缩液和步骤二中的芽孢溶液混合均匀，再进行喷雾干燥制成粉末即制作得到枯草芽孢杆菌制剂，喷雾干燥的进口温度为210℃，出口温度为90℃。
本实施方式步骤一中将枯草芽孢杆菌B10接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为36～39℃，发酵时间为65～75h；其中培养后的发酵液中的芽孢含量为300亿/克。
本实施方式步骤二中浓缩液的主要成份为芽孢，芽孢的直径为0.3～0.6μm，长1.5μm～2.0μm；芽孢耐高温，在250℃的条件下存活60min。
本实施方式步骤二中抗生素溶液的主要成份为抗生素、大分子多糖、大分子色素及可溶性蛋白，其中抗生素的分子量为1000～2000k。
本实施方式步骤二中抗生素溶液为深黄色。
本实施方式步骤三中的超滤膜过滤掉抗生素溶液中的大分子多糖、大分子色素及可溶性蛋白，所得到的抗生素透过液为淡黄色。
本实施方式步骤四被截留在膜的进液侧的抗生素浓缩液中的主要成份为抗生素，而通过纳滤膜的为单糖、无机盐等小分子杂质，达到了去除单糖、无机盐等小分子杂质的目的。
本实施方式制作得到的枯草芽孢杆菌制剂中的有效成分含量高，本实施方式采用血球计数板测定制作得到的枯草芽孢杆菌制剂的芽孢数为1600亿/克；本实施方式采用分光光度计法测定抗生素在枯草芽孢杆菌制剂的质量百分比为0.12％，分光光度计的波长为250nm；本实施方式对发酵液中糖类的去除率达到80％以上，制作得到的枯草芽孢杆菌制剂不易吸潮，在空气中放置3个月，增重率仅为3％，而相同重量的由传统方法制作得到的枯草芽孢杆菌制剂在空气中放置3个月，增重率为30％左右，本实施方式制作得到的枯草芽孢杆菌制剂保质期长，保质期为2年以上，不会变质。
Claims (4)
1.枯草芽孢杆菌制剂的制作方法，其特征在于枯草芽孢杆菌制剂按照以下步骤进行制作：一、将枯草芽孢杆菌B10接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为36～39℃，发酵时间为65～75h，枯草芽孢杆菌B10经发酵后得到发酵液；二、将发酵液通过截流分子量为30000～100000k的超滤膜过滤分离，操作压力为3～6bar，温度20～45℃，膜通量为55～65LMH，通过超滤膜的溶液为抗生素溶液，被截留在膜的进液侧的溶液为芽孢溶液，芽孢溶液浓缩倍数为5～7倍，水的洗涤用量为发酵液体积的20％～40％；三、将步骤二中的抗生素溶液通过截流分子量为3000～10000k的超滤膜过滤得到抗生素透过液，操作压力为10～26bar，温度为20～45℃，膜通量为45～55LMH，浓缩倍数为7～10倍，其中通过超滤膜的溶液为抗生素透过液；四、将步骤三中的抗生素透过液通过截流分子量为400～600k的纳滤膜过滤得到抗生素浓缩液，操作压力为15～30bar，温度为20～45℃，膜通量为35～45LMH，浓缩倍数为10～15倍，其中被截留在膜的进液侧的溶液为抗生素浓缩液；五、将步骤四中的抗生素浓缩液和步骤二中的芽孢溶液混合均匀，再进行喷雾干燥制成粉末即制作得到枯草芽孢杆菌制剂，喷雾干燥的进口温度为190～210℃，出口温度为80～100℃。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制剂的制作方法，其特征在于步骤二中芽孢溶液浓缩倍数为6倍。
3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌制剂的制作方法，其特征在于步骤四中滤液通过截流分子量为500k的纳滤膜过滤。
4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制剂的制作方法，其特征在于步骤五中喷雾干燥的进口温度为210℃，出口温度为90℃。
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