CN112920961A - 一种枯草芽孢杆菌的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌的培养方法。该方法包括：将解冻后的枯草芽孢杆菌菌种直接接种到种子罐的种子培养基中进行种子培养，得到枯草芽孢杆菌种子液，然后直接将所述种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到枯草芽孢杆菌的发酵液；其中，所述种子培养在搅拌的条件下进行，搅拌的转速为50‑200rpm，种子培养的温度为33‑37℃，时间至少为9小时。本发明的方法在不降低枯草芽孢杆菌发酵密度的情况下，显著缩短了整个培养周期，降低能耗。同时，相比于现有一级摇瓶和二级摇瓶0.2体积％左右的接种量，本申请的种子罐培养时的接种量仅需要0.005‑0.01体积％，也即，大大降低了菌种的使用量。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌的培养方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌是在自然界广泛存在的一种好氧的产芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌在孢子状态下(在成熟期以孢子状态存在)稳定性极好，有耐氧化、耐挤压、耐高温、耐积水、耐酸和耐胆盐等特性。有资料表明，枯草芽孢杆菌能长期耐60℃高温，在贮存和加工条件下枯草芽孢杆菌也有很高的耐受能力；在pH值2.2-7.0范围内枯草芽孢杆菌有较高的存活率，在酸性胃环境中能保持活性。
研究表明，枯草芽孢杆菌对机体具有诸多益处，例如：(1)枯草芽孢杆菌菌体生长过程中会产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；(2)枯草芽孢杆菌可迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长；(3)刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力；(4)枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用；(5)枯草芽孢杆菌能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。
枯草芽孢杆菌不仅在饲料中应用比较广泛，在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中的应用也相当广泛，是一种多功能的微生物。具体的，其可用于(1)市政和工业污水处理，工业循环水处理，腐化槽、化粪池等处理，畜牧养殖动物废料、臭味处理，粪便处理系统，垃圾、粪坑、粪池等处理；(2)畜牧、家禽、特种动物及宠物养殖，水产养殖；(3)可以与多种菌种混配，在农业生产中具有重要作用。
传统的枯草芽孢杆菌的培养过程主要为：冻存管→一级摇瓶→二级摇瓶→种子罐→发酵罐，整个培养过程周期较长，能耗高。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的培养周期长、能耗高的问题，提供一种枯草芽孢杆菌的培养方法，该方法能够在不降低枯草芽孢杆菌发酵密度的情况下，显著缩短整个培养周期，降低能耗。
为了实现上述目的，本发明提供一种枯草芽孢杆菌的培养方法，该方法包括：将解冻后的枯草芽孢杆菌菌种直接接种到种子罐的种子培养基中进行种子培养，得到枯草芽孢杆菌种子液，然后直接将所述种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到枯草芽孢杆菌的发酵液；
其中，所述种子培养在搅拌的条件下进行，搅拌的转速为50-200rpm，种子培养的温度为33-37℃，时间至少为9小时。
优选地，所述发酵培养基含有豆粕、玉米粉、淀粉酶、酵母浸粉、葡萄糖和硫酸锰。
