JP2022008620A - 栄養豊富な発芽性組成物及び芽胞培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】栄養－発芽性組成物、及び使用場所で細菌種の芽胞の発芽を増加させる方法を提供する。
【解決手段】細菌種の芽胞の発芽を補助する栄養－発芽性組成物であって、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン、大豆タンパク質の加水分解物、又はそれらの組合せを含むアミノ酸と、燐酸塩緩衝剤等の緩衝剤と、工業用防腐剤を含み、任意に細菌芽胞を含むことができる。使用場所で細菌種の芽胞の発芽を増加させる方法は、栄養－発芽性組成物及び好ましくは１又は２種以上のバチルス種からなる細菌芽胞を準備することと、使用場所又はその近傍の酸素存在下で、約３５℃～６０℃の範囲の温度に加熱するステップと、約２～６０分の培養時間の間、前記範囲の温度を維持して、活性化細菌を含む発芽した細菌溶液を生成するステップと、を含む。
【選択図】図１

Description

本願は、２０１６年４月５日に出願された米国仮特許出願第６２／３１８，５８７号の利益を主張する。

本発明は、栄養－発芽性濃縮組成物、及び発芽する細胞芽胞を使用場所(point of use)で培養する方法に関する。

芽胞(spore)の発芽は、多段階を生じさせるプロセスであり、芽胞が効果的に目を覚ますか、又は休眠状態から栄養生長状態に復活するプロセスである。第１段階は、芽胞が活性化され、典型的には発芽性物質(germinant)と呼ばれる環境シグナルによって発芽が誘導される。このシグナルは、Ｌ－アミノ酸などの栄養物であり得る。栄養を含む発芽性物質は、芽胞の内膜の受容体に結合して、発芽を開始させる。また、糖は、それらのコグネイト受容体に対するＬ－アミノ酸の結合親和性を増加させることが示されている。

発芽シグナルは、次いで、芽胞のコア中にＣａ^２＋（ＣａＤＰＡ）と１：１の比で保存されているジピコリン酸（ＤＰＡ）の放出を生じさせるカスケードを開始する。ＣａＤＰＡの放出は迅速なプロセスであり、典型的には９０％超が２分で完了する。ＣａＤＰＡ放出は、発芽プロセスに関係する芽胞に対する帰還不能点を表す。当該分野では、このステップを「コミットメント(commitment)」ステップと称している。

ＣａＤＰＡ放出後、芽胞は一部分が水和され、コアのｐＨは約８．０に上昇する。次いで、芽胞のコアは膨張し、コルテックス（主にペプチドグリカンからなる）はコア溶菌酵素によって分解される。芽胞は水分を吸収し、その結果、屈折性を喪失する。発芽プロセスの終わり頃にこの屈折性が失われると、芽胞の発芽が、位相差顕微鏡法を用いてモニターされることができる。

発芽の第２段階は、発芽後成長(outgrowth)であり、この段階では、芽胞の代謝、生合成、及びＤＮＡ複製／修復経路が開始する。発芽後成長期間には幾つかの過程がある。第１の過程は、熟成期として知られており、この期間では、形態学的変化（例えば細胞増殖）は起こらないが、芽胞の分子機構（例えば、転写因子、翻訳機構、生合成機構など）が活性化される。この期間の長さは、芽胞形成の過程で芽胞と共にパッケージングされる初期供給源に基づいて変化し得る。例えば、幾つかのバチルス種（枯草菌を含む）の好ましい炭素源はリンゴ酸塩であり、バチルス芽胞は、典型的には、リンゴ酸塩を豊富に含み、このリンゴ酸は復活プロセス中に用いられる。興味深いことに、リンゴ酸塩プールを利用することができない欠失突然変異体は、野生型芽胞と比較して熟成期間が拡大することを示す。これは、芽胞リンゴ酸塩プールが初期の発芽後成長プロセスを活性化するのに十分であることを表す。また、芽胞は、酸可溶性の小タンパク質を貯蔵する。この小タンパク質は、復活過程の最初の数分間で分解され、タンパク質合成のためのアミノ酸の直接の供給源としての役割を果たす。発芽後成長段階の後、芽胞の再生(revival)が完了し、細胞は栄養成長していると考えられる。

芽胞は、熱活性化によって発芽が引き起こされることは知られている。様々なバチルス種の芽胞が菌株の特異的温度で熱活性化されてきた。例えば、枯草菌の芽胞は７５℃、３０分間で熱活性化され、Ｂ．リケニホルミスの芽胞は６５℃、２０分間で熱活性化される。熱活性化により、芽胞コートタンパク質が一時的に可逆的アンフォールディング(reversible unfolding)を生じることが示されている。熱活性化された芽胞は、Ｌ－アラニンなどの栄養発芽性物質(nutrient germinants)が含まれる発芽緩衝剤の中で、さらなる時間発芽することができる。しかしながら、栄養発芽性物質が存在しない場合、芽胞は、それらの加熱前の(pre-heated)非発芽状態に戻る。

発芽は、熱活性化が無くても、栄養物を含有する発芽緩衝剤があれば、周囲温度（典型的な室温近く）で起こり得ることは知られているが、このプロセスは通常、熱活性化よりも時間がかかる。例えば、バチルス・リケニホルミス（B. licheniformis）及びバチルス・スブチリス（枯草菌）（B. subtilis）の芽胞は、それぞれ、３５℃又は３７℃で発芽するが、栄養発芽性物質を含む発芽緩衝剤ではより長い時間（例えば２時間）を要する。さらに、熱活性化されていないバチルス・スブチリスの芽胞は、栄養発芽性物質が無い条件（例えば、ＣａＣｌ_２＋Ｎａ_２ＤＰＡ）で長時間かけて発芽したことが知られている。

