CN1229492C - 净化水质的枯草芽孢杆菌、菌剂及固体发酵工艺与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于净化水质的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，CCTCC，M202045以及用该菌在固体培养基，适当的碳、氮比条件下培养、发酵然后经干燥，生产一种有效净化养殖水质的枯草芽孢杆菌制剂。该菌去除水体COD效率高，能迅速降解有机物，具有一定的反硝化能力、降解残渣能力和较强的降解硫化物的能力，小试结果表明：该菌在24小时消除COD可达76%；小试菌剂有效活菌数达3000亿/克以上；中试菌剂有效活菌数达200亿/克以上；同时具有耐盐、耐渗透压、维持养殖水体适宜pH等优良特性。

Description

净化水质的枯草芽孢杆菌、菌剂及固体发酵工艺与应用

                              技术领域

本发明属于农业应用微生物技术领域。具体地说涉及用于净化水质的枯草芽孢杆菌菌株的选育、用该菌株生产的净水剂及该菌剂的固体发酵工艺和应用方法。

                              背景技术

我国水产品年产总量超过4500万吨，居世界首位。但目前我国水产养殖业面临着一些严重的挑战，如爆发性疾病频繁发生、水污染严重、渔业资源退化等，这些问题严重制约着我国水产业的可持续发展。

对虾养殖是我国水产养殖的主导产业之一，具有明显的经济效益和社会效益。但近几年对虾的养殖环境也存在以下一些问题：一是虾塘泥皮泛滥。虾塘由于大量使用化学及抗生素药品，造成大量的藻类和生物的死亡，而平时又极少使用有益微生物制剂的虾塘，进水投苗后20天左右，大量发臭的泥皮上浮，对养殖水体造成极大的破坏。二是有些地区养殖水体出现富营养化现象。大量死亡藻类的分解造成水体呈现黑红色、黄泥色、死灰色、乳白色，水面上有漂浮物。三是虾塘的pH值不稳定。一般虾塘的pH值极不稳定，忽高忽低，高的时候pH值可达9.4，低的时候只有7.4。养虾户对pH值的常规处理方法是，当pH值偏高时，大多采用换水的方法；当pH值偏低时，大多采用泼洒生石灰的方法。特别是pH值偏高时，大量的换水冒有很大的风险——换进虾塘的水质的好坏无法把握，因为大多数感染病毒的虾塘用水随意排放，加上海水污染严重，赤潮随时都有可能出现，而换进虾塘的水源又在同一海域，因此大量的换水有可能引发病毒及各种细菌性疾病、夜光虫的暴发，给对虾养殖带来严重的威胁。四是虾塘青苔多、肥水难。青苔是虾农最怕的底栖藻类，青苔繁殖极快，严重影响对虾的正常生长。投喂的饲料夹在青苔中间，对虾无法觅食，造成营养不足，生长缓慢，饲料大量的浪费，饵料成本增加；钻进青苔的对虾绝大多数被缠死，影响成活率；收虾时加大了捕虾的难度，严重影响了对虾养殖的经济效益。由于虾塘长期施用化肥，有的塘底长满青苔，投到池塘肥料的大都被青苔吸收，造成有青苔的虾塘肥水的难度极大。五是虾塘底质臭。捕虾排干池水后的虾塘底质，淤泥中有机污染物(剩余饲料、对虾排泄物、动植物尸体等)散发出浓浊的臭味。

“养鱼先养水”。水质是养殖成败的首要因素，有机质及其有害分解物的积累则是水产业水质恶化的根本原因。如果能有效避免有机质及其分解产物的过量积累，就能获得良好的水质条件。