本发明通过将解冻后的枯草芽孢杆菌菌种直接接种到种子罐的种子培养基中，并在特定的条件下进行种子培养至少9小时，将如此获得的种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，在不降低枯草芽孢杆菌发酵密度的情况下，显著缩短了整个培养周期，降低能耗。同时，相比于现有一级摇瓶和二级摇瓶0.2体积％左右的接种量，本申请的种子罐培养时的接种量仅需要0.005-0.01体积％，也即，大大降低了菌种的使用量。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌的培养方法，该方法包括：将解冻后的枯草芽孢杆菌菌种直接接种到种子罐的种子培养基中进行种子培养，得到枯草芽孢杆菌种子液，然后直接将所述种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到枯草芽孢杆菌的发酵液；
其中，所述种子培养在搅拌的条件下进行，搅拌的转速为50-200rpm(例如，可以为50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm、100rpm、110rpm、120rpm、130rpm、140rpm、150rpm、155rpm、160rpm、165rpm、170rpm、175rpm、180rpm、185rpm、190rpm、195rpm、200rpm，以及任意两点组成的范围之内的任意值)，种子培养的温度为33-37℃(例如，33℃、33.5℃、34℃、34.5℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃)，时间至少为9小时。
根据本发明，传统培养方法中，一般一级摇瓶培养的时间为17-19小时，二级摇瓶培养的时间为17-19小时，并且一级摇瓶和二级摇瓶的接种量大约在0.2体积％，种子罐培养的时间为6-8小时，发酵培养的时间为19-21小时。其中，种子罐培养时间设定在6-8小时主要考虑的是枯草芽孢杆菌要以最佳的状态接种到发酵培养基中以确保发酵的有效性。而本发明的发明人在研究的过程中意外的发现，将解冻后的枯草芽孢杆菌菌种直接接种到种子罐的种子培养基中，并在33-37℃(例如，33℃、33.5℃、34℃、34.5℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃，优选36-37℃)的温度和50-200rpm(优选150-200rpm)的转速下适当的延长原有种子罐的培养时间至10小时以上，优选为10-13小时，例如，10小时、10.5小时、11小时、11.5小时、12小时、12.5小时、13小时、13.5小时、14小时，并将如此获得的种子液接种到发酵培养基中，能够有效缩短达到相同的产芽孢率时所需的培养时间，同时还能够减少枯草芽孢杆菌菌种的接种量，相比于传统的0.2体积％的接种量，其接种量可缩小至0.005-0.01体积％。也即，本发明的方法只需要在特定的条件下适当的延长种子罐的培养时间，即可省略原有的一级摇瓶和二级摇瓶培养，降低菌种的接种量，同时还能够有效缩短达到相同的产芽孢率时所需的培养时间，也即，使得整个培养周期大大缩短，同时也不影响发酵终点的产芽孢率。由此，本发明大大提高了发酵效率，同时降低了能耗。
由此，在本发明的方法中，相对于100毫升的所述种子培养基，所述解冻后的枯草芽孢杆菌菌种的接种量可降低至0.005-0.01毫升。
根据本发明，所述种子培养基可以为本领域常规的用于枯草芽孢杆菌种子培养的培养基，优选的，所述种子培养基含有蛋白胨、酵母粉、氯化钠和葡萄糖。进一步优选的，相对于100毫升的所述种子培养基，所述蛋白胨的含量为0.8-1.2g，所述酵母粉的含量为0.4-0.6g，所述氯化钠的含量为0.8-1.2g，所述葡萄糖的含量为0.4-0.6g，pH值为7-7.5。
所述种子培养基还含有水，含量可根据需要进行选择，例如，可以为92-96重量％。所述种子培养基含有上述成分(蛋白胨、酵母粉、氯化钠和葡萄糖)或由以上成分(蛋白胨、酵母粉、氯化钠和葡萄糖)和水组成。其中，蛋白胨、酵母粉、氯化钠和葡萄糖均为常规的用来配制微生物的培养基的物质，可以通过商购获得。
根据本发明，所述种子罐可以为本领域常规的用于枯草芽孢杆菌种子培养的种子罐，其可以商购获得，例如，可以为购自上海百仑生物科技有限公司型号为BLBIO-50SJ、容量50升、重量400Kg、材质为316不锈钢的种子罐。