また、芽胞を実験室環境で２段階プロセスで発芽させるために、熱活性化と栄養発芽性物質の使用を組み合わせることも知られている。芽胞は、最初に６５～７５℃の温度（この具体的温度は種に依存する）で所定時間（例えば３０分間）培養することによって熱活性化される。芽胞は、次に、Ｌ－アラニン等の栄養発芽性物質を含む緩衝剤に移される。また、米国特許第７，０８１，３６１号に開示されているように、ペレット化された栄養物質（砂糖、酵母エキス、及び直接の芽胞発芽剤ではない他の栄養素を含む）、細菌開始物質及び水を、温度が１６～４０℃、より好ましくは２９～３２℃に制御された成長チャンバー内に供給し、約２４時間かけて成長させることにより、使用場所近くの成長チャンバーの中で細菌を生育することも知られている。

ヒト、動物又は植物の消費に使用するためのプロバイオティックスとして、又は水処理施設又は排水ラインに直接投入するために、細菌が消費者／使用者に分配される使用場所で、活性バチルス種を単一工程で生成することにより、芽胞の培養及び活性化を迅速に行う方法の必要性がある。それゆえ、本発明は、単一工程で芽胞を発芽させるための簡単な方法を記載するもので、加熱培養と同時に栄養発芽性濃縮物を使用するものである。

本発明の好ましい一実施形態に係る栄養－発芽性組成物(nutrient-germinant composition)は、多くのＬ－アミノ酸の１種又は組合せ、及び任意選択的にＤ－グルコース（芽胞コート内のコグネイト受容体に対するＬ－アミノ酸の結合親和性を増加させる）を含み、燐酸塩緩衝剤などの中性緩衝剤、及び商業的に入手可能なＫａｔｈｏｎ／Ｌｉｎｇａｕｒｄ ＣＧ（メチルクロロイソチアゾリノン及びメチルイソチアゾリノンを含む活性成分を有する）などの工業用防腐剤(preservative)を含む。本発明の別の好ましい実施形態に係る栄養－発芽性組成物は、Ｌ－アミノ酸の１種又はＬ－アミノ酸の２種以上の組合せ、及び任意選択的にＤ－グルコース（芽胞コート内のコグネイト受容体に対するＬ－アミノ酸の結合親和性を増加させる）を含み、ＨＥＰＥＳナトリウム塩（芽胞発芽のために適切なｐＨを提供するための生物学的緩衝剤）、並びに、プロピルパラベン及びメチルパラベンの組合せなどの工業用防腐剤又は他のＧＲＡＳ（一般的に安全とみなされる）防腐剤を含む。別の好ましい実施形態では、組成物はまた、塩化カリウム又は燐酸一カリウム又は燐酸二カリウムなどのカリウムイオンの供給源を含む。別の好ましい実施形態では、組成物は、Ｄ－グルコースとＤ－フルクトースの両方を含む。

別の好ましい実施形態において、組成物はまた、１又は２種以上のバチルス種の芽胞を含み、前述の組成物成分のいずれかと組み合わせて、ＮａＣｌ等の発芽阻害剤、工業用防腐剤又はＤ－アラニンを含む。発芽阻害剤は、栄養－発芽性組成物の中で芽胞が早期に発芽するのを防止する。発芽阻害剤は、ＮａＣｌなどの芽胞の発芽を防止する化学物質、工業用防腐剤、又はＤ－アラニンを含むことができる。あるいは、細菌芽胞を別々に提供し、使用場所及び培養時に、本発明に係る栄養－発芽性組成物に添加することができる。

別の好ましい実施形態において、本発明に係る栄養発芽性組成物は濃縮された形態であり、使用場所にて、水又は他の希釈剤中で０．０１％～１０％の濃度に希釈される。濃縮された配合物を使用することにより、出荷、保管、及びパッケージングコストが低減され、使用場所での組成物の投与が容易になる。濃縮組成物は、液体の形態(form)が使用場所での希釈剤との混合が容易で迅速であるので最も好ましいが、ペレット、ブリック又は粉末のような固体形態も使用されることができる。長期保存及び／又は発芽阻害中に、組成物助剤中に一般的な工業用防腐剤を含めることは、組成物が好ましい濃縮形態である場合に特に有用である。

別の好ましい実施形態において、本発明は、栄養発芽性組成物を用いて、バチルス種の芽胞を、高温で所定時間（培養期間）、発芽させる方法を含む。前記高温は、好ましくは３５～６０℃、より好ましくは３８～５０℃、最も好ましくは４１℃～４４℃の温度であり、前記培養期間は、用途に応じて、好ましくは２～６０分の範囲である。本発明の好ましい組成物に係る濃縮形態の栄養－発芽性組成物は、最も好ましくは、本発明の培養方法に用いられるが、他の栄養－発芽性組成物が用いられることもできる。培養方法は、好ましくは、使用場所又はその近く、即ち、発芽芽胞が使用されるサイト（例えば、動物の給餌、給水又は寝床）若しくは消費されるサイト又はそれらの近くで実施され、発芽した芽胞を使用場所又は消費場所に分配することをさらに含む。本発明に係る好ましい方法は、多量の芽胞、液体（典型的には水）、栄養－発芽性組成物を収容することができるリザーバを有し、培養期間中に混合物を加熱することができるあらゆる培養装置において実施されることができる。最も好ましくは、本発明の方法は、これらの成分を混合することができ、培養期間の終わりに加熱を自動的に停止することができ、芽胞を含むプロバイオティックス又は処理溶液を、使用場所又は消費場所へ自動的に分配することができる装置の中で実施される。好ましい方法は、バッチ工程として、又は連続工程として実施されることができる。本発明の方法では、芽胞の態様は、乾燥粉末形態、液体懸濁液、又は再生された水性混合物等の様々なあらゆる態様が用いられることができる。