用生物学方法维持良好的水质，建立生态型养殖新模式是水产养殖的发展趋势，国内外都已开发出了一些商品制剂来解决水质问题(丁蕾，芽孢菌对养鱼水质影响的研究/，淡水渔业，1999(10)：7-10；李维，人工制备菌剂净化富营养化湖泊的研究，四川师范大学学报(自然科学版)，2001(6)，610-613)。在现有的专利文献中，本发明的发明人检索出两篇与本发明主题密切相关的对比文献：其中中国水产科学研院黄海水产研究所2002年8月25日提出的一份名为“利用枯草芽孢杆菌的水产养殖环境微生物修复方法”(专利申请号：00111307.0，公开日：2002年3月20日)是将从水产养殖池中筛选到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，通过发酵、分离、固定化，制成固体产品，投放到水产养殖中，据称可以降解残饵、粪便等有机污染物，达到净化水质的目的。但该发明专利申请未将发明的核心，即分离筛选得到的枯草芽孢杆菌菌株送交用于专利程序的生物材料保藏，以至可能出现发明公开不充分的问题。此外该专利申请所述的发明，其工艺流程比较复杂，应用成本不是很经济；另一份专利申请是许榕公开的名为“一种活菌生物净水剂的高密度活菌发酵工艺”发明专利申请，采用的是液体发酵工艺，与本发明的技术路线完全不同，而且该申请也没有提交用于专利程序的生物材料保藏，现有条件下公众无法得到该菌株，同样存在公开不充分问题。目前市场上的用于净水的枯草芽孢杆菌菌剂通常采用液体发酵生产。这些发酵菌剂在技术和产品存在着不少问题：一是产品有效活菌数较低，二是价格偏高，市场难以承受，由于生产工艺直接决定产品的质量和成本，液体发酵方式所采用的原料和生产方式使得产品价格较贵。如果是进口产品价格更高，效果虽然比较明显，但使用成本用户难以接受，一个月应用成本在50元/亩或以上。三是液体产品运输和贮存上都不太方便。

                              发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在缺陷，从自然环境中筛选出一种对有机质分解能力强的枯草芽孢杆菌菌株，采用廉价的农产品下脚料为主要原料配制培养基，生产利于净水的枯草芽孢杆菌菌剂，选用合适的固体发酵工艺，以提高该净水菌剂的质量，减少生产投入，从而达到降低生产成本的目的。

本发明通过以下技术方案实现：

一种枯草芽孢杆菌，该菌株为FY99-01(枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)，保藏在CCTCC，保藏编号为：NO.M202045，保藏日期：2002年12月2日。

上述编号为FY99-01的菌株是本发明的发明人从湖北省武汉市华中农业大学的水稻土中所得的87株细菌中，经过分离、筛选得到的一种对有机质分解能力强的枯草芽孢杆菌菌株。

一种固体净水菌剂的生产工艺，应用上述的保藏编号为CCTCC NO.202045菌株FY99-01接种到试管斜面培养基上，得到试管菌株；再将该试管菌株接种到三角瓶液体培养基上，得到三角瓶菌种；进一步地，将所述的三角瓶菌种接种到罐头瓶培养基上，得到固体菌种；将该固体菌种接种到生产用的固体培养基上，通过发酵、干燥，制成固体净水菌剂

该固体菌剂发酵流程是：斜面菌种→活化→三角瓶液体菌种→罐头瓶固体菌种→固体发酵生产(发酵池或床或其它容器)→烘干→粉碎→检验→包装→成品菌剂。

所述的固体净水菌剂具体工艺步骤如下

1)将以上所述的枯草芽孢杆菌菌株FY99-01(一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)，保藏在CCTCC，保藏编号为：NO.M202045，保藏日期：2002年12月2日，接入试管肉汤琼脂斜面上，该培养基成分有牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、水、琼脂，pH7.2，在高压灭菌锅(121℃)中灭菌30分钟，37℃条件下培养16-24小时；

2)制作三角瓶液体菌种：将试管菌株接种于马铃薯葡萄糖液体培养基上培养，该培养基按以下方法制作：按重量计，去皮马铃薯200.0g，蔗糖或葡萄糖20g，水1000ml；将马铃薯切成小块，于锅中加水1000ml煮沸半小时，双层纱布过滤，取其滤液加糖，并加水补足至1000ml。pH自然；然后将500ml三角瓶装量150ml液体种子培养基，接种后置30℃摇床，200rpm下培养36-48小时，使之成为三角瓶液体菌种；

3)制作罐头瓶固体菌种：按重量百分比称取20％稻草粉和80％麦麸作基本培养基，再添加1-5％膨润土、1-3％硫酸铵；将硫酸铵用水溶解后，加入到稻草粉、麦麸和膨润土中，加水量由手感确定：当手捏培养料能挤出水分即可；然后分装于罐头瓶，用纸和橡皮筋封口，在高压灭菌锅(15磅)中灭菌30min，冷却10min后接种上述步骤2)制备的三角瓶液体菌种，；30℃培养48小时，使之成为罐头瓶固体菌种；

