CN108884434A - 富含营养的萌发剂组合物及孢子培养方法 - Google Patents

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Abstract

一种有助于孢子萌发的营养萌发剂组合物和一种提高孢子萌发效率的方法。组合物包含L‑氨基酸、D‑葡萄糖和/或D‑果糖、磷酸盐缓冲液、工业防腐剂，并且可以包括细菌孢子，或者它们可以单独组合用于萌发。方法包括提供营养萌发剂组合物和细菌孢子，优选地一种或多种芽孢杆菌属物种，并加热至41℃至44℃的优选升高的温度范围培养时间为约2至60分钟。营养萌发剂组合物优选为浓缩液体形式，其在即将开始萌发/培养方法之前在使用点被稀释。方法还可包括将萌发的孢子溶液分配到使用点/消耗点，例如动物饲料、水或垫料、或废水系统或排水管。

Description

富含营养的萌发剂组合物及孢子培养方法
相关申请的引证
本申请要求2016年4月5日提交的美国临时专利申请号62/318,587的权益。
1.技术领域
本发明涉及营养-萌发剂(germinant)浓缩物组合物(成分，composition)和萌发(发芽，萌芽，有发芽能力，germinating)细菌孢子的使用点(point-of-use)培养(孵化，温育，incubation)方法。
2.背景技术
孢子萌发是一种多步骤的致病过程，其中孢子有效地唤醒或从休眠状态恢复到营养生长状态。第一步骤是激活孢子并通常通过称为萌发的环境信号诱导其萌发的步骤。该信号可以是诸如L-氨基酸的营养物。营养萌发剂与孢子内膜中的受体结合以启动萌发。此外，糖已被证明增加L-氨基酸对其同源受体的结合亲和力。
然后，萌发信号启动引起吡啶二羧酸(DPA)的释放的级联，其与孢子核中的Ca2+(CaDPA)以1:1的比例储存。CaDPA的释放是一个快速的过程，且通常在2分钟内完成>90％。CaDPA释放代表了其中它们致力于萌发过程的孢子的不归点(point of no return)。本领域技术人员将该步骤称为“定型(commitment)”步骤。
CaDPA释放后，孢子部分水合，且核的pH升至约8.0。然后，孢子的核膨胀，且皮层(主要由肽聚糖组成)被核裂解酶降解。孢子吸收水分，因此失去其折射率。在萌发过程结束时这种折射率的失去允许通过相差显微镜监测孢子萌发。
萌发的第二阶段是其中孢子的代谢、生物合成和DNA复制/修复途径开始的自然的发展步骤(外生长步骤，outgrowth step)。自然的发展期有几个阶段。第一种被称为成熟期，其中不发生形态变化(例如，细胞生长)，但孢子的分子机制(例如，转录因子、翻译机制、生物合成机制等)被激活。该期间的长度可以根据孢子形成过程期间使用孢子包装的初始资源而变化。例如，几种芽孢杆菌属物种(芽孢杆菌物种，Bacillus species)(包括枯草芽孢杆菌)的优选碳源是苹果酸，且芽孢杆菌孢子通常含有在复苏过程中使用的大量苹果酸。有趣的是，与野生型孢子相比，不能利用苹果酸池的缺失突变体显示出延长的成熟期，表明孢子苹果酸池足以激发初始的自然发展过程。此外，孢子储存小的酸溶性蛋白质，酸溶性蛋白质在复苏的前几分钟内降解充当蛋白质合成的直接氨基酸来源。在自然的发展步骤之后，孢子复苏完成并且细胞被认为是无性生长的。
已知可以通过热激活诱导孢子萌发。各种芽孢杆菌属物种的孢子在菌株特异性温度下被热激活。例如，枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)孢子在75℃下热激活30分钟，而地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)孢子在65℃下热激活20分钟。已显示热激活引起孢子外壳蛋白的瞬时、可逆展开。然后，可在含有营养萌发剂(例如，L-丙氨酸)的萌发缓冲液中将热激活的孢子萌发另外的时间。然而，如果不存在营养萌发剂，则孢子将返回其预热的非萌发状态。
还已知萌发可以在没有热激活但存在含有营养物的萌发缓冲液的情况下在环境温度(接近典型的室温)下发生，但该过程通常比热激活需要更长的时间。例如，地衣芽孢杆菌孢子和枯草芽孢杆菌孢子将分别在35℃或37℃下萌发，但在含有营养萌发剂的萌发缓冲液中其需要更长的时间(例如，2小时)。此外，已知枯草芽孢杆菌的非热激活孢子已在非营养萌发剂条件(例如，CaCl2+Na2DPA)中萌发延长的一段时间。
还已知在实验室环境中通过两步法将热激活和营养萌发剂的使用结合起来萌发孢子。首先，通过在65-75℃(该特定温度是物种依赖性的)范围内的温度下培养一段时间(例如，30分钟)来热激活孢子。然后，将孢子转移到含有营养萌发剂的缓冲溶液中，例如L-丙氨酸。还已知通过将颗粒化的营养物质(含有糖、酵母提取物和非直接孢子萌发剂的其它营养物)、细菌起子和水进料到生长室中在控制温度范围为16-40℃，更优选为29-32℃下使位于使用地点附近的生长室中的细菌生长，生长期约为24小时，如美国专利号7,081,361中所公开的。
需要一种快速孢子培养和激活方法，其允许在使用点位置在一步中产生活性芽孢杆菌属物种，其中细菌将被分配给消费者/用户，例如，以用于人类、动物或植物消费的益生菌或直接用于水处理设施或排水管线的方式。因此，本发明描述了一种简单的孢子萌发方法，其在一步中使用营养萌发剂浓缩物同时热培养。