本発明の好ましい実施形態は、広範な実用性及び適用性を有し、使用場所でバチルス種の芽胞を迅速に発芽させることができる。好ましい実施形態は、例えば、動物に餌を供給するためのプロバイオティックス、又は廃水システムを処理するための細菌を供給するためのプロバイオティックス、又は排水のメンテナンスのためのプロバイオティックスとして使用するための芽胞の調製に特に有用である。

本発明は、以下の図面に関連してさらに記載され説明される。
本発明の好ましい実施形態に係る組成物及び方法を用いた細菌スライドの写真を、対照スライドと比較して示す図である。 本発明の好ましい実施形態に係る組成物及び方法を用いた発芽レベルを実証するためのｐＯ_２試験データを、対照試験と比較して示すグラフである。 本発明の好ましい実施形態に係る組成物及び様々な方法を用いた発芽レベルを実証するためのｐＯ_２試験データを、対照試験と比較して示すグラフである。

本発明の好ましい一実施形態に係る栄養－発芽性組成物は、１又は２種以上のＬ－アミノ酸、Ｄ－グルコース（芽胞コート中でＬ－アミノ酸のそれらのコグネイト受容体に対する結合親和性を増加させるが、任意選択的である）、Ｄ－フルクトース（細菌種に応じて任意選択的）、芽胞発芽のために適切なｐＨを提供するための生物学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳナトリウム塩、燐酸塩緩衝剤、又はＴｒｉｓ緩衝剤）、任意選択的なカリウムイオン源（ＫＣｌ等）、及び工業用防腐剤を含む。別の好ましい実施形態では、組成物は、Ｄ－グルコースとＤ－フルクトースの両方を含む。Ｄ－グルコースとＤ－フルクトースの両方が使用される場合、ＫＣｌ等のカリウムイオン源を含むことが最も好ましい。Ｄ－フルクトースと、Ｄ－グルコース及びＤ－フルクトースと、カリウムイオン源との使用は、当業者に理解されるように、細菌の種に依存する。防腐剤は、比較的中性のｐＨを有し、前記組成物とｐＨ適合性のものを使用することが好ましい。別の好ましい実施形態において、組成物は、１又は２種以上のバチルス種の芽胞と、１又は２種以上の発芽阻害剤とを含む。あるいは、芽胞は、使用場所で、本発明に係る栄養－発芽性組成物に別途添加されることもできる。別の好ましい実施形態では、組成物は濃縮形態であり、最も好ましくは濃縮された液体であり、使用場所で希釈される。

好ましいＬ－アミノ酸は、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－バリン、及びＬ－システインを含む。濃縮組成物のさらなる実施形態において、Ｌ－アミノ酸は、大豆タンパク質の加水分解物として準備されることができる。濃縮された状態であるとき、組成物は、上記Ｌ－アミノ酸の１又は２種以上の溶液の各々を、好ましくは８．９～１３３．５ｇ／Ｌ、より好ましくは１３．２～１１１．２５ｇ／Ｌ、最も好ましくは１７．８～８９ｇ／Ｌ含み； Ｄ－グルコース（任意選択的）及び／又はＤ－フルクトース（任意選択的）の各々を、好ましくは１８～５４ｇ／Ｌ、より好ましくは２７～４５ｇ／Ｌ、最も好ましくは３０～４０ｇ／Ｌ含み； ＫＣｌ（カリウム源として任意選択的に）を、好ましくは７．４～２２．２ｇ／Ｌ、より好ましくは１１．１～１８．５ｇ／Ｌ、最も好ましくは１４～１６ｇ／Ｌ含み； 燐酸一ナトリウムを、好ましくは１０～３６ｇ／Ｌ、より好ましくは１５～３０ｇ／Ｌ、最も好ましくは２０～２４ｇ／Ｌ含み； 燐酸二ナトリウムを、好ましくは３０～９０ｇ／Ｌ、より好ましくは２１．３～７５ｇ／Ｌ、最も好ましくは２８．４～６０ｇ／Ｌ含み； １又は２種以上の工業用防腐剤を、最終（合計）重量で、好ましくは０．８～３．３ｇ／Ｌ、より好ましくは１．２～２．７ｇ／Ｌ、最も好ましくは１．６～２．２ｇ／Ｌ含む。組成物は、燐酸一ナトリウム／燐酸二ナトリウム緩衝剤に追加して、又はそれらに代えて、Ｔｒｉｓ塩基を、好ましくは１５～６１ｇ／Ｌ、より好ましくは２４～４３ｇ／Ｌ、最も好ましくは２７～３３ｇ／Ｌ含むか、又は、ＨＥＰＥＳ緩衝剤を３２．５～９７．５ｇ／Ｌ、より好ましくは４８．７５～８１．２５ｇ／Ｌ、最も好ましくは６０～７０ｇ／Ｌ含む。必要に応じて、燐酸一カリウムを、カリウムイオン源として使用されることもでき、使用量は、好ましくは１３．６～４０．８ｇ／Ｌ、より好ましくは２０．４～３４ｇ／Ｌ、最も好ましくは２６～２９ｇ／Ｌである。必要に応じて、燐酸二カリウムを、カリウムイオン源として使用されることもでき、使用量は、好ましくは８．７～２６．１ｇ／Ｌ、より好ましくは１３～２１．７５ｇ／Ｌ、最も好ましくは１６～１９ｇ／Ｌである。これら成分の量は、より高い濃度では成分の一部が不溶性になり、より低い濃度では芽胞の発芽効果がなくなるため、本発明の重要な特徴である。