4)再转接到加有75％稻草粉+20％膨润土+5％硫酸铵培养基的发酵培养池或培养床或培养容器中，发酵温度控制在30-45℃，发酵48小时，使芽孢形成率达到45％左右，得到枯草芽孢杆菌菌剂；

5)将步骤4)的菌剂在45-50℃下烘干，粉碎，制成固体净水剂。

一种用于净化水质的枯草芽孢杆菌菌剂，其核心是应用所述的菌株FY99-01(一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)，保藏在CCTCC，保藏编号：NO.M202045，保藏日期：2002年12月2日生产的净水剂，所述的净水剂至少含有200亿个/克枯草芽孢杆菌活菌。

一种枯草芽孢杆菌制剂在净化虾塘水质中的应用，其方法是：将本发明的含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏在CCTCC，保藏编号：NO.M202045所生产的净水菌剂，该菌剂至少含有200亿个/克枯草芽孢杆菌活菌。使用量按每亩水面/米水深用100-200克左右的净水用枯草芽孢杆菌制剂，以适量池水将净水制剂活化2～3小时后，加水全塘均匀泼洒，间隔7天再施用1次。净水枯草芽孢杆菌制剂也可与光合细菌菌剂、生物有机肥等配合使用，以解决青苔多、肥水难的问题，促进藻类及浮游生物的新陈代谢。具体方法是：

先用活化好的净水用枯草芽孢杆菌制剂(可加一定量的沸石粉)全塘泼洒，然后用发酵好的生物有机肥肥塘后，最后泼洒光合细菌菌剂。2星期左右再用150-200克(亩水面/米水深)的净水用枯草芽孢杆菌制剂泼洒，以免死亡的青苔造成虾塘底质污染。

一种枯草芽孢杆菌制剂在净化虾塘底质时的应用，方法是：将虾塘消毒3～4天后，再用水冲洗虾塘1～2遍，虾塘保持10公分左右的水体，使用量按每亩水面/米水深用800克左右的净水用本发明的枯草芽孢杆菌制剂，以适量池水将净水制剂活化2～3小时后，加水全塘均匀泼洒。3～5天内每天用铁耙全池简单的耙动一次。

本发明的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillus subtilis)FY99-01的生物学特性：

菌体大小(0.6～1.0)um×(1.5～2.0)um，芽孢中生、椭圆形、革兰氏阳性反应。在肉汤琼脂平板上形成的菌落乳白色、不规则、卷发状、边缘波状、表面隆起湿润、有光泽。过氧化氢酶试验阳性，V.P.反应阳性，硝酸盐还原阳性，最适生长温度30℃，在7％ NaCl浓度下能生长，水解酪素、明胶。

附图及其说明

图1：是本发明的菌剂生产工艺流程图；

图2：是不同培养条件下，本发明的FY99-01菌株对污水COD降解情况的柱形图；

图3：应用本发明净水剂对斑节虾养殖高位池中枯草芽孢杆菌与弧菌数量变化柱形图；

图4：应用本发明净水剂对斑节虾养殖高位池中COD值变化曲线；

图5：应用本发明净水剂对斑节虾养殖高位池中亚硝酸盐变化曲线图；

图6：应用本发明净水剂对斑节虾养殖高位池中pH值变化曲线图；

图7：应用本发明净水剂对斑节虾养殖高位池的H₂S变化曲线图；

图8：应用本发明净水剂对斑节虾养殖高位池的总碱度变化曲线图。

                         具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做进一步地说明：

实施例1：菌株的分离、鉴定与筛选

一、菌株的分离、筛选：

1.、分离用培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5g，水1000ml，琼脂20g，调pH7.2-7.4。

2.、土样分离方法——稀释平板计数法(李阜棣等主编，《农业微生物学实验技术》，中国农业出版社，1996)。

取新鲜土样(采自华中农业大学校园南端的水稻土)，用水稀释，取10^-4，10^-5，10^-6三个稀释度涂皿，28℃培养两天，计数，挑取土样中最高稀释度上的单菌落接种到斜面上。

3、优良菌株筛选：

筛选的出发菌株为从水稻土中分离所得的87株细菌，以COD去除率为主要指标，按污水体积的10％量加入菌悬液，混匀后，28℃摇床处理1天，将分离的细菌对污水进行降解实验，重复3次，挑选其中降解性能较强的10支菌株，对它们进行归属鉴定，芽孢杆菌为理想菌株。