发明内容
根据本发明一个优选实施方式的营养萌发剂组合物包含许多L-氨基酸中的一种或组合、任选的D-葡萄糖(其增加孢子壳中L-氨基酸对其同源受体的结合亲和力)、和中性缓冲液如磷酸盐缓冲液和工业防腐剂如市售的Kathon/Lingaurd CG(其具有包含甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮的活性成分)。根据本发明另一个优选实施方式的营养萌发剂组合物包含两种或更多种L-氨基酸中的一种或组合、任选的D-葡萄糖(其增加孢子壳中的L-氨基酸对其同源受体的结合亲和力)、HEPES钠盐(为孢子萌发提供适当pH的生物缓冲液)和工业防腐剂如对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸甲酯或其它GRAS(通常认为是安全的)防腐剂的组合。根据另一个优选的实施方式，组合物还包含钾离子源，例如氯化钾或磷酸二氢钾或磷酸氢二钾。根据另一个优选的实施方式，组合物包含D-葡萄糖和D-果糖。
根据另一个优选的实施方式，组合物还包含一种或多种芽孢杆菌属物种的孢子，并且包括萌发抑制剂，例如NaCl、工业防腐剂或D-丙氨酸，连同前述组合物成分中的任一种。萌发抑制剂防止孢子过早地在营养萌发剂组合物中萌发。萌发抑制剂可包括防止孢子萌发的化学物质，例如NaCl、工业防腐剂或D-丙氨酸。可替换地，可以单独提供细菌孢子，并在使用点和培养时将其添加到根据本发明的营养萌发剂组合物中。
根据另一个优选的实施方式，根据本发明的营养萌发剂组合物是浓缩形式，并且在使用点在水或另一种稀释剂中稀释至0.01％至10％浓度。浓缩制剂的使用降低了运输、储存和包装成本，并且使组合物在使用点的给药更容易。最优选地，浓缩组合物是液体形式，其在使用点与稀释剂混合更容易和更快，但也可以使用固体形式如粒料或砖块或粉末。在组合物中包含通用的工业防腐剂有助于长期储存和/或萌发抑制，当组合物为优选的浓缩形式时，这是特别有用的。
在另一个优选的实施方式中，本发明包括在升高的温度下使用营养萌发剂组合物萌发芽孢杆菌属物种的孢子的方法；优选地在35-60℃的范围内，更优选在38-50℃的范围内，且最优选地在41℃至44℃的范围内一段时间(培养期)。根据应用，培养期优选范围为2-60分钟。最优选地，根据本发明的优选组合物的浓缩形式的营养萌发剂组合物用于本发明的培养方法，但也可以使用其它营养萌发剂组合物。优选地，培养方法在使用点处或附近进行-在其中使用或消耗萌发孢子的地点处或地点附近(例如，靠近动物饲养、灌溉或垫料地点)，且进一步包括分配萌发的孢子到使用点/消费。根据本发明的优选方法可以在任何培养装置中进行，所述培养装置具有能够容纳一定体积的孢子、液体(通常是水)、营养萌发剂组合物并且能够在培养期间加热混合物的贮存器。最优选地，在装置中进行所述方法，所述装置还能够混合这些成分，在培养期结束时自动关闭加热，并自动分配包含孢子的益生菌或处理溶液至使用点/消费。优选的方法也可以间歇方法或以连续方法进行。任何种类的孢子形式，例如干粉形式、液体悬浮液或重构的含水混合物，可以与本发明的方法一起使用。
本发明的优选实施方式具有广泛的实用性和应用，并且允许在使用点快速萌发芽孢杆菌属物种的孢子。优选的实施方式特别适用于制备用作益生菌的孢子，例如用于喂养动物，以及用于提供细菌以处理废水系统或提供排水维持。
附图说明
结合以下附图进一步描述和解释本发明，其中：
图1显示了与对照载玻片相比，使用根据本发明的优选实施方式的组合物和方法的细菌载玻片的照片；
图2是显示与对照测试相比，使用根据本发明的优选实施方式的组合物和方法证实萌发水平的pO2测试数据的图；且
图3是显示与对照测试相比，使用根据本发明的优选实施方式的组合物和变化方法证实萌发水平的pO2测试数据的图。
具体实施方式
根据本发明的一个优选实施方式的营养萌发剂组合物包含一种或多种L-氨基酸、D-葡萄糖(其增加孢子壳中的L-氨基酸对其同源受体的结合亲和力并且是任选的)、D-果糖(任选的，取决于细菌种类)、生物缓冲液为孢子萌发提供适当的pH值(例如，HEPES钠盐、磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液)、钾离子的任选来源(例如KCl)和工业防腐剂。在另一个优选的实施方式中，组合物包含D-葡萄糖和D-果糖。当使用D-葡萄糖和D-果糖时，最优选包括钾离子源，例如KCl。如本领域普通技术人员所理解的，D-果糖，D-葡萄糖和D-果糖的组合以及钾离子源的使用取决于细菌的种类。优选使用与组合物pH相容的防腐剂，其具有相对中性的pH。根据另一个优选的实施方式，组合物还包含一种或多种芽孢杆菌属物种的孢子和一种或多种萌发抑制剂。可替换地，可以在使用点将孢子单独添加到根据本发明的营养萌发剂组合物中。根据另一个优选的实施方式，组合物为浓缩形式，最优选为浓缩液，并在使用点稀释。