最も好ましくは、本発明の実施形態に係る栄養－発芽性組成物は濃縮された状態であり、好ましくは、使用場所にて、水又は他の適当な希釈剤中で作業溶液(working solution)に希釈される。希釈は、好ましくは、濃縮物の０．１～１０％の範囲であり、残部が水であるが、前記範囲とは別の範囲を用いられることもできる。濃縮された配合物を使用することにより、出荷、保管、及び包装コストが低減され、使用場所での組成物の投与が容易になる。濃縮組成物は、使用場所における希釈剤との混合が容易で迅速である液体の形態であることが最も好ましいが、ペレット、ブリック又は粉末のような固体形態も使用されることができる。長期保存及び／又は発芽阻害中に、組成物助剤中に一般的な工業用防腐剤を含めることは、組成物が好ましい濃縮形態である場合に特に有用である。

好ましい一実施形態では、組成物は、好ましくは、１又は２種以上のバチルス芽胞を１０％～９０重量％含む。好ましいバチルス芽胞として、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・サブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ポリミキサ、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・メガテリウム、バチルス・コアグランス、バチルス・レンタス、バチルス・クラウジ、バチルス・シルクランス、バチルス・フィルムス、バチルス・ラクティス、バチルス・ラテロスポルス、バチルス・ラエボラクティクス、バチルス・ポリミキサ、バチルス・プミルス、バチルス・シンプレックス、及びバチルス・スファエリクス等のバチルス種を挙げることができる。なお、他のバチルス種芽胞を使用できることは、当業者には理解されるであろう。組成物は、最も好ましくは、３～１２のバチルス種を含む。あるいは、これらの芽胞は、使用場所にて、栄養－発芽性組成物に別々に添加されることもできる。

別の好ましい実施形態において、プロバイオティックスとして使用するための栄養－発芽性組成物は、消費者の消化管内で栄養素の分解を補助する点で、本質的にプロバイオティックである１又は２種以上のバチルス菌株を含む。この菌株は、好ましくは、１又は２種以上の酵素を産生し、前記酵素は、タンパク質を加水分解するプロテアーゼ、デンプンその他の炭水化物を加水分解するアミラーゼ、脂肪を加水分解するリパーゼ、複合糖類中のグリコシド結合の加水分解を補助し、セルロースの分解を補助するグリコシダーゼ、セルロースをグルコースに分解するセルラーゼ、リパーゼ様酵素であるエステラーゼ、及び植物の細胞壁に存在する多糖であるキシランを分解するキシラナーゼである。これら酵素を産生するバチルス菌株は当該分野において広く知られている。あるいは、これらのバチルス菌株は、使用場所で、栄養－発芽性組成物に別々に添加されることができる。

別の実施形態において、廃水処理又は排水処理として使用するための栄養－発芽性組成物は、典型的には、廃水及び／又は排水中に存在する有機物の消化に有益な酵素を産生する１又は２種以上のバチルス菌株を含む。バチルス菌株は、好ましくは、１又は２種以上の酵素を産生し、前記酵素は、植物タンパク質及び動物タンパク質を加水分解するプロテアーゼ、デンプンその他の炭水化物を加水分解するアミラーゼ、植物脂肪及び動物脂肪、油及びグリースを加水分解するリパーゼ、複合糖類中のグリコシド結合の加水分解を補助し、セルロースの分解を補助するグリコシダーゼ、セルロースをグルコースに分解するセルラーゼ、リパーゼ様酵素であるエステラーゼ、及びキシラナーゼである。他の酵素についても、同様に産生されることができる。本発明に係る好ましい組成物の中に含めるために選択される特定のバチルス種は、処理される廃水及び／又は排水中に存在する特定種類の有機物を標的とする酵素を特異的に産生するものであってよい。これらの酵素を産生するか、又は特定種類の廃棄物処理を標的とするバチルス菌株は、当技術分野で広く知られている。また、他の選択肢として、これらのバチルス菌株は、使用場所で栄養－発芽性組成物に別々に添加されることできる。

