KR20150133699A - 건조된 포자 발아성 화합물 혼합물 - Google Patents
건조된 포자 발아성 화합물 혼합물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20150133699A KR20150133699A KR1020157021934A KR20157021934A KR20150133699A KR 20150133699 A KR20150133699 A KR 20150133699A KR 1020157021934 A KR1020157021934 A KR 1020157021934A KR 20157021934 A KR20157021934 A KR 20157021934A KR 20150133699 A KR20150133699 A KR 20150133699A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- rain
- alanine
- bacillus
- glucose
- fructose
- Prior art date
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 107
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 230000035784 germination Effects 0.000 claims abstract description 95
- 210000004666 bacterial spore Anatomy 0.000 claims abstract description 75
- 239000011872 intimate mixture Substances 0.000 claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 50
- 230000002070 germicidal effect Effects 0.000 claims abstract description 39
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 29
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000004215 spore Anatomy 0.000 claims description 161
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 105
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 102
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 87
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 87
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 72
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 64
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 62
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 59
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 52
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 51
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 51
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 51
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 claims description 45
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 44
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 38
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 36
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 36
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 32
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 31
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 claims description 22
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 22
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 claims description 22
- 241000193171 Clostridium butyricum Species 0.000 claims description 20
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 claims description 18
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 17
- 241001328122 Bacillus clausii Species 0.000 claims description 17
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 16
- 241001668579 Pasteuria Species 0.000 claims description 15
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 15
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 13
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 13
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 claims description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 13
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 13
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 claims description 13
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 12
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 12
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 10
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 claims description 9
- 241001660259 Cereus <cactus> Species 0.000 claims description 9
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 9
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 claims description 8
- 238000007605 air drying Methods 0.000 claims description 8
- 238000002036 drum drying Methods 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241001593730 Acacia salicina Species 0.000 claims description 6
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 6
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 6
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 claims description 6
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 claims description 6
- 241000866625 Polymorphus Species 0.000 claims description 6
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 claims description 6
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 claims description 6
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 claims description 6
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N L-lactic acid Chemical compound C[C@H](O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 5
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 5
- 241000194106 Bacillus mycoides Species 0.000 claims description 4
- 241000405816 Pompilus Species 0.000 claims description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940116871 l-lactate Drugs 0.000 claims description 3
- 241000193741 Aneurinibacillus aneurinilyticus Species 0.000 claims description 2
- 241001468259 Anoxybacillus flavithermus Species 0.000 claims description 2
- 241000193375 Bacillus alcalophilus Species 0.000 claims description 2
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 claims description 2
- 241001143891 Bacillus aquimaris Species 0.000 claims description 2
- 241000193410 Bacillus atrophaeus Species 0.000 claims description 2
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 claims description 2
- 241000193747 Bacillus firmus Species 0.000 claims description 2
- 241001515794 Bacillus infernus Species 0.000 claims description 2
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 claims description 2
- 241000193400 Bacillus simplex Species 0.000 claims description 2
- 241000202341 Bacillus sporothermodurans Species 0.000 claims description 2
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims description 2
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 claims description 2
- 241000534628 Brevibacillus centrosporus Species 0.000 claims description 2
- 241000193417 Brevibacillus laterosporus Species 0.000 claims description 2
- 241000193401 Clostridium acetobutylicum Species 0.000 claims description 2
- 241000193454 Clostridium beijerinckii Species 0.000 claims description 2
- 241000186566 Clostridium ljungdahlii Species 0.000 claims description 2
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 claims description 2
- 241000033197 Hemibarbus labeo Species 0.000 claims description 2
- 241001134775 Lysinibacillus fusiformis Species 0.000 claims description 2
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 claims description 2
- 241000178961 Paenibacillus alvei Species 0.000 claims description 2
- 241000193418 Paenibacillus larvae Species 0.000 claims description 2
- 241001310335 Paenibacillus lentimorbus Species 0.000 claims description 2
- 241000881860 Paenibacillus mucilaginosus Species 0.000 claims description 2
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 claims description 2
- 241001310339 Paenibacillus popilliae Species 0.000 claims description 2
- 241000193390 Parageobacillus thermoglucosidasius Species 0.000 claims description 2
- 241000193448 Ruminiclostridium thermocellum Species 0.000 claims description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 claims description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims 4
- 241001242657 Pasteuria nishizawae Species 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 47
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 27
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 26
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 18
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 14
- 241000894007 species Species 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 11
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 10
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 8
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 8
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 8
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 8
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 8
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 6
- 230000004763 spore germination Effects 0.000 description 6
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 6
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- -1 bile acid salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 5
- 239000001967 plate count agar Substances 0.000 description 5
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 5
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005838 Streptomyces K61 (formerly S. griseoviridis) Substances 0.000 description 4
- 241000191251 Streptomyces griseoviridis Species 0.000 description 4
- 241000187392 Streptomyces griseus Species 0.000 description 4
- 241000187418 Streptomyces rochei Species 0.000 description 4
- 241000187177 Streptomyces thermovulgaris Species 0.000 description 4
- 241000764855 Streptomyces viridis Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 4
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000287826 Gallus Species 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 3
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- XTVVROIMIGLXTD-UHFFFAOYSA-N copper(II) nitrate Chemical compound [Cu+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O XTVVROIMIGLXTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229920003132 hydroxypropyl methylcellulose phthalate Polymers 0.000 description 3
- 229940031704 hydroxypropyl methylcellulose phthalate Drugs 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 3
- CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-m-cresol Chemical compound CC1=CC(O)=CC=C1Cl CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001156739 Actinobacteria <phylum> Species 0.000 description 2
- 229920000623 Cellulose acetate phthalate Polymers 0.000 description 2
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241000187191 Streptomyces viridochromogenes Species 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 229940081734 cellulose acetate phthalate Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000010200 folin Substances 0.000 description 2
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229920000639 hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate Polymers 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 2
- 238000003614 protease activity assay Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 2
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 2
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XIZXADDGOCJZAL-UHFFFAOYSA-N 3h-dioxole-5-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CCOO1 XIZXADDGOCJZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N RDIKFPRVLJLMER-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000186984 Kitasatospora aureofaciens Species 0.000 description 1
- HQMLIDZJXVVKCW-REOHCLBHSA-N L-alaninamide Chemical compound C[C@H](N)C(N)=O HQMLIDZJXVVKCW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- HSQGMTRYSIHDAC-BQBZGAKWSA-N Leu-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HSQGMTRYSIHDAC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 206010027146 Melanoderma Diseases 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KTHDTJVBEPMMGL-VKHMYHEASA-N N-acetyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)=O KTHDTJVBEPMMGL-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KTHDTJVBEPMMGL-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-L-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(C)=O KTHDTJVBEPMMGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019280 Pancreatic lipases Human genes 0.000 description 1
- 108050006759 Pancreatic lipases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000142909 Streptomyces acidiscabies Species 0.000 description 1
- 241000468326 Streptomyces alni Species 0.000 description 1
- 241001467541 Streptomyces galbus Species 0.000 description 1
- 241000218483 Streptomyces lydicus Species 0.000 description 1
- 241000187395 Streptomyces microflavus Species 0.000 description 1
- 241000187412 Streptomyces plicatus Species 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- YEXRLSXNWLNHQR-RGMNGODLSA-N [(2s)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopropan-2-yl]azanium;chloride Chemical compound Cl.C[C@H](N)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 YEXRLSXNWLNHQR-RGMNGODLSA-N 0.000 description 1
- WIQIWPPQGWGVHD-JEDNCBNOSA-N [(2s)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-1-oxopropan-2-yl]azanium;chloride Chemical compound Cl.C[C@H](N)C(=O)OC(C)(C)C WIQIWPPQGWGVHD-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- ZUAAPNNKRHMPKG-UHFFFAOYSA-N acetic acid;butanedioic acid;methanol;propane-1,2-diol Chemical compound OC.CC(O)=O.CC(O)CO.OC(=O)CCC(O)=O ZUAAPNNKRHMPKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006318 anionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- RLMHWGDKMJIEHH-QRPNPIFTSA-N benzyl (2s)-2-aminopropanoate;hydrochloride Chemical compound Cl.C[C@H](N)C(=O)OCC1=CC=CC=C1 RLMHWGDKMJIEHH-QRPNPIFTSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960002242 chlorocresol Drugs 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 1
- 150000003946 cyclohexylamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- JCXLZWMDXJFOOI-WCCKRBBISA-N ethyl (2s)-2-aminopropanoate;hydrochloride Chemical compound Cl.CCOC(=O)[C@H](C)N JCXLZWMDXJFOOI-WCCKRBBISA-N 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002816 gill Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- DWKPPFQULDPWHX-VKHMYHEASA-N l-alanyl ester Chemical compound COC(=O)[C@H](C)N DWKPPFQULDPWHX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M methyl sulfate(1-) Chemical compound COS([O-])(=O)=O JZMJDSHXVKJFKW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- KKHLKORVTUUSBC-YFKPBYRVSA-N n-(2,4-dinitrophenyl)-l-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O KKHLKORVTUUSBC-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940116369 pancreatic lipase Drugs 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940100467 polyvinyl acetate phthalate Drugs 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 210000004911 serous fluid Anatomy 0.000 description 1
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- 229940045946 sodium taurodeoxycholate Drugs 0.000 description 1
- YXHRQQJFKOHLAP-FVCKGWAHSA-M sodium;2-[[(4r)-4-[(3r,5r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,12-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]ethanesulfonate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 YXHRQQJFKOHLAP-FVCKGWAHSA-M 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000003330 sporicidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/742—Spore-forming bacteria, e.g. Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, clostridium or Lactobacillus sporogenes
-
- A23K1/008—
-
- A23K1/16—
-
- A23L1/3014—
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
- A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2200/00—Function of food ingredients
- A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
- A23V2200/32—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the health of the digestive tract
- A23V2200/3204—Probiotics, living bacteria to be ingested for action in the digestive tract
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physiology (AREA)
Abstract
한 측면에서, 본 발명은 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 건조된 친밀한 혼합물, 및 이러한 친밀한 혼합물의 제조 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 친밀한 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 박테리아 포자 및 발아성 화합물의 친밀한 혼합물을 제조하는 것을 포함하는, 박테리아 포자의 발아, 성장, 대사 및/또는 효소 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2013년 2월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 61/849,973을 우선권 주장하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
한 측면에서, 본 발명은 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 건조된 친밀한 혼합물, 및 이러한 혼합물의 제조 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 일반적으로, 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 건조된 친밀한 혼합물을 제조하는 것을 포함하는, 박테리아 포자의 발아, 성장, 대사 및/또는 효소 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
인간과 동물 둘 다에 대한 프로바이오틱스(probiotics)로서 특정의 바실루스 (Bacillus) 균주를 포함한 포자 형성성 박테리아를 사용하는 것이 최근 수년간 유행되었다. 문헌 (Knap et al., WO 2010/070005)에서 언급된 바와 같이, 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 및 바실루스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis)와 같은 종이, 동물 사료로부터의 영양소의 소화와 이용 가능성을 증가시킴으로써 성장을 증진시키기 위해 동물 사료 내의 보충제로서 사용되고 있다. 바실루스 코아굴란스 (Bacillus coagulans)는 인간의 소비를 위한 상업 프로바이오틱 제품 내의 활성 성분으로서, 단백질, 락토스 및 프룩토스의 소화에 도움을 준다.
문헌 [Maathuis et al., 2010, Beneficial Microbes, 1(1): 31-36]에 언급된 바와 같이, 상기 박테리아가 프로바이오틱스로서 기능하기 위해서는 그의 발아 형태 또는 영양생장(vegetative) 형태로 소장에 존재해야만 한다. 이러한 미생물이 그의 포자 형태에서 위산과 담즙산염에 대해 저항성이긴 하지만, 그들의 영양생장 상태에서는 상기 환경에 대해 감수성이다. 따라서, 그들의 영양생장 상태로 이용된 경우에는, 바실루스 균주가 제약상 허용되는 산-저항성 또는 "장내" 담체 내에 함유되어야만 한다 (미국 특허 출원 2003/0124104 (Farmer)의 단락 7 참조).
불행하게도, 영양생장 형태의 바실루스 종을 제제화하기는 어렵기 때문에, 이들 종은 적당한 저장 수명을 보유할 것이다. GanedenBC 제품 문헌에 언급된 바와 같이, 전통적인 영양생장 프로바이오틱스는 제조 공정에 있어서 고열과 압력을 견디지 못하고, 저장시 신속하게 사멸하며, 소화관 내의 위산과 담즙 효소에 대해 민감하다. 이와는 달리, 상기 종을 포자 형태로 제제화하는 것이 상업적 및 실용적 용도에 훨씬 더 적합하다. 따라서, 문헌 [Cartman et al., 2008, Applied and Environmental Microbiology, Aug., p. 5254-5258]에 의해 언급된 바와 같이, "박테리아 포자는 생 미생물 제품으로서 사용하기에 특히 잘 적합한데, 이는 이들이 대사적으로 휴지기이고 환경 스트레스에 대해서도 고도로 회복력이 있기 때문이다. 이들 고유 특성은 상업적 관점에서 매우 바람직한데, 이는 포자에 기반한 제품의 저장 수명이 길고, 유통과 저장 동안에도 그의 생육성을 유지하고 있다는 것을 의미한다".
