JP2016506735A - 乾燥した芽胞発芽性化合物の混合物 - Google Patents

Abstract

一態様では、本発明は細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物、および密接混合物を作製する方法に関する。別の態様では、本発明はこのような密接混合物を含む組成物に関する。本発明は、細菌芽胞と発芽性化合物との密接混合物を作製することを含む、細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および／または酵素活性を増大させる方法にも関する。【選択図】なし

Description

一態様では、本発明は細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物、および該混合物を作製する方法に関する。別の態様では、本発明はこのような混合物を含む組成物に関する。本発明は概して、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物を作製することを含む、細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および／または酵素活性を増大させる方法にも関する。

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１３年２月６日付で出願された米国仮出願第６１／８４９，９７３号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）の優先権の利益を主張する。

ヒトおよび動物の両方のプロバイオティクスとして幾つかのバチルス株を含む芽胞形成細菌の使用が近年普及してきている。特許文献１において言及されているように、バチルス・サブチリス（枯草菌）およびバチルス・リケニホルミスなどの種が、動物飼料からの栄養素の消化および利用能を増大させることにより成長を促進させるための動物飼料における栄養補助食品として使用されている。バチルス・コアグランスはタンパク質、ラクトースおよびフルクトースの消化を助ける、市販の食用プロバイオティクス製品における有効成分である。

非特許文献１において言及されているように、このような細菌はプロバイオティクスとして機能するために発芽型または栄養型で小腸に存在していなければならない。このような微生物は芽胞型では胃酸および胆汁塩の両方に耐性であるが、栄養型の状態ではこのような環境の影響を受けやすい。そのため、栄養型の状態で用いる場合、バチルス株は薬学的に許容可能な耐酸性、すなわち「腸溶性」担体内に含まれていなければならない。特許文献２の第７パラグラフを参照されたい。

残念なことに、適切な保存寿命を有するように栄養型のバチルス種を配合することは困難である。GanedenBCの商品パンフレットに言及されているように、従来の栄養型プロバイオティクスは製造過程における高熱および高圧に耐えることができず、保存時に急速に死滅し、消化管における胃酸および胆汁酵素に弱い。これに対して、このような種の芽胞型の配合物は商業的用途および実用的用途にはるかに適している。そのため、非特許文献２に言及されているように、「細菌芽胞は代謝的に休止状態であり、環境ストレスに対する回復力が高いことから、生きた微生物製品としての使用に特に適している。これらの固有の特性は商業上非常に望ましいものであり、芽胞系製品は保存寿命が長く、流通および保管の間、生存能力が保持されることを意味する。」

バチルス芽胞の発芽を刺激するのに幾つかの化合物、特に幾つかのＬ−アミノ酸を使用することが文献にて報告されている。このようなものとして例えば、非特許文献３に、水溶液中の芽胞懸濁液へのＬ−アラニンの添加により、多くのバチルス種の発芽が引き起こされることが開示されている。加えて、非特許文献１では、GanedenBCにおけるバチルス・コアグランス芽胞を、Ｌ−アラニンを含有する食餌とともに消化することにより、またはこのような芽胞とともにＬ−アラニンを粉末配合物に含ませることにより、小腸の起始部にて発芽状態へと誘起することができることが示唆されている。しかしながら、Maathiusによって示唆されたアプローチには、プロバイオティクスに有効な細菌培養物を樹立するのに幾つかの大きな課題がある。

１）GanedenBCにおいて用いられるバチルス・コアグランス芽胞自体は胃内の低ｐＨに強い耐性を示すが、胃酸への曝露は、かかる芽胞がより中性のｐＨに入った際に発芽の遅滞を引き起こす可能性がある。例えば、非特許文献４では、Ｂ．セレウスの芽胞は、発芽性化合物であるＬ−アラニンまたはＬ−システインの存在下であってもｐＨ４．５では発芽が抑制されたことが実証されている。芽胞はｐＨ４．５の緩衝液の後にｐＨ７．０の緩衝液に順次曝すことで、このようなＬ−アミノ酸への曝露に際して発芽させることが可能ではあったが、発芽に関して遅滞を示した。芽胞が排出されるまでの小腸に存在し得る期間が比較的短い場合には、大幅な発芽の遅延は非常に望ましくない。このことは、食餌通過時間が１日齢で約１．５時間であり、通過時間が７日齢で２時間未満である雛（非特許文献５を参照されたい）、および通過時間が９０分未満である小エビ（非特許文献６を参照されたい）などのより小型の動物に特に当てはまる。そのため、胃内で見られるような低ｐＨに曝される条件下において細菌芽胞の発芽を加速および増大させる必要性がある。

２）Ｌ−アラニンが豊富に含まれる食餌にはＤ−アラニンも豊富に含まれている場合がある。非特許文献７および非特許文献４に言及されているように、Ｄ−アラニンはバチルスの発芽の強力な阻害剤である。加えて、粉末の形でバチルス芽胞と混合する場合にＬ−アラニンと競合し得る他の発芽阻害剤（例えば、他のＤ−アミノ酸、無機酸および有機酸、脂肪酸、ならびに胆汁塩）が小腸に大量に存在する場合がある。そのため、発芽性化合物と競合し得る発芽阻害剤の存在下において芽胞の発芽を改善する方法を開発する必要性がある。

Knap et al.（国際公開第２０１０／０７０００５号） Farmer（米国特許出願公開第２００３／０１２４１０４号）

Maathuis et al.（2010, Beneficial Microbes, 1(1): 31-36） Cartman et al.（2008, Applied and Environmental Microbiology, Aug., p. 5254-5258） Foerster et al.（1966, Journal of Bacteriology 91(3): 1168-1177） Blocher et al.（1985, Applied and Environmental Microbiology 50(2): 274-279） B. C. Watson et al.（2006, Poultry Science 85: 493-497） Beseres et al., 2005, Journal of Shellfish Research 24(1): 301-308 Atluri et al.（2006, Journal of Bacteriology 188(1): 28-36）

したがって本発明の目的はこのような利点をもたらすことが可能な細菌芽胞配合物を提供することである。

細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および酵素活性が、細菌芽胞と発芽性化合物との密接混合物の形成を通じて増大することが見出されたことは驚くべきことであった。意外なことに、密接混合物は発芽阻害剤の存在下であっても細菌芽胞の発芽および増殖を増大する。

一態様では、本発明は、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物であって、該細菌芽胞および該発芽性化合物が、発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される、乾燥した密接混合物に関する。

別の態様では、本発明は、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物を含む組成物であって、該細菌芽胞および該発芽性化合物が、発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される、組成物に関する。

更なる態様では、本発明は、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物を作製する方法であって、該方法が、
ａ）細菌芽胞と発芽性化合物とを含む溶液を準備することと、
ｂ）溶液を乾燥することで、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物を得ることと、
を含み、細菌芽胞および発芽性化合物が、発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される、方法に関する。

また更なる態様では、本発明は、細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および／または酵素活性を増大させる方法であって、該方法は、
ａ）細菌芽胞と発芽性化合物とを含む溶液を準備することと、
ｂ）溶液を乾燥することで、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物を得ることと、
を含み、細菌芽胞および発芽性化合物が、該細菌芽胞の発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持され、さらに該方法は、
ｃ）密接混合物を細菌芽胞の発芽を促す環境に曝すことを含み、該密接混合物における該細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および／または酵素活性が、発芽性化合物を欠く対応する細菌芽胞配合物に比べて増大する、方法に関する。

本発明の混合物は細菌芽胞と発芽性化合物とで構成されている。用いられる細菌種は芽胞を形成する任意の種とすることができ、通例ヒトまたは動物において所望のプロバイオティクス活性を示すものである。しかしながら、農業、環境修復、堆肥化またはメタン生産、クリーニング用品などに有用なものを含む他の産業的用途を有する細菌種も利用することができる。このような種としては、その全体が引用することにより本明細書の一部となるBergey's Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition (2009)に挙げられている、ファーミキューテス門の芽胞形成成員およびアクチノバクテリア門の芽胞形成成員が挙げられる。ファーミキューテス門の成員には、好気性芽胞形成種（一般的にこれまではバチルス種として規定されてきた）および嫌気性芽胞形成種（一般的にはこれまではクロストリジウム種として規定されてきた）が含まれる。ファーミキューテス門の例示的な種としては、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アルベイ、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．アネウリノリチクス、Ｂ．アンシラシス、Ｂ．アクエマリス、Ｂ．アトロファエウス、Ｂ．ボロノフィルス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．カルドリイカス、Ｂ．セントロスポラス、Ｂ．セレウス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．コアグランス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．フラボサーマス、Ｂ．フシホルミス、Ｂ．グロビジ、Ｂ．インフェルナス、Ｂ．ラルヴェ、Ｂ．ラテロスポラス、Ｂ．レンチモルブス、Ｂ．レンタス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．メセンテリカス、Ｂ．ムシラギノサス、Ｂ．ミコイデス、Ｂ．ナットー、Ｂ．パントテニカス（Ｂ．ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃｕｓ）、Ｂ．ポピリエ、Ｂ．ポリミキサ、Ｂ．シュードアンシラシス、Ｂ．プミルス、Ｂ．シュリジェリー、Ｂ．シンプレックス、Ｂ．スファエリクス、Ｂ．スポロサーモデュランス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．サブチリス、Ｂ．サーモグルコシダシウス、Ｂ．チューリンゲンシス、Ｂ．ブルガチス、Ｂ．ウェイヘンステファネンシス、Ｃ．サーモセラム、Ｃ．リュングダリイ、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ、Ｃ．ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、およびパスツーリア・ニシザワエ、ならびにこのような種の遺伝子組換え変異体が挙げられる。好ましい種としては、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．セレウス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．コアグランス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．ラテロスポラス、Ｂ．レンタス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．ポリミキサ、Ｂ．プミルス、Ｂ．シンプレックス、Ｂ．スファエリクス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．サブチリス、Ｂ．チューリンゲンシスおよびＣ．ブチリカムが挙げられる。アクチノバクテリア門の成員としては、ストレプトミセス属の種、およびこのような種の遺伝子組換え変異体が挙げられる。好ましい種としては、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトミセス・グリセオビリディス、ストレプトミセス・リディクス、ストレプトミセス・プリカツス、ストレプトミセス・シンデネウシス、ストレプトミセス・ロチェイ、ストレプトミセス・アルニ、ストレプトミセス・ビリディス、ストレプトミセス・サーモブルガリス、ストレプトミセス・グリセウス、ストレプトミセス・アシディスキャビエス、ステプトミセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトミセス・ガルブス、ストレプトミセス・ミクロフラバスおよびストレプトミセス・オーレオファシエンスが挙げられる。