优选的L-氨基酸包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-缬氨酸和L-半胱氨酸。在浓缩组合物的另一个实施方式中，L-氨基酸可以大豆蛋白的水解产物形式提供。当为浓缩形式时，组合物优选包含下述的溶液：一种或多种上述L-氨基酸，其各自重量范围为8.9-133.5g/L，更优选为13.2-111.25g/L，且最优选为17.8-89g/L；D-葡萄糖(任选的)和/或D-果糖(任选的)，其重量范围为18-54g/L，更优选为27-45g/L，且最优选为30-40g/L；KCl(任选的，作为钾源)，其重量范围为7.4-22.2g/L，更优选为11.1-18.5g/L，且最优选为14-16g/L；磷酸二氢钠，其重量范围为10-36g/L，更优选为15-30g/L，最优选为20-24g/L；磷酸氢二钠，其重量范围为30-90g/L，更优选为21.3-75g/L，且最优选为28.4-60g/L；和一种或多种工业防腐剂，其最终(总)重量范围为0.8-3.3g/L，更优选为1.2-2.7g/L，最优选为1.6-2.2。除了或代替磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液，组合物可包含Tris碱，其重量范围为15-61g/L，更优选为24-43g/L，且最优选为27-33g/L；或HEPES缓冲液，其重量范围为32.5 97.5g/L，更优选为48.75-81.25g/L，且最优选为60-70g/L。任选地，磷酸二氢钾也可用作钾离子源，优选地其重量范围为13.6-40.8g/L，更优选为20.4-34g/L，且最优选为26-29g/L。任选地，磷酸氢二钾也可用作钾离子源，优选地其重量范围为8.7-26.1g/L，更优选为13-21.75g/L，且最优选为16-19g/L。这些成分的量是本发明的重要方面，因为较高浓度会使一些成分不溶，且较低浓度对萌发孢子无效。
最优选地，根据本发明的实施方式的营养萌发剂浓缩物组合物是浓缩形式，并且优选在使用点在水或任何其它合适的稀释剂中稀释成工作溶液。稀释度优选为0.1-10％范围内的浓缩物和余量水，但也可以使用其它量。浓缩制剂的使用降低了运输、储存和包装成本，并且使组合物在使用点的给药更容易。最优选地，浓缩组合物是液体形式，其在使用点与稀释剂混合更容易和更快，但也可以使用固体形式如粒料或砖块或粉末。在组合物中包含通用的工业防腐剂有助于长期储存和/或萌发抑制，当组合物为优选的浓缩形式时，这是特别有用的。
根据一个优选的实施方式，组合物优选包含按重量计10％至90％的一种或多种芽孢杆菌孢子。优选的芽孢杆菌孢子包括以下物种：地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquiefaciens)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、乳芽孢杆菌(Bacillus lactis)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)和球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)。如本领域普通技术人员所理解的，也可以使用其它芽孢杆菌孢子物种。最优选地，组合物包含3至12种芽孢杆菌属物种。可替换地，可以在使用点将这些孢子单独添加到营养萌发剂组合物中。
在另一个优选的实施方式中，用作益生菌的营养萌发剂组合物包含一种或多种本质上是益生菌的芽孢杆菌属菌株，因为它们有助于营养物在消费者消化道中的分解。菌株优选产生以下酶中的一种或多种：水解蛋白质的蛋白酶、水解淀粉和其它碳水化合物的淀粉酶、水解脂肪的脂肪酶、帮助复合糖中的糖苷键水解并帮助纤维素降解的糖苷酶、将纤维素降解为葡萄糖的纤维素酶、脂肪酶样酶的酯酶和降解木聚糖(在植物细胞壁中发现的多糖)的木聚糖酶。产生这些酶的芽孢杆菌菌株是本领域熟知的。可替换地，也可以在使用点将这些芽孢杆菌属菌株单独添加到营养萌发剂组合物中。
在另一个实施方式中，用作废水处理或排水处理的营养萌发剂组合物包含一种或多种芽孢杆菌属菌株，其产生有益于消化通常在废水和/或排水中发现的有机物质的酶。芽孢杆菌属菌株优选产生以下酶中的一种或多种：水解植物和动物蛋白质的蛋白酶，水解淀粉和其它碳水化合物的淀粉酶，水解植物和动物脂肪、油和油脂的脂肪酶，帮助复合糖中的糖苷键水解并帮助纤维素降解的糖苷酶，将纤维素降解为葡萄糖的纤维素酶，脂肪酶样酶的酯酶和木聚糖酶。也可以产生其它酶。选择包含在根据本发明的优选组合物中的特定芽孢杆菌属物种可以是特异性产生靶向在待处理的废水和/或排水中发现的特定类型的有机物质的酶的物种。产生这些酶或针对特定类型的废物处理的芽孢杆菌属菌株是本领域熟知的。再次，作为另一种替代方案，也可以在使用点将这些芽孢杆菌属菌株单独添加到营养萌发剂组合物中。