바실루스 포자의 발아를 자극하기 위하여 특정의 화합물, 특히 특정의 L-아미노산을 사용하는 것이 관련 기술분야의 문헌에 보고되었다. 따라서, 예를 들어 문헌 [Foerster et al., 1966, Journal of Bacteriology 91(3):1168-1177]에는 L-알라닌을 수용액 중의 포자 현탁물에 부가하면, 수많은 바실루스 종의 발아가 유발될 것이라고 개시되어 있다. 또한, 상기 인용된 문헌 (Maathius et al.)에서는 GanedenBC 중의 바실루스 코아굴란스 포자가, 이들을 L-알라닌 함유 식사와 함께 섭취하거나 또는 L-알라닌을 상기 포자와 함께 분말 제제 중에 포함시킴으로써 소장의 시작부에서 발아되도록 촉발될 수 있었다고 제안되었다. 그러나, 마티우스(Maathius)에 의해 제안된 접근 방식은 프로바이오틱하게 유효한 박테리아성 배양물을 확립하는 데에 대한 몇 가지 주요 과제를 제공한다:
1) GanedenBC에서 이용된 바실루스 코아굴란스 포자 자체가 위에서의 낮은 pH에 대해 상당히 저항성이긴 하지만, 이러한 산에 노출되면, 상기 포자가 보다 중성인 pH 내로 유입되는 경우에는 발아가 지체될 수 있었다. 예를 들어, 문헌 [Blocher et al., 1985, Applied and Environmental Microbiology 50(2):274-279]에서는 비. 세레우스 (B. cereus) 포자가 심지어 발아성 화합물 L-알라닌 또는 L-시스테인의 존재 하에서도 pH 4.5 하에 발아가 억제되었다는 것을 명확히 보여주었다. pH 4.5 완충액에 이어 pH 7.0 완충액에 순차적으로 노출된 포자는 상기 L-아미노산에 대한 노출시 발아될 수 있었지만, 발아를 실행하는 데 있어서 지체를 나타내었다. 포자가 배출되기 전에 소장에 존재할 수 있는 시간이 비교적 짧다는 것을 고려해 볼 때, 발아에 있어서의 어떠한 실질적인 지체도 매우 바람직하지 못하다. 이는 보다 작은 동물, 예컨대 1일생인 경우에는 사료 체류 시간이 약 1.5시간이고 7일생인 경우에는 사료 체류 시간이 2시간 미만인 병아리 (문헌 [B. C. Watson et al., 2006, Poultry Science 85:493-497] 참조), 및 사료 체류 시간이 90분 미만인 새우 (문헌 [Beseres et al., 2005, Journal of Shellfish Research 24(1):301-308] 참조)에게 특히 적용된다. 따라서, 위에서 발견된 바와 같은 낮은 pH에 대한 노출 조건 하에서 박테리아 포자의 발아를 가속시키고 증가시킬 필요성은 여전히 존재한다.
2) L-알라닌 함량이 높은 식사는 D-알라닌 함량이 높을 수도 있다. 문헌 [Atluri et al., 2006, Journal of Bacteriology 188(1): 28-36], 및 [Blocher et al. (상기 인용됨)]에 의해 언급된 바와 같이, D-알라닌은 바실루스 발아의 강력한 억제제이다. 또한, 바실루스 포자와 분말 형태로 혼합된 경우에 L-알라닌과 경쟁할 수 있는, 소장에 존재하는 다량의 다른 발아 억제제 (예를 들어, 다른 D-아미노산, 무기 및 유기 산, 지방산 및 담즙산염)가 있을 수 있다. 따라서, 발아성 화합물과 경쟁할 수 있는 발아 억제제의 존재 하에서 포자 발아를 개선시키는 방법을 개발할 필요가 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 이러한 이점을 제공할 수 있는 박테리아 포자 제제를 제공하는 것이다.
놀랍게도, 박테리아 포자 발아, 성장, 대사 및 효소 활성이, 박테리아 포자 및 발아성 화합물의 친밀한 혼합물의 형성을 통하여 증가되는 것으로 밝혀졌다. 예상치 못하게도, 이러한 친밀한 혼합물은 또한, 발아 억제제의 존재 하에서도 박테리아 포자의 발아와 성장을 증가시킨다.
한 측면에서, 본 발명은 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하며, 여기서 상기 박테리아 포자 및 발아성 화합물은 이들이 발아에 도움이 되는 환경에 도달할 때까지 근접한 위치에서 유지되는 것인 건조된 친밀한 혼합물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하며, 여기서 상기 박테리아 포자 및 발아성 화합물은 이들이 발아에 도움이 되는 환경에 도달할 때까지 근접한 위치에서 유지되는 것인 건조된 친밀한 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은
a) 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 용액을 제조하는 단계; 및
b) 상기 용액을 건조시켜, 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 건조된 친밀한 혼합물을 수득하며, 여기서 상기 박테리아 포자 및 발아성 화합물은 이들이 발아에 도움이 되는 환경에 도달할 때까지 근접한 위치에서 유지되는 것인 단계
를 포함하는, 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 건조된 친밀한 혼합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한 추가의 측면에서, 본 발명은
a) 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 용액을 제조하는 단계;
b) 상기 용액을 건조시켜, 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 건조된 친밀한 혼합물을 수득하며, 여기서 상기 박테리아 포자 및 발아성 화합물은, 이들이 박테리아 포자의 발아에 도움이 되는 환경에 도달할 때까지 근접한 위치에서 유지되는 것인 단계; 및
c) 상기 친밀한 혼합물을 박테리아 포자의 발아에 도움이 되는 환경에 노출시키며, 여기서 친밀한 혼합물 중의 박테리아 포자의 발아, 성장, 대사 및/또는 효소 활성은, 발아성 화합물이 결여된 상응하는 박테리아 포자 제제와 비교하여 증가되는 것인 단계
를 포함하는, 박테리아 포자의 발아, 성장, 대사 및/또는 효소 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 혼합물은 박테리아 포자 및 발아성 화합물로 구성된다. 이용된 박테리아 종은 포자를 형성하는 어떠한 종일 수도 있고, 이는 전형적으로, 인간 또는 동물에게서 바람직한 프로바이오틱 활성을 나타내는 것이다. 그러나, 농업, 환경 개선, 퇴비 또는 메탄 생산, 청소 용품 등에 유용한 것을 포함한, 다른 산업적으로 적용되는 박테리아 종이 이용될 수도 있다. 이러한 종은 그 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition (2009)]에 열거된 바와 같은, 피르미쿠테스(Firmicutes) 문의 포자 형성성 구성원 및 악티노박테리아(Actinobacteria) 문의 포자 형성성 구성원을 포함한다. 피르미쿠테스 문의 구성원은 호기성 포자-형성성 종 (일반적으로, 바실루스 종으로서 기존에 정의됨) 및 혐기성 포자-형성성 종 (일반적으로, 클로스트리디움 (Clostridium) 종으로서 기존에 정의됨)을 포함한다. 피르미쿠테스 문의 예시 종은 비. 알칼로필루스 (B. alcalophilus), 비. 알베이 (B. alvei), 비. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), 비. 아네우리노리티쿠스 (B. aneurinolyticus), 비. 안트라시스 (B. anthracis), 비. 아쿠아에마리스 (B. aquaemaris), 비. 아트로파에우스 (B. atrophaeus), 비. 보로노필루스 (B. boronophilus), 비. 브레비스 (B. brevis), 비. 칼도리이쿠스 (B. caldolyyicus), 비. 센트로스포루스 (B. centrosporus), 비. 세레우스 (B. cereus), 비. 시르쿨란스 (B. circulans), 비. 클라우시이 (B. clausii), 비. 코아굴란스 (B. coagulans), 비. 피르무스 (B. firmus), 비. 플라보써무스 (B. flavothermus), 비. 푸시포르미스 (B. fusiformis), 비. 글로비기이 (B. globigii), 비. 인페르누스 (B. infernus), 비. 라르바에 (B. larvae), 비. 라테로스포루스 (B. laterosporus), 비. 렌티모르부스 (B. lentimorbus), 비. 렌투스 (B. lentus), 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis), 비. 메가테리움 (B. megaterium), 비. 메센테리쿠스 (B. mesentericus), 비. 무실라기노수스 (B. mucilaginosus), 비. 미코이데스 (B. mycoides), 비. 나토 (B. natto), 비. 판토테니쿠스 (B. pantothenicus), 비. 포필리아에 (B. popilliae), 비. 폴리믹사 (B. polymyxa), 비. 슈도안트라시스 (B. pseudoanthracis), 비. 푸밀루스 (B. pumilus), 비. 슐레겔리이 (B. schlegelii), 비. 심플렉스 (B. simplex), 비. 스파에리쿠스 (B. sphaericus), 비. 스포로써모두란스 (B. sporothermodurans), 비. 스테아로써모필루스 (B. stearothermophilus), 비. 서브틸리스 (B. subtilis), 비. 써모글루코시다시우스 (B. thermoglucosidasius), 비. 투린기엔시스 (B. thuringiensis), 비. 불가티스 (B. vulgatis), 비. 웨이헨스테파넨시스 (B. weihenstephanensis), 씨. 써모셀룸 (C. thermocellum), 씨. 륭달리이 (C. ljungdahlii), 씨. 아세토부틸리쿰 (C. acetobutylicum), 씨. 베이제린크키이 (C. beijerinckii), 씨. 부티리쿰 (C. butyricum), 파스테우리아 페네트란스 (Pasteuria penetrans), 파스테우리아 토르네이 (Pasteuria thornei), 및 파스테우리아 니쉬자와 (Pasteuria nishizawa) 뿐만 아니라 상기 종의 유전적으로 변형된 변이체를 포함한다. 바람직한 종은 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 브레비스, 비. 세레우스, 비. 시르쿨란스, 비. 클라우시이, 비. 코아굴란스, 비. 피르무스, 비. 라테로스포루스, 비. 렌투스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 비. 폴리믹사, 비. 푸밀루스, 비. 심플렉스, 비. 스파에리쿠스, 비. 스테아로써모필루스, 비. 서브틸리스, 비. 투린기엔시스 및 씨. 부티리쿰을 포함한다. 악티노박테리아 문의 구성원은 스트렙토미세스 (Streptomyces) 종 뿐만 아니라 이러한 종의 유전적으로 변형된 변이체를 포함한다. 바람직한 종은 스트렙토미세스 비리도크로모게네스 (Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토미세스 그리세오비리디스 (Streptomyces griseoviridis), 스트렙토미세스 리디쿠스 (Streptomyces lydicus), 스트렙토미세스 플리카투스 (Streptomyces plicatus), 스트렙토미세스 신데네우시스 (Streptomyces sindeneusis), 스트렙토미세스 로체이 (Streptomyces rochei), 스트렙토미세스 알니 (Streptomyces alni), 스트렙토미세스 비리디스 (Streptomyces viridis), 스트렙토미세스 써모불가리스 (Streptomyces thermovulgaris), 스트렙토미세스 그리세우스 (Streptomyces griseus), 스트렙토미세스 아시디스카비에스 (Streptomyces acidiscabies), 스트렙토미세스 아우레오파시엔스 (Streptomyces aureofaciens), 스트렙토미세스 갈부스 (Streptomyces galbus), 스트렙토미세스 미크로플라부스 (Streptomyces microflavus), 및 스트렙토미세스 아우레오파시엔스를 포함한다.
발아성 화합물은 이것과 친밀하게 혼합되고 이러한 친밀한 혼합물을 형성하는 데 유용한 공정, 예컨대 분무 건조, 동결 건조, 공기 건조 또는 드럼 건조를 잘 받아들이는 특별한 포자-형성성 박테리아 종의 발아를 유발시키는 데 유효한 모든 화합물을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 발아성 화합물은 L-아미노산인데, 이는 L-알라닌, L-발린, L-프롤린, L-류신, L-시스테인, L-트레오닌, L-글루타민, L-아스파라긴, L-페닐알라닌 및 그의 유사체를 포함한다. 이러한 유사체는 염기 화학의 기 상에 또는 기 내에 치환물을 만듦으로써 통상의 기술자에 의해 창출될 수 있다. 따라서, 예를 들어 L-알라닌의 유사체는 L-Leu-L-Ala, L-Ala-L-Leu, L-Pro-L-Ala, L-Ala-L-Pro, a-L-Glu-L-Ala, L-Ala-L-Glu, L-His-L-Ala, L-Ala-L-His, L-Ala-L-Ala, Gly-L-Ala, L-Ala-Gly, N42-(메틸술포닐)에틸옥시카르보닐-L-알라닌 디시클로헥실암모늄 염 (N-MSOC-L-Ala), N-t-부톡시카르보닐-L-알라닌 (N-t-BOC-L-Ala), N-아세틸-L-알라닌 (N-Ac-L-Ala), N-2,4-디니트로페닐-L-알라닌 (N-DNP-L-Ala), N-카르보벤족시-L-알라닌 (N-CBZ-L-Ala), 5-디메틸아미노-1-나프탈렌술포닐-L-알라닌 시클로헥실아민 염 (N-단실-L-Ala), N-벤조일-L-알라닌 (N-Bz-L-Ala), L-알라닌 메틸 에스테르 히드로클로라이드, L-알라닌 에틸 에스테르 히드로클로라이드, L-알라닌 t-부틸 에스테르 히드로클로라이드, L-알라닌 벤질 에스테르 히드로클로라이드, L-알라닌아미드, L-알라닌 p-니트로아닐리드 히드로클로라이드 및 L-알라닌올을 포함한다. 한 실시양태에서, 발아성 화합물은 L-알라닌, L-발린, L-프롤린, L-류신, L-시스테인, L-트레오닌, L-글루타민, L-아스파라긴, 및 L-페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이다. 바람직하게, 상기 발아성 화합물은 L-알라닌이다.
상기 아미노산은 개별 화합물로서 이용될 수 있거나 또는 폴리펩티드의 형태로 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 단백질 가수분해물, 예를 들어 카세인 가수분해물이다. 유용한 폴리펩티드는 전형적으로, 발아체로서 기능하게 될 아미노산, 예컨대 L-알라닌, L-발린, L-프롤린, L-류신, L-시스테인, L-트레오닌, L-글루타민, L-아스파라긴, 및 L-페닐알라닌을 50% 이상 포함할 것인데, 이러한 퍼센트는 폴리펩티드 중의 아미노산의 수를 근거로 한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 발아성 화합물은 L-아미노산, 단백질, 당, 및 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 박테리아 포자/발아성 화합물 조합물은 다음을 포함한다:
L-알라닌 + 바실루스 서브틸리스, L-알라닌 + 바실루스 리케니포르미스, L-알라닌 + 바실루스 푸밀루스 (Bacillus pumilus), L-알라닌 + 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), L-알라닌 + 바실루스 코아굴란스, L-알라닌 + 바실루스 세레우스 (Bacillus cereus), L-알라닌 + 바실루스 클라우시이 (Bacillus clausii), L-알라닌 + 클로스트리디움 부티리쿰 (Clostridium butyricum),
L-발린 + 바실루스 서브틸리스, L-발린 + 바실루스 리케니포르미스, L-발린 + 바실루스 푸밀루스, L-발린 + 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, L-발린 + 바실루스 코아굴란스, L-발린 + 바실루스 세레우스, L-발린 + 바실루스 클라우시이, L-발린 + 클로스트리디움 부티리쿰,
L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 서브틸리스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 리케니포르미스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 푸밀루스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 코아굴란스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 세레우스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 클라우시이, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 클로스트리디움 부티리쿰,
L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 서브틸리스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 리케니포르미스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 푸밀루스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 코아굴란스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 세레우스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 클라우시이, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 클로스트리디움 부티리쿰,
L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 서브틸리스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 리케니포르미스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 푸밀루스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 코아굴란스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 세레우스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 클라우시이, L-알라닌 + 이노신 + 클로스트리디움 부티리쿰,
L-프롤린 + 글루코스 + 바실루스 메가테리움 (Bacillus megaterium), L-프롤린 + 바실루스 메가테리움, 및 L-락테이트 + 클로스트리디움 부티리쿰.