発芽性化合物は、特定の芽胞形成細菌種と密接に混合され、該芽胞形成細菌種の発芽を引き起こすのに有効であるとともに、噴霧乾燥、凍結乾燥、空気乾燥またはドラム乾燥などのこのような密接混合物を形成するのに有用なプロセスを受けることが可能な任意の化合物を含むことができる。通例、このような発芽性化合物は、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−フェニルアラニンおよびそれらの類似体を含むＬ−アミノ酸である。このような類似体は、当業者であれば基礎となる化学基にまたは化学基内で置換を行うことにより作製することができる。そのようなものとして例えば、Ｌ−アラニンの類似体としては、Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ、ａ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ、Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ、Ｎ４２−メチルスルホニル）エチルオキシカルボニル−Ｌ−アラニンジシクロヘキシルアンモニウム塩（Ｎ−ＭＳＯＣ−Ｌ−Ａｌａ）、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニン（Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−Ａｌａ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン（Ｎ−Ａｃ−Ｌ−Ａｌａ）、Ｎ−２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−アラニン（Ｎ−ＤＮＰ−Ｌ−Ａｌａ）、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−アラニン（Ｎ−ＣＢＺ−Ｌ−Ａｌａ）、５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニル−Ｌ−アラニンシクロヘキシルアミン塩（Ｎ−ダンシル−Ｌ−Ａｌａ）、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アラニン（Ｎ−Ｂｚ−Ｌ−Ａｌａ）、Ｌ−アラニンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−アラニンエチルエステル塩酸塩、Ｌ−アラニンｔ−ブチルエステル塩酸塩、Ｌ−アラニンベンジルエステル塩酸塩、Ｌ−アラニンアミド、Ｌ−アラニンｐ−ニトロアニリド塩酸塩およびＬ−アラニノールが挙げられる。一実施形態では、発芽性化合物は、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−フェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である。このような発芽性化合物はＬ−アラニンであるのが好ましい。

このようなアミノ酸を個々の化合物としてまたはポリペプチドの形態で用いることができる。一実施形態では、ポリペプチドはタンパク質の加水分解産物、例えばカゼインの加水分解産物である。有用なポリペプチドは通例、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギンおよびＬ−フェニルアラニンなどの発芽剤として機能するアミノ酸を少なくとも５０パーセント含む。このような百分率はポリペプチドにおけるアミノ酸の数に基づくものである。

好ましい実施形態では、発芽性化合物は、Ｌ−アミノ酸、タンパク質、糖および塩からなる群から選択される。特に好ましい細菌芽胞／発芽性化合物の組合せとしては、Ｌ−アラニン＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アラニン＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アラニン＋バチルス・プミルス、Ｌ−アラニン＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−アラニン＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アラニン＋バチルス・セレウス、Ｌ−アラニン＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−アラニン＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−バリン＋バチルス・サブチリス、Ｌ−バリン＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−バリン＋バチルス・プミルス、Ｌ−バリン＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−バリン＋バチルス・コアグランス、Ｌ−バリン＋バチルス・セレウス、Ｌ−バリン＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−バリン＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・プミルス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・セレウス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・プミルス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・セレウス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・プミルス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・セレウス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−アラニン＋イノシン＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−プロリン＋グルコース＋バチルス・メガテリウム、Ｌ−プロリン＋バチルス・メガテリウム、およびＬ−乳酸塩＋クロストリジウム・ブチリカムが挙げられる。

幾つかの実施形態では、本発明の好ましい混合物として、芽胞が、Ｂ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウムおよびＢ．プミルスからなる群から選択され、発芽性化合物が、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリンおよびＬ−アスパラギンからなる群から選択されるものが挙げられる。

発芽性化合物は用いる細菌芽胞が発芽を引き起こすのに十分な量で存在する。この量は任意の特定の細菌芽胞／発芽性化合物の混合物について日常実験により容易に決定することができるが、このような発芽性化合物は通例、乾燥前に０．０００１ｍｇ／ｍＬ〜１７０ｍｇ／ｍＬの濃度で配合される。幾つかの実施形態では、発芽性化合物は、乾燥前に０．０００３ｍｇ／ｍＬ〜１７０ｍｇ／ｍＬ、０．０００３ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ、０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、または０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で配合される。好ましい実施形態では、発芽性化合物は乾燥前に０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で配合される。

本明細書で用いられる場合、「密接混合物」という用語は芽胞および発芽性化合物が発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される混合物を表す。

このような密接混合物は噴霧乾燥、凍結乾燥、空気乾燥またはドラム乾燥などのプロセスを用いて得ることができる。好ましい実施形態では、密接混合物は噴霧乾燥または凍結乾燥により作製される。このような密接混合物を形成する場合、芽胞および発芽性化合物は、発芽性化合物により芽胞の発芽が引き起こされる条件下において混合しないことが重要であり、これはこの混合により混合物の保存寿命中に有害作用を伴う未熟な発芽が引き起こされる可能性があるためである。このことは２つのノズル若しくは２つの別々の流れの同時噴霧を可能にする単一ノズルのいずれかを使用することによる噴霧乾燥機における別々の流れを利用することにより、または発芽を促さない条件（例えば温度）下における凍結乾燥により避けることができる。未熟な発芽は、乾燥の直前に芽胞の塊を、発芽性化合物を含有する溶液に導入することによっても避けることができる。

好ましい実施形態では、発芽性化合物は密接混合物における細菌芽胞に吸着されるかまたは細菌芽胞によって吸収される。更なる実施形態では、細菌芽胞および発芽性化合物は密接混合物全体に亘って微細に分散している。また更なる実施形態では、細菌芽胞および発芽性化合物は、細菌芽胞から本質的になる個々の粒子と発芽性化合物から本質的になる個々の粒子とを肉眼では視認することができないように密接混合物全体に亘って微視的に分散している。

一実施形態では、密接混合物は乾燥前に溶液中で細菌芽胞と発芽性化合物とを混ぜ合わせることにより調製される。細菌芽胞と発芽性化合物とを乾燥の直前に溶液中で混ぜ合わせるのが好ましい。

何ら理論に束縛されることを望むものではないが、密接混合物の形成により、該混合物が発芽に適切な環境に達したら、より好ましくは発芽性化合物を芽胞の発芽開始部位に結合することができる近接位置に発芽性化合物が置かれると考えられる。このような近接位置のために、発芽性化合物が、存在し得る発芽干渉化合物（Ｄ−アミノ酸など）を競合的に上回ることが可能となり、結果としてより多くの割合の芽胞が発芽することになる。細菌が栄養期に入ると対数増殖することから、このような割合の増大は培養物の形成において幾らかの対数増大を速やかにもたらすことができる。

本発明は（ａ）細菌芽胞と（ｂ）発芽性化合物とを含む密接混合物を含む組成物であって、芽胞と発芽性化合物とが、このような組成物が活性化環境に曝されるまで発芽性化合物が芽胞の発芽を誘導しないような不活性形態で維持される、組成物にも関する。

本明細書で用いられる場合、「活性化環境」という用語は、芽胞が栄養型の状態へと誘導されるように発芽性化合物と芽胞とが相互作用することが可能な環境を表す。このような活性化環境は温度、湿度、ｐＨまたは塩分濃度などの因子の組合せを含み得る。

発芽性化合物と細菌芽胞との密接混合物の形成は、発芽、増殖、代謝、酵素活性、ならびに低ｐＨ、高い塩濃度および毒性金属への曝露などの環境ストレスに対する耐性を含むが、それらに限定されない細菌芽胞の対象となる１つまたは複数の性質を増大させることにより、細菌芽胞の有用性を向上させることができる。幾つかの実施形態では、密接混合物は、発芽性化合物を欠く対応する細菌芽胞配合物と比べて少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％または５００％対象となる性質を増大させる。