当孢子包含在营养萌发剂组合物中时，组合物还包含一种或多种萌发抑制剂和/或防腐剂。优选的萌发抑制剂或防腐剂包括NaCl、D-丙氨酸或防腐剂。具体地，组合物包含29-117g/L，更优选为43-88g/L，最优选为52-71g/L范围内的高浓度NaCl，和/或一种或多种化学防腐剂(例如Linguard ICP或Kathon CG(其活性成分包含甲基氯异噻唑啉酮，约1.15-1.18％和甲基异噻唑啉酮，约0.35-0.4％))，最终(总)浓度为0.8-3.3g/L，更优选为1.2-2.7g/L，最优选为1.6-2.2g/L，和/或范围为8-116g/L，更优选为26-89g/L，最优选为40-50g/L的D-丙氨酸(已知的萌发竞争性抑制剂)。这些萌发抑制剂或防腐剂使孢子保持无活性状态，并防止孢子在其使用点稀释和活化之前过早萌发。当根据本实施方式的组合物与本发明的优选方法一起使用时，使用萌发抑制剂是特别优选的，其中萌发在使用点发生。根据本发明的营养萌发剂组合物任选地包含其它标准成分，包括但不限于确保组合物的保质期的其它防腐剂和有助于活性成分分散的表面活性剂，其通常包含在孢子组合物中或在工业处理产品中。
根据一个优选的实施方式，根据本发明的在使用点萌发孢子的方法包括提供包含孢子和营养物的组合物(优选地根据本发明的组合物，但孢子和营养物也可以在单独的组合物/单独的添加组分中)并将组合物加热至升高的温度或温度范围，并将组合物保持在该温度或该范围内一段时间(培养期)，以允许在接近消耗点的使用点位置萌发。培养期间的加热在营养萌发组合物的存在下在一个步骤中进行。该方法还优选包括将萌发的孢子分配给动物(通过饲料或水)、动物垫料、植物、池塘、人类、废水系统或排水管的步骤。优选地，将孢子组合物加热至35-55℃范围内的温度，更优选为38-50℃范围内的温度，最优选为41℃至44℃范围内的温度。培养期可根据最终用途应用而变化。对于益生菌应用，优选的是培养期持续不超过10分钟。最优选地，在益生菌应用中，培养期为2-5分钟。通过这种方式，孢子在孢子完全萌发之前释放到动物体内，并且有更大的机会存活到动物的肠道，在那里它们是最有益的。另一方面，废水应用可能需要更长的培养时间，范围在20-60分钟之间，以确保将完全萌发的孢子输送到待处理的废水中。最优选地，用于废水处理的培养期为20-30分钟。无论应用如何，培养可以在空气培养器、水培养器或在给定温度范围内提供均匀恒定热量的任何其它室中。
根据本发明的优选方法测试根据本发明的优选实施方式的各种组合物。组合物、方法和结果如下所述。
实施例1-为了使孢子萌发，将自由流LF-88益生菌(可从NCH公司商购的孢子液体制剂)加入到1mL的自来水中，终浓度为约1x 109CFU/mL，其中CFU代表菌落形成单位。将包含L-丙氨酸(89g/L)、磷酸二氢钠(20g/L)、磷酸氢二钠(60g/L)和Linguard CP(总计1.6g/L)的根据本发明的优选实施方式的营养萌发剂浓缩物组合物加入到水和细菌混合物中以提供以混合物的总重量计为4％终浓度的营养萌发剂组合物。为了比较，用相同量的自由流LF-88益生菌和水制备阴性对照反应，但不添加营养萌发剂浓缩物组合物。将两种混合物(萌发剂和没有营养萌发剂组合物的阴性对照)共混并在设定为42℃的预培养加热模块中或在环境室温(约23℃)下培养60分钟。
使用相差显微镜观察来自每个反应的孢子。使用标准程序制备载玻片。在OlympusBX41显微镜(100X油浸物镜)上观察孢子，并使用由cellSens Dimension软件包控制的Olympus UC30相机成像。
拍摄图像并将萌发的孢子计数为场中的总孢子的百分比。针对每种条件(测试混合物)分析总共10个代表性图像。萌发的孢子由于水的流入而失去其折射率并且是相暗的(phase-dark)，而未萌发的孢子是相亮的(phase-bright)。
图1显示来自这些测试的代表性图像。图像A表示根据本发明的优选组合物和优选方法，使用营养萌发剂组合物萌发并在42℃下的培养期间加热的孢子。较暗的斑点显示萌发的孢子，较亮的斑点显示未萌发的孢子。图像B表示使用根据本发明的优选实施方式的营养萌发剂组合物萌发，但是在环境温度(23℃)下培养的孢子。图像C-D表示未用根据本发明的营养萌发剂组合物处理的对照孢子，其中一种已在42℃下培养，一种在环境温度(23℃)下培养。
如图1中可见，“A”图像显示比其它图像显著更多的萌发孢子(暗点)。用根据本发明的优选实施方式的营养萌发剂组合物结合根据本发明的优选实施方式的萌发方法培养的孢子显示出96.8％的表观萌发效率(实施例1，图1A)。用根据本发明的优选实施方式的营养萌发剂组合物但未使用根据本发明的优选实施方式的萌发方法培养的对照孢子显示出2.3％的表观萌发效率(实施例1，图1B)。类似地，未使用根据本发明的营养萌发剂组合物培养的孢子在42℃和23℃下分别显示出1.2％和2.6％的表观激活效率(实施例1，图1C和图1D)。未通过本方法的优选实施方式处理的样品中的萌发孢子表示在自由流LF-88益生菌溶液中已经萌发的小百分比的孢子。该实施例表明，当一起使用根据本发明的优选实施方式的营养萌发剂组合物和培养方法时，孢子萌发显著增加。