특정 실시양태에서, 본 발명의 바람직한 혼합물은 포자가 비. 서브틸리스, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 및 비. 푸밀루스로 이루어진 군으로부터 선택되고; 발아성 화합물이 L-알라닌, L-발린, 및 L-아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
발아성 화합물은 이용된 박테리아 포자가 발아를 유발시키기에 충분한 양으로 존재한다. 이것이 통상적인 실험에 의해 어떠한 특별한 박테리아 포자/발아성 화합물 혼합물에 대해서도 용이하게 결정될 수 있긴 하지만, 이러한 발아성 화합물은 전형적으로, 건조되기 이전에, 0.0001 mg/mL 내지 170 mg/mL의 농도 하에서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 발아성 화합물은 건조되기 이전에, 0.0003 mg/mL 내지 170 mg/mL, 0.0003 mg/mL 내지 30 mg/mL, 0.001 mg/mL 내지 100 mg/mL, 또는 0.001 mg/mL 내지 10 mg/mL의 농도 하에서 제제화된다. 바람직한 실시양태에서, 발아성 화합물은 건조되기 이전에, 0.001 mg/mL 내지 1 mg/mL의 농도 하에서 제제화된다.
본원에 이용된 바와 같은, 용어 "친밀한 혼합물"은 포자 및 발아성 화합물이 발아에 도움이 되는 환경에 도달할 때까지 근접한 위치에서 유지되는 혼합물을 지칭한다.
이러한 친밀한 혼합물은 분무 건조, 동결 건조, 공기 건조 또는 드럼 건조와 같은 공정을 이용하여 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 친밀한 혼합물은 분무 건조 또는 동결 건조에 의해 생성된다. 상기 친밀한 혼합물을 형성하는 경우에는, 발아성 화합물이 포자가 발아를 유발할 수 있게 하는 조건 하에, 이러한 포자 및 발아성 화합물을 함께 혼합하지 않는 것이 중요한데, 이는 상기 혼합물의 저장 수명 동안 부작용을 수반하는 조숙한 발아를 유발시킬 수 있기 때문이다. 이는 2개의 별개의 스트림을 동시에 분무할 수 있게 하는 2개 노즐 또는 단일 노즐을 사용함으로써 또는 발아에 도움이 되지 않는 조건 (예를 들어, 온도) 하에 동결 건조시킴으로써, 별개의 스트림을 분무 건조기에서 이용하여 피할 수 있다. 조숙한 발아는 또한, 포자 덩어리를, 건조하기 직전에 발아성 화합물 함유 용액에 도입함으로써 피할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 발아성 화합물은 친밀한 혼합물 중의 박테리아 포자에 흡착시키거나 또는 이러한 포자에 의해 흡수된다. 추가의 실시양태에서, 박테리아 포자 및 발아성 화합물는 친밀한 혼합물 전반에 걸쳐 미세하게 분산된다. 또한 추가의 실시양태에서, 박테리아 포자 및 발아성 화합물은 친밀한 혼합물 전반에 걸쳐 미시적으로 분산되므로, 박테리아 포자로 본질적으로 이루어진 개개의 입자와 발아성 화합물로 본질적으로 이루어진 개개의 입자는 육안으로 볼 수 없다.
한 실시양태에서, 친밀한 혼합물은 박테리아 포자 및 발아성 화합물을, 건조하기 이전에, 용액 중에서 조합함으로써 제조된다. 바람직하게, 박테리아 포자 및 발아성 화합물은 건조하기 직전에 용액 중에서 조합한다.
어떠한 이론에도 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 친밀한 혼합물의 형성으로 인해, 상기 혼합물이 발아에 적당한 환경에 도달할 때 포자의 발아 개시인자 부위와 보다 바람직하게 결합할 수 있는 근접한 위치에 발아성 화합물이 놓여지는 것으로 여겨진다. 이러한 근접한 위치로 인해, 발아성 화합물은, 존재할 수도 있는 발아 간섭 화합물 (예컨대, D-아미노산)과 경쟁해서 더 잘할 수 있게 되는데, 그 결과 더 많은 비율의 포자가 발아될 것이다. 박테리아의 대수적 성장에 기인하여, 이들이 일단 영양생장기에 들어가면, 상기와 같이 증가된 비율은 배양물 형성에 있어서 수차례의 log 증가를 신속하게 초래할 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 박테리아 포자와 (b) 발아성 화합물을 포함하는 친밀한 혼합물을 포함하는 조성물에 관한 것인데, 이러한 포자 및 발아성 화합물은, 상기 조성물이 활성화 환경에 적용받을 때까지 발아성 화합물이 포자의 발아를 유도하지 않도록 불활성 형태로 유지된다.
본원에 이용된 바와 같이, 용어 "활성화 환경"은 발아성 화합물과 포자가 상호 작용할 수 있게 하여, 포자가 영양생장 상태에 들어가게 유도되는 환경을 지칭한다. 이러한 활성화 환경은 온도, 수분, pH 또는 염도와 같은 인자의 조합을 포함할 수 있다.
발아성 화합물과 박테리아 포자의 친밀한 혼합물의 형성은 박테리아 포자의 하나 이상의 관심 형질 (이는 발아, 성장, 대사, 효소 활성, 및 환경 스트레스, 예컨대 낮은 pH, 고 염 농도 및 독성 금속에 대한 노출에 대한 내성을 포함하지만, 그에 제한되지 않는다)을 증가시킴으로써 박테리아 포자의 유용성을 증강시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 친밀한 혼합물은 관심 형질을, 발아성 화합물이 결여된 상응하는 박테리아 포자 제제와 비교하여 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 또는 500% 정도 증가시킨다.
발아를 추가로 증강시키기 위하여, 친밀한 혼합물을 형성하기 이전에, 포자에 쇼크를 가하는 것이 바람직하다. 포자는 각종 표준 방법, 예를 들어 삼투성 쇼크, 열 쇼크, 압력 쇼크, 영양소의 고갈, 및/또는 특정의 산에 대한 노출로 쇼크를 가할 수 있다. 열 쇼크는 열 쇼크 단백질의 생성을 유도시키기에 충분한 온도 하에 충분한 시간 동안 포자를 가열하는 것을 포함한다. 상기 인용된 문헌 (Atluri et al.)에는 바실루스 서브틸리스에 대한 상기 한 가지 열 쇼크 처리 방법이 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 친밀한 혼합물을 포함한다. 이러한 조성물은 그들의 의도된 용도에 따라서, 공동-발아체, 영양소 및 제제화 보조제 (예를 들어, 계면활성제 및/또는 장용 코팅)를 포함한 부가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
이용될 수 있는 공동-발아체는 퓨린 뉴클레오시드, 예컨대 이노신 또는 아데노신, 염, 당 (예컨대, 글루코스 및 프룩토스) 등을 포함하는데, 이들 모두는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
일단 포자가 발아되면 박테리아 콜로니의 조작에 도움을 주게 될, 덱스트로스, 전분 및 미량 영양소를 포함한 영양소가 또한 포함될 수 있다.
상기 조성물을 프로바이오틱으로서 사용하고자 하는 경우에는, 낮은 pH 환경에 대한 포자의 노출과 연관된 포자 발아 상의 지체를 피하기 위해서는 장용 코팅을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 장용 코팅은 위에서의 용액을 견뎌내고 중성 또는 알칼리성 장액에서 용해되도록 설계된다. 상기 코팅은 pH-민감성일 수 있는데, 예를 들어 위에서 직면하게 되는 바와 같은 산성 환경에서는 용해되지 않지만, 소장에서 직면하게 되는 바와 같은 중성 환경에서는 용해될 수 있다. 대안적으로, 장용 코팅은 특이적 대사 현상에 노출되는 경우, 예컨대 소장에서 발견되는 소화 효소와 직면하는 경우에 용해될 수 있다. 예를 들어, 상기 코팅은 췌장 효소, 예컨대 트립신, 키모트립신 또는 췌장 리파제에 의해 소화된다. 이러한 코팅의 소화 또는 용해로 인해, 바실루스 포자/발아성 화합물이 포자의 발아에 도움이 되는 환경에 들어갈 수 있게 된다.
이용될 수 있는 장용 코팅 재료는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 알지네이트, 말산-프로판 1,2-디올; 셀룰로스 유도체, 예를 들어 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트 (HPMCP); 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 히드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트, 및 메타크릴산과 메틸 메타크릴레이트의 음이온성 중합체; 및 에틸아크릴레이트 메틸아크릴산 공중합체의 수 에멀션, 또는 히드록시프로필 메틸 셀룰로스 아세테이트 숙시네이트 (HPMAS)를 포함한다.
농업 또는 산업용으로 이용되는 경우, 상기 조성물은 표준 제제화 보조제, 예컨대 계면활성제, 유화제, 다른 활성 성분 등을 추가로 포함할 수 있는데, 단 이러한 다른 성분은 발아를 방해하지 않아야 하거나 또는 발아된 포자의 생육성에 불리한 영향을 미치지 않아야 한다. 예를 들어, 달리 특별히 살포자성이 아닌 페놀계 화합물이 0.2% (페놀), 0.08% (크레솔), 및 0.02% (클로로크레솔) (wt./vol) 정도로 낮은 농도 하에서 발아를 억제하는 것으로 공지되어 있다. 발아를 억제할 수 있는 다른 화합물이 또한, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [A. D. Russell, Bacterial Spores and Chemical Sporicidal Agents, CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Apr. 1990, p. 99-119] 참조).
본 발명은 또한,
a) 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 용액을 제조하는 단계; 및
b) 상기 용액을 건조시켜, 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 건조된 친밀한 혼합물을 수득하며, 여기서 상기 박테리아 포자 및 발아성 화합물은 이들이 발아에 도움이 되는 환경에 도달할 때까지 근접한 위치에서 유지되는 것인 단계
를 포함하는, 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 건조된 친밀한 혼합물을 제조하는 방법을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 상기 언급된 방법에서의 건조는 분무 건조, 동결 건조, 공기 건조 또는 드럼 건조이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 언급된 방법에서의 포자는 비. 알칼로필루스, 비. 알베이, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 아네우리노리티쿠스, 비. 안트라시스, 비. 아쿠아에마리스, 비. 아트로파에우스, 비. 보로노필루스, 비. 브레비스, 비. 칼도리이쿠스, 비. 센트로스포루스, 비. 세레우스, 비. 시르쿨란스, 비. 클라우시이, 비. 코아굴란스, 비. 피르무스, 비. 플라보써무스, 비. 푸시포르미스, 비. 글로비기이, 비. 인페르누스, 비. 라르바에, 비. 라테로스포루스, 비. 렌투스, 비. 렌티모르부스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 비. 메센테리쿠스, 비. 무실라기노수스, 비. 미코이데스, 비. 나토, 비. 판토테니쿠스, 비. 포필리아에, 비. 폴리믹사, 비. 슈도안트라시스, 비. 푸밀루스, 비. 슐레겔리이, 비. 심플렉스, 비. 스파에리쿠스, 비. 스포로써모두란스, 비. 스테아로써모필루스, 비. 서브틸리스, 비. 써모글루코시다시우스, 비. 투린기엔시스, 비. 불가티스, 비. 웨이헨스테파넨시스, 씨. 써모셀룸, 씨. 륭달리이, 씨. 아세토부틸리쿰, 씨. 베이제린크키이, 씨. 부티리쿰, 파스테우리아 페네트란스, 파스테우리아 토르네이, 파스테우리아 니쉬자와에, 및 스트렙토미세스 종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 상기 언급된 방법에서의 포자는 비. 서브틸리스, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 및 비. 푸밀루스로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 언급된 방법에서의 발아성 화합물은 L-알라닌, L-발린, 및 L-아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 언급된 방법에서의 발아성 화합물은 건조되기 이전에, 0.0001 mg/ml 내지 170 mg/ml의 농도 하에서 제제화될 수 있다. 상기 언급된 방법의 일부 실시양태에서, 발아성 화합물은 건조되기 이전에, 0.0003 mg/mL 내지 170 mg/mL, 0.0003 mg/mL 내지 30 mg/mL, 0.001 mg/mL 내지 100 mg/mL, 또는 0.001 mg/mL 내지 10 mg/mL의 농도 하에서 제제화된다. 상기 언급된 방법의 바람직한 실시양태에서, 발아성 화합물은 건조되기 이전에, 0.001 mg/mL 내지 1 mg/mL의 농도 하에서 제제화된다. 특정 실시양태에서, 상기 언급된 방법에서의 발아성 화합물은 폴리펩티드이다. 상기 언급된 방법의 바람직한 실시양태에서는, 포자에 쇼크를 가하였다.
본 발명은 또한, 상기 언급된 방법에 의해 제조된 건조된 친밀한 혼합물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
a) 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 용액을 제조하는 단계;
b) 상기 용액을 건조시켜, 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 건조된 친밀한 혼합물을 수득하며, 여기서 상기 박테리아 포자 및 발아성 화합물은, 이들이 박테리아 포자의 발아에 도움이 되는 환경에 도달할 때까지 근접한 위치에서 유지되는 것인 단계; 및
c) 상기 친밀한 혼합물을 박테리아 포자의 발아에 도움이 되는 환경에 노출시키며, 여기서 친밀한 혼합물 중의 박테리아 포자의 발아, 성장, 대사 및/또는 효소 활성은, 발아성 화합물이 결여된 상응하는 박테리아 포자 제제와 비교하여 증가되는 것인 단계
를 포함하는, 박테리아 포자의 발아, 성장, 대사 및/또는 효소 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.
상기 언급된 방법의 일부 실시양태에서, 친밀한 혼합물은 관심 형질을, 발아성 화합물이 결여된 상응하는 박테리아 포자 제제와 비교하여 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 또는 500% 정도 증가시킨다.
상기 언급된 방법의 바람직한 실시양태에서, 친밀한 혼합물 중의 박테리아 포자의 발아, 성장, 대사 및/또는 효소 활성 %는, 발아성 화합물이 결여된 상응하는 박테리아 포자 제제와 비교하여 10% 이상 증가된다. 상기 언급된 방법의 추가의 바람직한 실시양태에서, 건조는 분무 건조, 동결 건조, 공기 건조 또는 드럼 건조이다.