発芽を更に高めるために、密接混合物の形成前に芽胞にショックを与えることが好ましい。芽胞には多様な標準方法、例えば浸透圧ショック、熱ショック、圧力ショック、栄養素の欠乏、および／または幾つかの酸への曝露にてショックを与えることができる。熱ショックは熱ショックタンパク質の生成を誘導するのに十分な温度で十分な期間、芽胞を加熱することを伴うものである。非特許文献７には、バチルス・サブチリスに対するそのような熱ショック処理の一つが記載されている。

本発明の組成物は細菌芽胞と発芽性化合物とを含む密接混合物を含む。このような組成物は、目的とする用途に応じて補助発芽剤、栄養素および配合助剤（例えば界面活性剤および／または腸溶性コーティング）を含む更なる成分を更に含むことができる。

用いることができる補助発芽剤としては、イノシンまたはアデノシンなどのプリンヌクレオシド、塩、糖（グルコースおよびフルクトースなど）が挙げられ、それらは全て当業者に既知である。

デキストロース、デンプン、および芽胞が発芽した場合に細菌コロニーの増殖を助ける微量栄養素を含む栄養素も含まれ得る。

組成物がプロバイオティクスとしての使用を目的とする場合、低ｐＨ環境への芽胞の曝露に関連する芽胞の発芽の遅滞を避けるために、腸溶性コーティングの使用を利用することが好ましい。このような腸溶性コーティングは、胃内の溶液に耐えるとともに、中性またはアルカリ性の腸液に溶解するように設計される。このようなコーティングはｐＨ感受性とすることができ、例えば胃内で直面するような酸性環境では溶解しないが、小腸で直面するような中性環境では溶解する。代替的には、腸溶性コーティングは小腸に見られる消化酵素との遭遇などの特定の代謝事象に曝されることで溶解することができる。例えばコーティングは、トリプシン、キモトリプシンまたは膵リパーゼなどの膵酵素により消化される。コーティングの消化または溶解により、バチルス芽胞／発芽性化合物が芽胞の発芽を促す環境へと入ることが可能となる。

用いることができる腸溶性コーティング材料は当該技術分野において既知であり、このような材料としては、アルギン酸塩、リンゴ酸−プロパン１，２−ジオール；セルロース誘導体、例えば酢酸フタル酸セルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）；酢酸フタル酸セルロース、ポリビニルアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびメタクリル酸とメチルメタクリレートとのアニオン性ポリマー；ならびにエチルアクリレートメチルアクリル酸コポリマーの水エマルジョン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＡＳ）が挙げられる。

農業的用途または産業的用途に用いられる場合、このような組成物は、発芽を妨げるか、または発芽した芽胞の生存能力に有害な影響を与えない限りは界面活性剤、乳化剤、他の有効成分などの標準的な配合助剤を更に含むことができる。例えば、特に殺芽胞性ではないフェノール系化合物が、０．２％（フェノール）、０．０８％（クレゾール）、および０．０２％（クロロクレゾール）（ｗｔ．／ｖｏｌ）と低い濃度で発芽を阻害することが知られている。発芽を阻害する可能性のある他の化合物も当該技術分野において既知である。例えばA. D. Russell, Bacterial Spores and Chemical Sporicidal Agents, CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Apr. 1990, p. 99-119を参照されたい。

本発明はまた、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物を作製する方法であって、該方法が、
ａ）細菌芽胞と発芽性化合物とを含む溶液を準備することと、
ｂ）溶液を乾燥することで、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物を得ることと、
を含み、細菌芽胞および発芽性化合物が、発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される、方法を提供する。

好ましい実施形態では、上述の方法における乾燥は噴霧乾燥、凍結乾燥、空気乾燥またはドラム乾燥である。別の好ましい実施形態では、上述の方法における芽胞は、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アルベイ、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．アネウリノリチクス、Ｂ．アンシラシス、Ｂ．アクエマリス、Ｂ．アトロファエウス、Ｂ．ボロノフィルス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．カルドリイカス、Ｂ．セントロスポラス、Ｂ．セレウス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．コアグランス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．フラボサーマス、Ｂ．フシホルミス、Ｂ．グロビジ、Ｂ．インフェルナス、Ｂ．ラルヴェ、Ｂ．ラテロスポラス、Ｂ．レンタス、Ｂ．レンチモルブス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．メセンテリカス、Ｂ．ムシラギノサス、Ｂ．ミコイデス、Ｂ．ナットー、Ｂ．パントテニカス（Ｂ．ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃｕｓ）、Ｂ．ポピリエ、Ｂ．ポリミキサ、Ｂ．シュードアンシラシス、Ｂ．プミルス、Ｂ．シュリジェリー、Ｂ．シンプレックス、Ｂ．スファエリクス、Ｂ．スポロサーモデュランス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．サブチリス、Ｂ．サーモグルコシダシウス、Ｂ．チューリンゲンシス、Ｂ．ブルガチス、Ｂ．ウェイヘンステファネンシス、Ｃ．サーモセラム、Ｃ．リュングダリイ、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ、Ｃ．ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ、およびストレプトミセス属の一種からなる群から選択される。

更なる好ましい実施形態では、上述の方法における芽胞は、Ｂ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウムおよびＢ．プミルスからなる群から選択され、上述の方法における発芽性化合物は、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリンおよびＬ−アスパラギンからなる群から選択される。

上述の方法における発芽性化合物は乾燥前に０．０００１ｍｇ／ｍｌ〜１７０ｍｇ／ｍｌの濃度で配合することができる。上述の方法の幾つかの実施形態では、発芽性化合物は乾燥前に０．０００３ｍｇ／ｍＬ〜１７０ｍｇ／ｍＬ、０．０００３ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ、０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、または０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で配合される。上述の方法の好ましい実施形態では、発芽性化合物は乾燥前に０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で配合される。幾つかの実施形態では、上述の方法における発芽性化合物はポリペプチドである。上述の方法の好ましい実施形態では、芽胞にショックを与えている。

本発明は上述の方法により作製される乾燥した密接混合物も提供する。

別の態様では、本発明は、細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および／または酵素活性を増大させる方法であって、該方法は、
ａ）細菌芽胞と発芽性化合物とを含む溶液を準備することと、
ｂ）溶液を乾燥することで、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物を得ることと、
を含み、細菌芽胞および発芽性化合物が、該細菌芽胞の発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持され、さらに該方法は、
ｃ）密接混合物を細菌芽胞の発芽を促す環境に曝すことを含み、該密接混合物における該細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および／または酵素活性が、発芽性化合物を欠く対応する細菌芽胞配合物に比べて増大する、方法を提供する。

上述の方法の幾つかの実施形態では、密接混合物は、発芽性化合物を欠く対応する細菌芽胞配合物と比べて少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％または５００％対象となる性質を増大させる。

上述の方法の好ましい実施形態では、密接混合物における細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および／または酵素活性のパーセントが、発芽性化合物を欠く対応する細菌芽胞配合物に比べて少なくとも１０％増大する。上述の方法の更なる好ましい実施形態では、乾燥は噴霧乾燥、凍結乾燥、空気乾燥またはドラム乾燥である。

幾つかの実施形態では、上述の方法における芽胞は、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アルベイ、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．アネウリノリチクス、Ｂ．アンシラシス、Ｂ．アクエマリス、Ｂ．アトロファエウス、Ｂ．ボロノフィルス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．カルドリイカス、Ｂ．セントロスポラス、Ｂ．セレウス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．コアグランス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．フラボサーマス、Ｂ．フシホルミス、Ｂ．グロビジ、Ｂ．インフェルナス、Ｂ．ラルヴェ、Ｂ．ラテロスポラス、Ｂ．レンタス、Ｂ．レンチモルブス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．メセンテリカス、Ｂ．ムシラギノサス、Ｂ．ミコイデス、Ｂ．ナットー、Ｂ．パントテニカス（Ｂ．ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃｕｓ）、Ｂ．ポピリエ、Ｂ．ポリミキサ、Ｂ．シュードアンシラシス、Ｂ．プミルス、Ｂ．シュリジェリー、Ｂ．シンプレックス、Ｂ．スファエリクス、Ｂ．スポロサーモデュランス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．サブチリス、Ｂ．サーモグルコシダシウス、Ｂ．チューリンゲンシス、Ｂ．ブルガチス、Ｂ．ウェイヘンステファネンシス、Ｃ．サーモセラム、Ｃ．リュングダリイ、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ、Ｃ．ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ、およびストレプトミセス属の一種からなる群から選択される。好ましい実施形態では、芽胞は、Ｂ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウムおよびＢ．プミルスからなる群から選択され、発芽性化合物は、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリンおよびＬ−アスパラギンからなる群から選択される。