实施例2-使用相同的测试混合物/培养方法(使用相同的营养萌发剂组合物和加热的培养，“处理的孢子，42℃”)进行另一组培养测试并重复在上述实施例1中所述的对照混合物/培养方法(没有营养萌发剂组合物和没有加热，“未处理的孢子，23℃”)，但进行不同的测试以比较根据本发明的优选实施方式的测试混合物与对照混合物相比的功效。此外，测试了两种其它混合物-其中一种使用实施例1的营养萌发剂组合物但没有加热(“处理的孢子，23℃”)，且另一种没有使用营养萌发剂但是孢子被加热(“未处理的孢子，42℃”)。简而言之，在用或不用优选的营养萌发剂组合物处理的情况下，将孢子在42℃或23℃下培养1小时。培养后，将来自1mL的每个反应的孢子在23℃下以14K RPM沉淀3分钟，并重悬于1mL的缓冲场(Butterfield)的缓冲液中。将约6x 105CFU(0.02mL)加入到0.980mL的含有过量D-丙氨酸的Davis基本培养基(含有3％的葡萄糖作为碳源和微量元素)中。D-丙氨酸是L-氨基酸介导的萌发的有效抑制剂。
将约1.2x 105CFU加入到PreSens OxoPlate的四个孔中的每个孔中。PreSensOxoPlate使用光学氧传感器以使用两个滤光片对来荧光测量样品的氧含量(激发：540nm，发射：650nm和激发：540，发射：590nm)。如制造商所述进行对照，并在BioTek 800FLx荧光酶标仪上进行测量。伴随连续摇动，在37℃下每隔10分钟采集时间点持续24小时，并使用以下公式处理数据以确定氧分压(pO2)：
pO2＝100*[(K0/IR)-1(K0/K100)-1]
已萌发并继续分裂和生长为营养细胞的孢子消耗氧气作为其代谢生长的一部分。氧气消耗由pO2下降表示。据推测，观察到的生长是由于通过本发明萌发的孢子的自然的发展和营养生长所致。这些测试的pO2水平如图2所示。
如图2所示，使用根据本发明的优选实施方式的测试混合物和方法培养(处理的孢子42℃，使用营养萌发剂组合物和加热二者)导致孢子开始营养生长比对照孢子混合物快4小时，所述对照孢子混合物未根据本发明的优选实施方式处理或加热，或者已用营养萌发剂组合物处理或加热，但不是两者一起。在对照实验中看到的增长可能代表约2％的萌发孢子存在于自由流Lf-88益生菌中(参见实施例1)。该实施例还表明当使用根据本发明的优选实施方式的营养萌发组合物和培养方法时，孢子萌发显著增加。
实施例3-使用如上文实施例1中所述的类似测试和对照混合物以及培养方法进行另一组培养测试。简言之，将LF-88以约108CFU/mL的终浓度加入到10mL的蒸馏水中。将样品在各种温度下培养，以显示与对照混合物相比，根据本发明的优选实施方式的测试方法的功效。用实施例1中描述的营养萌发剂组合物制备反应(图3中的“处理的孢子”)并在23℃(环境温度，不加热)、32℃、42℃或60℃下培养。将对照反应在环境室温下培养，不含营养萌发剂组合物。在培养1小时后，将1mL的每种反应在23℃下以14K RPM沉淀3分钟，并重悬于缓冲场的缓冲液中。将约6x 105CFU(0.02mL)加入到0.980mL的含有过量D-丙氨酸的Davis基本培养基(含有3％的葡萄糖作为碳源和微量元素)中。
将约1.2x 105CFU加入到PreSens OxoPlate的四个孔中的每个孔中。如制造商所述进行对照，并使用两个滤光片对在BioTek 800FLx荧光酶标仪上进行测量(激发：540nm，发射：650nm和激发：540，发射：590nm)。伴随连续摇动，在37℃下每隔10分钟采集时间点持续24小时，并处理数据以确定氧分压(pO2)。这些测试的pO2水平如图3所示。
如图3所示，根据本发明的优选实施方式的使用营养萌发剂组合物的培养和加热导致孢子在对照之前开始营养生长数小时。用营养萌发剂组合物处理但未加热的孢子与对照混合物相当。与对照实验相比，根据本发明的一个实施方式(由“处理的孢子32℃”曲线表示)在低于35-55℃的优选范围的温度下培养的营养萌发剂组合物处理的孢子开始更快地营养生长，但不如在根据本发明的优选范围内的升高的温度下处理的孢子快。根据本发明的一个实施方式，用营养萌发剂组合物处理并在41℃至44℃的最优选范围内的温度下培养的孢子显示出最佳结果，是第一个开始营养生长并且开始生长比对照快4小时。如在先前的实施例中所见，在未处理的对照实验中看到的生长可能代表约2％的萌发孢子存在于自由流LF-88益生菌中(参见实施例1)。该实施例还表明当使用根据本发明的优选实施方式的营养萌发组合物和培养方法时，孢子萌发显著增加。
本领域普通技术人员在阅读本说明书和本文的优选实施方式的描述后也将理解，可以在本发明的范围内对装置进行修改和改变，并且本文公开的本发明的范围旨在仅受发明人合法授权的所附权利要求的最广泛解释的限制。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种在使用点使细菌孢子萌发的方法，包括以下步骤：
提供营养萌发剂组合物，以及如果在所述营养萌发剂组合物中不包含细菌物种的孢子，则提供所述细菌物种的孢子；
将所述营养萌发剂组合物和所述孢子加热至约35℃至60℃范围内的温度；
将所述温度保持在所述范围内，持续约2至60分钟的培养期，以形成萌发的孢子溶液；以及
其中加热步骤和保持步骤在氧气的存在下进行。
2.根据权利要求13所述的方法，其中所述营养萌发剂组合物为浓缩液体形式，并且还包括：
向所述营养萌发剂组合物加入稀释剂；
在培养期期间将稀释的营养萌发剂组合物与细菌孢子混合；并且
