JP6552416B2 - 乾燥した芽胞発芽性化合物の混合物 - Google Patents
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Description
本出願は、2013年2月6日付で出願された米国仮出願第61/849,973号(その全体が引用することにより本明細書の一部をなす)の優先権の利益を主張する。
a)細菌芽胞と発芽性化合物とを含む溶液を準備することと、
b)溶液を乾燥することで、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物を得ることと、
を含み、細菌芽胞および発芽性化合物が、発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される、方法に関する。
a)細菌芽胞と発芽性化合物とを含む溶液を準備することと、
b)溶液を乾燥することで、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物を得ることと、
を含み、細菌芽胞および発芽性化合物が、該細菌芽胞の発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持され、さらに該方法は、
c)密接混合物を細菌芽胞の発芽を促す環境に曝すことを含み、該密接混合物における該細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および/または酵素活性が、発芽性化合物を欠く対応する細菌芽胞配合物に比べて増大する、方法に関する。
a)細菌芽胞と発芽性化合物とを含む溶液を準備することと、
b)溶液を乾燥することで、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物を得ることと、
を含み、細菌芽胞および発芽性化合物が、発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される、方法を提供する。
a)細菌芽胞と発芽性化合物とを含む溶液を準備することと、
b)溶液を乾燥することで、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物を得ることと、
を含み、細菌芽胞および発芽性化合物が、該細菌芽胞の発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持され、さらに該方法は、
c)密接混合物を細菌芽胞の発芽を促す環境に曝すことを含み、該密接混合物における該細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および/または酵素活性が、発芽性化合物を欠く対応する細菌芽胞配合物に比べて増大する、方法を提供する。
本発明の密接混合物の芽胞の発芽率を発芽剤と従来的に混合した芽胞の発芽率と比較するために、下記の処理を行った。
バチルス・サブチリス芽胞を、L−アラニン溶液の存在下における芽胞の噴霧乾燥を介してGOSDで処理し、発芽のレベルを光学密度(OD)の読み取りにより求めた。
0.01Mのリン酸カリウム緩衝液を、1MのK2HPO4(87.09gが0.5Lの蒸留水に溶解されている)および1MのKH2PO4(68.045gが0.5Lの蒸留水に溶解されている)溶液を用いて調製した。61.5mlの1MのK2HPO4と38.5mlの1MのKH2PO4とを混ぜ合わせ、蒸留水にて1000mlへと希釈することで、pH7.0の0.1Mのリン酸カリウム緩衝液を作製した。0.1Mのリン酸カリウム緩衝液を蒸留水にて1:10の比で更に希釈して、0.01Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を得た。緩衝液を121℃にて60分間オートクレーブで処理することにより滅菌した。
バチルス・リケニホルミス芽胞を、実施例1に記載のように、蒸留水1mL当たり0.044グラムのL−アラニンの存在下における芽胞の噴霧乾燥を介してGOSDで処理した。発芽のレベルは、芽胞懸濁液の調製に0.01Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を用いて上記のように光学密度(OD)の読み取りにより求めた。
バチルス・サブチリス株ENV923 GO+芽胞およびGO−芽胞を上記のように調製し、様々なpHレベルで0.01Mのリン酸カリウム緩衝液に再懸濁した。OD600の測定は上記のように行った。
0.01Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0緩衝液)を実施例1に記載のように調製した。
・pH範囲が3.0〜6.0である0.01Mのリン酸カリウム緩衝液を調製するために、13.2mlの1MのK2HPO4と86.8mlの1MのKH2PO4溶液(実施例1に記載されている)とを混合して、蒸留水で容量を1Lにすることにより作製された0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を基となる緩衝液として使用した。