上述の方法の幾つかの実施形態では、発芽性化合物はポリペプチドである。好ましい実施形態では、上述の方法における発芽性化合物は乾燥前に０．０００１ｍｇ／ｍｌ〜１７０ｍｇ／ｍｌの濃度で配合することができる。上述の方法の幾つかの実施形態では、発芽性化合物は乾燥前に０．０００３ｍｇ／ｍＬ〜１７０ｍｇ／ｍＬ、０．０００３ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ、０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、または０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で配合される。上述の方法の好ましい実施形態では、発芽性化合物は乾燥前に０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの濃度で配合される。上述の方法の更なる好ましい実施形態では、芽胞にショックを与えている。

下記の実施例は本発明を更に説明することを意図するものであるが、如何なる場合であっても本発明を限定する意図はない。

下記実施例では、「ＧＯＳＤ」および「ＧＯ＋」という用語は、発芽性最適化物質（optimizer）（特に指定がなければＬ−アラニン）を示される特定のバチルス種とともに噴霧乾燥した組成物を表す。Ｌ−アラニンを蒸留水１ミリリットル当たり０．０４４グラムのアラニンを含有する溶液として噴霧乾燥の直前に芽胞の塊に導入し、バチルス種の芽胞を噴霧乾燥した。

「ＧＯ−」という用語は発芽性化合物が存在していないバチルス種を同じように噴霧乾燥した組成物を表す。

さらに特に指定がなければ、下記実施例において芽胞の発芽を判断するのに、下記方法を用いた。芽胞を栄養溶液に入れ、発芽が開始すると、芽胞はジピコリン酸およびイオンを放出し、これにより暗化が起こる。発芽のこの指標が芽胞懸濁液による可視光の光減衰の低減をもたらす。したがって発芽率は暗期の芽胞／明期の芽胞の割合をカウントし、紫外線可視分光光度計下にて発芽する芽胞懸濁液の６００ｎｍでの光学密度（Ｏ．Ｄ．６００）の低減をモニタリングすることにより求めた。次いでこれを発芽パーセントへと変換する。

実施例１：Ｌ−アラニンとの密接混合物におけるＢ．サブチリスＥＮＶ９２３の発芽の増大
本発明の密接混合物の芽胞の発芽率を発芽剤と従来的に混合した芽胞の発芽率と比較するために、下記の処理を行った。

Ａ． 密接混合物の形成：Ｌ−アラニンを蒸留水１ミリリットル当たり０．０４４グラムのアラニンを含有する溶液として噴霧乾燥の直前に芽胞の塊に導入し、Ｂ．サブチリスＥＮＶ９２３の芽胞を噴霧乾燥した。生成された密接混合物を、続いてｐＨ７をもたらす蒸留水中の０．０１Ｍのリン酸緩衝液からなる溶液に導入することにより発芽させ、開始Ｏ．Ｄ．６００を０．６に較正した。

Ｂ． 芽胞と発芽剤との従来的な混合：Ｂ．サブチリスＥＮＶ９２３の芽胞を噴霧乾燥した後、ｐＨ７をもたらす蒸留水中の０．０１Ｍのリン酸緩衝液からなる溶液に導入した。芽胞を緩衝溶液に添加することで、開始Ｏ．Ｄ．６００を０．６に較正した。溶液１ミリリットル当たり０．０００１グラムのアラニン濃度でアラニンを溶液に添加した。

Ｃ． 芽胞単独の発芽：Ｂ．サブチリスＥＮＶ９２３の芽胞を噴霧乾燥した後、ｐＨ７をもたらす蒸留水中の０．０１Ｍのリン酸緩衝液からなる溶液に導入して、開始Ｏ．Ｄ．６００を０．６に較正した。

このような処理をそれぞれ２回反復して行った。下記表１に、光学密度の低下パーセントにより測定される、Ｂ．サブチリスＥＮＶ９２３の発芽に影響するこのような処理の平均結果を示す。光学密度の低下は発芽の進行を示すものである。光学密度（ＯＤ）は６００ｎｍの波長でＪｅｎｗａｙ Ｍｏｄｅｌ ６３２０Ｄ Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｒａｎｇｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。用いたＬ−アラニンは純度が９９％であり、Alfa Aeser（英国、ランカシャー州、ヒーシャム）から供給された。

上記の結果から、本発明の密接混合物における芽胞は同じ発芽剤と密接には混合していない芽胞よりも迅速に発芽することが分かる。発芽剤と混合した芽胞は芽胞単独よりも極めて大きい発芽を示した。

実施例２：ＧＯＳＤで処理したバチルス・サブチリス株ＥＮＶ９２３の発芽の増大
バチルス・サブチリス芽胞を、Ｌ−アラニン溶液の存在下における芽胞の噴霧乾燥を介してＧＯＳＤで処理し、発芽のレベルを光学密度（ＯＤ）の読み取りにより求めた。

０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）
０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液を、１ＭのＫ_２ＨＰＯ_４（８７．０９ｇが０．５Ｌの蒸留水に溶解されている）および１ＭのＫＨ_２ＰＯ_４（６８．０４５ｇが０．５Ｌの蒸留水に溶解されている）溶液を用いて調製した。６１．５ｍｌの１ＭのＫ_２ＨＰＯ_４と３８．５ｍｌの１ＭのＫＨ_２ＰＯ_４とを混ぜ合わせ、蒸留水にて１０００ｍｌへと希釈することで、ｐＨ７．０の０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液を作製した。０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液を蒸留水にて１：１０の比で更に希釈して、０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を得た。緩衝液を１２１℃にて６０分間オートクレーブで処理することにより滅菌した。

バチルス・サブチリス芽胞懸濁液を、０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中にて１．７×１０^８ｃｆｕ／ｍｌの濃度で調製し、３７℃に予め加熱しておいた水浴内でインキュベートして、発芽のパーセントについて５分間隔で４５分間に亘って評価した。

結論：ＧＯＳＤ処理はバチルス・サブチリス芽胞の発芽パーセントおよび発芽速度を著しく高めた。

実施例３：ＧＯＳＤで処理したバチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ１００の発芽の増大
バチルス・リケニホルミス芽胞を、実施例１に記載のように、蒸留水１ｍＬ当たり０．０４４グラムのＬ−アラニンの存在下における芽胞の噴霧乾燥を介してＧＯＳＤで処理した。発芽のレベルは、芽胞懸濁液の調製に０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて上記のように光学密度（ＯＤ）の読み取りにより求めた。

バチルス・リケニホルミス芽胞懸濁液を０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中にて１．２９×１０^８ｃｆｕ／ｍｌの濃度で調製し、３７℃に予め加熱しておいた水浴内でインキュベートして、発芽のパーセントについて５分間隔で４５分間に亘って評価した。

結論：ＧＯＳＤ処理はバチルス・リケニホルミス芽胞の発芽パーセントおよび発芽速度を著しく高めた。

実施例４：ＧＯＳＤで処理したバチルス・サブチリス株ＥＮＶ９２３についての様々なｐＨレベルでの発芽の増大
バチルス・サブチリス株ＥＮＶ９２３ ＧＯ＋芽胞およびＧＯ−芽胞を上記のように調製し、様々なｐＨレベルで０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液に再懸濁した。ＯＤ_６００の測定は上記のように行った。

ｐＨ３．０〜７．０での０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液
０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０緩衝液）を実施例１に記載のように調製した。
・ｐＨ範囲が３．０〜６．０である０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液を調製するために、１３．２ｍｌの１ＭのＫ_２ＨＰＯ_４と８６．８ｍｌの１ＭのＫＨ_２ＰＯ_４溶液（実施例１に記載されている）とを混合して、蒸留水で容量を１Ｌにすることにより作製された０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を基となる緩衝液として使用した。
・ｐＨ５．０〜ｐＨ３．０の０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液を得るために、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を蒸留水で希釈し、緩衝液のｐＨを、１ＭのＨ_２ＰＯ_４を用いてｐＨ５．０、ｐＨ４．０およびｐＨ３．０に下げ、０．１Ｍの緩衝液と蒸留水との比を１：１０に保ちながら、蒸留水を用いて最終容量にした。

調製した緩衝液を４℃にて保管し、各実験の前に緩衝液のｐＨを、１ＭのＮａＯＨまたは１ＭのＨ_２ＰＯ_４を用いて再調整した。

結論：ＧＯＳＤによる処理により、バチルス・サブチリス芽胞をより急速に発芽させ、より低いｐＨレベルの影響を克服することが可能となる。

実施例５：ＧＯＳＤで処理したバチルス・サブチリス株ＥＮＶ９２３の発芽の増大。芽胞の発芽応答は様々な温度レベルの影響を受ける。表には１０分間隔で測定された発芽パーセントを示す。
バチルス・サブチリス株ＥＮＶ９２３ＧＯＳＤ芽胞および対照芽胞を上記のように調製した。芽胞の発芽を上記のように光学密度（ＯＤ）の測定により調べた。ＯＤ_６００の測定のために芽胞懸濁液を調製し、１．７×１０^８ｃｆｕ／ｍｌの濃度で０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）（リン酸緩衝液、ｐＨ７．０調製物）中で４℃に冷却した。各芽胞懸濁液について、３ｍｌ容量まで満たした３つの培養管を準備した。撹拌および初期のＯＤ_６００測定の後、培養管を２５℃、３０℃および３７℃に予め加熱しておいた水浴内において１２０分間インキュベートした。１０分間隔で培養管を撹拌し、ＯＤ_６００測定を行った。