其中所述稀释的营养萌发剂组合物的浓度为约0.1％至10％。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述温度的范围为约41℃至44℃。
4.根据权利要求3所述的方法，还包括将所述萌发的孢子溶液分配到使用点，并且其中所述使用点包括动物饲料、动物水、动物垫料、植物、池塘、废水系统或排水管。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述营养萌发剂组合物包含：
L-氨基酸；
一种或多种缓冲液，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、HEPES、Tris碱或它们的组合；
工业防腐剂；
任选的D-葡萄糖、或任选的D-果糖、或任选的D-葡萄糖和D-果糖二者；以及
任选的钾离子源。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、大豆蛋白的水解产物、或它们的组合。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述营养萌发剂组合物包含总计约17.8g/L至89g/L的一种或多种L-氨基酸。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述营养萌发剂组合物还包含芽孢杆菌属物种的孢子和任选的萌发抑制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述萌发抑制剂或防腐剂包括氯化钠、D-丙氨酸或它们的组合。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述营养萌发剂组合物包含约29g/L至117g/L的氯化钠。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述营养萌发剂组合物包含约8g/L至116g/L的D-丙氨酸。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述芽孢杆菌属物种是地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquiefaciens)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、乳芽孢杆菌(Bacillus lactis)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)和球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)或它们的组合。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述芽孢杆菌属物种能够产生有助于食用动物的消化道、废水或排水管线中的有机物质分解的酶。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、酯酶、脲酶、纤维素酶、木聚糖酶或它们的组合。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述营养萌发剂组合物为浓缩液体，所述浓缩液体包含：
约8.9-133.5g/L的一种或多种L-氨基酸；
总计为约0.8-3.3g/L的一种或多种工业防腐剂；
总计为约40-126g/L的一种或多种磷酸盐缓冲液、约15-61g/L的Tris碱、或约32.5—97.5g/L的HEPES、或它们的组合；
任选的约18-54g/L的D-葡萄糖、D-果糖或它们的组合；
任选的约7.4-22.2g/L的KCl。
16.根据权利要求15所述的方法，还包括：
向所述营养萌发剂组合物加入稀释剂；和
在培养期期间将稀释的营养萌发剂组合物与细菌孢子混合。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述稀释的营养萌发剂组合物的浓度为约0.1％至10％。
18.一种有助于细菌孢子萌发的营养萌发剂组合物，所述组合物包含：
L-氨基酸；
一种或多种缓冲液，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、HEPES、Tris碱或它们的组合；
一种或多种工业防腐剂；
任选的D-葡萄糖、任选的D-果糖、或任选的D-葡萄糖和D-果糖二者；以及
任选的钾离子源。
19.根据权利要求18所述的营养萌发剂组合物，其中所述L-氨基酸是L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、大豆蛋白的水解产物、或它们的组合。
20.根据权利要求18所述的营养萌发剂组合物，其中所述组合物包含总计约17.8g/L至89g/L的一种或多种L-氨基酸。
21.根据权利要求18所述的营养萌发剂组合物，还包含芽孢杆菌属物种的孢子和任选的萌发抑制剂。