芽胞が栄養－発芽性組成物の中に含まれる場合、組成物はまた、１又は２種以上の発芽阻害剤及び／又は防腐剤を含む。好ましい発芽阻害剤又は防腐剤は、ＮａＣｌ、Ｄ－アラニン、又は防腐剤を含む。具体的には、組成物は、高濃度のＮａＣｌ、及び／又は、１又は２種以上の化学防腐剤（Ｌｉｎｇｕａｒｄ ＩＣＰ又はＫａｔｈｏｎ ＣＧ（メチルクロロイソチアゾリノンを約１．１５～１．１８％と、メチルイソチアゾリノンを約０．３５～０．４％含む活性成分を有する））、及び／又は、Ｄ－アラニン（公知の競合性発芽抑制剤）を含み、前記ＮａＣｌの濃度は、２９～１１７ｇ／Ｌ、より好ましくは４３～８８ｇ／Ｌ、最も好ましくは５２～７１ｇ／Ｌであり、前記化学防腐剤の最終（合計）濃度は、０．８～３．３ｇ／Ｌ、より好ましくは１．２～２．７ｇ／Ｌ、最も好ましくは１．６～２．２ｇ／Ｌであり、前記Ｄ－アラニンの濃度は、８～１１６ｇ／Ｌ、より好ましくは２６～８９ｇ／Ｌ、最も好ましくは４０～５０ｇ／Ｌである。これらの発芽阻害剤又は防腐剤は、芽胞を不活性状態に維持する役割を有し、使用場所でそれらを希釈及び活性化させる前に芽胞が早期発芽するのを防止する。発芽阻害剤の使用が特に好ましいのは、この実施形態による組成物が、本発明の好ましい方法で使用され、使用場所で発芽が起こる場合である。本発明に係る栄養－発芽性組成物は、芽胞組成物又は工業用処理製品の中に一般的に含まれる他の標準的な成分を任意選択的に含むことができ、その成分は、限定するものでないが、活性成分の分散を補助する組成物及び界面活性剤の保存寿命を確保することができる他の防腐剤である。

本発明の好ましい一実施形態は、使用場所で芽胞を発芽させる方法であり、前記方法は、芽胞及び栄養素（芽胞及び栄養素は、好ましくは、本発明に係る組成物であるが、別の組成物の中又は別途加えられた要素の中に含まれていてもよい）を含む組成物を準備することと、前記組成物を高温度又はある温度範囲に加熱し、前記組成物を前記温度又は温度範囲内で所定時間（培養期間）維持することと、含み、消費場所近傍の使用場所で発芽させることができるようにしたものである。培養期間中の加熱は、栄養－発芽性組成物の存在下で一回の段階で行われる。この方法はまた、好ましくは、発芽した芽胞を、動物（飼料又は水を介して）、動物の寝床、植物、池、ヒト、廃水システム又は排水に分配するステップを含む。芽胞組成物は、好ましくは３５～５５℃の温度、より好ましくは３８～５０℃の温度、最も好ましくは４１℃～４４℃の温度に加熱される。培養期間は、最終用途に応じて変化し得る。プロバイオティック用途では、培養時間は１０分以下であることが好ましい。プロバイオティック用途で最も好ましい培養期間は２～５分である。このようにして、芽胞は完全に発芽してしまう前に動物にリリースされるので、芽胞にとって最も有益な動物の腸管を通して生存する可能性が増す。一方で、廃水に適用される場合、完全に発芽した芽胞が、処理される廃水に確実に送達されるようにするために、２０～６０分のより長い培養期間を必要とする。廃水処理の場合、培養期間は、最も好ましくは、２０～３０分である。用途の如何に拘わらす、培養は、エアインキュベータ、ウォーターインキュベータ、又は所定の温度範囲で均一で一定の熱を供給できる他のあらゆるチャンバーの中で行われることができる。

本発明の好ましい実施形態による種々の組成物について、本発明の好ましい方法に従って試験した。組成物、方法及び結果を以下に記載する。

＜実施例１＞
芽胞を発芽させるために、ＦｒｅｅＦｌｏｗ ＬＦ－８８プロバイオティクス（ＮＣＨ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商業的に入手可能な芽胞液体配合物）を約１ｍｌの水道水に加えて、最終濃度を約１×１０^９ＣＦＵ／ｍＬ（ＣＦＵはコロニー形成単位を表す）にする。本発明の好ましい実施形態による発芽誘起栄養素濃縮組成物は、Ｌ－アラニン（８９ｇ／Ｌ）、燐酸一ナトリウム（２０ｇ／Ｌ）、燐酸二ナトリウム（６０ｇ／Ｌ）及びリンガードＣＰ（合計１．６ｇ／Ｌ）を含み、当該組成物を、水及び細菌混合物に添加して、栄養－発芽性組成物の最終濃度を混合物の総重量の４％にした。比較のために、栄養発芽性濃縮組成物は添加せずに、同じ量のＦｒｅｅＦｌｏｗ ＬＦ－８８プロバイオティクスと水を用いた陰性対照反応を調製した。両方の混合物（発芽剤と、栄養－発芽性組成物を含まない陰性対照）を混合し、予め培養されたヒートブロックの中で、４２℃又は周囲室温（約２３℃）で６０分間培養した。

各反応後の芽胞を、位相差顕微鏡法を用いて観察した。スライドを、標準的な手順を用いて調製した。芽胞はＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４１顕微鏡（１００倍油浸対物レンズ）で観察し、ｃｅｌｌＳｅｎｓ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎソフトウェアパッケージによって制御されたＯｌｙｍｐｕｓ ＵＣ３０カメラを用いて画像化した。

得られた画像の視野の中で、発芽した芽胞を、総芽胞の百分率として計数した。合計１０個の代表的な画像について、各条件（試験混合物）の分析を行なった。発芽した芽胞は水の流入により屈折性を失い、暗い位相であるのに対し、発芽していない芽胞は明るい位相である。