結論：ＧＯＳＤによる処理（ＧＯ＋）により、バチルス・サブチリス芽胞をより急速に発芽させ、より低い温度状況の影響を克服することが可能となる。

実施例６：異なるモル濃度のＮａＣｌ溶液の存在下におけるＧＯＳＤを用いたおよびＧＯＳＤを用いないバチルス・リケニホルミスの発芽パーセント
培地：
培地は希薄トリプチックソイブロス（ｍＴＳＢ）（BD、２１１８２２）とした。培地は、５０ｍｇのトリプチックソイブロス粉末を、完全に溶解するまで加熱および撹拌しながら１Ｌの水に懸濁させることにより調製した。次いで培地をボトルに等しく分配し（aliquoted）、１２１℃にて３０分間オートクレーブで処理した。製造業者の報告にある粉末含量に基づくと、ｍＴＳＢ培地には１リットル当たり、
カゼインの膵消化物：２８．３ｍｇ
ダイズのパパイン（Papic）消化物：５．０ｍｇ
デキストロース：４．２ｍｇ
塩化ナトリウム：８．３ｍｇ
リン酸二カリウム：４．２ｍｇ
が含有されていた。培地を加熱し、オートクレーブで処理する前に、最終濃度が０．５Ｍまたは１．５Ｍ（それぞれ、２９．２２ｇ／Ｌおよび８７．６６ｇ／Ｌ）になるように、必要に応じて塩化ナトリウム（Amresco、Ｘ１９０）を添加することで、浸透圧ストレスを誘導した。

芽胞懸濁液：
ＧＯＳＤで処理したまたは処理していないバチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ１００の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において０．１％のＯｃｔｏｓｏｌ ＳＬＳ（ＦＴ−ＳＬＳ−２４６ＤＲＵＭ、Tiarco Chemical（ジョージア州ドールトン））を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を５秒間隔で少なくとも合計１５秒間、または芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が１×１０^１０ｃｆｕ／ｍｌとなるように行った。この芽胞懸濁液から２５０μｌを４．７５ｍｌのｍＴＳＢが入った培養管に移し、５×１０^８ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ０．６の開始ＯＤ６００を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求める。

ＯＤ発芽アッセイ：
懸濁した芽胞が入った培養管を速やかにボルテックスし、ゼロ時点にてＯＤ６００を測定し、３７℃の水浴内においてインキュベートした。各時間間隔において、時間を記録し、培養管を取り出し、ボルテックスして、ＯＤ６００を測定し、水浴に戻した。ＯＤ６００の減少パーセントは、ゼロ時点の値から測定値を減算し、ゼロ時点の値で除算して、１００％を乗算することにより求めた。完全な発芽は６０％のＯＤ６００の減少パーセントに相当するものであることが以前に報告されている。そのため発芽パーセントはＯＤ６００の減少パーセントに１．６７を乗算することにより求めた。

結論：ＧＯＳＤによる処理により、バチルス・リケニホルミス芽胞をより急速に発芽させ、様々な塩（ＮａＣｌ）レベルの浸透圧ストレスの影響を克服することが可能となる。

実施例７：異なるパーツパーミリオンの銅溶液の存在下におけるＧＯＳＤを用いたおよびＧＯＳＤを用いないバチルス・リケニホルミスの発芽パーセント
培地：
ｍＴＳＢ培地は上記のように調製したが、最終濃度が５０ｍＭとなるまでＮａＣｌを添加することで、浸透圧が平衡状態の培地を作製した。１×１０^５ｐｐｍの硝酸銅（ＩＩ）ヘミ（ペンタ水和物）（Alfa Aesar、１２５２３）ストック溶液を、２ｇを２０ｍｌの水に懸濁させ、０．２２μｍのフィルターに通すことにより作製した。これを一定分量のｍＴＳＢに添加することで、０ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍおよび２００ｐｐｍの最終濃度を達成した。

芽胞懸濁液：
ＧＯＳＤで処理したまたは処理していないバチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ１００の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において０．１％のＯｃｔｏｓｏｌ ＳＬＳ（ＦＴ−ＳＬＳ−２４６ＤＲＵＭ、Tiarco Chemical（ジョージア州ドールトン））を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を５秒間隔で少なくとも合計１５秒間、または芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が２×１０^９ｃｆｕ／ｍｌとなるように行った。この芽胞懸濁液から２５０μｌを４．７５ｍｌのｍＴＳＢが入った培養管に移し、１×１０^８ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ０．６の開始ＯＤ６００を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求めた。

ＯＤ発芽アッセイ：実施例６に示されるように行い、算出した。

結論：ＧＯＳＤによる処理により、バチルス・リケニホルミス芽胞をより急速に発芽させ、様々な銅イオンレベルのストレスの影響を克服することが可能となる。

実施例８：異なるパーツパーミリオンのアルミニウム溶液の存在下におけるＧＯＳＤを用いたおよびＧＯＳＤを用いないバチルス・リケニホルミスの発芽パーセント
培地：
ｍＴＳＢ培地は上記のように調製したが、最終濃度が５０ｍＭとなるまでＮａＣｌを添加することで、浸透圧が平衡状態の培地を作製した。１０００ｐｐｍのＡｌ^３＋ストック溶液を、０．６２ｇのＡｌ_２（ＳＯ_４）_３・１４Ｈ_２Ｏ（Alfa Aesar、１２３６２）を５０ｍｌの水に懸濁させ、０．２２μｍのフィルターに通すことにより作製した。これを一定分量のｍＴＳＢに添加することで、０ｐｐｍ、０．２５ｐｐｍ、０．５０ｐｐｍおよび１．０ｐｐｍの最終濃度を達成した。培地のｐＨをＨＣｌの添加によりｐＨ４．５へと下げ、Ａｌ^３＋イオンの完全な分離を可能にした。

芽胞懸濁液：
ＧＯＳＤで処理したまたは処理していないバチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ１００の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において０．１％のＯｃｔｏｓｏｌ ＳＬＳ（ＦＴ−ＳＬＳ−２４６ＤＲＵＭ、Tiarco Chemical（ジョージア州ドールトン））を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を５秒間隔で少なくとも合計１５秒間、または芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が１×１０^１０ｃｆｕ／ｍｌとなるように行った。この芽胞懸濁液から２５０μｌを４．７５ｍｌのｍＴＳＢが入った培養管に移し、５×１０^８ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ０．６の開始ＯＤ６００を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求めた。

ＯＤ発芽アッセイ：実施例６と同様に行い、算出した。

結論：ＧＯＳＤによる処理により、バチルス・リケニホルミス芽胞をより急速に発芽させ、様々なアルミニウムイオンレベルのストレスの影響を克服することが可能となる。

実施例９：異なるミリモル濃度の胆汁塩溶液の存在下におけるＧＯＳＤを用いたおよびＧＯＳＤを用いないバチルス・リケニホルミスの発芽パーセント
培地：
ｍＴＳＢ培地は上記のように調製したが、最終濃度が５０ｍＭとなるまでＮａＣｌを添加することで、浸透圧が平衡状態の培地を作製した。８０ｍＭの胆汁塩ストック溶液を、２．５ｇのタウロデオキシコール酸ナトリウム（Sigma、Ｔ０８７５）、１．１ｇのグリコデオキシコール酸ナトリウム（Sigma、Ｇ９９１０）および０．３４６ｇのデオキシコール酸ナトリウム（Sigma、Ｄ５６７０）を１００ｍｌの水に懸濁させ、０．２２μｍのフィルターに通すことにより作製した。これを一定分量のｍＴＳＢに添加することで、０ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭおよび８ｍＭの最終濃度を達成した。

芽胞懸濁液：
ＧＯＳＤで処理したまたは処理していないバチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ１００の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において０．１％のＯｃｔｏｓｏｌ ＳＬＳ（ＦＴ−ＳＬＳ−２４６ＤＲＵＭ、Tiarco Chemical（ジョージア州ドールトン））を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を５秒間隔で少なくとも合計１５秒間、または芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させた。これはブレンダージャー内の最終濃度が１×１０^１０ｃｆｕ／ｍｌとなるように行った。この芽胞懸濁液から２５０μｌを４．７５ｍｌのｍＴＳＢが入った培養管に移し、５×１０^８ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度を得た。これらの濃度は、およそ０．６の開始ＯＤ６００を達成するために芽胞の各バッチについて行った最適化により求めた。

ＯＤ発芽アッセイ：
上記のように行い、算出した。

結論：ＧＯＳＤによる処理により、バチルス・リケニホルミス芽胞をより急速に発芽させ、胃腸管において遭遇し得る様々な胆汁塩レベルのストレスの影響を克服することが可能となる。

実施例１０：規定のリン酸カリウム培地および２％のグルコースにおけるＧＯＳＤを用いたまたはＧＯＳＤを用いないバチルス・リケニホルミスの３つの反復物の平均増殖
バチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ４３１ＧＯ＋芽胞をＧＯＳＤ（先に記載された手法）で処理した。対照として、ＧＯＳＤを用いずに噴霧乾燥した同じ培養物由来のＧＯ−芽胞を使用した。増殖試験を、２％のグルコースを添加した最小塩培地において行った。