・pH5.0〜pH3.0の0.01Mのリン酸カリウム緩衝液を得るために、0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)を蒸留水で希釈し、緩衝液のpHを、1MのH2PO4を用いてpH5.0、pH4.0およびpH3.0に下げ、0.1Mの緩衝液と蒸留水との比を1:10に保ちながら、蒸留水を用いて最終容量にした。
バチルス・サブチリス株ENV923GOSD芽胞および対照芽胞を上記のように調製した。芽胞の発芽を上記のように光学密度(OD)の測定により調べた。OD600の測定のために芽胞懸濁液を調製し、1.7×108cfu/mlの濃度で0.01Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)(リン酸緩衝液、pH7.0調製物)中で4℃に冷却した。各芽胞懸濁液について、3ml容量まで満たした3つの培養管を準備した。撹拌および初期のOD600測定の後、培養管を25℃、30℃および37℃に予め加熱しておいた水浴内において120分間インキュベートした。10分間隔で培養管を撹拌し、OD600測定を行った。
培地:
培地は希薄トリプチックソイブロス(mTSB)(BD、211822)とした。培地は、50mgのトリプチックソイブロス粉末を、完全に溶解するまで加熱および撹拌しながら1Lの水に懸濁させることにより調製した。次いで培地をボトルに等しく分配し(aliquoted)、121℃にて30分間オートクレーブで処理した。製造業者の報告にある粉末含量に基づくと、mTSB培地には1リットル当たり、
カゼインの膵消化物:28.3mg
ダイズのパパイン(Papic)消化物:5.0mg
デキストロース:4.2mg
塩化ナトリウム:8.3mg
リン酸二カリウム:4.2mg
が含有されていた。培地を加熱し、オートクレーブで処理する前に、最終濃度が0.5Mまたは1.5M(それぞれ、29.22g/Lおよび87.66g/L)になるように、必要に応じて塩化ナトリウム(Amresco、X190)を添加することで、浸透圧ストレスを誘導した。
GOSDで処理したまたは処理していないバチルス・リケニホルミス株ENV100の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において0.1%のOctosol SLS(FT−SLS−246DRUM、Tiarco Chemical(ジョージア州ドールトン))を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を5秒間隔で少なくとも合計15秒間、または芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が1×1010cfu/mlとなるように行った。この芽胞懸濁液から250μlを4.75mlのmTSBが入った培養管に移し、5×108cfu/mlの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ0.6の開始OD600を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求める。
懸濁した芽胞が入った培養管を速やかにボルテックスし、ゼロ時点にてOD600を測定し、37℃の水浴内においてインキュベートした。各時間間隔において、時間を記録し、培養管を取り出し、ボルテックスして、OD600を測定し、水浴に戻した。OD600の減少パーセントは、ゼロ時点の値から測定値を減算し、ゼロ時点の値で除算して、100%を乗算することにより求めた。完全な発芽は60%のOD600の減少パーセントに相当するものであることが以前に報告されている。そのため発芽パーセントはOD600の減少パーセントに1.67を乗算することにより求めた。
培地:
mTSB培地は上記のように調製したが、最終濃度が50mMとなるまでNaClを添加することで、浸透圧が平衡状態の培地を作製した。1×105ppmの硝酸銅(II)ヘミ(ペンタ水和物)(Alfa Aesar、12523)ストック溶液を、2gを20mlの水に懸濁させ、0.22μmのフィルターに通すことにより作製した。これを一定分量のmTSBに添加することで、0ppm、50ppm、100ppmおよび200ppmの最終濃度を達成した。
GOSDで処理したまたは処理していないバチルス・リケニホルミス株ENV100の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において0.1%のOctosol SLS(FT−SLS−246DRUM、Tiarco Chemical(ジョージア州ドールトン))を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を5秒間隔で少なくとも合計15秒間、または芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が2×109cfu/mlとなるように行った。この芽胞懸濁液から250μlを4.75mlのmTSBが入った培養管に移し、1×108cfu/mlの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ0.6の開始OD600を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求めた。