COD的测定按《环境监测分析方法》中的重铬酸钾法(城乡建设环境保护部环境保护局主编，《环境监测分析方法》，北京，中国环境科学出版社，1986)。

二、细菌的鉴定方法

结合菌株的形态学特征、培养特征、生理生化特征，参考《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)、《常见细菌系统鉴定手册》、《微生物实验技术教程》和《污染控制微生物工程》等文献，将细菌鉴定到种。鉴定本发明的菌株FY99-01为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)FY99-01菌株的保藏培养基为牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5g，水1000ml，琼脂20g，调pH7.2-7.4。

分析、比较表明，FY99-01菌株是一株在净化水质方面具有应用价值的细菌，特别是能迅速降解有机物，去除水体COD效率高的枯草芽孢杆菌。图2表示的是不同培养条件下，菌株YT99-01对水体COD降解情况的柱形图。从图中可以看出，在适宜的温度和通气条件下，该菌对COD的去除率1天可达70％以上。

实施例2：固体高密度发酵工艺设计及净水枯草芽孢杆菌菌剂生产

本发明的菌剂固体高密度发酵工艺流程图见图1。

1.三角瓶液体菌种扩大培养：4只500ml三角瓶，分别装150ml PDA培养基(配比如前所述)，灭菌后接种活化好的FY99-01菌种，置30℃摇床(200rpm)培养36-48hrs。

2.罐头瓶固体菌种扩大培养：基本培养基为稻草粉0.6kg和麦麸2.4kg，再添加膨润土0.8kg，硫酸铵0.2kg(在另外的实施例中膨润土和硫酸铵的实际添加量可按照本发明前面所述的比例范围内加入)，水8L，调料拌匀后将培养料分装于160个罐头瓶中，30℃培养48hrs。

3.固体高密度发酵生产：在搅拌机中按以下配方调好料：稻草粉375kg，膨润土100kg，硫酸铵25kg，水1吨。输送到灭菌池中灭菌，冷至35℃接种罐头瓶固体菌种，发酵，通无菌风，控制品温在30-45℃，48小时发酵完成，45-50℃烘干，粉碎，检验，包装。

实施例3：本发明的枯草芽孢杆菌净水菌剂在对虾养殖中的应用

2002年4月，本申请的发明人在中国海南省三亚市选取三口大小和水质情况相近的高位池进行了为期11天的实验，开展了枯草芽孢杆菌制剂在对虾养殖池中的消长及改善水质效果的试验，对养殖池施用枯草芽胞杆菌菌剂后水中枯草芽胞杆菌、弧菌以及COD、硫化氢、亚硝酸盐、总碱度的变化情况及其相互关系和施用效果进行了跟踪检测、分析和评价。试验材料与方法结果如下：

一、材料及方法

实验于2002年4月1日至2002年4月11日在中国海南省英州江海养殖厂进行。实验挑选三邻近斑节对虾养殖池7#、8#精养高位池(7#池为对照池，8#为处理池，另外，4#池投放由深圳艺鹏公司生产的新型水产药品——抗菌肽)。4月1日放苗，放苗前先用次氯酸钠、生石灰对养殖池进行消毒。

1、枯草芽胞杆菌的使用方法

枯草芽胞杆菌制剂，由本申请人生产，每克含枯草芽孢杆菌数约为200亿。2002年4月1日下午18:30将菌粉末按每亩水面/米水深用100-200克左右的净水用枯草芽孢杆菌制剂，以适量池水将净水制剂活化2～3小时后，加水全塘均匀泼洒，间隔7天再施用1次。

2、池塘系统和饲养管理

高位池养殖系统由4个部分组成，即进水系统，排水系统，养虾池和增氧系统。进水系统由引水管道、蓄水井、提水动力装置、进水渠组成。由引水管道将海水引进蓄水井中、海水再由提水动力装置抽到进水渠或进水管中，进水系统中有滤水装置。采用沙滤，并在进水渠和虾池进水口安装约60目过滤网，滤去一些海洋生物。排水系统由虾池排水口、排水渠组成，进水系统与排水系统完全分开，排水口在池中央。虾池为正方形水泥池，面积为10亩，水深1.5米，建在面向大海的沙滩上，距离防护林带100米左右，池底高于海水高潮2m左右。增氧系统主要是由增氧机和电力系统组成，每池设置8台水浮式增氧机和4台水下增氧机，分布在养殖池的四角离池边3m左右，不定时为水池增氧，使池水环流，改善水质。