培地
培地を、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（１．２６ｇ／Ｌ）、ＭｇＣｌ_２（０．８１ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ_２（０．１５ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（０．０５ｇ／Ｌ）を蒸留水に溶解し、１ｍｌ／Ｌの１０００×Ｔｒａｃｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｉｘ（ＭｎＳＯ_４（０．８５ｇ／５０ｍｌ）、ＺｎＳＯ_４（０．１５ｇ／５０ｍｌ）、ＦｅＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ（０．１５ｇ／５０ｍｌ）、塩酸チアミン（０．０５ｇ／５０ｍｌ）を添加することにより調製した。好ましい溶液をフラスコに注ぎ（９０ｍｌ／フラスコ）、１２１℃にて４０分間オートクレーブで処理した。接種前に培地に４ｍｌの滅菌濾過した２５×リン酸カリウム溶液（Ｋ_２ＨＰＯ_４（３．４４ｇ／５０ｍｌ）、ＫＨ_２ＰＯ_４（２．８１ｇ／５０ｍｌ））、および２ｍｌの５０×グルコース（１００ｇ／２００ｍｌ）を添加することで、最終濃度を２％にした。

バチルス・リケニホルミス細胞の増殖
接種に用いた芽胞の量は、ＧＯ−およびＧＯ＋芽胞粉末の菌数を用いて決定した。濃（１０００×）バチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ４３１の芽胞懸濁液は、滅菌ブレンダージャー内の芽胞を、滅菌水を用いてブレンドすることにより調製し、培地が入ったフラスコに下記表の０時間に示されている濃度まで添加した。初期培養物のカウントはブレンドされた芽胞懸濁液の希釈およびプレートカウントを行うことにより得た。各芽胞サンプルについて３つのフラスコを準備した。

フラスコを３０℃、１５０ｒｐｍでインキュベートし、サンプルを４８時間増殖させた。サンプルを採取し、プレートカウントを２４時間および４８時間で行った。

結論：ＧＯＳＤ処理はバチルス・リケニホルミスの発芽および増殖速度を著しく高めた。

実施例１１：異なる濃度のＮａＣｌの存在下におけるＧＯＳＤを用いたまたはＧＯＳＤを用いない処理を比較する２日間に亘るバチルス・リケニホルミスの増殖
培地：
ｍＴＳＢは上記のように調製したが、最終濃度が０Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍ、または１．５Ｍ（それぞれ０ｇ／Ｌ、２９．２２ｇ／Ｌ、５８．４４ｇ／Ｌ、または８７．６６ｇ／Ｌ）となるように必要に応じて塩化ナトリウム（Amresco、Ｘ１９０）を添加することで、浸透圧ストレスを誘導した。培地を加熱し、フラスコに等しく分配し、オートクレーブで処理した。

プレートカウントアガー（ＰＣＡ）（BD、２４７９１０）を、製造業者の取扱説明書に従って、２３．５ｇの粉末を１Ｌの水に懸濁させ、頻繁に撹拌しながら沸騰させ、ガラスジャーに等しく分配し、オートクレーブで処理した。必要となるまで培地ジャーを４５℃の水浴に冷却させておいた。粉末の製造業者は、ＰＣＡについて１リットル当たり下記の含量であると報告している：
カゼインの膵消化物：５．０ｇ
酵母抽出物：２．５ｇ
デキストロース：１．０ｇ
寒天：１５．０ｇ

芽胞懸濁液：
ＧＯＳＤで処理したまたは処理していないバチルス・リケニホルミス株ＥＮＶ１００の芽胞粉末を滅菌ブレンダージャー内において０．１％のＯｃｔｏｓｏｌ ＳＬＳ（ＦＴ−ＳＬＳ−２４６ＤＲＵＭ、Tiarco Chemical（ジョージア州ドールトン））を含む滅菌水中に懸濁させた。芽胞を５秒間隔で少なくとも合計１５秒間、または芽胞が視覚的に完全に懸濁するまでブレンドすることにより懸濁させ、その後滅菌水で段階希釈を行った。これは培養フラスコ内の最終濃度が１×１０^２ｃｆｕ／ｍｌとなるように行った。

定量化：
フラスコを１５０ｒｐｍで２８時間（「１日」）または５０時間（「２日」）振盪させながら３７℃にてインキュベートした。一定分量を各フラスコからペトリ皿へと４５℃未満に冷却したＰＣＡを上から注ぐことで段階希釈し、かき混ぜ（swirled）、固化させた。プレートを反転し、３７℃でおよそ２４時間インキュベートした。コロニーをカウントし、希釈率に基づき濃度を算出した。また各フラスコからおよそ１０μｌのサンプルをＰＣＡプレート上で画線培養し、純度を調べた。

結論：ＧＯＳＤ処理は浸透圧塩ストレス下においてバチルス・リケニホルミスの発芽および増殖を著しく高めた。

実施例１２：バチルス・サブチリス株ＥＮＶ９２３のプロテアーゼ活性
先に記載されたようにＧＯＳＤで処理した（ＧＯ＋）、および非処理の（ＧＯ−）バチルス・サブチリス株ＥＮＶ９２３の芽胞をプロテアーゼ活性試験に使用した。

培地
化学的に組成が明確である培地（ＣＤＳＭ：Chemically Defined Salt Medium）をプロテアーゼ試験における細胞増殖に使用した。培地は基となる溶液成分（ｇ／Ｌ）：（ＮＨ_４）ＳＯ_４、１．２６ｇ；Ｌ−グルタミン酸、１．１８ｇ；ＭｇＣｌ_２、０．８１；ＣａＣｌ_２、０．１５５および８５％ Ｌ−乳酸（０．５３０ｍｌ／Ｌ）を蒸留水に溶解し、１ｍｌ／Ｌの１０００×Ｔｒａｃｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｉｘ（ｇ／５０ｍｌ）を添加することにより調製した。基となる溶液の入ったフラスコ（４８ｍｌ／フラスコ）を４０分間オートクレーブで処理した。接種前にグルコースを含む２ｍｌの別々に調製した滅菌濾過済み２５×緩衝溶液（ｇ／５０ｍｌ）：ＭＯＰＳ、１１．６；ＫＨ_２ＰＯ_４、０．６；グルコース、４．５を添加した。

バチルス・サブチリスＥＮＶ９２３細胞の増殖
接種に用いた芽胞の量は、ＧＯ−およびＧＯ＋芽胞粉末の菌数を用いて決定した。濃（１０００×）バチルス・サブチリス株ＥＮＶ９２３の芽胞懸濁液は、滅菌ブレンダージャー内の芽胞を、滅菌済みの０．０１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いてブレンドすることにより調製し、約１×１０^４ｃｆｕ／ｍｌの濃度でフラスコに添加した。初期培養物の菌数はブレンドされた芽胞懸濁液の希釈およびプレートカウントを行うことにより確認した。各芽胞サンプルについて３つのフラスコを準備した。フラスコを３０℃、１５０ｒｐｍでインキュベートし、サンプルを４８時間で採取した。

プロテアーゼ活性アッセイ
プロテアーゼ活性アッセイを、基質としてカゼインと、チロシンと反応し、青色の発現を促すフォーリン−チオカルト法のフェノール試薬とを用いて細胞上清にて行った。プロテアーゼ活性単位は１分に付き１μｇのチロシンを遊離させる酵素の量として定義された。試験管内のチロシンの量は、Jenwayの７３０５分光光度計にてＯＤ_６５０を測定し、検量線を用いて遊離されたチロシンを算出することにより決定した。

試薬
試薬１：０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）（実施例１に記載のように調製した）を１：１の比で蒸留水にて希釈することで、０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を得た。
試薬２：０．６５％のカゼイン溶液
０．６５ｇのカゼインを８０ｍｌの０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、加熱することでカゼインを溶液にし、最終容量を、０．０５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて１００ｍｌにした。
試薬３：１５％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）
１５ｇのＴＣＡを蒸留水に溶解し、最終容量を１００ｍｌにした。
試薬４：２０％のＮａ_２ＣＯ_３
２０ｇのＮａ_２ＣＯ_３を蒸留水に溶解し、最終容量を１００ｍｌにした。

プロテアーゼアッセイ
１０ｍｌの培養物を遠心分離し、上清を０．２μｍのフィルターに通して滅菌管へと濾過した。
３ｍｌの濾過した上清を３ｍｌの０．６５％のカゼイン溶液と混合して、３７℃の水浴に１時間入れた。
反応を６ｍｌの１５％のＴＣＡを添加することにより停止させ、サンプルを５分間遠心分離した。
０．５ｍｌの各サンプルを１ｍｌの２０％のＮａ_２ＣＯ_３と混合し、その後０．５ｍｌのフォーリン−チオカルト法のフェノール試薬の添加および室温での２０分間のインキュベーションを行うことで、青色を発現させた。
３ｍｌの蒸留水を各サンプルに添加し、混合後にＯＤ_６５０を測定した。
プロテアーゼ活性を算出するために、チロシン用の検量線を、蒸留水に溶解したチロシンの希釈系列を得て、それらの希釈系列を培養サンプルと同じ条件にて処理し、ＯＤ_６５０を測定することにより作成した。