22.根据权利要求21所述的营养萌发剂组合物，其中所述萌发抑制剂或防腐剂包括氯化钠、D-丙氨酸、甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮或它们的组合。
23.根据权利要求22所述的营养萌发剂组合物，其中所述组合物包含约29g/L至117g/L的氯化钠。
24.根据权利要求22所述的营养萌发剂组合物，其中所述组合物包含约8g/L至116g/L的D-丙氨酸。
25.根据权利要求21所述的营养萌发剂组合物，其中所述芽孢杆菌属物种是地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、乳芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、左旋乳酸芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、简单芽孢杆菌和球形芽孢杆菌或它们的组合。
26.根据权利要求21所述的营养萌发剂组合物，其中所述芽孢杆菌属物种能够产生有助于食用动物的消化道、废水或排水管线中的有机物质分解的酶。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述酶包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、酯酶、脲酶、纤维素酶、木聚糖酶或它们的组合。
28.根据权利要求18所述的组合物，其中所述组合物为浓缩液体，所述浓缩液体包含：
约8.9-133.5g/L的一种或多种L-氨基酸；
总计为约0.8-3.3g/L的一种或多种工业防腐剂；
总计为约40-126g/L的一种或多种磷酸盐缓冲液、约15-61g/L的Tris碱、或约32.5—97.5g/L的HEPES、或它们的组合；
任选的约18-54g/L的D-葡萄糖、D-果糖或它们的组合；以及
任选的约7.4-22.2g/L的KCl。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述磷酸盐缓冲液包含约10-36g/L的磷酸二氢钠和约30-90g/L的磷酸氢二钠。

Claims (29)

1.一种在使用点使细菌孢子萌发的方法，包括以下步骤：
提供营养萌发剂组合物，以及如果在所述营养萌发剂组合物中不包含细菌物种的孢子，则提供所述细菌物种的孢子；
将所述营养萌发剂组合物和所述孢子加热至约35℃至60℃范围内的温度；
将所述温度保持在所述范围内，持续约2至60分钟的培养期，以形成萌发的孢子溶液。
2.根据权利要求13所述的方法，其中所述营养萌发剂组合物为浓缩液体形式，并且还包括：
向所述营养萌发剂组合物加入稀释剂；
在培养期期间将稀释的营养萌发剂组合物与细菌孢子混合；并且
其中所述稀释的营养萌发剂组合物的浓度为约0.1％至10％。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述温度的范围为约41℃至44℃。
4.根据权利要求3所述的方法，还包括将所述萌发的孢子溶液分配到使用点，并且其中所述使用点包括动物饲料、动物水、动物垫料、植物、池塘、废水系统或排水管。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述营养萌发剂组合物包含：
L-氨基酸；
一种或多种缓冲液，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、HEPES、Tris碱或它们的组合；
工业防腐剂；
任选的D-葡萄糖、或任选的D-果糖、或任选的D-葡萄糖和D-果糖二者；以及
任选的钾离子源。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、大豆蛋白的水解产物、或它们的组合。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述营养萌发剂组合物包含总计约17.8g/L至89g/L的一种或多种L-氨基酸。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述营养萌发剂组合物还包含芽孢杆菌属物种的孢子和任选的萌发抑制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述萌发抑制剂或防腐剂包括氯化钠、D-丙氨酸或它们的组合。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述营养萌发剂组合物包含约29g/L至117g/L的氯化钠。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述营养萌发剂组合物包含约8g/L至116g/L的D-丙氨酸。