図１は、これら試験結果の代表的な画像を示す。画像Ａは、本発明の好ましい組成物及び好ましい方法によるもので、栄養－発芽性組成物を用いて発芽され、培養期間中に４２℃で加熱された芽胞を表す。黒い斑点は発芽した芽胞を示し、明るい斑点は発芽していない芽胞を示す。画像Ｂは、本発明の好ましい実施形態に係る栄養－発芽性組成物を用い、周囲温度（２３℃）での培養で発芽した芽胞を示す。画像Ｃ及び画像Ｄは、本発明に係る栄養発芽性組成物で処理されなかった対照芽胞で、４２℃で培養した対照芽胞と、周囲温度（２３℃）で培養した対照芽胞である。

図１に示されるように、画像「Ａ」は、発芽した芽胞（黒い斑点）が他の画像よりも有意に多いことを示す。本発明の好ましい実施形態に係る栄養－発芽性組成物を、本発明の好ましい実施形態に係る発芽方法と組み合わせて培養した芽胞は、見かけの発芽効率が９６．８％（実施例１、図１Ａ）であることを示した。本発明の好ましい実施形態に係る栄養－発芽性組成物を、本発明の好ましい実施形態による発芽法を使用せずに培養した対照芽胞は、見かけの発芽効率が２．３％（実施例１、図１Ｂ）である。同様に、本発明に係る栄養－発芽性組成物を用いずに培養した芽胞は、４２℃の培養での見かけ活性化効率は１．２％（実施例１、図１Ｃ）であり、２３℃での培養での見かけ活性化効率は２．６％（実施例１、図１Ｄ）である。本方法の好ましい実施形態によって処理されていない試料中の発芽芽胞が示す僅かな割合の発芽は、ＦｒｅｅＦｌｏｗ ＬＦ－８８プロバイオティクス溶液中で既に発芽していたものである。この実施例は、本発明の好ましい実施形態に係る栄養－発芽性組成物と培養方法を組み合わせて使用することにより、芽胞の発芽が有意に増加することを示すものである。

＜実施例２＞
実施例１に記載された同じ試験混合物／培養法（同じ栄養－発芽性組成物を使用し、加熱して培養を行なったもの「栄養処理され４２℃で培養された芽胞」）と、対照混合物／培養方法（栄養－発芽性組成物を使用せず、加熱せずに培養を行なったもの「栄養処理されずに２３℃で培養された芽胞」）を用いて、別の培養試験を繰り返して行なった。異なる点は、本発明の好ましい実施形態に係る試験混合物の効率を対照混合物と比較するために行なったことである。さらに、他の２種類の混合物を試験した。１つは、実施例１の栄養－発芽性組成物を用いたが加熱しないもの（「栄養処理され２３℃で培養された芽胞」）であり、もう１つは、栄養－発芽性組成物を使用しないで加熱したもの（「栄養処理されず４２℃で培養された芽胞」）である。簡潔に記載すると、好ましい栄養－発芽性組成物で処理した芽胞と処理していない芽胞とを、４２℃又は２３℃で１時間培養したということである。培養後、各反応液１ｍＬの芽胞を２３℃の１４Ｋ ＲＰＭで３分間ペレット化し、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液１ｍＬの中で再懸濁した。約６×１０^５ＣＦＵ（０．０２ｍＬ）を、０．９８０ｍＬのＤａｖｉｓ最少培地（炭素源として３％グルコース及び微量元素を含む）を過剰のＤ－アラニンと共に添加した。Ｄ－アラニンは、Ｌ－アミノ酸培地での発芽の強力な阻害剤である。

約１．２ｘ１０^５ＣＦＵをＰｒｅＳｅｎｓ ＯｘｏＰｌａｔｅの４つのウェルの各々に加えた。ＰｒｅＳｅｎｓ ＯｘｏＰｌａｔｅｓは光学酸素センサーを用いるもので、２つのフィルター対（励起５４０ｎｍ、発光６５０ｎｍ：励起５４０、発光５９０ｎｍ）を使用して、試料の酸素含有量を蛍光測定する。対照は、製造者の記載通りに実施され、測定は、ＢｉｏＴｅｋ ８００ＦＬｘ蛍光プレートリーダで行なった。時間点(time points)は、３７℃の温度で、２４時間に亘って絶えずシェイクしながら１０分毎に採取し、データは次の式を用いて処理し、酸素の分圧（ｐＯ_２）を決定した：

ｐＯ_２＝１００^＊［（Ｋ_０／ＩＲ）－１（Ｋ_０／Ｋ_１００）－１］

発芽した芽胞は、増殖性細胞が代謝成長の一部として酸素を消費する時に分裂し成長を続ける。酸素の消費は、ｐＯ_２の低下によって表される。おそらく、観察される成長は、本発明によって発芽した芽胞の発芽後成長及び栄養生育(vegetative growth)によるものである。これら試験におけるｐＯ_２レベルを図３に示す。

図２に示されるように、本発明の好ましい実施形態に係る試験混合物及び方法（栄養－発芽性組成物と方法の両方を使用して処理された芽胞４２℃）は、本発明の好ましい実施形態に係る処理も加熱もされていないか、又は栄養－発芽性組成物による処理と加熱が一緒ではなくどちらか一方のみが行われた対照芽胞混合物よりも４時間早く栄養生育を開始した。実験の対照で観察された生育は、ＦｒｅｅＦｌｏｗ ＬＦ－８８プロバイオティクス（実施例１参照）に存在する約２％の発芽芽胞を表すと推定される。この実施例では、本発明の好ましい実施形態に係る栄養－発芽性組成物及び培養方法が使用される場合、芽胞の発芽が有意に増加することをさらに示す。