根据本发明，所述发酵培养基可以为本领域常规的用于枯草芽孢杆菌发酵的培养基。例如，所述发酵培养基可以含有0.3-1.0重量％的酵母粉、0.3-0.8重量％的玉米浆、0.3-0.8重量％的糖蜜、1.5-2.5重量％的玉米粉、1-3重量％的豆粕和0.008-0.05重量％的硫酸锰，pH 7.2±0.2。
但本发明的发明人发现，当使用含有豆粕、玉米粉、淀粉酶、酵母浸粉、葡萄糖和硫酸锰的所述发酵培养基对枯草芽孢杆菌进行培养时，能够更进一步的缩短发酵时间，从而进一步提高发酵效率，降低能耗。
其中，对于所述发酵培养基中含有的如上组分的含量可以在较宽的范围内进行选择，优选的，相对于100重量份的所述枯草芽孢杆菌发酵培养基，所述豆粕的含量为1-2.5重量份，所述玉米粉的含量为2-3重量份，所述淀粉酶的含量为0.01-0.03重量份，所述酵母浸粉的含量为0.5-1重量份，所述葡萄糖的含量为0.3-0.7重量份，所述硫酸锰的含量为0.01-0.03重量份。
其中，所述淀粉酶可以为耐高温淀粉酶，例如，可以耐受90℃以上温度的淀粉酶。所述淀粉酶可以在枯草芽孢杆菌发酵的过程中对培养基中含有的豆粕和玉米粉等淀粉类物质进行进一步的酶解，从而保证糖源可以稳定的提供给枯草芽孢杆菌，使得发酵性能进一步提高。
优选的，所述发酵培养基中还含有泡敌，优选的，以20重量％泡敌计算，相对于1L的发酵培养基，其含量为0.5-1.5ml。
所述发酵培养基还含有水，含量可根据需要进行选择，例如，可以为92-96重量％。所述枯草芽孢杆菌的发酵培养基含有上述成分(豆粕、玉米粉、淀粉酶、酵母浸粉、葡萄糖、硫酸锰和泡敌)或由以上成分(豆粕、玉米粉、淀粉酶、酵母浸粉、葡萄糖、硫酸锰和泡敌)和水组成。其中，豆粕、玉米粉、淀粉酶、酵母浸粉、葡萄糖和硫酸锰均为常规的用来配制微生物的培养基的物质，可以通过商购获得。
对所述枯草芽孢杆菌进行发酵培养时，对枯草芽孢杆菌的接种量没有特别的要求，然而，在本发明的优选实施方式中，相对于每100毫升的培养基，所述发酵液的接种量为0.1-1毫升。
本发明中，对发酵培养的条件没有特别的要求，可以为常规的培养枯草芽孢杆菌的条件。例如，在有氧的条件下进行培养，温度可以为33-37℃，可以通过搅拌提供氧气，搅拌的电机转速可以为600-1000rpm，培养的时间以芽孢率达到95％以上时为基准，其中，所述芽孢率可通过镜检并计数的方法计算得到。
本发明中，发酵所使用的枯草芽孢杆菌可以为商购的固体制剂或枯草芽孢杆菌菌种，例如，获自安徽农业大学生命科学学院的枯草芽孢杆菌菌种，编号为951NA4。在使用前，所述枯草芽孢杆菌处于冷冻保存的状态，在使用前取出自然解冻，得到解冻后的枯草芽孢杆菌菌种。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，
枯草芽孢杆菌获自安徽农业大学生命科学学院的枯草芽孢杆菌菌种，编号为951NA4；将保存在超低温冰箱中的枯草芽孢杆菌提前0.5h自然解冻。
芽孢率可通过镜检、计数的方法计算得出。
种子罐为购自上海百仑生物科技有限公司，型号为BLBIO-50SJ、容量50升、重量400Kg、材质为316不锈钢的种子罐。
枯草芽孢杆菌发酵液中活菌数的测定方法：发酵结束后取一定量的发酵液，使用无菌生理盐水稀释至合适的倍数后涂布在NA平板上，37℃左右下倒置培养24小时，对菌落数进行计数(菌落为水滴状)，并计算得到相应发酵液中枯草芽孢杆菌的活菌数。
对比例1
本对比例用于说明传统的枯草芽孢杆菌的培养方法
一级摇瓶培养：酵母粉0.5重量％，蛋白胨1重量％，葡萄糖0.5重量％，氯化钠1重量％，NaOH调pH7.2±0.2，121℃灭菌20分钟，降温。以0.2体积的接种量接种解冻后的枯草芽孢杆菌菌种，摇瓶机设置100rpm，35℃培养18小时。
二级摇瓶培养：酵母粉0.5重量％，蛋白胨1重量％，葡萄糖0.5重量％，氯化钠1重量％，NaOH调pH7.2±0.2，121℃灭菌20分钟，降温。以0.2体积％的接种量接种一级摇瓶种子液，摇瓶机设置100rpm，35℃培养18小时。