3、投料与投饵：饲料是由粤海水产饲料公司生产的粤海牌斑节对虾0号饲料，每天投饵4-5次(水温高于28℃时，则投饵5次；水温低于28℃时，则投饵4次)。

4、养殖池水化学指标的测定

分别于4月1、3、5、7、9、11日上午9:00-11:00间，用取水器在7#、8#池离岸20米处定点采集中部水样500ml，装满至瓶口，塞紧，避免空气进入，避光保存。所采水样应在2小时内进行检测分析，采样期间水温维持在29-32℃之间，盐度维持在34-36‰之间。

5、pH值的测定

利用便携式pH计测定。

6、化学需氧量(COD)的测定--碱性高锰酸钾法

按《中华人民共和国国家标准GB海洋监测规范海水分析17378.4-1998》测定。

7、硫化物的测定--碘量法

8、亚硝酸盐测定--重氮偶氮法

按《中华人民共和国国家标准GB海洋调查规范海水化学要素观测17763.4-1992》测定。

9、总碱度的测定

按《中华人民共和国国家标准GB海洋调查规范海水化学要素观测17763.4-1992》测定。

10、养殖池微生物指标的测定

11、枯草芽胞杆菌的测定和计数(采用常规血清学方法)

采用牛肉膏蛋白胨固体培养基稀释平板，再挑取可疑菌落进行血清凝集反应。记录发生阳性反应的菌落数换算成CFU值。

11、弧菌计数

采用TCBS弧菌培养基稀释平板计数。

弧菌培养基(TCBS)配方：牛肉膏3g，蛋白胨10，蔗糖15g，氯化钠20g，Teepol 1ml，溴麝香草酚兰0.06g，蒸馏水1L，pH7.8。

二、实验结果

1、养殖池中枯草芽胞杆菌与弧菌的消长变化

枯草芽胞杆菌的数量在3000-31000个/ml的范围内波动，于4月7日达到峰值，比4月3日的数量增加了几乎一个数量级(图3)。

由于养殖对虾的大多数细菌病是由弧菌引起的，养殖环境中弧菌数量超过临界值(一般认为不应超过10⁴cell/ml)时，将可能发生虾病。在本次实验中，对照池和处理池的弧菌均在同一个数量级内变化，而且均没有超过临界值，二者差异虽然不显著，但处理池的弧菌变化相对平稳些。

2、COD值的变化规律

从实验结果来看，由于两池起始的COD都处于较低水平，一直比较平稳，因此处理效果对比好象并不明显。但是从图4可以很明显的看出，投放了枯草杆菌制剂的8#池COD值，10d内COD值从投放前的9.504下降到8.222。而对照的COD值一般都高于处理池。经计算，投放枯草芽孢杆菌制剂的处理池COD值的平均水平(8.925)低于对照池(9.783)，并且波动比对照池要小。

3、亚硝酸盐的变化规律

硝态氮、亚硝态氮、氨氮总称三态氮，它们在水中可通过硝化与反硝化过程互相转化。亚硝态氮是三态氮中不稳定的中间形式，对虾体具有很强的毒性。溶氧充足时，在硝化菌的作用下可转化为无毒的硝态氮，在缺氧条件下则在反硝化菌作用下，又可能转化为毒性更强的氨氮。因此，亚硝酸盐的浓度在很大程度上能反映养殖环境的健康状况。

图5看出，投放了枯草芽孢杆菌制剂的8#池中亚硝酸盐浓度呈下降趋势(从0.0769ug/L下降到0.0599ug/L)，而同期对照池中亚硝酸盐浓度呈上升趋势(从0.0677ug/L上升到0.079ug/L。)

4、pH值的变化规律

从图6可以看出，8#池的pH值变化曲线基本上介于4#池和7#池的曲线之间(在8.023-8.598的范围内)，均在警戒范围之内，而7#池在4月5日pH值高达8.752。

5、H₂S浓度的变化规律

从图7可看出，两池的H₂S浓度都在规定范围之内，对照池硫化氢浓度在0.00515-0.0246mg/L的范围内波动，而处理池硫化氢浓度从4月1日的0.068mg/L降到4月11日的0.0109mg/L，从4月1日到4月3日的开始两天内，更是骤降了0.0422mg/L之多。