＜実施例３＞
上記実施例１に記載したのと同様の試験及び対照混合物及び培養法を用いて別の培養試験を行なった。簡潔に記載すると、ＬＦ－８８を約１０ｍＬの蒸留水に加えて、最終濃度は約１０^８ＣＦＵ／ｍＬである。種々の温度で培養した試料は、対照混合物と比べて、本発明の好ましい実施形態に係る試験方法の有効性を示した。反応物は、実施例１に記載された栄養－発芽性組成物（図３の「処理された芽胞」）を準備し、２３℃（周囲温度で加熱なし）、３２℃、４２℃、又は６０℃で培養した。対照反応物は、栄養－発芽性組成物を含まない組成物で、周囲室内温度で培養した。培養１時間後、各反応物１ｍＬを、２３℃にて１４Ｋ ＲＰＭで３分間ペレット化し、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ緩衝液中で再懸濁させた。約６×１０^５ＣＦＵ（０．０２ｍＬ）を０．９８０ｍＬのＤａｖｉｓ最少培地（炭素源として３％グルコースと微量元素を含む）を過剰のＤ－アラニンと共に添加した。

約１．２ｘ１０^５ＣＦＵをＰｒｅＳｅｎｓ ＯｘｏＰｌａｔｅの４つのウェルの各々に加えた。対照は、製造者の記載通りに実施され、測定は、２つのフィルター対（励起：５４０ｎｍ、発光：６５０ｎｍ、及び、励起：５４０、発光：５９０ｎｍ）を使用し、ＢｉｏＴｅｋ ８００ＦＬｘ蛍光プレートリーダで行なった。時間点は、３７℃の温度で、２４時間に亘って絶えずシェイクしながら１０分毎に行ない、データを処理して、酸素の分圧（ｐＯ_２）を決定した。これら試験結果のｐＯ_２レベルは図３に示されている。

図３に示されるように、本発明の好ましい実施形態に係る栄養－発芽性組成物及び加熱を用いた培養した芽胞は、対照より数時間前に、栄養生育を開始した。栄養－発芽性組成物で処理されたが加熱されていない芽胞は、対照混合物と同等である。栄養－発芽性組成物で処理された芽胞で、本発明の一実施形態に係る３５～５５℃の好ましい温度範囲より低い温度（「処理された芽胞３２℃」曲線によって表される）で培養された芽胞の栄養生育の開始は、対照よりも早かったが、本発明による好ましい温度範囲内の高温で処理された芽胞よりも早くはなかった。芽胞を栄養－発芽性組成物で処理し、本発明の一実施形態における最も好ましい温度範囲である４１℃～４４℃の温度で培養した芽胞は、栄養生育の開始が一番早く、対照よりも４時間早く開始し、最も良い結果を示した。前の実施例に見られるように、無処理の対照実験で観察された生育は、ＦｒｅｅＦｌｏｗ ＬＦ－８８プロバイオティクスに存在する約２％の発芽芽胞であると推定される（実施例１参照）。この実施例はさらに、本発明の好ましい実施形態による栄養－発芽性組成物及び培養方法を使用すると、芽胞の発芽が有意に増加することを示す。

当業者であれば、本明細書及び本明細書の好ましい実施形態の説明を読むことにより、本発明の範囲内で装置に改変及び変更を加えることができる。本発明の範囲は、本発明者らが法律的に権利を与えられた添付の特許請求の範囲の最も広い解釈によってのみ制限されるものとする。

Claims (29)