특정 실시양태에서, 상기 언급된 방법에서의 포자는 비. 알칼로필루스, 비. 알베이, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 아네우리노리티쿠스, 비. 안트라시스, 비. 아쿠아에마리스, 비. 아트로파에우스, 비. 보로노필루스, 비. 브레비스, 비. 칼도리이쿠스, 비. 센트로스포루스, 비. 세레우스, 비. 시르쿨란스, 비. 클라우시이, 비. 코아굴란스, 비. 피르무스, 비. 플라보써무스, 비. 푸시포르미스, 비. 글로비기이, 비. 인페르누스, 비. 라르바에, 비. 라테로스포루스, 비. 렌투스, 비. 렌티모르부스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 비. 메센테리쿠스, 비. 무실라기노수스, 비. 미코이데스, 비. 나토, 비. 판토테니쿠스, 비. 포필리아에, 비. 폴리믹사, 비. 슈도안트라시스, 비. 푸밀루스, 비. 슐레겔리이, 비. 심플렉스, 비. 스파에리쿠스, 비. 스포로써모두란스, 비. 스테아로써모필루스, 비. 서브틸리스, 비. 써모글루코시다시우스, 비. 투린기엔시스, 비. 불가티스, 비. 웨이헨스테파넨시스, 씨. 써모셀룸, 씨. 륭달리이, 씨. 아세토부틸리쿰, 씨. 베이제린크키이, 씨. 부티리쿰, 파스테우리아 페네트란스, 파스테우리아 토르네이, 파스테우리아 니쉬자와에, 및 스트렙토미세스 종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 포자는 비. 서브틸리스, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 및 비. 푸밀루스로 이루어진 군으로부터 선택되고; 발아성 화합물은 L-알라닌, L-발린, 및 L-아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 언급된 방법의 일부 실시양태에서, 발아성 화합물은 폴리펩티드이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 언급된 방법에서의 발아성 화합물은 건조되기 이전에, 0.0001 mg/ml 내지 170 mg/ml의 농도 하에서 제제화된다. 상기 언급된 방법의 일부 실시양태에서, 발아성 화합물은 건조되기 이전에, 0.0003 mg/mL 내지 170 mg/mL, 0.0003 mg/mL 내지 30 mg/mL, 0.001 mg/mL 내지 100 mg/mL, 또는 0.001 mg/mL 내지 10 mg/mL의 농도 하에서 제제화된다. 상기 언급된 방법의 바람직한 실시양태에서, 발아성 화합물은 건조되기 이전에, 0.001 mg/mL 내지 1 mg/mL의 농도 하에서 제제화된다. 상기 언급된 방법의 추가의 바람직한 실시양태에서는, 포자에 쇼크를 가하였다.
실시예
다음 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위한 것이지만, 이로써 본 발명이 어떠한 방식으로든 제한되지 않는다.
다음 실시예에서, 용어 "GOSD" 및 "GO+"는 발아성 최적화제 (달리 명시되지 않는 한 L-알라닌)를, 표시된 특별한 바실루스 종과 함께 분무 건조시킨 조성물을 지칭한다. 바실루스 종의 포자는 L-알라닌과 함께 분무 건조시켰는데, 이는 증류수 1 밀리리터당 알라닌 0.044 그램을 함유하는 용액으로서 분무 건조하기 직전에 포자 덩어리에 도입된다.
용어 "GO-"는 바실루스 종을 발아성 화합물의 부재 하에서 유사하게 분무 건조시킨 조성물을 지칭한다.
추가로, 다음 방법을 이용하여, 달리 표시되지 않는 한 다음 실시예에서 포자 발아를 결정하였다. 포자를 영양소 용액 내에 놓아두고 발아되기 시작하면, 이는 디피콜린산과 이온을 방출시키는데, 이로써 흑점이 발생한다. 이러한 발아 지표로 인해, 포자 현탁물에 의한 가시광선의 흡광도가 감소된다. 따라서, 발아율은 상 어두운/밝은 포자의 비율을 계수하고, 자외선-가시광선 분광광도계 하에 발아성 포자 현탁물의 600 nm 하의 광밀도 (O.D.600) 상의 감소를 모니터링함으로써 결정하였다. 이어서, 이를 발아 %로 전환시킨다.
실시예
1: L-알라닌과의 친밀한 혼합물 중의 비.
서브틸리스
ENV
923의
증가
된 발아
본 발명의 친밀한 혼합물의 포자의 발아율과, 발아체와 통상적으로 혼합된 포자의 발아율을 비교하기 위하여, 다음 처리를 수행하였다:
A. 친밀한 혼합물의 형성: 비. 서브틸리스 ENV 923의 포자를 L-알라닌과 함께 분무 건조시켰는데, 이는 증류수 1 밀리리터당 알라닌 0.044 그램을 함유하는 용액으로서 분무 건조하기 직전에 포자 덩어리 내로 도입하였다. 이로써 생성된 친밀한 혼합물을, 증류수 중의 0.01 M 인산염 완충액으로 이루어진 용액에 연속해서 도입함으로써 (이로써 pH 7이 된다) 발아시키고 0.6의 출발 O.D. 600이 되도록 교정하였다.
B. 포자를 발아체와 통상적으로 혼합함: 비. 서브틸리스 ENV 923의 포자를 분무 건조시키고, 연속해서 증류수 중의 0.01 M 인산염 완충액으로 이루어진 용액 내로 도입하였다 (이로써 pH 7이 된다). 포자를 상기 완충 용액에 가하여 0.6의 출발 O.D. 600이 되도록 교정하였다. 알라닌을, 용액 1 밀리리터당 0.0001 그램의 알라닌 농도로 상기 용액에 가하였다.
C. 포자 단독의 발아: 비. 서브틸리스 ENV 923의 포자를 분무 건조시키고, 연속해서 증류수 중의 0.01 M 인산염 완충액으로 이루어진 용액 내로 도입하고 (이로써 pH 7이 된다). 0.6의 출발 O.D. 600이 되도록 교정하였다.
상기 처리 각각을 두 번 반복해서 수행하였다. 다음 표 1은 광밀도 상의 저하 %로써 측정된 바와 같이 비. 서브틸리스 ENV 923의 발아에 영향을 미치는 상기 처리의 평균 결과를 나타낸다. 광밀도 상의 저하는 발아가 진행된다는 것을 표시한다. 광밀도 (OD)는 젠웨이(Jenway) 모델 6320D 가시 거리 분광광도계를 이용하여 600 nm 파장에서 측정하였다. 활용된 L-알라닌은 99% 순도이고, 알파 아에서 (Alfa Aeser; 영국 랭커셔 히셤)로부터 공급되었다.
[표 1]
시간 경과에 따른 OD (600 nm) 기준선으로부터의 저하 %
상기 결과는 본 발명의 친밀한 혼합물 중의 포자가, 동일한 발아체와 친밀하지 않게 혼합된 포자 보다 더 신속하게 발아된다는 것을 보여준다. 발아체와 혼합된 포자는 포자 단독 보다 훨씬 더 많이 발아를 나타내었다.
실시예
2:
GOSD로
처리된
바실루스
서브틸리스
균주
ENV923의
증가된
발아
바실루스 서브틸리스 포자를, L-알라닌의 용액의 존재 하에 포자를 분무 건조함으로써 GOSD로 처리하였고, 광밀도 (OD) 판독을 통하여 발아 수준을 결정하였다.
0.01 M
인산칼륨
완충액, pH 7
1 M K2HPO4 (0.5 L 증류수에 용해된 87.09 g) 및 1 M KH2PO4 (0.5 L 증류수에 용해된 68.045 g) 용액을 이용하여 0.01 M 인산칼륨 완충액을 제조하였다. 61.5 ml의 1 M K2HPO4를 38.5 ml의 1 M KH2PO4와 합하고 증류수를 이용하여 1000 ml가 되도록 희석시켜, 0.1 M 인산칼륨 완충액, pH 7.0을 만들었다. 0.1 M 인산칼륨 완충액을 증류수로 1:10의 비율로 추가로 희석시켜, 0.01 M 인산칼륨 완충액, pH 7.0을 수득하였다. 이 완충액을 60분 동안 121℃ 하에 오토클레이빙함으로써 멸균시켰다.
바실루스 서브틸리스 포자 현탁물을 0.01 M 인산칼륨 완충액, pH 7.0에서 1.7 x 108 cfu/ml 농도로 제조하고, 예열된 37℃ 수조에서 인큐베이션하며, 45분 기간에 걸쳐 5분 간격으로 발아 %에 관하여 평가하였다.
[표 2]
결론: GOSD 처리는 바실루스 서브틸리스 포자의 발아 % 및 발아 속도를 상당히 증강시켰다.
실시예
3:
GOSD로
처리된
바실루스
리케니포르미스
균주
ENV100의
증가된
발아
바실루스 리케니포르미스 포자를, 실시예 1에 기재된 바와 같이 증류수 1 mL당 0.044 그램의 L-알라닌의 존재 하에 포자를 분무 건조함으로써 GOSD로 처리하였다. 포자 현탁물 제조를 위하여 0.01 M 인산칼륨 완충액, pH 7.0을 이용하여 상기 언급된 바와 같이 광밀도 (OD) 판독을 통하여 발아 수준을 결정하였다.
바실루스 리케니포르미스 포자 현탁물을 0.01 M 인산칼륨 완충액, pH 7.0에서 1.29 x 108 cfu/ml 농도로 제조하고, 예열된 37℃ 수조에서 인큐베이션하며, 45분 기간에 걸쳐 5분 간격으로 발아 %에 관하여 평가하였다.
[표 3]
결론: GOSD 처리는 바실루스 리케니포르미스 포자의 발아 % 및 발아 속도를 상당히 증강시켰다.
실시예
4:
GOSD로
처리된
바실루스
서브틸리스
균주
ENV923에
대한 각종 pH 수준 하에서의
증가된
발아
바실루스 서브틸리스 균주 ENV923 GO+ 및 GO- 포자를 상기 언급된 바와 같이 제조하였고, 이를 각종 pH 수준 하의 0.01 M 인산칼륨 완충액에 재현탁시켰다. OD600 측정을 상기 언급된 바와 같이 수행하였다.
0.01 M
인산칼륨
완충액, pH 3.0 내지 7.0
0.01 M 인산칼륨 완충액, pH 7.0을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다.
● 3.0 내지 6.0의 pH 범위의 0.01 M 인산칼륨 완충액을 제조하기 위하여, 염기 완충액으로서, 13.2 ml의 1 M K2HPO4와 86.8 ml의 1 M KH2PO4 용액 (실시예 1에 기재됨)을 혼합하고 증류수를 이용하여 용적이 1 L가 되게 함으로써 제조된 0.1 M 인산칼륨 완충액, pH 6.0을 사용하였다.
● pH 5.0 내지 pH 3.0의 0.01 M 인산칼륨 완충액을 수득하기 위하여, 0.1 M 인산칼륨 완충액, pH 6.0을 증류수로 희석시키고, 1 M H2PO4를 이용하여 완충액의 pH를 pH 5.0, pH 4.0 및 pH 3.0으로 낮추고, 0.1 M 완충액 대 증류수의 비를 1:10으로 유지시키면서 증류수를 이용하여 최종 용적을 만들었다.
제조된 완충액을 4℃ 하에 저장하고, 각 실험하기 이전에, 1 M NaOH 또는 1 M H2PO4를 이용하여 완충액의 pH를 재조정하였다.
[표 4]
각종 pH 수준에서 GOSD로 처리한 (GO+) 및 GOSD로 처리하지 않은 (GO-) 발아 결과. 표는 5분 간격으로 측정된 발아 %를 나타낸다.
결론: GOSD로 처리하면, 바실루스 서브틸리스 포자가 더 신속하게 발아될 수 있고 더 낮은 pH 수준의 효과를 극복할 수 있다.
실시예
5:
GOSD로
처리된
바실루스
서브틸리스
균주
ENV923의
증가된
발아.
각종 온도 수준에 의해 영향을 받은 바와 같은 포자 발아
반응. 표는
10분 간격으로 측정된 발아
%를
나타낸다.
바실루스 서브틸리스 균주 ENV 923 GOSD 및 대조군 포자를 상기 언급된 바와 같이 제조하였다. 포자의 발아는 상기 언급된 바와 같은 광밀도 (OD) 측정을 통하여 시험하였다. OD600 측정을 위한 포자 현탁물을 제조하고, 1.7 x 108 cfu/ml 농도 하에 0.01 M 인산칼륨 완충액, pH 7.0 (인산염 완충액, pH 7.0 제제) 중에서 4℃로 냉각시켰다. 각 포자 현탁물에 대해, 3 ml 용적으로 채워진 3개의 배양 튜브를 제조하였다. 진탕시키고 초기 OD600을 측정한 후, 상기 튜브를 120분 동안 25℃, 30℃ 및 37℃로 예열된 수조에서 인큐베이션하였다. 10분 간격으로 튜브를 진탕시키고 OD600 측정을 수행하였다.
[표 5]
37℃, 30℃ 및 25℃ 하에 GO- 및 GO+로 처리한 바실루스 서브틸리스의 발아 %
결론: GOSD로 처리하면 (GO+), 바실루스 서브틸리스 포자가 더 신속하게 발아될 수 있고 더 낮은 온도 요법의 효과를 극복할 수 있다.
실시예
6: NaCl의 상이한 몰 용액의
존재 하에
GOSD로
처리한 및 처리하지 않은
바실루스
리케니포르미스의
발아
%
배지:
배지는 묽은 트립틱 소이 브로쓰 (mTSB)(BD, 211822)이었다. 이 배지는 50 mg의 트립틱 소이 브로쓰 분말을 완전히 용해될 때까지 열을 공급하고 진탕시키면서 1 L 물에 현탁시킴으로써 제조하였다. 이어서, 병에 등분하고, 121℃ 하에 30분 동안 오토클레이빙하였다. 제조업자의 보고된 분말 내용물에 근거하여, mTSB 배지는 1리터당 다음을 함유하였다:
카세인의 췌장 소화물: 28.3 mg
대두의 파픽(Papic) 소화물: 5.0 mg
덱스트로스: 4.2 mg
염화나트륨: 8.3 mg
인산이칼륨: 4.2 mg.