6、总碱度的变化规律

总碱度是指中和海水中弱阴离子所需氢离子的量除以海水的体积，它反映了池水的缓冲容量。缓冲能力越强说明池水对pH值的自我调节能力越强。从图8中可知，除了4月3日和4月11日对照池的总碱度略高于处理池外，处理池的总碱度都要明显高于对照池，其中4月5日，更是高出了0.309之多。

本发明的效果：

1.该菌剂去除水体COD效率高，能迅速降解有机物，具有一定的反硝化能力、降解残渣能力和较强的降解硫化物的能力，小试结果表明：该菌在24小时消除COD可达76％；小试菌剂有效活菌数达3000亿/克以上；中试菌剂有效活菌数达200亿/克以上；同时具有耐盐、耐渗透压、维持养殖水体适宜pH等优良特性。

2、建立了适合工业化生产的高密度固体发酵工艺，研制出芽孢杆菌固体发酵的营养配方和条件，既有效减少了杂菌污染，又能保证芽孢杆菌的正常生长和繁殖。

3、该净水菌剂的生产，原材料来源广，价格低廉，生产工艺简单，操作条件温和，无“三废”，产品便于贮存和运输，与液体菌剂和进口菌剂相比生产成本有了明显的下降。

              表1本发明中试菌剂中枯草芽孢杆菌活菌数检测(按10批次汇总)

批次号	1(CK)	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											芽孢杆菌活菌数(亿/g)	86	1870	204	2058	870	2230	1460	212	2270	1690

注：每批次投料量均为1吨，共生产了10吨枯草芽孢杆菌制剂，除1个批次的对照外，本发明的各批次产品有效活菌数均在200亿/g以上(表1)。

              表2本发明的菌剂与同类技术和产品主要指标比较

	同类技术和产品	本发明技术和生产的产品
			生产方式	液体发酵	固体发酵
剂型	粉剂、片剂、水剂	粉剂
			菌种	芽孢杆菌(未标到种)	枯草芽孢杆菌(编号FY99-01)
有效活菌数	50-100亿/ml	≥200亿/克
			价格	10-2万元人民币/吨(进口产品)1万元人民币/吨(国产产品)	0.3-2万元人民币/吨(本发明)
使用浓度	30-100克/亩次(进口产品)1000-2000克/亩次(国产产品)	100克/亩次(本发明)
			使用成本	10-12元人民币/亩次	2-3元/人民币亩次(本发明)
效果评价	良好	良好

4、枯草芽胞杆菌施入养殖池后，能够很好的适应海水盐度和渗透压、温度等环境并通过自身的繁殖，使菌数逐渐增加，5-8天达到高峰。因此，投放枯草芽胞杆菌的时间间隔以一周左右为宜。施用枯草芽胞杆菌后，由于枯草芽胞杆菌的繁殖和代谢作用，养殖池中的有害物质——亚硝酸盐、硫化氢减少，衡量水质污染状况的化学耗氧量COD值和总碱度(ALK)降低，维持在较低水平上。pH值维持在适宜对虾生长的安全水平。此外，枯草芽孢杆菌对弧菌有一定的抑制作用。说明枯草芽胞杆菌能够达到净化水质，优化养殖环境，保持养殖池微生态系平衡的效果。

5、在净化水质、优化养殖水环境方面的明显效果：

(1)经本发明的菌剂处理后的虾塘，5天左右，泥皮不臭；10天左右，泥皮消失。

(2)本发明的菌剂与光合细菌菌剂的配合使用可促进藻类及浮游生物的新陈代谢。净水枯草芽孢杆菌制剂对老化和死亡的藻类具有良好的分解作用。2～3天后，富营养化水体的水质恢复正常，水体呈淡绿色或者黄绿色或者茶褐色，老化或者死亡的藻类经净水用枯草芽孢杆菌制剂分解后不会对塘底造成污染，新繁殖的藻类为对虾的生长提供了充足的光合作用，充裕的水中溶氧，适口性好的活性饵料。

(3)、经本发明的菌剂处理底质后的虾塘的pH值稳定，可保持8.2～8.8之间，属正常范围。换水次数减少80％以上。

(4)、本发明的菌剂与光合细菌菌剂的配合使用对青苔、肥水难的虾塘的作用明显：2天左右水的透明度就可达35公分的理想效果，肥效可持续25天左右，2星期左右，塘底的青苔由于缺少光合作用而彻底死亡。净水用枯草芽孢杆菌制剂与光合细菌菌剂的配合使用有效地解决了青苔泛滥、水难肥这一难题。