1. 使用場所で細菌芽胞を発芽させる方法であって、
   栄養－発芽性組成物が含まれない場合、栄養－発芽性組成物及びある細菌種の芽胞を準備するステップと、
   前記栄養－発芽性組成物及び芽胞を、約３５℃～６０℃の温度に加熱するステップと、
   約２～６０分の培養期間の間、温度を前記温度範囲維持して、発芽した芽胞溶液を生成するステップと、を含む、方法。
2. 栄養－発芽性組成物は濃縮された液体の形態であり、
   栄養－発芽性組成物に希釈剤を加えるステップと、
   培養期間中、希釈された栄養－発芽性組成物と細菌芽胞とを混合するステップと、をさらに含み、
   希釈された栄養－発芽性組成物の濃度が、約０．１％～１０％である、請求項１の方法。
3. 温度範囲は、約４１℃～４４℃である、請求項１の方法。
4. 発芽した芽胞溶液を使用場所に分配するステップをさらに含み、前記使用場所は、動物の飼料、動物用の水、動物の寝床、植物、池、廃水システム又は排水を含む、請求項３の方法。
5. 栄養－発芽性組成物は、
   Ｌ－アミノ酸と、
   燐酸塩緩衝剤、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ塩基、又はそれらの組合せを含む１又は２種以上の緩衝剤と、
   工業用防腐剤と、
   任意選択的にＤ－グルコース、又は任意選択的にＤ－フルクトース、又は任意選択的にＤ－グルコース及びＤ－フルクトースの両方と、
   任意選択的にカリウムイオン源と、を含む、請求項１の方法。
6. Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン、大豆タンパク質の加水分解物、又はそれらの組合せである、請求項５の方法。
7. 栄養－発芽性組成物は、１又は２種以上のＬ－アミノ酸を合計で約１７．８～８９ｇ／Ｌ含む、請求項５の方法。
8. 栄養－発芽性組成物は、バチルス種の芽胞と、任意選択的に発芽阻害剤と、をさらに含む、請求項５の方法。
9. 発芽阻害剤又は防腐剤は、塩化ナトリウム、Ｄ－アラニン、又はそれらの組合せを含む、請求項８の方法。
10. 栄養－発芽性組成物は、塩化ナトリウムを約２９ｇ／Ｌ～１１７ｇ／Ｌ含む、請求項９の方法。
11. 栄養－発芽性組成物は、Ｄ－アラニンを約８ｇ／Ｌ～１１６ｇ／Ｌ含む、請求項９の方法。
12. バチルス種は、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・サブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ポリミキサ、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・メガテリウム、バチルス・コアグランス、バチルス・レンタス、バチルス・クラウジ、バチルス・シルクランス、バチルス・フィルムス、バチルス・ラクティス、バチルス・ラテロスポルス、バチルス・ラエボラクティクス、バチルス・ポリミキサ、バチルス・プミルス、バチルス・シンプレックス、バチルス・スファエリクス又はそれらの組合せである、請求項８の方法。
13. バチルス種は、消費する動物の消化管、廃水又は排水ラインの中の有機物の分解を補助する酵素を産生する能力を有する、請求項８の方法。
14. 酵素は、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、又はそれらの組合せを含む、請求項１３の方法。
15. 栄養－発芽性組成物は、
    約８．９～１３３．５ｇ／Ｌの１又は２種以上のＬ－アミノ酸と、
    合計で約０．８～３．３ｇ／Ｌの１又は２種以上の工業用防腐剤と、
    合計で約４０～１２６の１又は２種以上の燐酸塩緩衝剤、約１５～６１ｇ／ＬのＴｒｉｓ塩基若しくは約３２．５～９７．５ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、又はそれらの組合せと、
    任意選択的に約１８～５４ｇ／ＬのＤ－グルコース、Ｄ－フルクトース、又はそれらの組合せと、
    任意選択的に約７．４～２２．２ｇ／ＬのＫＣｌと、を含む濃縮液体である、請求項１の方法。
16. 栄養－発芽性組成物に希釈剤を加えるステップと、
    培養期間中、希釈された栄養－発芽性組成物と細菌芽胞とを混合するステップと、をさらに含む、請求項１５の方法。
17. 希釈された栄養－発芽性組成物の濃度は、約０．１％～１０％である、請求項１６の方法。
18. 細菌芽胞の発芽を補助する栄養－発芽性組成物であって、
    Ｌ－アミノ酸と、
    燐酸塩緩衝剤、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ塩基、又はそれらの組合せを含む１又は２種以上の緩衝剤と、
    １又は２種以上の工業用防腐剤と、
    任意選択的にＤ－グルコース、又は任意選択的にＤ－フルクトース、又は任意選択的にＤ－グルコース及びＤ－フルクトースの両方と、
    任意選択的にカリウムイオン源と、を含む、栄養－発芽性組成物。
19. Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン、大豆タンパク質の加水分解物、又はそれらの組合せである、請求項１８の栄養－発芽性組成物。
20. １又は２種以上のＬ－アミノ酸を合計で約１７．８～８９ｇ／Ｌ含む、請求項１８の栄養－発芽性組成物。
21. バチルス種の芽胞と、任意選択的に発芽阻害剤とをさらに含む、請求項１８の栄養－発芽性組成物。
22. 発芽阻害剤又は防腐剤は、塩化ナトリウム、Ｄ－アラニン、メチルクロロイソチアゾリノン、メチルイソチアゾリノン、又はそれらの組合せを含む、請求項２１の栄養－発芽性組成物。
23. 塩化ナトリウムを約２９ｇ／Ｌ～１１７ｇ／Ｌ含む、請求項２２の栄養－発芽性組成物。
24. Ｄ－アラニンを約８ｇ／Ｌ～１１６ｇ／Ｌ含む、請求項２２の栄養－発芽性組成物。
25. バチルス種は、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・サブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ポリミキサ、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・メガテリウム、バチルス・コアグランス、バチルス・レンタス、バチルス・クラウジ、バチルス・シルクランス、バチルス・フィルムス、バチルス・ラクティス、バチルス・ラテロスポルス、バチルス・ラエボラクティクス、バチルス・ポリミキサ、バチルス・プミルス、バチルス・シンプレックス、バチルス・スファエリクス又はそれらの組合せである、請求項２１の栄養－発芽性組成物。
26. バチルス種は、消費する動物の消化管、廃水又は排水ラインの中の有機物の分解を補助する酵素を産生する能力を有する、請求項２１の栄養－発芽性組成物。
27. 酵素は、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ウレアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、又はそれらの組合せを含む、請求項２６の組成物。
28. 約８．９～１３３．５ｇ／Ｌの１又は２種以上のＬ－アミノ酸と、
    合計で約０．８～３．３ｇ／Ｌの１又は２種以上の工業用防腐剤と、
    合計で約４０～１２６の１又は２種以上の燐酸塩緩衝剤、約１５～６１ｇ／ＬのＴｒｉｓ塩基若しくは約３２．５～９７．５ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、又はそれらの組合せと、
    任意選択的に約１８～５４ｇ／ＬのＤ－グルコース、Ｄ－フルクトース、又はそれらの組合せと、
    任意選択的に約７．４～２２．２ｇ／ＬのＫＣｌと、を含む濃縮液体である、請求項１８の組成物。
29. 燐酸塩緩衝剤は、約１５～３０ｇ／Ｌの燐酸一ナトリウムと、約３０～９０ｇ／Ｌの燐酸二ナトリウムとを含む、請求項２８の組成物。

Images