염화나트륨 [암레스코(Amresco) X190]을 가하여 적절한 삼투성 스트레스를 유도시켜, 상기 배지를 가열하고 오토클레이빙하기 전에 최종 농도가 0.5 M 또는 1.5 M (각각 29.22 g/L 및 87.66 g/L)이 되도록 하였다.
포자 현탁물:
GOSD로 처리되거나 처리되지 않은 바실루스 리케니포르미스 균주 ENV100의 포자 분말을 멸균 블렌더 병 내에서 0.1% 옥토솔 SLS [FT-SLS-246DRUM, 티아르코 케미칼 (Tiarco Chemical; 미국 조지아주 달턴)]를 수반한 멸균수에 현탁시켰다. 총 15초 이상 동안 5초 간격으로 블렌딩하거나 또는 포자가 완전히 가시적으로 현탁될 때까지 블렌딩함으로써 포자를 현탁시켰다. 이는 상기 블렌더 병 내에서의 최종 농도가 1 x 1010 cfu/ml로 되도록 수행하였다. 이러한 포자 현탁물로부터의 250 ㎕를, 4.75 ml mTSB를 함유하는 튜브에 옮겨 5 x 108 cfu/ml의 최종 농도를 수득하였다. 이들 농도는 대략 0.6의 출발 OD600을 달성하기 위하여 포자의 각 배치 상에서 수행된 최적화에 의해 결정되었다.
OD 발아 검정:
상기 현탁된 포자를 함유하는 튜브를 즉시 와동시키고, 시점 제로 동안 OD600 하에 측정하였으며, 37℃ 수조에서 인큐베이션하였다. 각각의 시간 간격에서, 그 시간을 기록하고, 튜브를 꺼내며, 와동시키고, OD600 하에서 측정하며 수욕으로 다시 보냈다. 제로 시점으로부터 측정된 값을 공제하고, 이를 제로 시점으로 나눈 다음 100%를 곱함으로써, OD600 상의 감소 %를 결정하였다. 완전한 발아는 60%의 OD600 감소 %에 상응하는 것으로 기존에 확인되었다. 따라서, 발아 %는 OD600 감소 %에 1.67을 곱함으로써 결정하였다.
[표 6]
NaCl의 0, 0.5 몰 및 1.5 몰 용액의 존재 하에 GOSD로 처리한 (GO+) 및 처리하지 않은 (GO-), 1시간에 걸친 바실루스 리케니포르미스 포자의 발아 %.
결론: GOSD로 처리하면, 바실루스 리케니포르미스 포자가 더 신속하게 발아될 수 있고 각종 염 (NaCl) 수준의 삼투성 스트레스 효과를 극복할 수 있다.
실시예
7: 구리의 상이한
백만분율
용액의
존재 하에
GOSD로
처리한 및 처리하지 않은 바실루스 리케니포르미스의 발아 %
배지:
mTSB 배지를 상기와 같이 제조하였는데, 단 NaCl로 보충시켜 50 mM의 최종 농도로 만들어 삼투적으로 균형 잡힌 배지를 창출시켰다. 2 g을 20 ml 물에 현탁시키고, 0.22 ㎛ 필터링함으로써, 1 x 105 ppm 질산구리(II) 반(오수화물) [알파 아에사르(Alfa Aesar) 12523] 스톡 용액을 만들었다. 이를 mTSB 분취액에 가하여 0, 50, 100, 및 200 ppm 최종 농도를 달성하였다.
포자 현탁물:
GOSD로 처리되거나 처리되지 않은 바실루스 리케니포르미스 균주 ENV100의 포자 분말을 멸균 블렌더 병 내에서 0.1% 옥토솔 SLS (FT-SLS-246DRUM, 티아르코 케미칼; 미국 조지아주 달턴)를 수반한 멸균수에 현탁시켰다. 총 15초 이상 동안 5초 간격으로 블렌딩하거나 또는 포자가 완전히 가시적으로 현탁될 때까지 블렌딩함으로써 포자를 현탁시켰다. 이는 상기 블렌더 병 내에서의 최종 농도가 2 x 109 cfu/ml로 되도록 수행하였다. 이러한 포자 현탁물로부터의 250 ㎕를, 4.75 ml mTSB를 함유하는 튜브에 옮겨 1 x 108 cfu/ml의 최종 농도를 수득하였다. 이들 농도는 대략 0.6의 출발 OD600을 달성하기 위하여 포자의 각 배치 상에서 수행된 최적화에 의해 결정되었다.
OD 발아 검정: 실시예 6에 표시된 바와 같이 수행하고 계산하였다.
[표 7]
구리 이온의 0, 50 ppm, 100 ppm 및 200 ppm 용액의 존재 하에 GOSD로 처리한 (GO+) 및 처리하지 않은 (GO-), 1시간에 걸친 바실루스 리케니포르미스 포자의 발아 %.
결론: GOSD로 처리하면, 바실루스 리케니포르미스 포자가 더 신속하게 발아될 수 있고 각종 수준의 구리 이온의 스트레스 효과를 극복할 수 있다.
실시예
8: 알루미늄의 상이한
백만분율
용액의
존재 하에
GOSD로
처리한 및 처리하지 않은 바실루스 리케니포르미스의 발아 %
배지:
mTSB 배지를 상기와 같이 제조하였는데, 단 NaCl로 보충시켜 50 mM의 최종 농도로 만들어 삼투적으로 균형 잡힌 배지를 창출시켰다. 0.62 g의 Al2(SO4)3*14 H2O (알파 아에사르 12362)를 50 ml 물에 현탁시키고, 0.22 ㎛ 필터링함으로써, 1000 ppm Al3 + 스톡 용액을 만들었다. 이를 mTSB 분취액에 가하여 0, 0.25, 0.50 및 1.0 ppm 최종 농도를 달성하였다. 이어서, HCl을 부가하여 Al3 + 이온을 완전히 분리시킴으로써, 배지의 pH를 pH 4.5로 낮추었다.
포자 현탁물:
GOSD로 처리되거나 처리되지 않은 바실루스 리케니포르미스 균주 ENV100의 포자 분말을 멸균 블렌더 병 내에서 0.1% 옥토솔 SLS (FT-SLS-246DRUM, 티아르코 케미칼; 미국 조지아주 달턴)를 수반한 멸균수에 현탁시켰다. 총 15초 이상 동안 5초 간격으로 블렌딩하거나 또는 포자가 완전히 가시적으로 현탁될 때까지 블렌딩함으로써 포자를 현탁시켰다. 이는 상기 블렌더 병 내에서의 최종 농도가 1 x 1010 cfu/ml로 되도록 수행하였다. 이러한 포자 현탁물로부터의 250 ㎕를, 4.75 ml mTSB를 함유하는 튜브에 옮겨 5 x 108 cfu/ml의 최종 농도를 수득하였다. 이들 농도는 대략 0.6의 출발 OD600을 달성하기 위하여 포자의 각 배치 상에서 수행된 최적화에 의해 결정되었다.
OD 발아 검정: 실시예 6에서와 같이 수행하고 계산하였다.
[표 8]
알루미늄 이온의 0, 0.25 ppm, 0.50 ppm 및 1.0 ppm 용액의 존재 하에 GOSD로 처리한 (GO+) 및 처리하지 않은 (GO-), 1시간에 걸친 바실루스 리케니포르미스 포자의 발아 %.
결론: GOSD로 처리하면, 바실루스 리케니포르미스 포자가 더 신속하게 발아될 수 있고 각종 수준의 알루미늄 이온의 스트레스 효과를 극복할 수 있다.
실시예
9:
담즙산염의
상이한
밀리몰
용액의
존재 하에
GOSD로
처리한 및 처리하지 않은 바실루스 리케니포르미스의 발아 %
배지:
mTSB 배지를 상기와 같이 제조하였는데, 단 NaCl로 보충시켜 50 mM의 최종 농도로 만들어 삼투적으로 균형 잡힌 배지를 창출시켰다. 2.5 g 소듐 타우로데옥시콜레이트 [시그마(Sigma) T0875], 1.1 g 소듐 글리코데옥시콜레이트 (시그마 G9910), 및 0.346 g 소듐 데옥시콜레이트 (시그마 D5670)를 100 ml 물에 현탁시키고, 0.22 ㎛ 필터링함으로써, 80 mM 담즙산염 스톡 용액을 만들었다. 이를 mTSB 분취액에 가하여 0, 4, 6 및 8 mM 최종 농도를 달성하였다.
포자 현탁물:
GOSD로 처리되거나 처리되지 않은 바실루스 리케니포르미스 균주 ENV100의 포자 분말을 멸균 블렌더 병 내에서 0.1% 옥토솔 SLS (FT-SLS-246DRUM, 티아르코 케미칼; 미국 조지아주 달턴)를 수반한 멸균수에 현탁시켰다. 총 15초 이상 동안 5초 간격으로 블렌딩하거나 또는 포자가 완전히 가시적으로 현탁될 때까지 블렌딩함으로써 포자를 현탁시켰다. 이는 상기 블렌더 병 내에서의 최종 농도가 1 x 1010 cfu/ml로 되도록 수행하였다. 이러한 포자 현탁물로부터의 250 ㎕를, 4.75 ml mTSB를 함유하는 튜브에 옮겨 5 x 108 cfu/ml의 최종 농도를 수득하였다. 이들 농도는 대략 0.6의 출발 OD600을 달성하기 위하여 포자의 각 배치 상에서 수행된 최적화에 의해 결정되었다.
OD 발아 검정:
상기 언급된 바와 같이 수행하고 계산하였다.
[표 9]
담즙산염의 0, 4 mM, 6 mM 및 8 mM 용액의 존재 하에 GOSD로 처리한 (GO+) 및 처리하지 않은 (GO-), 1시간에 걸친 바실루스 리케니포르미스 포자의 발아 %.
결론: GOSD로 처리하면, 바실루스 리케니포르미스 포자가 더 신속하게 발아될 수 있고, 위장관에서 직면할 수 있는 각종 수준의 담즙산염의 스트레스 효과를 극복할 수 있다.
실시예
10: 규정된
인산칼륨
배지 및 2%
글루코스에서
GOSD로
처리하거나 처리하지 않은 바실루스 리케니포르미스의 3회 반복물의 평균 성장.
바실루스 리케니포르미스 균주 ENV 431 GO+ 포자를 GOSD로 처리하였다 (앞서 기재된 과정). 대조군으로서, GOSD를 사용하지 않고 분무 건조시켰던 동일한 배양물로부터의 GO- 포자를 사용하였다. 2% 글루코스가 보충된 최소 염 배지에서 성장 시험을 수행하였다.
배지:
(NH4)2SO4 (1.26 g/L), MgCl2 (0.81 g/L), CaCl2 (0.15 g/L), NaCl (0.05 g/L)을 증류수에 용해시키고, 1 ml/L 1000 X 미량 미네랄 혼합물 [MnSO4 (0.85 g/50 ml), ZnSO4 (0.15 g/50 ml), FeSO4 x 7H2O (0.15 g/50 ml), 티아미노-히드로클로라이드 (0.05 g/50 ml)]를 부가함으로써, 배지를 제조하였다. 제조된 용액을 플라스크에 따라 붓고 (90 ml/플라스크), 40분 동안 121℃ 하에 오토클레이빙하였다. 접종하기 전에, 상기 배지에 25 X 인산칼륨 [K2HPO4 (3.44 g/50 ml), KH2PO4 (2.81 g/50 ml)]의 필터 멸균된 용액 4 ml 및 50 X (100 g/200 ml) 글루코스 2 ml를 보충시켜 2% 최종 농도가 되도록 하였다.
바실루스
리케니포르미스
세포의 성장
접종에 사용된 포자의 양은, GO- 및 GO+ 포자 분말 계수치를 이용하여 결정하였다. 진한 (1000 X) 바실루스 리케니포르미스 균주 ENV 431 포자 현탁물은, 멸균수를 이용하여 멸균 블렌더 병에서 포자를 블렌딩함으로써 제조하였고, 이를 배지를 수반한 플라스크에 가하여, 다음 표에서 0 h로서 표시된 농도가 되도록 하였다. 희석을 수행하고 블렌딩된 포자 현탁물의 플레이트 계수를 수행함으로써 초기 배양물의 계수치를 수득하였다. 각 포자 샘플에 대해 3개의 플라스크가 준비되었다.
이 플라스크를 30℃, 150 rpm 하에 인큐베이션하고 48 h 동안 성장시켰다. 샘플을 취하고 24 h 및 48 h에 플레이트 계수를 수행하였다.
[표 10]
최소 인산칼륨 배지 및 2% 글루코스에서 GOSD로 처리하거나 (GO+) 처리하지 않은 (GO-) 바실루스 리케니포르미스의 3회 반복물의 평균 성장. 제시된 데이터는 cfu/ml이다.
결론: GOSD 처리는 바실루스 리케니포르미스 발아와 성장률을 상당히 증강시켰다.
실시예
11: 2일
기간에 걸친
바실루스
리케니포르미스의
성장; 상이한 농도의 NaCl의 존재 하에 GOSD를 이용한 처리 또는 이용하지 않은 처리를 비교함.
배지:
mTSB를 상기 언급된 바와 같이 제조하였는데, 단 염화나트륨 (암레스코 X190)를 가하여 적절한 삼투성 스트레스를 유도시켜, 최종 농도가 0, 0.5, 1.0 또는 1.5 M (각각 0, 29.22, 58.44, 또는 87.66 g/L)이 되도록 하였다. 상기 배지를 가열하고, 플라스크에 등분한 다음, 오토클레이빙하였다.
플레이트 계수 한천 (PCA) (BD 247910)을 제조업자의 지시에 따라서 제조하였다: 23.5 g의 분말을 1 L의 물에 현탁시키고, 자주 진탕시키면서 비등시키며, 유리 항아리 내로 등분시킨 다음, 오토클레이빙하였다. 배지 항아리를 필요할 때까지 45℃ 수조에서 냉각시켰다. 분말 제조업자는 1리터당 PCA에 대한 다음 내용물을 보고하였다:
카세인의 췌장 소화물: 5.0 g
효모 추출물: 2.5 g
덱스트로스: 1.0 g
한천: 15.0 g.
포자
현탁물
:
GOSD로 처리되거나 처리되지 않은 바실루스 리케니포르미스 균주 ENV100의 포자 분말을 멸균 블렌더 병 내에서 0.1% 옥토솔 SLS (FT-SLS-246DRUM, 티아르코 케미칼; 미국 조지아주 달턴)를 수반한 멸균수에 현탁시켰다. 총 15초 이상 동안 5초 간격으로 블렌딩하거나 또는 포자가 완전히 가시적으로 현탁될 때까지 블렌딩함으로써 포자를 현탁시킨 다음, 멸균수에서 일련으로 희석시켰다. 이는 배양 플라스크 내의 최종 농도가 1 x 102 cfu/ml로 되도록 수행하였다.