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述芽孢杆菌属物种是地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquiefaciens)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、乳芽孢杆菌(Bacillus lactis)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)和球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)或它们的组合。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述芽孢杆菌属物种能够产生有助于食用动物的消化道、废水或排水管线中的有机物质分解的酶。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述酶包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、酯酶、脲酶、纤维素酶、木聚糖酶或它们的组合。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述营养萌发剂组合物为浓缩液体，所述浓缩液体包含：
约8.9-133.5g/L的一种或多种L-氨基酸；
总计为约0.8-3.3g/L的一种或多种工业防腐剂；
总计为约40-126的一种或多种磷酸盐缓冲液、约15-61g/L的Tris碱、或约32.5—97.5g/L的HEPES、或它们的组合；
任选的约18-54g/L的D-葡萄糖、D-果糖或它们的组合；
任选的约7.4-22.2g/L的KCl。
16.根据权利要求15所述的方法，还包括：
向所述营养萌发剂组合物加入稀释剂；和
在培养期期间将稀释的营养萌发剂组合物与细菌孢子混合。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述稀释的营养萌发剂组合物的浓度为约0.1％至10％。
18.一种有助于细菌孢子萌发的营养萌发剂组合物，所述组合物包含：
L-氨基酸；
一种或多种缓冲液，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、HEPES、Tris碱或它们的组合；
一种或多种工业防腐剂；
任选的D-葡萄糖、任选的D-果糖、或任选的D-葡萄糖和D-果糖二者；以及
任选的钾离子源。
19.根据权利要求18所述的营养萌发剂组合物，其中所述L-氨基酸是L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、大豆蛋白的水解产物、或它们的组合。
20.根据权利要求18所述的营养萌发剂组合物，其中所述组合物包含总计约17.8g/L至89g/L的一种或多种L-氨基酸。
21.根据权利要求18所述的营养萌发剂组合物，还包含芽孢杆菌属物种的孢子和任选的萌发抑制剂。
22.根据权利要求21所述的营养萌发剂组合物，其中所述萌发抑制剂或防腐剂包括氯化钠、D-丙氨酸、甲基氯异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮或它们的组合。
23.根据权利要求22所述的营养萌发剂组合物，其中所述组合物包含约29g/L至117g/L的氯化钠。
24.根据权利要求22所述的营养萌发剂组合物，其中所述组合物包含约8g/L至116g/L的D-丙氨酸。
25.根据权利要求21所述的营养萌发剂组合物，其中所述芽孢杆菌属物种是地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、乳芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、左旋乳酸芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、简单芽孢杆菌和球形芽孢杆菌或它们的组合。
26.根据权利要求21所述的营养萌发剂组合物，其中所述芽孢杆菌属物种能够产生有助于食用动物的消化道、废水或排水管线中的有机物质分解的酶。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述酶包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、酯酶、脲酶、纤维素酶、木聚糖酶或它们的组合。
28.根据权利要求18所述的组合物，其中所述组合物为浓缩液体，所述浓缩液体包含：
约8.9-133.5g/L的一种或多种L-氨基酸；
总计为约0.8-3.3g/L的一种或多种工业防腐剂；
总计为约40-126的一种或多种磷酸盐缓冲液、约15-61g/L的Tris碱、或约32.5—97.5g/L的HEPES、或它们的组合；
任选的约18-54g/L的D-葡萄糖、D-果糖或它们的组合；以及
任选的约7.4-22.2g/L的KCl。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述磷酸盐缓冲液包含约10-36g/L的磷酸二氢钠和约30-90g/L的磷酸氢二钠。
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