結論：バチルス・サブチリス芽胞のＧＯＳＤによる処理により、プロテアーゼなどの酵素のより大量の産生が可能となる。

実施例１３：発芽性化合物の存在下におけるストレプトミセス・ビリドクロモゲネスの発芽
ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス芽胞は、１０ｍｌのＴＸ緩衝液（０．００１％のＴｗｅｅｎ ８０を含む０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．３））を注ぎ、滅菌綿棒を用いて芽胞を取り出すことによりプレートから回収した。プレートからの芽胞懸濁液を５０ｍｌ容の滅菌管に注いだ。全てのサンプルの芽胞懸濁液を得たら、熱ショックを、芽胞懸濁液の入った滅菌管をヒートブロックに入れ、温度を５５℃に到達させ、５５℃の温度を１０分間維持することにより行った。熱ショック後、芽胞懸濁液を氷水中で５分間冷却し、３０分間遠沈した。上清を捨て、芽胞を４℃の２５ｍｌの０．０２Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁させ、１５分間遠沈した。上清を捨てた後、芽胞を２０ｍｌの０．０２Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁させ、激しく混合することで芽胞懸濁液を得て、これを実験に使用した。

サンプルは、１．５ｍｌの２×発芽剤ブレンドを１．５ｍｌの芽胞懸濁液と混合することにより調製した。全ての発芽剤ブレンドは２×５０ｍｌの溶液として蒸留水中にて調製した。塩化カルシウムを１００×溶液（０．４ｇ／１０ｍｌ）として調製し、２０μｌを１０ｍｌの２×発芽剤ブレンドに添加した。発芽性化合物の最終濃度は下記の通りであった：０．８９ｍｇ／ｍｌのＬ−アラニン；１．１７ｍｇ／ｍｌのＬ−バリン、１３．２ｍｇ／ｍｌのＬ−アスパラギン；２．２５ｍｇ／ｍｌのグルコース；および２．２５ｍｇ／ｍｌのフルクトース。初期ＯＤ６００を測定した後、サンプルを３０℃の水浴に移し、ＯＤ６００を１５分間隔で９０分間測定し、発芽率を求めた。

結論：ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス芽胞の発芽性化合物による処理が発芽を高めた。

実施例１４：細菌芽胞および発芽性化合物の密接混合物と従来混合との発芽率の比較
密接混合物の芽胞の発芽率を発芽剤と従来的に混合した芽胞の発芽率と比較するために、下記の処理を行った。

Ａ． 密接混合物の形成：Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギンまたはＬ−フェニルアラニンを蒸留水１ミリリットル当たり０．０４４グラムのアミノ酸を含有する溶液として乾燥の直前に芽胞の塊に導入し、Ｂ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．セレウス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．ラテロスポラス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．ミコイデス、Ｂ．ポピリエ、Ｂ．ポリミキサ、Ｂ．プミルス、Ｂ．チューリンゲンシス、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトミセス・グリセオビリディス、ストレプトミセス・リディクス、ストレプトミセス・プリカツス、ストレプトミセス・シンデネウシス、ストレプトミセス・ロチェイ、ストレプトミセス・アルニ、ストレプトミセス・ビリディス、ストレプトミセス・サーモブルガリス、ストレプトミセス・グリセウス、ストレプトミセス・アシディスキャビエス、ストレプトミセス・オーレオファシエンス、ストレプトミセス・ガルブス、ストレプトミセス・ミクロフラバス、およびステプトミセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）の芽胞を乾燥させる。生成された密接混合物を、続いてｐＨ７をもたらす蒸留水中の０．０１Ｍのリン酸緩衝液からなる溶液に導入することにより発芽させる。

Ｂ． 芽胞と発芽剤との従来的な混合：Ｂ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．セレウス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．ラテロスポラス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．ミコイデス、Ｂ．ポピリエ、Ｂ．ポリミキサ、Ｂ．プミルス、Ｂ．チューリンゲンシス、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトミセス・グリセオビリディス、ストレプトミセス・リディクス、ストレプトミセス・プリカツス、ストレプトミセス・シンデネウシス、ストレプトミセス・ロチェイ、ストレプトミセス・アルニ、ストレプトミセス・ビリディス、ストレプトミセス・サーモブルガリス、ストレプトミセス・グリセウス、ストレプトミセス・アシディスキャビエス、ステプトミセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトミセス・ガルブス、ストレプトミセス・ミクロフラバス、およびストレプトミセス・オーレオファシエンスの芽胞を水和および乾燥させる。このような芽胞を、ｐＨ７をもたらす蒸留水中の０．０１Ｍのリン酸緩衝液と溶液１ミリリットル当たり０．０００１グラムのＬ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギンまたはＬ−フェニルアラニンとからなる溶液に導入することにより発芽させる。

Ｃ． 芽胞単独の発芽：Ｂ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．セレウス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．ラテロスポラス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．ミコイデス、Ｂ．ポピリエ、Ｂ．ポリミキサ、Ｂ．プミルス、Ｂ．チューリンゲンシス、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトミセス・グリセオビリディス、ストレプトミセス・リディクス、ストレプトミセス・プリカツス、ストレプトミセス・シンデネウシス、ストレプトミセス・ロチェイ、ストレプトミセス・アルニ、ストレプトミセス・ビリディス、ストレプトミセス・サーモブルガリス、ストレプトミセス・グリセウス、ストレプトミセス・アシディスキャビエス、ステプトミセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトミセス・ガルブス、ストレプトミセス・ミクロフラバス、およびストレプトミセス・オーレオファシエンスの芽胞を水和および乾燥させる。芽胞を、続いてｐＨ７をもたらす蒸留水中の０．０１Ｍのリン酸緩衝液からなる溶液に導入する。

このような処理それぞれについて得られる芽胞の発芽を、光学密度の低下パーセントにより、または顕微鏡下で発芽した芽胞の数をカウントすることにより測定する。密接に混合した組成物が、対応する従来的に混合した同等物よりも迅速に発芽することが見出される。

Claims (37)