정량화:
플라스크를 150 rpm 하에 28시간 ("1일") 또는 50시간 ("2일") 동안 진탕시키면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 각 플라스크로부터의 분취액을, PCA를 수반한 페트리 디쉬(petri dish) 내로 일련으로 희석시키고, <45℃로 냉각시키며, 상부에 따라 붓고, 소용돌이치게 한 다음, 고형화시켰다. 플레이트를 역위시키고, 37℃에서 대략 24시간 동안 인큐베이션하였다. 콜로니를 계수하고, 희석물에 근거하여 농도를 계산하였다. 각 플라스크로부터의 대략 10 ㎕ 샘플을 또한, PCA 플레이트 상에 스트리킹하여 순도에 관하여 시험하였다.
[표 11]
염 용액으로부터 삼투성 스트레스에 의해 도전받은 경우에 GOSD로 처리된 (GO+) 바실루스 리케니포르미스의 성장.
결론: GOSD 처리는 삼투성 염 스트레스 하에 바실루스 리케니포르미스의 발아와 성장을 상당히 증강시켰다.
실시예
12:
바실루스
서브틸리스
균주
ENV
923의 프로테아제 활성
앞서 기재된 바와 같이 GOSD로 처리된 (GO+) 및 처리되지 않은 (GO-) 바실루스 서브틸리스 균주 ENV 923 포자를 프로테아제 활성 시험에 사용하였다.
배지
화학적으로 규정된 염 배지 (CDSM)를 프로테아제 시험에서 세포 증식을 위해 사용하였다. 염기 용액 구성분 (g/L): (NH4)SO4, 1.26 g; L-글루탐산, 1.18 g; MgCl2, 0.81; CaCl2, 0.155 및 85% L-락트산 (0.530 ml/L)을 증류수에 용해시키고, 1 ml/L의 1000 X 미량 미네랄 혼합물 (g/50 ml)을 부가함으로써 배지를 제조하였다. 염기 용액을 수반한 플라스크 (48 ml/플라스크)를 40분 동안 오토클레이빙하였다. 접종하기 전에, 글루코스 (g/50 ml)를 수반한 2 ml의 별도로 제조된 필터 멸균된 25 X 완충 용액 (MOPS, 11.6; KH2PO4, 0.6; 글루코스, 4.5)을 가하였다.
바실루스
서브틸리스
ENV923
세포의 성장
접종에 사용된 포자의 양은, GO- 및 GO+ 포자 분말 계수치를 이용하여 결정하였다. 진한 (1000 X) 바실루스 서브틸리스 균주 ENV923 포자 현탁물은, 멸균성 0.01 M 인산탈륨 완충액, pH 7.0을 이용하여 멸균 블렌더 병에서 포자를 블렌딩함으로써 제조하였고, 이를 플라스크에 약 1 x 104 cfu/ml의 농도로 가하였다. 희석을 수행하고 블렌딩된 포자 현탁물의 플레이트 계수를 수행함으로써 초기 배양물의 계수치를 확증하였다. 각 포자 샘플에 대해 3개의 플라스크가 준비되었다.
이 플라스크를 30℃, 150 rpm 하에 인큐베이션하고 샘플을 48 h에 취하였다.
프로테아제 활성 검정
티로신과 반응하고 청색 발색을 촉진시키는 폴린 앤 시오칼라테우(Folin & Ciocalateu)의 페놀 시약 및 기질로서의 카세인을 이용하여 세포 상청액 상에서 프로테아제 활성 검정을 수행하였다. 프로테아제 활성 단위는 1분 내에 1 ㎍의 티로신을 유리시키는 효소의 양으로서 정의되었다. 시험 튜브 내의 티로신의 양은 젠웨이 7305 분광광도계 내에서 OD650을 측정하고, 표준 곡선을 이용하여 유리된 티로신을 계산함으로써 결정하였다.
시약
시약 1: 0.05 M 인산칼륨 완충액, pH 7.0
0.1 M 인산칼륨 완충액, pH 7.0 (실시예 1에 기재된 바와 같이 제조됨)을 증류수로 1:1의 비로 희석시켜 0.05 M 인산칼륨 완충액, pH 7.0을 수득하였다.
시약 2: 0.65% 카세인 용액
0.65 g의 카세인을 80 ml의 0.05 M 인산칼륨 완충액, pH 7.0에 용해시키고, 가열시켜 카세인을 용액 내로 이동시키며, 0.05 M 인산칼륨 완충액, pH 7.0을 이용하여 최종 용적이 100 ml가 되도록 하였다.
시약 3: 15% 트리클로로아세트산 (TCA)
15 g의 TCA를 증류수에 용해시키고, 최종 용적이 100 ml가 되도록 하였다.
시약 4: 20% Na2CO3
20 g의 Na2CO3를 증류수에 용해시키고, 최종 용적이 100 ml가 되도록 하였다.
프로테아제 검정
● 10 ml의 배양물을 원심분리시키고, 상청액을 0.2 ㎛ 필터를 통하여 멸균성 튜브 내로 여과시켰다.
● 3 ml의 여과된 상청액을 3 ml의 0.65% 카세인 용액과 혼합하고, 1시간 동안 37℃ 수욕 내에 놓아두었다.
● 6 ml의 15% TCA를 부가함으로써 반응을 중지시키고, 샘플을 5분 동안 원심분리시켰다.
● 0.5 ml의 각 샘플을 1 ml의 20% Na2CO3와 혼합한 다음, 0.5 ml의 폴린 앤 시올칼리에우의 페놀 시약을 부가하고, 청색 발색을 허용하기 위해 실온 하에 20분 동안 인큐베이션하였다.
● 3 ml의 증류수를 각 샘플에 가하고, 혼합한 후, OD650을 측정하였다.
● 프로테아제 활성을 계산하기 위하여, 증류수에 용해된 티로신의 희석 시리즈를 수득하고, 이를 배양 샘플과 동일한 조건 하에 처리하며 OD650을 측정함으로써 티로신에 대한 표준 곡선을 제조하였다.
[표 12]
대조군 (GO-)과 비교한, GOSD로 처리된 (GO+) 바실루스 서브틸리스의 프로테아제 생성
결론: 바실루스 서브틸리스 포자를 GOSD로 처리하면, 프로테아제와 같은 효소의 생성이 더 많아질 수 있다.
실시예
13:
발아성
화합물의
존재 하에
스트렙토미세스
비리도크로모게네
스의 발아
10 ml의 TX 완충액 [0.001% 트윈(Tween) 80을 수반한 0.05 M 트리스(Tris)-HCl 완충액, pH 7.3]을 따라 붓고, 멸균성 면봉을 이용하여 포자를 제거함으로써, 스트렙토미세스 비리도크로모게네스를 플레이트로부터 채취하였다. 플레이트로부터의 포자 현탁물을 멸균성 50 ml용 튜브 내로 따라 부었다. 모든 샘플의 포자 현탁물이 수득되면, 포자 현탁물을 수반한 튜브를 열 블록 내에 놓아두고, 온도를 55℃에 도달시키며, 온도를 55℃에서 10분 동안 유지시킴으로써 열 쇼크를 수행하였다. 열 쇼크 후, 포자 현탁물을 빙수에서 5분 동안 냉각시키고, 30분 동안 침강시켰다. 상청액을 따라 버리고, 포자를 4℃ 하에 25 ml의 0.02 M 인산칼륨 완충액, pH 7.0에 재현탁시키며, 15분 동안 침강시켰다. 상청액을 따라 버린 후, 포자를 20 ml의 0.02 M 인산칼륨 완충액, pH 7.0에 재현탁시키고, 격렬하게 혼합시켜 본 실험에 사용된 포자 현탁물을 수득하였다.
1.5 ml의 2 X 발아체 블렌드를 1.5 ml 포자 현탁물과 혼합함으로써 샘플을 제조하였다. 모든 발아체 블렌드를 2 X 50 ml 용액으로서 증류수에서 제조하였다. 염화칼슘을 100 X 용액 (0.4 g/10 ml)으로서 제조하였고, 20 ㎕를 10 ml의 2 X 발아체 블렌드에 가하였다. 발아성 화합물의 최종 농도는 다음과 같다: 0.89 mg/ml의 L-알라닌; 1.17 mg/ml의 L-발린, 13.2 mg/ml의 L-아스파라긴; 2.25 mg/ml의 글루코스; 및 2.25 mg/ml의 프룩토스. 초기 OD600을 측정한 후, 샘플을 30℃ 수욕에 옮기고, OD600을 90분 동안 15분 간격으로 측정하여 발아율을 결정하였다.
[표 13]
광밀도 상의 ENV 151 (스트렙토미세스 비리도크로모게네스) 저하 %
결론: 스트렙토미세스 비리도크로모게네스 포자를 발아성 화합물로 처리하면, 발아가 증강되었다.
실시예
14: 박테리아 포자 및 발아성 화합물의 친밀한 혼합물과 통상적인
혼
합물 간의 발아율 비교
친밀한 혼합물의 포자의 발아율과, 발아체와 통상적으로 혼합된 포자의 발아율을 비교하기 위하여, 다음 처리를 수행하였다:
A. 친밀한 혼합물의 형성: 비. 서브틸리스, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 브레비스, 비. 세레우스, 비. 코아굴란스, 비. 피르무스, 비. 라테로스포루스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 비. 미코이데스, 비. 포필리아에, 비. 폴리믹사, 비. 푸밀루스, 비. 투린기엔시스, 파스테우리아 페네트란스, 파스테우리아 토르네이, 파스테우리아 니쉬자와에, 스트렙토미세스 비리도크로모게네스, 스트렙토미세스 그리세오비리디스, 스트렙토미세스 리디쿠스, 스트렙토미세스 플리카투스, 스트렙토미세스 신데네우시스, 스트렙토미세스 로체이, 스트렙토미세스 알니, 스트렙토미세스 비리디스, 스트렙토미세스 써모불가리스, 스트렙토미세스 그리세우스, 스트렙토미세스 아시디스카비에스, 스트렙토미세스 아우레오파시엔스, 스트렙토미세스 갈부스, 스트렙토미세스 미크로플라부스, 및 스트렙토미세스 아우레오파시엔스의 포자를 L-알라닌, L-발린, L-프롤린, L-류신, L-시스테인, L-트레오닌, L-글루타민, L-아스파라긴 또는 L-페닐알라닌과 함께 건조시켰는데, 이는 증류수 1 밀리리터당 상기 아미노산 0.044 그램을 함유하는 용액으로서 건조하기 직전에 포자 덩어리 내로 도입하였다. 이로써 생성된 친밀한 혼합물은, 증류수 중의 0.01 M 인산염 완충액으로 이루어진 용액에 연속해서 도입함으로써 (이로써 pH 7이 된다) 발아시켰다.
B. 포자를 발아체와 통상적으로 혼합함: 비. 서브틸리스, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 브레비스, 비. 세레우스, 비. 코아굴란스, 비. 피르무스, 비. 라테로스포루스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 비. 미코이데스, 비. 포필리아에, 비. 폴리믹사, 비. 푸밀루스, 비. 투린기엔시스, 파스테우리아 페네트란스, 파스테우리아 토르네이, 파스테우리아 니쉬자와에, 스트렙토미세스 비리도크로모게네스, 스트렙토미세스 그리세오비리디스, 스트렙토미세스 리디쿠스, 스트렙토미세스 플리카투스, 스트렙토미세스 신데네우시스, 스트렙토미세스 로체이, 스트렙토미세스 알니, 스트렙토미세스 비리디스, 스트렙토미세스 써모불가리스, 스트렙토미세스 그리세우스, 스트렙토미세스 아시디스카비에스, 스트렙토미세스 아우레오파시엔스, 스트렙토미세스 갈부스, 스트렙토미세스 미크로플라부스, 및 스트렙토미세스 아우레오파시엔스의 포자를 수화 및 건조시켰다. 이러한 포자는, 증류수 중의 0.01 M 인산염 완충액 (이로써 pH 7이 된다), 및 용액 1 밀리리터당 0.0001 그램의 L-알라닌, L-발린, L-프롤린, L-류신, L-시스테인, L-트레오닌, L-글루타민, L-아스파라긴 또는 L-페닐알라닌으로 이루어진 용액 내에 도입함으로써 발아시켰다.
C. 포자 단독의 발아: 비. 서브틸리스, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 브레비스, 비. 세레우스, 비. 코아굴란스, 비. 피르무스, 비. 라테로스포루스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 비. 미코이데스, 비. 포필리아에, 비. 폴리믹사, 비. 푸밀루스, 비. 투린기엔시스, 파스테우리아 페네트란스, 파스테우리아 토르네이, 파스테우리아 니쉬자와에, 스트렙토미세스 비리도크로모게네스, 스트렙토미세스 그리세오비리디스, 스트렙토미세스 리디쿠스, 스트렙토미세스 플리카투스, 스트렙토미세스 신데네우시스, 스트렙토미세스 로체이, 스트렙토미세스 알니, 스트렙토미세스 비리디스, 스트렙토미세스 써모불가리스, 스트렙토미세스 그리세우스, 스트렙토미세스 아시디스카비에스, 스트렙토미세스 아우레오파시엔스, 스트렙토미세스 갈부스, 스트렙토미세스 미크로플라부스, 및 스트렙토미세스 아우레오파시엔스의 포자를 수화 및 건조시켰다. 이러한 포자는, 증류수 중의 0.01 M 인산염 완충액 (이로써 pH 7이 된다)으로 이루어진 용액 내로 연속해서 도입하였다.
이러한 각 처리에 대해 생성되는 포자의 발아는 광밀도 상의 저하 %에 의해 또는 발아된 포자의 수를 현미경으로 계수함으로써 측정한다. 친밀하게 혼합된 조성물이, 통상적으로 혼합된 그들의 상응하는 등가물 보다 더 신속하게 발아되는 것으로 밝혀졌다.
Claims (37)
- 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하며, 여기서 상기 박테리아 포자 및 발아성 화합물은 이들이 발아에 도움이 되는 환경에 도달할 때까지 근접한 위치에서 유지되는 것인, 건조된 친밀한 혼합물.