种子罐培养：酵母粉0.5重量％，蛋白胨1重量％，葡萄糖0.5重量％，氯化钠1重量％，NaOH调pH7.2±0.2，121℃灭菌20分钟，降温。以0.2体积％的接种量接种二级摇瓶种子液，种子罐转速100rpm，35℃培养7小时。
发酵罐培养：豆粕1.8重量％，玉米粉2.5重量％，高温淀粉酶0.2重量‰，酵母浸粉0.8重量％，葡萄糖0.5重量％，硫酸锰0.2重量‰(20重量％泡敌1ml/2L)，121℃灭菌20分钟，降温。以0.5体积％的接种量接种种子罐种子液，发酵罐电机转速为800rpm，35℃培养至出芽孢率95％以上，停止发酵。
记录整个培养周期所用时间，水电成本，发酵培养时间，以及发酵液中枯草芽孢杆菌的活菌数，结果见表1。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的枯草芽孢杆菌的培养方法
种子罐培养：酵母粉0.5重量％，蛋白胨1重量％，葡萄糖0.5重量％，氯化钠1重量％，NaOH调pH7.2±0.2，121℃灭菌20分钟，降温。以0.01体积％的接种量接种解冻后的枯草芽孢杆菌菌种，种子罐转速200rpm，37℃培养10小时。
发酵罐培养：豆粕1.8重量％，玉米粉2.5重量％，高温淀粉酶0.2重量‰，酵母浸粉0.8重量％，葡萄糖0.5重量％，硫酸锰0.2重量‰(20重量％泡敌1ml/2L)，121℃灭菌20分钟，降温。以0.5体积％的接种量接种种子罐种子液，发酵罐电机转速为800rpm，35℃培养至出芽孢率95％以上，停止发酵。
记录整个培养周期所用时间，水电成本，发酵培养时间，以及发酵液中枯草芽孢杆菌的活菌数，结果见表1。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的枯草芽孢杆菌的培养方法
种子罐培养：酵母粉0.4重量％，蛋白胨1.2重量％，葡萄糖0.4重量％，氯化钠1.2重量％，NaOH调pH7.2±0.2，121℃灭菌20分钟，降温。以0.005体积％的接种量接种解冻后的枯草芽孢杆菌菌种，种子罐转速175rpm，36.5℃培养12小时。
发酵罐培养：豆粕1重量％，玉米粉3重量％，高温淀粉酶0.1重量‰，酵母浸粉1重量％，葡萄糖0.3重量％，硫酸锰0.3重量‰(20重量％泡敌1ml/2L)，121℃灭菌20分钟，降温。以0.5体积％的接种量接种种子罐种子液，发酵罐电机转速为700rpm，35℃培养至出芽孢率95％以上，停止发酵。
记录整个培养周期所用时间，水电成本，发酵培养时间，以及发酵液中枯草芽孢杆菌的活菌数，结果见表1。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的枯草芽孢杆菌的培养方法
种子罐培养：酵母粉0.6重量％，蛋白胨0.8重量％，葡萄糖0.6重量％，氯化钠0.8重量％，NaOH调pH7.2±0.2，121℃灭菌20分钟，降温。以0.008体积％的接种量接种解冻后的枯草芽孢杆菌菌种，种子罐转速150rpm，37℃培养14小时。
发酵罐培养：豆粕2.5重量％，玉米粉2重量％，高温淀粉酶0.3重量‰，酵母浸粉0.5重量％，葡萄糖0.7重量％，硫酸锰0.1重量‰(20重量％泡敌1ml/2L)，121℃灭菌20分钟，降温。以0.5体积％的接种量接种种子罐种子液，发酵罐电机转速为900rpm，35℃培养至出芽孢率95％以上，停止发酵。
记录整个培养周期所用时间，水电成本，发酵培养时间，以及发酵液中枯草芽孢杆菌的活菌数，结果见表1。
实施例4
本实施例用于说明本发明提供的枯草芽孢杆菌的培养方法
按照实施例3的方法进行枯草芽孢杆菌的培养，不同的是，发酵培养基含有1.0重量％的酵母粉、0.8重量％的玉米浆、0.8重量％的糖蜜、2.5重量％的玉米粉、2重量％的豆粕和0.03重量％的硫酸锰(20重量％泡敌1ml/2L)。
记录整个培养周期所用时间，水电成本，发酵培养时间，以及发酵液中枯草芽孢杆菌的活菌数，结果见表1。
实施例5
本实施例用于说明本发明提供的枯草芽孢杆菌的培养方法
按照实施例3的方法进行枯草芽孢杆菌的培养，不同的是，种子罐的转速为100rpm，培养温度为35℃，培养时间为16小时。
记录整个培养周期所用时间，水电成本，发酵培养时间，以及发酵液中枯草芽孢杆菌的活菌数，结果见表1。
对比例2
本对比例用于说明参比的枯草芽孢杆菌的培养方法
按照实施例3的方法进行枯草芽孢杆菌的培养，不同的是，种子罐培养中，以0.2体积％的接种量接种解冻后的枯草芽孢杆菌菌种，培养的时间为7小时。
记录整个培养周期所用时间，水电成本，发酵培养时间，以及发酵液中枯草芽孢杆菌的活菌数，结果见表1。
对比例3
本对比例用于说明参比的枯草芽孢杆菌的培养方法
按照实施例3的方法进行枯草芽孢杆菌的培养，不同的是，将种子罐改为摇瓶，但培养条件不变，以0.2体积％的接种量接种解冻后的枯草芽孢杆菌菌种。
记录整个培养周期所用时间，水电成本，发酵培养时间，以及发酵液中枯草芽孢杆菌的活菌数，结果见表1。
表1
将实施例1与对比例1相比，本发明通过在种子罐中以特定的条件培养至少9小时，能够省去一级和二级摇瓶培养的程序，并且还能够降低种子罐的接种量，缩短发酵罐的发酵时间，从而缩短了整个培养的周期，降低了成本。
将实施例3和实施例4相比可以看出，采用本发明特定的发酵培养基，能够进一步缩短发酵时间，从而进一步缩短整个培养时间，降低成本。
将实施例3和实施例5相比可以看出，适当的提高种子罐的转速和培养温度，能够进一步缩短发酵时间，从而进一步缩短整个培养时间，降低成本，提高产能。
将实施例3和对比例2相比可以看出，即便在种子罐中，在高接种量下，菌种培养时间缩短，会导致发酵时间的延长。
将实施例3和对比例3相比可以看出，提高接种量保持相同的时间，将种子罐替换为摇瓶也会导致后续发酵时间的延长。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种枯草芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，该方法包括：将解冻后的枯草芽孢杆菌菌种直接接种到种子罐的种子培养基中进行种子培养，得到枯草芽孢杆菌种子液，然后直接将所述种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养，得到枯草芽孢杆菌的发酵液；
其中，所述种子培养在搅拌的条件下进行，搅拌的转速为50-200rpm，种子培养的温度为33-37℃，时间至少为9小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述种子培养的时间为9-14小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，相对于100毫升的所述种子培养基，所述解冻后的枯草芽孢杆菌菌种的接种量为0.005-0.01毫升。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述种子培养基含有蛋白胨、酵母粉、氯化钠和葡萄糖。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，相对于100毫升的所述种子培养基，所述蛋白胨的含量为0.8-1.2g，所述酵母粉的含量为0.4-0.6g，所述氯化钠的含量为0.8-1.2g，所述葡萄糖的含量为0.4-0.6g，pH值为7-7.5。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，所述发酵培养基含有豆粕、玉米粉、淀粉酶、酵母浸粉、葡萄糖和硫酸锰。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，相对于100毫升的所述发酵培养基，所述豆粕的含量为1-2.5g，所述玉米粉的含量为2-3g，所述淀粉酶的含量为0.01-0.03g，所述酵母浸粉的含量为0.5-1g，所述葡萄糖的含量为0.3-0.7g，所述硫酸锰的含量为0.01-0.03g。
8.根据权利要求1、6或7所述的方法，其中，相对于100毫升的所述发酵培养基，所述种子液的接种量为0.2-0.5毫升。
9.根据权利要求1和6-8中任意一项所述的方法，其中，所述发酵培养的条件包括：温度为33-37℃，并且所述发酵培养在600-1000rpm的电机转速下进行。
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