(5)、经过本发明的菌剂处理后的虾塘，底质明显改良，臭味消失，塘底原淤泥的表层呈淡黄色，适合对虾的养殖。

对北海、钦州、防城60个养殖对虾用户的跟踪调查，虾塘施用本发明的菌剂，虾苗成活率提高80％以上，同比增长20％～30％；病毒及细菌性疾病同比下降60％左右，对虾生长速度提前10～15天左右；养殖成功率提高80％以上，同比增长80％以上。

使用本发明的菌剂与光合细菌菌剂配合施用改善了养殖环境，亩水面可减少化学和抗生素用量50％左右(折合人民币60元)；每塘按亩产对虾200公斤计算，可节省饲料40公斤(折合人民币240元左右)；可增产15％左右，增产量为30公斤(折合人民币450元左右)，特别是养殖成功率的大幅度提高，增强了养虾业的抗风险能力。

Claims (8)

1、一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，该菌为FY99-01(枯草芽孢杆Bacillus subtilis)，保藏在CCTCC，保藏编号：CCTCC NO.M202045，保藏日期：2002年12月2日。

2、一种固体净水菌剂的生产工艺，其特征在于，将权利要求1所述的保藏编号为CCTCCNO.202045菌株FY99-01接种到试管斜面培养基上，得到试管菌株；再将该试管菌株接种到三角瓶液体培养基上，得到三角瓶菌种；进一步地，将所述的三角瓶菌种接种到罐头瓶培养基上，得到固体菌种；将该固体菌种接种到生产用的固体培养基上，通过发酵、干燥，制成固体净水菌剂。

3、权利要求2所述的固体净水菌剂的生产工艺，其特征在于：

1)将权利要求1所述的保藏编号为CCTCC NO.202045的枯草芽孢杆菌菌株FY99-01，接入试管肉汤琼脂斜面上，该培养基成分有牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、水、琼脂，pH7.2，在压力为15磅的高压灭菌锅中灭菌30分钟，37℃条件下培养16-24小时，使其活化，得到试管菌株；

2)制作三角瓶液体菌种：将步骤1)得到的试管菌株接种于马铃薯葡萄糖液体培养基上培养，该培养基按以下方法制作：按重量计，去皮马铃薯200.0g，蔗糖或葡萄糖20g，水1000ml；将马铃薯切成小块，于锅中加水1000ml煮沸半小时，双层纱布过滤，取其滤液加糖，并加水补足至1000ml，pH自然，然后将500ml三角瓶装量150ml液体种子培养基，接种后置30℃摇床，200rpm下培养36-48小时，使之成为三角瓶液体菌种；

3)制作罐头瓶固体菌种：按重量百分比称取20％稻草粉和80％麦麸作基本培养基，再添加1-5％膨润土、1-3％硫酸铵；将硫酸铵用水溶解后，加入到稻草粉、麦麸和膨润土中，加水量由手感确定：当手捏培养料能挤出水分即可；然后分装于罐头瓶，用纸和橡皮筋封口，在压力为15磅的高压灭菌锅中灭菌30m分钟，冷却10分钟后接种步骤2)制备的三角瓶液体菌种；30℃培养48小时，使之成为罐头瓶固体菌种；

4)将步骤3)得到的固体菌种转接到含有固体培养基的发酵培养池或床或容器中，所述的培养基为75％稻草粉+20％膨润土+5％硫酸铵，发酵温度控制在30-45℃，发酵48小时，使芽孢形成率达到45％左右，得到枯草芽孢杆菌菌剂；

5)将步骤4)得到的菌剂在45-50℃下烘干、粉碎，制成固体净水菌剂。

4、一种用于净化水质的微生物制剂，其特征在于，应用权利要求1所述的菌株FY99-01(一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)，保藏在CCTCC，保藏编号：NO.M202045生产的枯草芽孢杆菌净水剂，该净水剂至少含有200亿个/克枯草芽孢杆菌活菌。

5、权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在净化虾塘水质中的应用。

6、权利要求4所述的微生物制剂在净化虾塘底质中的应用。

7、权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在净化虾塘底质中的应用。

8、权利要求4所述的微生物制剂在净化虾塘底质中的应用。

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