- 제1항에 있어서, 포자가 비. 알칼로필루스 (B. alcalophilus), 비. 알베이 (B. alvei), 비. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), 비. 아네우리노리티쿠스 (B. aneurinolyticus), 비. 안트라시스 (B. anthracis), 비. 아쿠아에마리스 (B. aquaemaris), 비. 아트로파에우스 (B. atrophaeus), 비. 보로노필루스 (B. boronophilus), 비. 브레비스 (B. brevis), 비. 칼도리이쿠스 (B. caldolyyicus), 비. 센트로스포루스 (B. centrosporus), 비. 세레우스 (B. cereus), 비. 시르쿨란스 (B. circulans), 비. 클라우시이 (B. clausii), 비. 코아굴란스 (B. coagulans), 비. 피르무스 (B. firmus), 비. 플라보써무스 (B. flavothermus), 비. 푸시포르미스 (B. fusiformis), 비. 글로비기이 (B. globigii), 비. 인페르누스 (B. infernus), 비. 라르바에 (B. larvae), 비. 라테로스포루스 (B. laterosporus), 비. 렌투스 (B. lentus), 비. 렌티모르부스 (B. lentimorbus), 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis), 비. 메가테리움 (B. megaterium), 비. 메센테리쿠스 (B. mesentericus), 비. 무실라기노수스 (B. mucilaginosus), 비. 미코이데스 (B. mycoides), 비. 나토 (B. natto), 비. 판토테니쿠스 (B. pantothenicus), 비. 포필리아에 (B. popilliae), 비. 폴리믹사 (B. polymyxa), 비. 슈도안트라시스 (B. pseudoanthracis), 비. 푸밀루스 (B. pumilus), 비. 슐레겔리이 (B. schlegelii), 비. 심플렉스 (B. simplex), 비. 스파에리쿠스 (B. sphaericus), 비. 스포로써모두란스 (B. sporothermodurans), 비. 스테아로써모필루스 (B. stearothermophilus), 비. 서브틸리스 (B. subtilis), 비. 써모글루코시다시우스 (B. thermoglucosidasius), 비. 투린기엔시스 (B. thuringiensis), 비. 불가티스 (B. vulgatis), 비. 웨이헨스테파넨시스 (B. weihenstephanensis), 씨. 써모셀룸 (C. thermocellum), 씨. 륭달리이 (C. ljungdahlii), 씨. 아세토부틸리쿰 (C. acetobutylicum), 씨. 베이제린크키이 (C. beijerinckii), 씨. 부티리쿰 (C. butyricum), 파스테우리아 페네트란스 (Pasteuria penetrans), 파스테우리아 토르네이 (Pasteuria thornei), 파스테우리아 니쉬자와에 (Pasteuria nishizawae), 및 스트렙토미세스 (Streptomyces) 종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 혼합물.
- 제1항에 있어서, 발아성 화합물이 L-알라닌, L-발린, L-프롤린, L-류신, L-시스테인, L-트레오닌, L-글루타민, L-아스파라긴, L-페닐알라닌 및 그의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 혼합물.
- 제1항에 있어서, L-알라닌 + 바실루스 서브틸리스, L-알라닌 + 바실루스 리케니포르미스, L-알라닌 + 바실루스 푸밀루스, L-알라닌 + 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, L-알라닌 + 바실루스 코아굴란스, L-알라닌 + 바실루스 세레우스, L-알라닌 + 바실루스 클라우시이, L-알라닌 + 클로스트리디움 부티리쿰,
L-발린 + 바실루스 서브틸리스, L-발린 + 바실루스 리케니포르미스, L-발린 + 바실루스 푸밀루스, L-발린 + 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, L-발린 + 바실루스 코아굴란스, L-발린 + 바실루스 세레우스, L-발린 + 바실루스 클라우시이, L-발린 + 클로스트리디움 부티리쿰,
L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 서브틸리스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 리케니포르미스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 푸밀루스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 코아굴란스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 세레우스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 클라우시이, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 클로스트리디움 부티리쿰,
L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 서브틸리스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 리케니포르미스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 푸밀루스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 코아굴란스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 세레우스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 클라우시이, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 클로스트리디움 부티리쿰,
L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 서브틸리스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 리케니포르미스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 푸밀루스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 코아굴란스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 세레우스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 클라우시이, L-알라닌 + 이노신 + 클로스트리디움 부티리쿰,
L-프롤린 + 글루코스 + 바실루스 메가테리움, L-프롤린 + 바실루스 메가테리움, 및 L-락테이트 + 클로스트리디움 부티리쿰으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혼합물. - 제1항에 있어서, 분무 건조, 동결 건조, 공기 건조 또는 드럼 건조에 의해 제조되는 혼합물.
- 제1항에 있어서, 포자가 비. 서브틸리스, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 및 비. 푸밀루스로 이루어진 군으로부터 선택되고; 발아성 화합물이 L-알라닌, L-발린, 및 L-아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 혼합물.
- 제1항에 있어서, 발아성 화합물이 폴리펩티드인 혼합물.
- 제1항에 있어서, 발아성 화합물이 건조되기 이전에, 0.0003 mg/ml 내지 170 mg/ml의 농도 하에서 제제화되는 것인 혼합물.
- 제1항에 있어서, 포자가 쇼크를 받은 것인 혼합물.
- 제1항의 건조된 친밀한 혼합물을 포함하는 조성물.
- 제10항에 있어서, 포자가 비. 알칼로필루스, 비. 알베이, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 아네우리노리티쿠스, 비. 안트라시스, 비. 아쿠아에마리스, 비. 아트로파에우스, 비. 보로노필루스, 비. 브레비스, 비. 칼도리이쿠스, 비. 센트로스포루스, 비. 세레우스, 비. 시르쿨란스, 비. 클라우시이, 비. 코아굴란스, 비. 피르무스, 비. 플라보써무스, 비. 푸시포르미스, 비. 글로비기이, 비. 인페르누스, 비. 라르바에, 비. 라테로스포루스, 비. 렌투스, 비. 렌티모르부스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 비. 메센테리쿠스, 비. 무실라기노수스, 비. 미코이데스, 비. 나토, 비. 판토테니쿠스, 비. 포필리아에, 비. 폴리믹사, 비. 슈도안트라시스, 비. 푸밀루스, 비. 슐레겔리이, 비. 심플렉스, 비. 스파에리쿠스, 비. 스포로써모두란스, 비. 스테아로써모필루스, 비. 서브틸리스, 비. 써모글루코시다시우스, 비. 투린기엔시스, 비. 불가티스, 비. 웨이헨스테파넨시스, 씨. 써모셀룸, 씨. 륭달리이, 씨. 아세토부틸리쿰, 씨. 베이제린크키이, 씨. 부티리쿰, 파스테우리아 페네트란스, 파스테우리아 토르네이, 파스테우리아 니쉬자와에, 및 스트렙토미세스 종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제10항에 있어서, 발아성 화합물이 L-알라닌, L-발린, L-프롤린, L-류신, L-시스테인, L-트레오닌, L-글루타민, L-아스파라긴, L-페닐알라닌 및 그의 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제10항에 있어서, L-알라닌 + 바실루스 서브틸리스, L-알라닌 + 바실루스 리케니포르미스, L-알라닌 + 바실루스 푸밀루스, L-알라닌 + 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, L-알라닌 + 바실루스 코아굴란스, L-알라닌 + 바실루스 세레우스, L-알라닌 + 바실루스 클라우시이, L-알라닌 + 클로스트리디움 부티리쿰,
L-발린 + 바실루스 서브틸리스, L-발린 + 바실루스 리케니포르미스, L-발린 + 바실루스 푸밀루스, L-발린 + 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, L-발린 + 바실루스 코아굴란스, L-발린 + 바실루스 세레우스, L-발린 + 바실루스 클라우시이, L-발린 + 클로스트리디움 부티리쿰,
L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 서브틸리스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 리케니포르미스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 푸밀루스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 코아굴란스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 세레우스, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 클라우시이, L-알라닌 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 클로스트리디움 부티리쿰,
L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 서브틸리스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 리케니포르미스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 푸밀루스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 코아굴란스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 세레우스, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 바실루스 클라우시이, L-아스파라긴 + 글루코스+프룩토스+칼륨 이온 (GFK) + 클로스트리디움 부티리쿰,
L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 서브틸리스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 리케니포르미스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 푸밀루스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 코아굴란스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 세레우스, L-알라닌 + 이노신 + 바실루스 클라우시이, L-알라닌 + 이노신 + 클로스트리디움 부티리쿰,
L-프롤린 + 글루코스 + 바실루스 메가테리움, L-프롤린 + 바실루스 메가테리움, 및 L-락테이트 + 클로스트리디움 부티리쿰으로 이루어진 군으로부터 선택된 혼합물인 조성물. - 제10항에 있어서, 혼합물이 분무 건조, 동결 건조, 공기 건조 또는 드럼 건조에 의해 제조되는 것인 조성물.
- 제10항에 있어서, 장용 코팅을 추가로 포함하는 조성물.
- 제10항에 있어서, 포자가 비. 서브틸리스, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 및 비. 푸밀루스로 이루어진 군으로부터 선택되고; 발아성 화합물이 L-알라닌, L-발린, 및 L-아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
- 제10항에 있어서, 발아성 화합물이 폴리펩티드인 조성물.
- 제10항에 있어서, 발아성 화합물이 건조되기 이전에, 0.0003 mg/ml 내지 170 mg/ml의 농도 하에서 제제화되는 것인 조성물.
- 제10항에 있어서, 포자가 쇼크를 받은 것인 조성물.
- 제10항에 있어서, 공동-발아체를 추가로 포함하는 조성물.
- 제10항에 있어서, 영양소를 추가로 포함하는 조성물.
- a) 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 용액을 제조하는 단계; 및
b) 상기 용액을 건조시켜, 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 건조된 친밀한 혼합물을 수득하며, 여기서 상기 박테리아 포자 및 발아성 화합물은 이들이 발아에 도움이 되는 환경에 도달할 때까지 근접한 위치에서 유지되는 것인 단계
를 포함하는, 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 건조된 친밀한 혼합물을 제조하는 방법. - 제22항에 있어서, 건조가 분무 건조, 동결 건조, 공기 건조 또는 드럼 건조인 방법.
- 제22항에 있어서, 포자가 비. 알칼로필루스, 비. 알베이, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 아네우리노리티쿠스, 비. 안트라시스, 비. 아쿠아에마리스, 비. 아트로파에우스, 비. 보로노필루스, 비. 브레비스, 비. 칼도리이쿠스, 비. 센트로스포루스, 비. 세레우스, 비. 시르쿨란스, 비. 클라우시이, 비. 코아굴란스, 비. 피르무스, 비. 플라보써무스, 비. 푸시포르미스, 비. 글로비기이, 비. 인페르누스, 비. 라르바에, 비. 라테로스포루스, 비. 렌투스, 비. 렌티모르부스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 비. 메센테리쿠스, 비. 무실라기노수스, 비. 미코이데스, 비. 나토, 비. 판토테니쿠스, 비. 포필리아에, 비. 폴리믹사, 비. 슈도안트라시스, 비. 푸밀루스, 비. 슐레겔리이, 비. 심플렉스, 비. 스파에리쿠스, 비. 스포로써모두란스, 비. 스테아로써모필루스, 비. 서브틸리스, 비. 써모글루코시다시우스, 비. 투린기엔시스, 비. 불가티스, 비. 웨이헨스테파넨시스, 씨. 써모셀룸, 씨. 륭달리이, 씨. 아세토부틸리쿰, 씨. 베이제린크키이, 씨. 부티리쿰, 파스테우리아 페네트란스, 파스테우리아 토르네이, 파스테우리아 니쉬자와에, 및 스트렙토미세스 종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 포자가 비. 서브틸리스, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 및 비. 푸밀루스로 이루어진 군으로부터 선택되고; 발아성 화합물이 L-알라닌, L-발린, 및 L-아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제22항의 방법에 의해 제조된, 건조된 친밀한 혼합물.
- 제22항에 있어서, 발아성 화합물이 폴리펩티드인 방법.
- 제22항에 있어서, 발아성 화합물이 건조되기 이전에, 0.0003 mg/ml 내지 170 mg/ml의 농도 하에서 제제화되는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 포자가 쇼크를 받은 것인 방법.
- a) 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 용액을 제조하는 단계;
b) 상기 용액을 건조시켜, 박테리아 포자 및 발아성 화합물을 포함하는 건조된 친밀한 혼합물을 수득하며, 여기서 상기 박테리아 포자 및 발아성 화합물은, 이들이 박테리아 포자의 발아에 도움이 되는 환경에 도달할 때까지 근접한 위치에서 유지되는 것인 단계; 및
c) 상기 친밀한 혼합물을 박테리아 포자의 발아에 도움이 되는 환경에 노출시키며, 여기서 친밀한 혼합물 중의 박테리아 포자의 발아, 성장, 대사 및/또는 효소 활성은, 발아성 화합물이 결여된 상응하는 박테리아 포자 제제와 비교하여 증가되는 것인 단계
를 포함하는, 박테리아 포자의 발아, 성장, 대사 및/또는 효소 활성을 증가시키는 방법. - 제30항에 있어서, 친밀한 혼합물 중의 박테리아 포자의 발아, 성장, 대사 및/또는 효소 활성 %가, 발아성 화합물이 결여된 상응하는 박테리아 포자 제제와 비교하여 10% 이상 증가되는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 건조가 분무 건조, 동결 건조, 공기 건조 또는 드럼 건조인 방법.
- 제30항에 있어서, 포자가 비. 알칼로필루스, 비. 알베이, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 아네우리노리티쿠스, 비. 안트라시스, 비. 아쿠아에마리스, 비. 아트로파에우스, 비. 보로노필루스, 비. 브레비스, 비. 칼도리이쿠스, 비. 센트로스포루스, 비. 세레우스, 비. 시르쿨란스, 비. 클라우시이, 비. 코아굴란스, 비. 피르무스, 비. 플라보써무스, 비. 푸시포르미스, 비. 글로비기이, 비. 인페르누스, 비. 라르바에, 비. 라테로스포루스, 비. 렌투스, 비. 렌티모르부스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 비. 메센테리쿠스, 비. 무실라기노수스, 비. 미코이데스, 비. 나토, 비. 판토테니쿠스, 비. 포필리아에, 비. 폴리믹사, 비. 슈도안트라시스, 비. 푸밀루스, 비. 슐레겔리이, 비. 심플렉스, 비. 스파에리쿠스, 비. 스포로써모두란스, 비. 스테아로써모필루스, 비. 서브틸리스, 비. 써모글루코시다시우스, 비. 투린기엔시스, 비. 불가티스, 비. 웨이헨스테파넨시스, 씨. 써모셀룸, 씨. 륭달리이, 씨. 아세토부틸리쿰, 씨. 베이제린크키이, 씨. 부티리쿰, 파스테우리아 페네트란스, 파스테우리아 토르네이, 파스테우리아 니쉬자와에, 및 스트렙토미세스 종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 포자가 비. 서브틸리스, 비. 아밀로리퀘파시엔스, 비. 리케니포르미스, 비. 메가테리움, 및 비. 푸밀루스로 이루어진 군으로부터 선택되고; 발아성 화합물이 L-알라닌, L-발린, 및 L-아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 발아성 화합물이 폴리펩티드인 방법.