1. 細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物であって、該細菌芽胞および該発芽性化合物が、発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される、乾燥した密接混合物。
2. 前記芽胞が、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アルベイ、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．アネウリノリチクス、Ｂ．アンシラシス、Ｂ．アクエマリス、Ｂ．アトロファエウス、Ｂ．ボロノフィルス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．カルドリイカス、Ｂ．セントロスポラス、Ｂ．セレウス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．コアグランス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．フラボサーマス、Ｂ．フシホルミス、Ｂ．グロビジ、Ｂ．インフェルナス、Ｂ．ラルヴェ、Ｂ．ラテロスポラス、Ｂ．レンタス、Ｂ．レンチモルブス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．メセンテリカス、Ｂ．ムシラギノサス、Ｂ．ミコイデス、Ｂ．ナットー、Ｂ．パントテニカス（Ｂ．ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃｕｓ）、Ｂ．ポピリエ、Ｂ．ポリミキサ、Ｂ．シュードアンシラシス、Ｂ．プミルス、Ｂ．シュリジェリー、Ｂ．シンプレックス、Ｂ．スファエリクス、Ｂ．スポロサーモデュランス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．サブチリス、Ｂ．サーモグルコシダシウス、Ｂ．チューリンゲンシス、Ｂ．ブルガチス、Ｂ．ウェイヘンステファネンシス、Ｃ．サーモセラム、Ｃ．リュングダリイ、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ、Ｃ．ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ、およびストレプトミセス属の一種からなる群から選択される、請求項１に記載の混合物。
3. 前記発芽性化合物が、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−フェニルアラニンおよびそれらの類似体からなる群から選択される、請求項１に記載の混合物。
4. 前記組成物が、Ｌ−アラニン＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アラニン＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アラニン＋バチルス・プミルス、Ｌ−アラニン＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−アラニン＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アラニン＋バチルス・セレウス、Ｌ−アラニン＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−アラニン＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−バリン＋バチルス・サブチリス、Ｌ−バリン＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−バリン＋バチルス・プミルス、Ｌ−バリン＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−バリン＋バチルス・コアグランス、Ｌ−バリン＋バチルス・セレウス、Ｌ−バリン＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−バリン＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・プミルス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・セレウス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・プミルス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・セレウス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・プミルス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・セレウス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−アラニン＋イノシン＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−プロリン＋グルコース＋バチルス・メガテリウム、Ｌ−プロリン＋バチルス・メガテリウム、およびＬ−乳酸塩＋クロストリジウム・ブチリカムからなる群から選択される混合物である、請求項１に記載の混合物。
5. 噴霧乾燥、凍結乾燥、空気乾燥またはドラム乾燥により作製される、請求項１に記載の混合物。
6. 前記芽胞が、Ｂ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウムおよびＢ．プミルスからなる群から選択され、前記発芽性化合物が、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリンおよびＬ−アスパラギンからなる群から選択される、請求項１に記載の混合物。
7. 前記発芽性化合物がポリペプチドである、請求項１に記載の混合物。
8. 前記発芽性化合物が、乾燥前に０．０００３ｍｇ／ｍｌ〜１７０ｍｇ／ｍｌの濃度で配合される、請求項１に記載の混合物。
9. 前記芽胞にショックを与えている、請求項１に記載の混合物。
10. 請求項１に記載の乾燥した密接混合物を含む組成物。
11. 前記芽胞が、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アルベイ、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．アネウリノリチクス、Ｂ．アンシラシス、Ｂ．アクエマリス、Ｂ．アトロファエウス、Ｂ．ボロノフィルス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．カルドリイカス、Ｂ．セントロスポラス、Ｂ．セレウス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．コアグランス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．フラボサーマス、Ｂ．フシホルミス、Ｂ．グロビジ、Ｂ．インフェルナス、Ｂ．ラルヴェ、Ｂ．ラテロスポラス、Ｂ．レンタス、Ｂ．レンチモルブス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．メセンテリカス、Ｂ．ムシラギノサス、Ｂ．ミコイデス、Ｂ．ナットー、Ｂ．パントテニカス（Ｂ．ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃｕｓ）、Ｂ．ポピリエ、Ｂ．ポリミキサ、Ｂ．シュードアンシラシス、Ｂ．プミルス、Ｂ．シュリジェリー、Ｂ．シンプレックス、Ｂ．スファエリクス、Ｂ．スポロサーモデュランス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．サブチリス、Ｂ．サーモグルコシダシウス、Ｂ．チューリンゲンシス、Ｂ．ブルガチス、Ｂ．ウェイヘンステファネンシス、Ｃ．サーモセラム、Ｃ．リュングダリイ、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ、Ｃ．ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ、およびストレプトミセス属の一種からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記発芽性化合物が、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−フェニルアラニンおよびそれらの類似体からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
13. Ｌ−アラニン＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アラニン＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アラニン＋バチルス・プミルス、Ｌ−アラニン＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−アラニン＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アラニン＋バチルス・セレウス、Ｌ−アラニン＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−アラニン＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−バリン＋バチルス・サブチリス、Ｌ−バリン＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−バリン＋バチルス・プミルス、Ｌ−バリン＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−バリン＋バチルス・コアグランス、Ｌ−バリン＋バチルス・セレウス、Ｌ−バリン＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−バリン＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・プミルス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・セレウス、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−アラニン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・プミルス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・セレウス、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−アスパラギン＋グルコース＋フルクトース＋カリウムイオン（ＧＦＫ）＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・サブチリス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・リケニホルミス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・プミルス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・アミロリケファシエンス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・コアグランス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・セレウス、Ｌ−アラニン＋イノシン＋バチルス・クラウシイ、Ｌ−アラニン＋イノシン＋クロストリジウム・ブチリカム、Ｌ−プロリン＋グルコース＋バチルス・メガテリウム、Ｌ−プロリン＋バチルス・メガテリウム、およびＬ−乳酸塩＋クロストリジウム・ブチリカムからなる群から選択される混合物である、請求項１０に記載の組成物。
14. 前記混合物が噴霧乾燥、凍結乾燥、空気乾燥またはドラム乾燥により作製される、請求項１０に記載の組成物。
15. 腸溶性コーティングを更に備える、請求項１０に記載の組成物。
16. 前記芽胞が、Ｂ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウムおよびＢ．プミルスからなる群から選択され、前記発芽性化合物が、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリンおよびＬ−アスパラギンからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
17. 前記発芽性化合物がポリペプチドである、請求項１０に記載の組成物。
18. 前記発芽性化合物が、乾燥前に０．０００３ｍｇ／ｍｌ〜１７０ｍｇ／ｍｌの濃度で配合される、請求項１０に記載の組成物。
19. 前記芽胞にショックを与えている、請求項１０に記載の組成物。
20. 補助発芽剤を更に含む、請求項１０に記載の組成物。
21. 栄養素を更に含む、請求項１０に記載の組成物。
22. 細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物を作製する方法であって、該方法が、
    ａ）細菌芽胞と発芽性化合物とを含む溶液を準備することと、
    ｂ）前記溶液を乾燥することで、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物を得ることと、
    を含み、前記細菌芽胞および前記発芽性化合物が、発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持される、方法。
23. 前記乾燥が噴霧乾燥、凍結乾燥、空気乾燥またはドラム乾燥である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記芽胞が、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アルベイ、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．アネウリノリチクス、Ｂ．アンシラシス、Ｂ．アクエマリス、Ｂ．アトロファエウス、Ｂ．ボロノフィルス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．カルドリイカス、Ｂ．セントロスポラス、Ｂ．セレウス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．コアグランス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．フラボサーマス、Ｂ．フシホルミス、Ｂ．グロビジ、Ｂ．インフェルナス、Ｂ．ラルヴェ、Ｂ．ラテロスポラス、Ｂ．レンタス、Ｂ．レンチモルブス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．メセンテリカス、Ｂ．ムシラギノサス、Ｂ．ミコイデス、Ｂ．ナットー、Ｂ．パントテニカス（Ｂ．ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃｕｓ）、Ｂ．ポピリエ、Ｂ．ポリミキサ、Ｂ．シュードアンシラシス、Ｂ．プミルス、Ｂ．シュリジェリー、Ｂ．シンプレックス、Ｂ．スファエリクス、Ｂ．スポロサーモデュランス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．サブチリス、Ｂ．サーモグルコシダシウス、Ｂ．チューリンゲンシス、Ｂ．ブルガチス、Ｂ．ウェイヘンステファネンシス、Ｃ．サーモセラム、Ｃ．リュングダリイ、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ、Ｃ．ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ、およびストレプトミセス属の一種からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
25. 前記芽胞が、Ｂ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウムおよびＢ．プミルスからなる群から選択され、前記発芽性化合物が、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリンおよびＬ−アスパラギンからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
26. 請求項２２に記載の方法により作製される乾燥した密接混合物。
27. 前記発芽性化合物がポリペプチドである、請求項２２に記載の方法。
28. 前記発芽性化合物が、乾燥前に０．０００３ｍｇ／ｍｌ〜１７０ｍｇ／ｍｌの濃度で配合される、請求項２２に記載の方法。
29. 前記芽胞にショックを与えている、請求項２２に記載の方法。
30. 細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および／または酵素活性を増大させる方法であって、該方法は、
    ａ）細菌芽胞と発芽性化合物とを含む溶液を準備することと、
    ｂ）前記溶液を乾燥することで、細菌芽胞と発芽性化合物とを含む乾燥した密接混合物を得ることと、
    を含み、前記細菌芽胞および前記発芽性化合物が、該細菌芽胞の発芽を促す環境に達するまで近接位置に維持され、さらに該方法は、
    ｃ）前記密接混合物を前記細菌芽胞の発芽を促す環境に曝すことを含み、該密接混合物における該細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および／または酵素活性が、発芽性化合物を欠く対応する細菌芽胞配合物に比べて増大する、方法。
31. 前記密接混合物における細菌芽胞の発芽、増殖、代謝および／または酵素活性のパーセントが、発芽性化合物を欠く前記対応する細菌芽胞配合物に比べて少なくとも１０％増大する、請求項３０に記載の方法。
32. 前記乾燥が噴霧乾燥、凍結乾燥、空気乾燥またはドラム乾燥である、請求項３０に記載の方法。
33. 前記芽胞が、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アルベイ、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．アネウリノリチクス、Ｂ．アンシラシス、Ｂ．アクエマリス、Ｂ．アトロファエウス、Ｂ．ボロノフィルス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．カルドリイカス、Ｂ．セントロスポラス、Ｂ．セレウス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．コアグランス、Ｂ．フィルムス、Ｂ．フラボサーマス、Ｂ．フシホルミス、Ｂ．グロビジ、Ｂ．インフェルナス、Ｂ．ラルヴェ、Ｂ．ラテロスポラス、Ｂ．レンタス、Ｂ．レンチモルブス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．メセンテリカス、Ｂ．ムシラギノサス、Ｂ．ミコイデス、Ｂ．ナットー、Ｂ．パントテニカス（Ｂ．ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃｕｓ）、Ｂ．ポピリエ、Ｂ．ポリミキサ、Ｂ．シュードアンシラシス、Ｂ．プミルス、Ｂ．シュリジェリー、Ｂ．シンプレックス、Ｂ．スファエリクス、Ｂ．スポロサーモデュランス、Ｂ．ステアロサーモフィラス、Ｂ．サブチリス、Ｂ．サーモグルコシダシウス、Ｂ．チューリンゲンシス、Ｂ．ブルガチス、Ｂ．ウェイヘンステファネンシス、Ｃ．サーモセラム、Ｃ．リュングダリイ、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキ、Ｃ．ブチリカム、パスツーリア・ペネトランス、パスツーリア・トルネイ、パスツーリア・ニシザワエ、およびストレプトミセス属の一種からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
34. 前記芽胞が、Ｂ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．メガテリウムおよびＢ．プミルスからなる群から選択され、前記発芽性化合物が、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリンおよびＬ−アスパラギンからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
35. 前記発芽性化合物がポリペプチドである、請求項３０に記載の方法。
36. 前記発芽性化合物が、乾燥前に０．０００３ｍｇ／ｍｌ〜１７０ｍｇ／ｍｌの濃度で配合される、請求項３０に記載の方法。
37. 前記芽胞にショックを与えている、請求項３０に記載の方法。