培地:
mTSB培地は上記のように調製したが、最終濃度が50mMとなるまでNaClを添加することで、浸透圧が平衡状態の培地を作製した。1000ppmのAl3+ストック溶液を、0.62gのAl2(SO4)3・14H2O(Alfa Aesar、12362)を50mlの水に懸濁させ、0.22μmのフィルターに通すことにより作製した。これを一定分量のmTSBに添加することで、0ppm、0.25ppm、0.50ppmおよび1.0ppmの最終濃度を達成した。培地のpHをHClの添加によりpH4.5へと下げ、Al3+イオンの完全な分離を可能にした。
GOSDで処理したまたは処理していないバチルス・リケニホルミス株ENV100の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において0.1%のOctosol SLS(FT−SLS−246DRUM、Tiarco Chemical(ジョージア州ドールトン))を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を5秒間隔で少なくとも合計15秒間、または芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が1×1010cfu/mlとなるように行った。この芽胞懸濁液から250μlを4.75mlのmTSBが入った培養管に移し、5×108cfu/mlの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ0.6の開始OD600を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求めた。
培地:
mTSB培地は上記のように調製したが、最終濃度が50mMとなるまでNaClを添加することで、浸透圧が平衡状態の培地を作製した。80mMの胆汁塩ストック溶液を、2.5gのタウロデオキシコール酸ナトリウム(Sigma、T0875)、1.1gのグリコデオキシコール酸ナトリウム(Sigma、G9910)および0.346gのデオキシコール酸ナトリウム(Sigma、D5670)を100mlの水に懸濁させ、0.22μmのフィルターに通すことにより作製した。これを一定分量のmTSBに添加することで、0mM、4mM、6mMおよび8mMの最終濃度を達成した。
GOSDで処理したまたは処理していないバチルス・リケニホルミス株ENV100の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において0.1%のOctosol SLS(FT−SLS−246DRUM、Tiarco Chemical(ジョージア州ドールトン))を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を5秒間隔で少なくとも合計15秒間、または芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が1×1010cfu/mlとなるように行った。この芽胞懸濁液から250μlを4.75mlのmTSBが入った培養管に移し、5×108cfu/mlの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ0.6の開始OD600を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求めた。
上記のように行い、算出した。
バチルス・リケニホルミス株ENV431GO+芽胞をGOSD(先に記載された手法)で処理した。対照として、GOSDを用いずに噴霧乾燥した同じ培養物由来のGO−芽胞を使用した。増殖試験を、2%のグルコースを添加した最小塩培地において行った。
培地を、(NH4)2SO4(1.26g/L)、MgCl2(0.81g/L)、CaCl2(0.15g/L)、NaCl(0.05g/L)を蒸留水に溶解し、1ml/Lの1000×Trace Mineral Mix(MnSO4(0.85g/50ml)、ZnSO4(0.15g/50ml)、FeSO4×7H2O(0.15g/50ml)、塩酸チアミン(0.05g/50ml)を添加することにより調製した。好ましい溶液をフラスコに注ぎ(90ml/フラスコ)、121℃にて40分間オートクレーブで処理した。接種前に培地に4mlの滅菌濾過した25×リン酸カリウム溶液(K2HPO4(3.44g/50ml)、KH2PO4(2.81g/50ml))、および2mlの50×グルコース(100g/200ml)を添加することで、最終濃度を2%にした。
接種に用いた芽胞の量は、GO−およびGO+芽胞粉末の菌数を用いて決定した。濃(1000×)バチルス・リケニホルミス株ENV431の芽胞懸濁液は、滅菌ブレンダージャー内の芽胞を、滅菌水を用いてブレンドすることにより調製し、培地が入ったフラスコに下記表の0時間に示されている濃度まで添加した。初期培養物のカウントはブレンドされた芽胞懸濁液の希釈およびプレートカウントを行うことにより得た。各芽胞サンプルについて3つのフラスコを準備した。
培地:
mTSBは上記のように調製したが、最終濃度が0M、0.5M、1.0M、または1.5M(それぞれ0g/L、29.22g/L、58.44g/L、または87.66g/L)となるように必要に応じて塩化ナトリウム(Amresco、X190)を添加することで、浸透圧ストレスを誘導した。培地を加熱し、フラスコに等しく分配し、オートクレーブで処理した。
カゼインの膵消化物:5.0g
酵母抽出物:2.5g
デキストロース:1.0g
寒天:15.0g
GOSDで処理したまたは処理していないバチルス・リケニホルミス株ENV100の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において0.1%のOctosol SLS(FT−SLS−246DRUM、Tiarco Chemical(ジョージア州ドールトン))を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を5秒間隔で少なくとも合計15秒間、または芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させ、その後滅菌水で段階希釈を行った。これは培養フラスコ内の最終濃度が1×102cfu/mlとなるように行った。
フラスコを150rpmで28時間(「1日」)または50時間(「2日」)振盪させながら37℃にてインキュベートした。一定分量を各フラスコからペトリ皿へと45℃未満に冷却したPCAを上から注ぐことで段階希釈し、かき混ぜ(swirled)、固化させた。プレートを反転し、37℃でおよそ24時間インキュベートした。コロニーをカウントし、希釈率に基づき濃度を算出した。また各フラスコからおよそ10μlのサンプルをPCAプレート上で画線培養し、純度を調べた。
先に記載されたようにGOSDで処理した(GO+)、および非処理の(GO−)バチルス・サブチリス株ENV923の芽胞をプロテアーゼ活性試験に使用した。
化学的に組成が明確である培地(CDSM:Chemically Defined Salt Medium)をプロテアーゼ試験における細胞増殖に使用した。培地は基となる溶液成分(g/L):(NH4)SO4、1.26g;L−グルタミン酸、1.18g;MgCl2、0.81;CaCl2、0.155および85% L−乳酸(0.530ml/L)を蒸留水に溶解し、1ml/Lの1000×Trace Mineral Mix(g/50ml)を添加することにより調製した。基となる溶液の入ったフラスコ(48ml/フラスコ)を40分間オートクレーブで処理した。接種前にグルコースを含む2mlの別々に調製した滅菌濾過済み25×緩衝溶液(g/50ml):MOPS、11.6;KH2PO4、0.6;グルコース、4.5を添加した。
接種に用いた芽胞の量は、GO−およびGO+芽胞粉末の菌数を用いて決定した。濃(1000×)バチルス・サブチリス株ENV923の芽胞懸濁液は、滅菌ブレンダージャー内の芽胞を、滅菌済みの0.01Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を用いてブレンドすることにより調製し、約1×104cfu/mlの濃度でフラスコに添加した。初期培養物の菌数はブレンドされた芽胞懸濁液の希釈およびプレートカウントを行うことにより確認した。各芽胞サンプルについて3つのフラスコを準備した。フラスコを30℃、150rpmでインキュベートし、サンプルを48時間で採取した。
プロテアーゼ活性アッセイを、基質としてカゼインと、チロシンと反応し、青色の発現を促すフォーリン−チオカルト法のフェノール試薬とを用いて細胞上清にて行った。プロテアーゼ活性単位は1分に付き1μgのチロシンを遊離させる酵素の量として定義された。試験管内のチロシンの量は、Jenwayの7305分光光度計にてOD650を測定し、検量線を用いて遊離されたチロシンを算出することにより決定した。
試薬1:0.05Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)
0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)(実施例1に記載のように調製した)を1:1の比で蒸留水にて希釈することで、0.05Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を得た。
試薬2:0.65%のカゼイン溶液
0.65gのカゼインを80mlの0.05Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に溶解し、加熱することでカゼインを溶液にし、最終容量を、0.05Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を用いて100mlにした。
試薬3:15%のトリクロロ酢酸(TCA)
15gのTCAを蒸留水に溶解し、最終容量を100mlにした。
試薬4:20%のNa2CO3
20gのNa2CO3を蒸留水に溶解し、最終容量を100mlにした。
10mlの培養物を遠心分離し、上清を0.2μmのフィルターに通して滅菌管へと濾過した。
3mlの濾過した上清を3mlの0.65%のカゼイン溶液と混合して、37℃の水浴に1時間入れた。
反応を6mlの15%のTCAを添加することにより停止させ、サンプルを5分間遠心分離した。
0.5mlの各サンプルを1mlの20%のNa2CO3と混合し、その後0.5mlのフォーリン−チオカルト法のフェノール試薬の添加および室温での20分間のインキュベーションを行うことで、青色を発現させた。
3mlの蒸留水を各サンプルに添加し、混合後にOD650を測定した。
プロテアーゼ活性を算出するために、チロシン用の検量線を、蒸留水に溶解したチロシンの希釈系列を得て、それらの希釈系列を培養サンプルと同じ条件にて処理し、OD650を測定することにより作成した。
ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス芽胞は、10mlのTX緩衝液(0.001%のTween 80を含む0.05MのTris−HCl緩衝液(pH7.3))を注ぎ、滅菌綿棒を用いて芽胞を取り出すことによりプレートから回収した。プレートからの芽胞懸濁液を50ml容の滅菌管に注いだ。全てのサンプルの芽胞懸濁液を得たら、熱ショックを、芽胞懸濁液の入った滅菌管をヒートブロックに入れ、温度を55℃に到達させ、55℃の温度を10分間維持することにより行った。熱ショック後、芽胞懸濁液を氷水中で5分間冷却し、30分間遠沈した。上清を捨て、芽胞を4℃の25mlの0.02Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に再懸濁させ、15分間遠沈した。上清を捨てた後、芽胞を20mlの0.02Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に再懸濁させ、激しく混合することで芽胞懸濁液を得て、これを実験に使用した。
密接混合物の芽胞の発芽率を発芽剤と従来的に混合した芽胞の発芽率と比較するために、下記の処理を行った。
Claims (17)
- 細菌芽胞とL−アミノ酸とを含む乾燥した密接混合物であって、該L−アミノ酸が該細菌芽胞に吸着されるか又は吸収され、該密接混合物における該細菌芽胞が、該L−アミノ酸と密接には混合していない細菌芽胞よりも、より迅速に発芽する、乾燥した密接混合物であって、
前記L−アミノ酸が、L−アラニン、L−バリン、L−プロリン、L−ロイシン、L−システイン、L−スレオニン、L−グルタミン、L−アスパラギン、L−フェニルアラニンからなる群から選択され、かつ、
前記L−アミノ酸がポリペプチドの形態でない、混合物。 - 前記芽胞が、B.アルカロフィルス、B.アルベイ、B.アミロリケファシエンス、B.アネウリノリチクス、B.アンシラシス、B.アクエマリス、B.アトロファエウス、B.ボロノフィルス、B.ブレビス、B.カルドリイカス、B.セントロスポラス、B.セレウス、B.サーキュランス、B.クラウシイ、B.コアグランス、B.フィルムス、B.フラボサーマス、B.フシホルミス、B.グロビジ、B.インフェルナス、B.ラルヴェ、B.ラテロスポラス、B.レンタス、B.レンチモルブス、B.リケニホルミス、B.メガテリウム、B.メセンテリカス、B.ムシラギノサス、B.ミコイデス、B.ナットー、B.パントテニカス(B.pantothenicus)、B.ポピリエ、B.ポリミキサ、B.シュードアンシラシス、B.プミルス、B.シュリジェリー、B.シンプレックス、B.スファエリクス、B.スポロサーモデュランス、B.ステアロサーモフィラス、B.サブチリス、B.サーモグルコシダシウス、B.チューリンゲンシス、B.ブルガチス、B.ウェイヘンステファネンシス、C.サーモセラム、C.リュングダリイ、C.アセトブチリカム、C.ベイジェリンキ、C.ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ、およびストレプトミセス属の一種からなる群から選択される、請求項1に記載の混合物。
- 前記混合物が、L−アラニン+バチルス・サブチリス、L−アラニン+バチルス・リケニホルミス、L−アラニン+バチルス・プミルス、L−アラニン+バチルス・アミロリケファシエンス、L−アラニン+バチルス・コアグランス、L−アラニン+バチルス・セレウス、L−アラニン+バチルス・クラウシイ、L−アラニン+クロストリジウム・ブチリカム、L−バリン+バチルス・サブチリス、L−バリン+バチルス・リケニホルミス、L−バリン+バチルス・プミルス、L−バリン+バチルス・アミロリケファシエンス、L−バリン+バチルス・コアグランス、L−バリン+バチルス・セレウス、L−バリン+バチルス・クラウシイ、L−バリン+クロストリジウム・ブチリカム、L−アラニン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+バチルス・サブチリス、L−アラニン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+バチルス・リケニホルミス、L−アラニン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+バチルス・プミルス、L−アラニン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+バチルス・アミロリケファシエンス、L−アラニン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+バチルス・コアグランス、L−アラニン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+バチルス・セレウス、L−アラニン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+バチルス・クラウシイ、L−アラニン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+クロストリジウム・ブチリカム、L−アスパラギン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+バチルス・サブチリス、L−アスパラギン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+バチルス・リケニホルミス、L−アスパラギン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+バチルス・プミルス、L−アスパラギン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+バチルス・アミロリケファシエンス、L−アスパラギン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+バチルス・コアグランス、L−アスパラギン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+バチルス・セレウス、L−アスパラギン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+バチルス・クラウシイ、L−アスパラギン+グルコース+フルクトース+カリウムイオン(GFK)+クロストリジウム・ブチリカム、L−アラニン+イノシン+バチルス・サブチリス、L−アラニン+イノシン+バチルス・リケニホルミス、L−アラニン+イノシン+バチルス・プミルス、L−アラニン+イノシン+バチルス・アミロリケファシエンス、L−アラニン+イノシン+バチルス・コアグランス、L−アラニン+イノシン+バチルス・セレウス、L−アラニン+イノシン+バチルス・クラウシイ、L−アラニン+イノシン+クロストリジウム・ブチリカム、L−プロリン+グルコース+バチルス・メガテリウム、およびL−プロリン+バチルス・メガテリウムからなる群から選択される混合物である、請求項1に記載の混合物。
- 噴霧乾燥、凍結乾燥、空気乾燥またはドラム乾燥により作製される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の混合物。
- 前記芽胞が、B.サブチリス、B.アミロリケファシエンス、B.リケニホルミス、B.メガテリウムおよびB.プミルスからなる群から選択され、前記L−アミノ酸が、L−アラニン、L−バリンおよびL−アスパラギンからなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の混合物。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の乾燥した密接混合物を含む組成物。
- 腸溶性コーティングを更に備える、請求項6に記載の組成物。
- 細菌芽胞とL−アミノ酸とを含む乾燥した密接混合物を作製する方法であって、該方法が、
a)細菌芽胞とL−アミノ酸とを含む溶液を準備することと、
b)前記溶液を乾燥することで、細菌芽胞とL−アミノ酸とを含む乾燥した密接混合物を得ることと、
を含み、前記L−アミノ酸が前記細菌芽胞に吸着されるか又は吸収され、前記密接混合物における前記細菌芽胞が、前記L−アミノ酸と密接には混合していない細菌芽胞よりも、より迅速に発芽する、方法であって、
前記L−アミノ酸が、L−アラニン、L−バリン、L−プロリン、L−ロイシン、L−システイン、L−スレオニン、L−グルタミン、L−アスパラギン、L−フェニルアラニンからなる群から選択され、かつ、前記L−アミノ酸がポリペプチドの形態でない、方法。 - 前記乾燥が噴霧乾燥、凍結乾燥、空気乾燥またはドラム乾燥である、請求項8に記載の方法。
- 前記芽胞が、B.アルカロフィルス、B.アルベイ、B.アミロリケファシエンス、B.アネウリノリチクス、B.アンシラシス、B.アクエマリス、B.アトロファエウス、B.ボロノフィルス、B.ブレビス、B.カルドリイカス、B.セントロスポラス、B.セレウス、B.サーキュランス、B.クラウシイ、B.コアグランス、B.フィルムス、B.フラボサーマス、B.フシホルミス、B.グロビジ、B.インフェルナス、B.ラルヴェ、B.ラテロスポラス、B.レンタス、B.レンチモルブス、B.リケニホルミス、B.メガテリウム、B.メセンテリカス、B.ムシラギノサス、B.ミコイデス、B.ナットー、B.パントテニカス(B.pantothenicus)、B.ポピリエ、B.ポリミキサ、B.シュードアンシラシス、B.プミルス、B.シュリジェリー、B.シンプレックス、B.スファエリクス、B.スポロサーモデュランス、B.ステアロサーモフィラス、B.サブチリス、B.サーモグルコシダシウス、B.チューリンゲンシス、B.ブルガチス、B.ウェイヘンステファネンシス、C.サーモセラム、C.リュングダリイ、C.アセトブチリカム、C.ベイジェリンキ、C.ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ、およびストレプトミセス属の一種からなる群から選択される、請求項8または9に記載の方法。
- 前記芽胞が、B.サブチリス、B.アミロリケファシエンス、B.リケニホルミス、B.メガテリウムおよびB.プミルスからなる群から選択され、前記L−アミノ酸が、L−アラニン、L−バリンおよびL−アスパラギンからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
- 請求項8〜11のいずれか一項に記載の方法により作製される乾燥した密接混合物。
- 細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および/または酵素活性を増大させる方法であって、該方法は、
a)細菌芽胞とL−アミノ酸とを含む溶液を準備することと、
b)前記溶液を乾燥することで、細菌芽胞とL−アミノ酸とを含む乾燥した密接混合物を得ることと、
を含み、前記L−アミノ酸が前記細菌芽胞に吸着されるか又は吸収され、さらに該方法は、
c)前記密接混合物を前記細菌芽胞の発芽を促す環境に曝すことを含み、該密接混合物における該細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および/または酵素活性が、L−アミノ酸を欠く対応する細菌芽胞配合物に比べて増大する、方法であって、
前記L−アミノ酸が、L−アラニン、L−バリン、L−プロリン、L−ロイシン、L−システイン、L−スレオニン、L−グルタミン、L−アスパラギン、L−フェニルアラニンからなる群から選択され、かつ、前記L−アミノ酸がポリペプチドの形態でない、方法。 - 前記密接混合物における細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および/または酵素活性のパーセントが、L−アミノ酸を欠く前記対応する細菌芽胞配合物に比べて少なくとも10%増大する、請求項13に記載の方法。
- 前記乾燥が噴霧乾燥、凍結乾燥、空気乾燥またはドラム乾燥である、請求項13または14に記載の方法。
- 前記芽胞が、B.アルカロフィルス、B.アルベイ、B.アミロリケファシエンス、B.アネウリノリチクス、B.アンシラシス、B.アクエマリス、B.アトロファエウス、B.ボロノフィルス、B.ブレビス、B.カルドリイカス、B.セントロスポラス、B.セレウス、B.サーキュランス、B.クラウシイ、B.コアグランス、B.フィルムス、B.フラボサーマス、B.フシホルミス、B.グロビジ、B.インフェルナス、B.ラルヴェ、B.ラテロスポラス、B.レンタス、B.レンチモルブス、B.リケニホルミス、B.メガテリウム、B.メセンテリカス、B.ムシラギノサス、B.ミコイデス、B.ナットー、B.パントテニカス(B.pantothenicus)、B.ポピリエ、B.ポリミキサ、B.シュードアンシラシス、B.プミルス、B.シュリジェリー、B.シンプレックス、B.スファエリクス、B.スポロサーモデュランス、B.ステアロサーモフィラス、B.サブチリス、B.サーモグルコシダシウス、B.チューリンゲンシス、B.ブルガチス、B.ウェイヘンステファネンシス、C.サーモセラム、C.リュングダリイ、C.アセトブチリカム、C.ベイジェリンキ、C.ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ、およびストレプトミセス属の一種からなる群から選択される、請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記芽胞が、B.サブチリス、B.アミロリケファシエンス、B.リケニホルミス、B.メガテリウムおよびB.プミルスからなる群から選択され、前記L−アミノ酸が、L−アラニン、L−バリンおよびL−アスパラギンからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
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