- 제30항에 있어서, 발아성 화합물이 건조되기 이전에, 0.0003 mg/ml 내지 170 mg/ml의 농도 하에서 제제화되는 것인 방법.
- 제30항에 있어서, 포자가 쇼크를 받은 것인 방법.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201361849973P | 2013-02-06 | 2013-02-06 | |
| US61/849,973 | 2013-02-06 | ||
| US14/174,099 | 2014-02-06 | ||
| US14/174,099 US9447376B2 (en) | 2013-02-06 | 2014-02-06 | Dried spore germinative compound mixtures |
| PCT/US2014/015076 WO2014124120A1 (en) | 2013-02-06 | 2014-02-06 | Dried spore germinative compound mixtures |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20150133699A true KR20150133699A (ko) | 2015-11-30 |
| KR102302522B1 KR102302522B1 (ko) | 2021-09-14 |
Family
ID=51259538
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020157021934A KR102302522B1 (ko) | 2013-02-06 | 2014-02-06 | 건조된 포자 발아성 화합물 혼합물 |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9447376B2 (ko) |
| EP (1) | EP2954041B1 (ko) |
| JP (2) | JP6552416B2 (ko) |
| KR (1) | KR102302522B1 (ko) |
| CN (1) | CN105121622A (ko) |
| AU (1) | AU2014214917B2 (ko) |
| BR (1) | BR112015018783B1 (ko) |
| CA (1) | CA2899606C (ko) |
| DK (1) | DK2954041T3 (ko) |
| EA (1) | EA034962B1 (ko) |
| ES (1) | ES2699438T3 (ko) |
| HR (1) | HRP20181498T1 (ko) |
| HU (1) | HUE040216T2 (ko) |
| LT (1) | LT2954041T (ko) |
| MX (1) | MX358960B (ko) |
| PL (1) | PL2954041T3 (ko) |
| PT (1) | PT2954041T (ko) |
| RS (1) | RS58158B1 (ko) |
| SI (1) | SI2954041T1 (ko) |
| WO (1) | WO2014124120A1 (ko) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2015156089A (ru) * | 2013-05-31 | 2017-07-06 | Новозимс Биоаг А/С | Композиции и способы для усиления прорастания |
| US10653729B2 (en) | 2013-10-25 | 2020-05-19 | Nch Corporation | Delivery system and probiotic composition for animals and plants |
| US10766799B2 (en) | 2014-05-23 | 2020-09-08 | Nch Corporation | Method for improving quality of aquaculture pond water using a nutrient germinant composition and spore incubation method |
| US9908799B2 (en) | 2014-05-23 | 2018-03-06 | Nch Corporation | Method for improving quality of aquaculture pond water |
| WO2016196680A1 (en) * | 2015-06-01 | 2016-12-08 | Robert Caron | Biofilm control and frack fluid production using bacillus subtilis activated with gfak |
| CN105439725A (zh) * | 2015-12-19 | 2016-03-30 | 佛山市艳晖生物科技有限公司 | 一种用于农场现场发酵的多粘类芽孢杆菌药肥及其应用 |
| CN105594698B (zh) * | 2015-12-19 | 2018-06-01 | 佛山市艳晖生物科技有限公司 | 一种侧孢芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法 |
| CN105439723A (zh) * | 2015-12-19 | 2016-03-30 | 佛山市艳晖生物科技有限公司 | 一种用于农场现场发酵的解淀粉芽孢杆菌药肥及其应用 |
| CN105439726A (zh) * | 2015-12-19 | 2016-03-30 | 佛山市艳晖生物科技有限公司 | 一种应用于农场现场发酵的巨大芽孢杆菌菌肥及其应用 |
| CN105439724A (zh) * | 2015-12-19 | 2016-03-30 | 佛山市艳晖生物科技有限公司 | 一种用于农场现场发酵的胶冻样芽孢杆菌菌肥及其应用 |
| CN105602864B (zh) * | 2015-12-19 | 2019-02-12 | 广州百农基生物技术有限公司 | 用于畜禽养殖场现场发酵的纳豆芽孢杆菌制剂及应用 |
| US10897922B2 (en) | 2016-04-05 | 2021-01-26 | Nch Corporation | Composition and method for germinative compounds in probiotic food and beverage products for human consumption |
| JP6953425B2 (ja) | 2016-04-05 | 2021-10-27 | エヌシーエイチ コーポレイションＮｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | 栄養豊富な発芽性組成物及び芽胞培養方法 |
| WO2018026446A1 (en) * | 2016-07-30 | 2018-02-08 | Novozymes Bioag A/S | Composition comprising non-germinant and bacterial spores |
| CA3079993C (en) * | 2017-11-03 | 2022-09-20 | Nch Corporation | Composition and method for germinative compounds in probiotic food and beverage products for human consumption |
| CA3088139C (en) * | 2018-02-28 | 2024-02-20 | Nch Corporation | Method for improving quality of aquaculture pond water using a nutrient germinant composition and spore incubation method |
| EP3784807A1 (en) * | 2018-04-23 | 2021-03-03 | Evonik Operations GmbH | Synbiotic compositions |
| US11401500B2 (en) | 2018-08-29 | 2022-08-02 | Nch Corporation | System, method, and composition for incubating spores for use in aquaculture, agriculture, wastewater, and environmental remediation applications |
| CN109619182B (zh) * | 2018-11-08 | 2022-07-08 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 芽孢萌发剂及应用 |
| WO2020264009A1 (en) * | 2019-06-24 | 2020-12-30 | Noxilizer Inc. | Method of manufacturing biological indicators |
| US11884960B2 (en) * | 2019-08-16 | 2024-01-30 | Terragene Llc | Biological indicator for determining the efficacy of a steam or heat sterilization process and its method of use |
| CN110904002B (zh) * | 2019-11-25 | 2022-04-29 | 天津大学 | 一种生物移除四环素类抗生素的方法 |
| WO2021159068A1 (en) | 2020-02-06 | 2021-08-12 | Nch Corportion | Composition and method of using germinative compounds in probiotics for inflammation reduction in humans |
| WO2021194930A1 (en) * | 2020-03-23 | 2021-09-30 | Nch Corporation | System and method for using a single-serve nutrient spore composition for small scale farm applications |
| BR112022019075A2 (pt) * | 2020-03-24 | 2022-11-08 | Triplew Ltd | Produção de ácido lático a partir de resíduos orgânicos usando composições de esporos de bacillus coagulans |
| BR112023018245A2 (pt) * | 2021-04-30 | 2024-01-16 | Total Biotecnologia Ind E Comercio S/A | Composição agrícola de espécies bacterianas do gênero bacillus e alicina, processo de fabricação e usos da mesma, bem como métodos para controlar nematoides em culturas agrícolas e promover o crescimento de plantas em culturas agrícolas |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995025163A1 (en) * | 1994-03-15 | 1995-09-21 | Philom Bios Inc. | Methods for the production of fungal spores and compositions thereof |
| WO1999005310A1 (en) * | 1997-07-28 | 1999-02-04 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Spore germination media |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6187555B1 (en) | 1998-04-16 | 2001-02-13 | 3M Innovative Properties Company | Spores with increased sensitivity to sterilants using additives that bind to sterilant-sensitive sites |
| US6849256B1 (en) | 1999-11-08 | 2005-02-01 | Ganeden Biotech Incorporated | Inhibition of pathogens by probiotic bacteria |
| WO2001066471A2 (en) * | 2000-03-08 | 2001-09-13 | Hercules Incorporated | Control of spore forming bacteria in aqueous systems |
| AU2002348340B2 (en) | 2001-11-05 | 2008-07-03 | Ganeden Biotech, Inc. | Probiotic compositions |
| MX2007004462A (es) | 2004-10-15 | 2008-04-07 | Zuchem Inc | Produccion fermentativa de manitol. |
| MX345067B (es) | 2008-04-07 | 2017-01-16 | Bayer Cropscience Lp | Formulación acuosa estable que contiene esporas. |
| RU2015135354A (ru) * | 2008-12-19 | 2018-12-26 | Кр. Хансен А/С | Композиция палочковидных бактерий, устойчивых к желчи, секретирующих высокие уровни незаменимых аминокислот |
| US8802079B2 (en) | 2008-12-19 | 2014-08-12 | Chr. Hansen A/S | Bile resistant Bacillus composition |
| CA2808495A1 (en) * | 2010-08-25 | 2012-03-01 | Tate & Lyle Ingredients Americas Llc | Synbiotic product |
| CA2822296A1 (en) | 2010-12-21 | 2012-06-28 | Bayer Cropscience Lp | Sandpaper mutants of bacillus and methods of their use to enhance plant growth, promote plant health and control diseases and pests |
| CN102515927B (zh) * | 2011-09-21 | 2013-09-11 | 周法永 | 一种药效型微生物肥料及其制备方法和应用 |
| EP2773744B1 (en) * | 2011-11-02 | 2018-12-19 | Texas Tech University System | Media compositions for promoting bacterial and fungal growth |
-
2014
- 2014-02-06 CA CA2899606A patent/CA2899606C/en active Active
- 2014-02-06 EP EP14749483.5A patent/EP2954041B1/en active Active
- 2014-02-06 US US14/174,099 patent/US9447376B2/en active Active
- 2014-02-06 LT LTEP14749483.5T patent/LT2954041T/lt unknown
- 2014-02-06 CN CN201480007598.5A patent/CN105121622A/zh active Pending
- 2014-02-06 HU HUE14749483A patent/HUE040216T2/hu unknown
- 2014-02-06 DK DK14749483.5T patent/DK2954041T3/en active
- 2014-02-06 EA EA201591463A patent/EA034962B1/ru unknown
- 2014-02-06 PL PL14749483T patent/PL2954041T3/pl unknown
- 2014-02-06 JP JP2015556259A patent/JP6552416B2/ja active Active
- 2014-02-06 SI SI201430879T patent/SI2954041T1/sl unknown
- 2014-02-06 RS RS20181083A patent/RS58158B1/sr unknown
- 2014-02-06 MX MX2015010124A patent/MX358960B/es active IP Right Grant
- 2014-02-06 BR BR112015018783-8A patent/BR112015018783B1/pt active IP Right Grant
- 2014-02-06 ES ES14749483T patent/ES2699438T3/es active Active
- 2014-02-06 PT PT14749483T patent/PT2954041T/pt unknown
- 2014-02-06 KR KR1020157021934A patent/KR102302522B1/ko active IP Right Grant
- 2014-02-06 WO PCT/US2014/015076 patent/WO2014124120A1/en active Application Filing
- 2014-02-06 AU AU2014214917A patent/AU2014214917B2/en active Active
-
2016
- 2016-08-26 US US15/248,328 patent/US10308909B2/en active Active
-
2018
- 2018-09-20 HR HRP20181498TT patent/HRP20181498T1/hr unknown
-
2019
- 2019-03-28 JP JP2019063618A patent/JP2019115357A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995025163A1 (en) * | 1994-03-15 | 1995-09-21 | Philom Bios Inc. | Methods for the production of fungal spores and compositions thereof |
| WO1999005310A1 (en) * | 1997-07-28 | 1999-02-04 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Spore germination media |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102302522B1 (ko) | 건조된 포자 발아성 화합물 혼합물 | |
| KR102533305B1 (ko) | 바실루스속 세균의 배양 방법 및 유용 물질의 제조 방법 | |
| EP3177149B1 (en) | Bacterial spore compositions for industrial uses | |
| CN108884434B (zh) | 富含营养的萌发剂组合物及孢子培养方法 | |
| Bedi et al. | Characterization of Rhizobium isolated from root nodules of Trifolium alexandrinum | |
| Cai et al. | Isolation of Vibrio parahaemolyticus from abalone (Haliotis diversicolor supertexta L.) postlarvae associated with mass mortalities | |
| EP1546366B9 (fr) | Procede de detection et de comptage de microorganismes dans un echantillon | |
| US20110086797A1 (en) | Control of spore germination | |
| CN101636157A (zh) | 作为抗菌干预的新型靶的腺苷酰环化酶 | |
| Chen et al. | Prevalence and contamination patterns of Listeria monocytogenes in Flammulina velutipes plants | |
| US8524468B2 (en) | Method for detecting the presence or absence of methicillin resistant staphylococcus aureus (MRSA) in a test sample | |
| CZ2014565A3 (cs) | Kmeny laktobacilů produkující látky účinné proti vaginálním patogenům, jejich použití a hygienické prostředky je obsahující | |
| Olayiwola et al. | Microbiological Quality Assessment and Antibiogram of the Bacteria isolated from fish feed, Oyo, South-west Nigeria | |
| Zhao et al. | Cultivation of Paenibacillus polymyxa by solid-state fermentation of pear residues | |
| Bharathirajan et al. | Study on the Antibacterial Activity and Identification of cellulolytic bacteria from Cow Urine | |
| Raju et al. | Production and Optimization Studies of Protease by Soil Isolate Actinomycetes Using Mixed Substrate of Pomegranate Peel Powder and Banana Peel Powder under Solid State Fermentation | |
| Busse | Family I. Corynebacteriaceae Lehmann and Neumann 1902AL emend. Stackebrandt, Rainey and Ward-Rainey 1997, 485 emend. Zhi, Li and Stackebrandt 2009, 593 | |
| Onyenwe et al. | Comparative analysis on the curing effect of acridine orange (mutagen) on beta-lactamase producing Staphylococus aureus, from bovine and human origin | |
| RU2535881C1 (ru) | Способ выделения и идентификации бактерий рода klebsiella | |
| US20140349325A1 (en) | Method and medium for detecting the presence or absence of an antibiotic resistant pathogenic staphylococci in a test sample |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |