WO2022226608A1 - Ativação das funções bionematicida e promotora do crescimento vegetal em uma solução biotecnológica - Google Patents

Ativação das funções bionematicida e promotora do crescimento vegetal em uma solução biotecnológica Download PDF

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Douglas Fabiano GOMES
Juliana MARCOLINA GOMES
Jonas HIPOLITO DE ASSIS FILHO
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    • C12R2001/075—Bacillus thuringiensis

Definitions

  • the present invention is related to agricultural compositions comprising a combination of two or more species of bacteria of the genus Bacillus and a botanical extract comprising allicin as an active ingredient, presenting bionematicidal and plant growth promoting effect.
  • the present invention contemplates the process of preparing the compositions and their agricultural application.
  • Bacillus genus Bacillus are Gram-positive microorganisms, widespread in nature with the ability to produce large amounts of enzymes and a wide range of antibiotics, which make them excellent agricultural tools for plant growth promotion and biological management of pathogens. , including phytonematodes. In addition, they have the ability to form resistance structures under abiotic stress conditions called endospores, increasing their survival in unfavorable environments and, when industrially induced, guarantee the stability of the product for long periods of storage.
  • Garlic extract has allicin as one of its active principles, a compound with broad antimicrobial activity even at low concentrations (mM), both against Gram-negative and Gram-positive bacteria, including the genus Bacillus (Leontiev et al., 2018). ). Therefore, it is common sense that the combination of the botanical extract of garlic with bacteria of the genus Bacillus results in incompatibility, composing a technical challenge to be solved. This incompatibility between garlic extract and Bacillus is recognized by the scientific community, and an example described is the inhibition of Bacillus cereus when in contact with 3%, 5% and 10% of this extract (Zahira et al., 1982).
  • compositions comprising a combination of viable cells from two or more species of bacteria of the genus Bacillus and a botanical extract comprising allicin.
  • the present invention surprisingly solves the problem of incompatibility of two or more species of bacteria of the genus Bacillus with each other as well as with a botanical extract comprising allicin by formulating compositions using essentially only endospores of the bacteria of the genus Bacillus.
  • the use of endospores of bacteria of the genus Bacillus according to the present invention enables the preparation of a unique and stable formulation, with a long shelf life and maintenance of the activity of the individual actives, capable of promoting a surprising effect in the control of phytonematodes and in the promotion of plant growth.
  • compositions of the present invention optionally further comprise a formulation that promotes the germination of endospores into metabolically active forms only when applied to the field, where the bacteria are able to play their respective biological roles without harming each other.
  • the solution presents free amino acids, carbon sources and microbial metabolites, which accelerate the biological activation of endospores without depending on stochastic factors.
  • the present invention provides agricultural compositions comprising endospores of two or more species of bacteria of the genus Bacillus and a botanical extract comprising allicin, method of preparation and uses thereof, as well as methods of controlling nematodes in plant cultures and promoting growth. vegetable.
  • Figure 1 Bacillus velezensis Bacillus amyloliquefaciens compatibility assay in Petri dishes.
  • FIG. 1 Stability between cells of three species of Bacillus in its two forms, vegetative and resistant (endospores), in the presence of the botanical extract of garlic after 24 and 48 hours of the formulation in mixture.
  • Figure 4 Synergistic effect of Bacillus spp. and botanical extracts in promoting corn growth.
  • the present invention provides an agricultural composition comprising endospores of two or more species of bacteria of the genus Bacillus and a botanical extract comprising allicin.
  • the agricultural composition comprises endospores of three or more species of bacteria of the genus Bacillus.
  • an agricultural composition according to the present invention further comprises components that promote germination of endospores into metabolically active forms only when applied in the field.
  • an agricultural composition according to the present invention has a surprising and potentiated nematicide effect as well as a plant growth promoter. The observed nematicidal effect is greater than that presented by the separate components, bacterial cells and the botanical extract.
  • Species of the genus Bacillus useful in the context of the present invention include, but are not limited to, B. velezensis, B. amyloliquefaciens, B. thuringiensis, B. megaterium, B. subtilis, B. firmus, Paenibacillus macerans, B. licheniformis.
  • species of bacteria of the genus Bacillus are selected from the group consisting of B. velezensis (Adetomiwa and Olubukola, 2019; Rabbee et al., 2019), B.
  • amyloliquefaciens (Idris et al., 2007; Liu et al., 2013; Xu et al., 2013) and B. thuringiensis (Bravo, Gill, and Soberón, 2007; Sansinenea, 2012; Sch ⁇ nemann, Knaak and Fi ⁇ za, 2014).
  • B. thuringiensis Brainvo, Gill, and Soberón, 2007; Sansinenea, 2012; Sch ⁇ nemann, Knaak and Fi ⁇ za, 2014.
  • different strains of said Bacillus species may be employed.
  • Botanical extracts are rich in biologically active natural compounds, with enormous potential for biotechnological application.
  • Botanical extracts comprising bionematicidal compounds such as allicin useful in the context of the present invention include, but are not limited to, garlic extract (Allium sativum), tea tree (Melaleuca alternifolia), neem (Azadirachta indica), clove (Syzygium) aromaticum).
  • a botanical extract comprising allicin is extracted mainly from garlic bulbs (Allium sativum ) as it has a higher concentration of the active ingredient.
  • These bioactive compounds derive from different extraction processes, from solvents with different polarities, generating mainly alcoholic extracts, aqueous extracts or hydrolates and essential oils.
  • the main extractors of allicin are: water, when used immediately; or by means of ethanolic solvents, since they present greater efficiency in the extraction of the active ingredient. In both methods, the extracts are passed through a filtration process, and in some cases the extract may follow the allicin concentration step.
  • a botanical extract comprising allicin according to the present invention can be obtained by the method as described in Zahira et al., 1982; Curtis et al., 2004 and Fujisawa et al., 2008 incorporated herein in their entirety by reference.
  • Components that promote endospore germination into metabolically active forms only when applied to the field in the context of the present invention include, but are not limited to, carbon sources such as glucose, sucrose, maltose, cane molasses, nitrogen sources, including yeast extract , bacteriological peptone, free amino acids, including glutamic acid, tryptophan and glycine and, finally, metabolic extracts of microbial origin, including those rich in exopolysaccharides (EPS).
  • carbon sources such as glucose, sucrose, maltose, cane molasses
  • nitrogen sources including yeast extract , bacteriological peptone, free amino acids, including glutamic acid, tryptophan and glycine
  • metabolic extracts of microbial origin including those rich in exopolysaccharides (EPS).
  • EPS exopolysaccharides
  • a composition of the present invention may optionally contain additives, or agriculturally acceptable carriers, such as seed treatment and seed furrow additives, cell protectors for spray tanks, soil conditioners, fall aids, seed coating polymers, polymers for coatings of chemical or organic fertilizer granules, solid fertilizers, liquid fertilizers used in formulations for foliar products, endospore activators, among other purposes.
  • additives such as seed treatment and seed furrow additives, cell protectors for spray tanks, soil conditioners, fall aids, seed coating polymers, polymers for coatings of chemical or organic fertilizer granules, solid fertilizers, liquid fertilizers used in formulations for foliar products, endospore activators, among other purposes.
  • a composition according to the present invention may be packaged in a suitable package known in the art.
  • a plastic bag and/or vials can be used without the need for oxygen exchange of the final product.
  • the packaging of the product presented by the present invention eliminates the need for light protection, as it presents photostability.
  • the packaged volume can contain approximately 1 - 20 L and can be stored in refrigerated environments, or at room temperature, comprising the range of approximately 10 - 35°C.
  • the present invention further provides a process for producing an agricultural composition comprising the steps of: (a) fermenting microbial cultures of two or more species of the genus Bacillus;
  • the present invention also provides additional parameters for fermentation of Bacillus cells, and cell sporulation, such as parameters of pressure, temperature, oxygenation (air volume and agitation) and culture media, making it possible to obtain Bacillus endospores used in the preparation of an agricultural composition according to the present invention.
  • the fermentation of the culture of the different Bacillus in batches takes place for approximately 24 - 168 hours.
  • the method of the present invention comprises sequentially expanding (scaling) the culture of Bacillus spp. for inoculation of the fermentation culture.
  • the sequential expansion is started in volumes of 100 ml_, which serve as an inoculum for about 1 L. These, in turn, are inoculated in about 10 L, which are then inoculated in 180 L tanks and which, finally, they are transferred to reactors containing about 2000 L.
  • the Bacillus species is expanded into about 100 ml vials by incubation on an orbital shaker at about 80 rpm to about 200 rpm.
  • the incubation time is preferably from about 8 hours to about 24 hours.
  • the Bacillus species are then cultured in stainless steel flasks containing about 1 L of culture medium.
  • the culture temperature for multiplication of the three species of Bacillus in accordance with the present invention is from about 22°C to about 38°C.
  • different Bacillus species are inoculated separately in the scaling process up to 180L and mixed in the 2000L fermenters as described for the present invention.
  • said flasks are inoculated into two other stainless steel flasks of about 10 L and then transferred into tanks containing about 180 L of culture specific for each microorganism, with the addition of a stainless steel flask containing about 5 L of the solution of endospore-forming salts for Bacillus spp. (Table 4), incubated for about 24 to about 168 hours.
  • the step of mixing the different Bacillus species and botanical extract comprising allicin in a concentration of about 1% to about 30% is conducted at a temperature of about 22°C to about 38°C.
  • the pressure is preferably from about 0.5 to about 1.2 kgf/cm 3 .
  • Agitation is preferably from about 40 Hz to about 45 Hz.
  • the culture medium used for scaling up the culture of the three Bacillus and/or fermentation for the 100 ml_, 1L and 10 L scales is described in Table 1.
  • Endospore formation by Bacillus cells is induced by the imposition of an osmotic stress modality during or after the fermentative process of cell multiplication.
  • Osmotic stress is simulated by adding a concentrated salt solution, composed of 50 to 400 g/L of Ca(N03) 2 , 1.0 to 10 g/L of MnCh and 0.1 to 0.8 g/L L of FeS0 4 , which, in combination, trigger a series of physiological responses in cells, resulting in the induction of endospore formation.
  • the formation of endospores occurs in the stationary phase of bacterial growth, when microorganisms understand stress as an unfavorable condition for survival.
  • Endospores are known resistance structures for Gram positive bacterial cells.
  • osmotic stress is induced by incubating the cells in medium containing a saline concentration of 1 g/L to about 15 g/L.
  • the salts are Ca(NO3) 2 , MnCh and FeSO 4 .
  • a solution as described in Table 4 is added to the culture and/or fermentation broth in a ratio of about 1 spore-formed saline to about 36 Bacillus culture broth.
  • the cells are incubated with the saline for about 24 to about 168 hours.
  • the present invention provides a product comprising a composition according to the present invention as a growth promoter for plants, especially grasses.
  • the present invention further provides use of the compositions according to the present invention for controlling nematodes and/or for promoting plant growth in agricultural crops.
  • the present invention further provides methods of controlling nematodes and/or promoting plant growth in agricultural crops comprising applying a composition according to the present invention to agricultural crops. in a modality preferably, the methods of the present invention are applied to grass crops, preferably maize.
  • an agricultural composition according to the present invention is applied to seeds and/or the planting furrow.
  • the following examples are intended to illustrate, but not limit, the invention.
  • Bacillus species are inoculated separately in flasks containing 100 mL of culture medium as described in Table 1 for B. amyloliquefacies and B. velezensis and Table 3 for B. thurigiensis, being incubated in an orbital shaker at 80-200 rpm, at 22- 38 ° C for approximately 8-48 hours.
  • Table 2 Culture medium used for the growth of Bacillus spp. for 200 L tanks.
  • Table 3 Culture medium used for the growth of B. thuringiensis in 200 L tanks.
  • the sterilization process using 1400 L of water with defoamer is carried out for approximately 60 to 120 minutes, at a temperature of approximately 121 °C to approximately 130 °C .
  • sterilization is carried out at a pressure of approximately 1.0 - 2.0 kgf/cm 2 .
  • the pressure is preferably from about 1.0 to about 1.2 kgf/cm 3 .
  • Agitation is preferably from about 40 Hz to about 45 Hz.
  • the three species of Bacillus containing about 1 to about 30% allicin-based botanical extract is then inoculated and mixed with the fermenter, preferably about 30 to about 120 minutes.
  • the final product is packaged in gallons or bags, packages in which the product is stored and marketed.
  • Example 3 The induction and stabilization of endospores allows (i) the combination of different species of Bacillus ( Figure 1) and (ii) their association with botanical extracts ( Figure 2).
  • Figure 1 When the cells of the three species of Bacillus, B. amyloliquefaciens, B. velezensis and B. thuringiensis, in their vegetative forms, were added to the botanical extract of garlic, there was a strong drop in cell viability, in just 24 hours, and even more accentuated after 48 hours.
  • the cells of the species in their respective resistance forms were submitted to the same conditions, addition of the botanical extract and storage time, great stability of the composition was obtained, without significant differences in the concentration and viability of the cells.
  • the stability and compatibility obtained in the assay using sporulated cells mixed with allicin makes the technology possible for industrial production and agronomic application.
  • Example 4 The combination of three Bacillus species and botanical extract potentiates the nematicide effect on agriculturally relevant targets
  • J2 juveniles of Meloidogyne javanica nematodes commonly called “knot nematodes” was evaluated.
  • knot nematodes or root-knot nematode in English, being considered one of the most economically important phytonemtaoid groups in the country.
  • J2 stage juveniles are the infective form of nematodes, that is, they are the mobile and active form of the nematode that penetrate the root cell elongation zone and initiate the process of parasitism.
  • Bacillus spp. are recognized for their nematicidal potential thanks to their ability to synthesize a wide range of antibiotics, polypeptides, hydrolytic enzymes and endotoxins that interfere with the reproductive cycle of nematodes, and act on adult and juvenile forms (Machado et al., 2012).
  • Garlic extract in turn, has biologically active ingredients, among which allicin and polysulfites stand out, which have double action against insects and nematodes, and have been used as component of new generation nematicity products (Umetsu and Shirai, 2020).
  • the invention acted on the mobile forms of the nematode (J2), which have a greater power of root infection, highlighting the enormous potential of this technology for the management of this great challenge in today's agriculture.
  • Example 5 In addition to enhancing the nematicide effect, the combination of three species of Bacillus and botanical extract acts synergistically to promote plant growth.
  • the present invention which consists of the combination of three species of Bacillus and garlic extract, provided plant growth promotion, as can be seen in figures 4 and 5.
  • the nematicide effect it was verified synergistic action of the components of the present innovation, so that its effect is greater than the sum of the effects of each of the agents applied separately.
  • ADELEKE M. T. V. Effect of Allium sativum (garlic) extract on the growth and nodulation of cowpea (Vigna unguiculata) and groundnut (Arachis hypogea). African Journal of Agricultural Research, v. 43, n.11 4304-4312, 2016.
  • ADETOMIWA A.A., DU, T.L. E OLUBUKOLA, O.B.. Bacillus velezensis: phylogeny, useful applications, and avenues for exploitation. Applied Microbiology and Biotechnology, 103, 2019, 3669-3682.
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Abstract

A presente invenção refere-se ao efeito potencializador da associação de extrato botânico e Bacillus ssp. como agente bionematicida e surpreendentemente seu potencial efeito em promoção de crescimento de plantas em um único produto alcançado por um processo industrial diferenciado. O processo industrial de indução na formação de endósporos de Bacillus spp. através do estresse osmótico das células vegetativa no meio de cultura durante bacteriano é o que possibilita a mescla de Bacillus spp. e extrato botânico, uma vez que existe tanto a incompatibilidade entre as espécies de Bacillus quanto a incompatibilidade do extrato botânico, ambos na fase vegetativa do microrganismo. Por fim, a sinergia entre os princípios ativos, células microbianas e alicina, ativavam a função bionematicida e promotora de crescimento da composição biotecnológica apresentada.

Description

“ATIVAÇÃO DAS FUNÇÕES BIONEMATICIDA E PROMOTORA DO CRESCIMENTO VEGETAL EM UMA SOLUÇÃO BIOTECNOLÓGICA COMPOSTA POR TRÊS ESPÉCIES DE BACILLUS E ALICINA; PROCESSO INDUSTRIAL E APLICAÇÃO DA MESMA”
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
A presente invenção está relacionada a composições agrícolas compreendendo uma combinação de duas ou mais espécies de bactérias do gênero Bacillus e extrato botânico compreendendo alicina como princípio ativo, apresentando efeito bionematicida e promotor do crescimento vegetal. A invenção apresentada contempla o processo de preparação das composições e a aplicação agrícola das mesmas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As bactérias do gênero Bacillus são microrganismos Gram-positivos, amplamente difundidas na natureza com habilidade de produzir grandes quantidades de enzimas e uma variada gama de antibióticos, o que os tornam excelentes ferramentas de uso agrícola para promoção de crescimento de plantas e manejo biológico de patógenos, incluindo fitonematóides. Além disso, possuem a capacidade de formar estruturas de resistência em condições de estresse abiótico denominadas de endósporos, aumentando sua sobrevivência em ambientes desfavoráveis e, quando induzidos industrialmente, garantem a estabilidade do produto por longos períodos de armazenamento.
São amplamente conhecidos por seus efeitos benéficos, principalmente em plantas de importância agronómica, seja ele de promoção de crescimento ou até mesmo como agentes biodefensivos contra fitonematóides, ou seja, em ambientes favoráveis deixam a forma de resistência (endósporos) e assumem a fase vegetativa, desencadeando seus mecanismos de ação, tais como a formação de biofilme e síntese de metabólitos com efeito nematicida. Outra ferramenta muito importante no manejo dos nematoides é o uso de extratos botânicos, tais como extratos de alho, atuando principalmente com “efeito de choque”, ou seja, pelo efeito nematostático de contato que resulta na mortalidade do alvo. Dentre os fatores bióticos que limitam a produtividade das lavouras, o ataque de pragas, como os nematoides, é sem dúvida um dos mais impactantes para o agronegócio brasileiro. De acordo com a Embrapa Soja, no Brasil os prejuízos causados por nematoides estão estimados em R$ 16,5 bilhões (US$ 3,7 bilhões), apenas na cultura da soja, e relata-se que as principais culturas agrícolas cultivadas no país são suscetíveis aos fitopatógenos (Embrapa Soja, 2020). As características edafoclimáticas do Brasil proporcionam condições ideais para reprodução e alimentação da praga e, após terem se estabelecido em uma área, os nematoides são de difícil erradicação, o que torna ferramentas de manejo imprescindíveis. Os nematoides das galhas ( Meloidogyne spp.) e das lesões radiculares (Pratylenchus spp.) estão entre as principais espécies de fitonematoides de relevância agrícola.
O extrato de alho tem como um dos seus princípios ativos a alicina, composto com ampla atividade antimicrobiana mesmo em baixas concentrações (mM), tanto contra bactérias Gram-negativas quanto Gram- positivas, incluindo o gênero dos Bacillus (Leontiev et al., 2018). Sendo assim, é de senso comum que a combinação do extrato botânico de alho com bactérias do gênero Bacillus resulta em incompatibilidade, compondo um desafio técnico a ser solucionado. Essa incompatibilidade entre o extrato de alho com Bacillus é reconhecida pela comunidade científica, sendo que um exemplo descrito é a inibição de Bacillus cereus quando em contato com 3%, 5% e 10% desse extrato (Zahira et al., 1982).
Ademais, existem relatos quanto à incompatibilidade entre as células vegetativas das diferentes espécies de Bacillus, que ficou evidente em ensaios in vitro realizados com B. pumilus C116 e Bacillus thuringiensis subsp. kenyae C25 (Gomes et al., 2003). No entanto, não é regra para ensaios in vivo, uma vez que a mescla de diferentes espécies de Bacillus pode aumentar a supressão de doenças (De Boer, 1999). Duffy et al. (1996) reportaram que a coinoculação de diferentes microrganismos atua em regiões distintas das raízes e assim não ocorre a inibição da ação de cada microrganismo, ou ainda porque a produção de compostos secundários inibitórios ocorre na fase estacionária e não age nos estágios iniciais de colonização.
Sendo assim, existe uma necessidade na técnica por composições agrícolas compreendendo uma combinação de células viáveis de duas ou mais espécies de bactérias do gênero Bacillus e extrato botânico compreendendo alicina.
BREVE DESCRIÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO
A presente invenção surpreendentemente soluciona o problema da incompatibilidade de duas ou mais espécies de bactérias do gênero Bacillus entre si, bem como com um extrato botânico compreendendo alicina por meio da formulação de composições utilizando essencialmente apenas endósporos das bactérias do gênero Bacillus. O uso de endósporos de bactérias do gênero Bacillus de acordo com a presente invenção viabiliza a preparação de uma formulação única e estável, com tempo de prateleira prolongado e manutenção da atividade dos ativos individuais, capaz de promover um efeito surpreendente no controle de fitonematóides e na promoção do crescimento vegetal.
Além disso, as composições da presente invenção opcionalmente compreendem ainda uma formulação que promove a germinação dos endósporos em formas metabolicamente ativas apenas quando aplicados a campo, onde as bactérias são capazes de desempenharem seus respectivos papeis biológicos sem prejuízos entre as mesmas. Entre esses indutores, a solução apresenta aminoácidos livres, fontes de carbono e metabólitos de origem microbiana, que aceleram a ativação biológica dos endósporos sem depender de fatores estocásticos.
Assim, a presente invenção fornece composições agrícolas compreendendo endósporos de duas ou mais espécies de bactérias do gênero Bacillus e um extrato botânico compreendendo alicina, método de preparação e usos das mesmas, bem como métodos de controle de nematódeos em culturas vegetais e de promoção do crescimento vegetal.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Ensaio de compatibilidade de Bacillus velezensis Bacillus amyloliquefaciens em placas de Petri.
Figura 2. Estabilidade entre células de três espécies de Bacillus em suas duas formas, vegetativa e de resistência (endósporos), na presença do extrato botânico de alho após 24 e 48 horas da formulação em mistura.
Figura 3. Efeito nematicida do extrato botânico associado às três espécies de Bacillus, após 24 e 48 horas de exposição dos nematoides.
Figura 4. Efeito sinérgico de Bacillus spp. e extratos botânicos na promoção de crescimento de milho.
Figura 5. Fenótipo de plantas de milho tratadas com Bacillus spp. e extratos botânicos. T1 = controle; T2 = 3 Bacillus spp.; T3 = Extrato Botânico; T4= 3 Bacillus spp. + Extrato Botânico.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO
Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma composição agrícola compreendendo endósporos de duas ou mais espécies de bactéria do gênero Bacillus e um extrato botânico compreendendo alicina. Em um aspecto preferencial, a composição agrícola compreende endósporos de três ou mais espécies de bactéria do gênero Bacillus. Opcionalmente, uma composição agrícola de acordo com a presente invenção compreende ainda componentes que promovem a germinação dos endósporos em formas metabolicamente ativas apenas quando aplicados a campo.
O uso de endósporos de bactérias do gênero Bacillus de acordo com a presente invenção viabiliza a preparação de uma formulação única e estável, com tempo de prateleira prolongado e manutenção da atividade dos ativos individuais. Sendo assim, uma composição agrícola de acordo com a presente invenção apresenta um surpreendente e potencializado efeito nematicida bem como promotor do crescimento vegetal. O efeito nematicida observado é maior que o apresentado pelos componentes separados, células bacterianas e o extrato botânico.
Espécies do gênero Bacillus úteis no contexto da presente invenção compreendem, mas não estão limitadas a B. velezensis, B. amyloliquefaciens, B. thuringiensis, B. megaterium, B. subtilis, B. firmus, Paenibacillus macerans, B. licheniformis. Preferencialmente, espécies de bactéria do gênero Bacillus são selecionadas do grupo consistindo em B. velezensis (Adetomiwa e Olubukola, 2019; Rabbee et al., 2019), B. amyloliquefaciens (Idris et al., 2007; Liu et al., 2013; Xu et al., 2013) e B. thuringiensis (Bravo, Gill, e Soberón, 2007; Sansinenea, 2012; Schúnemann, Knaak and Fiúza, 2014). Como será entendido pelo técnico no assunto, diferentes estirpes das referidas espécies de Bacillus poderão ser empregadas.
Os extratos botânicos são ricos em compostos naturais biologicamente ativos, com enorme potencial de aplicação biotecnológica. Extratos botânicos compreendendo compostos de ação bionematicida, como a alicina, úteis no contexto da presente invenção compreendem, mas não estão limitados a extrato de alho ( Allium sativum ), melaleuca (Melaleuca alternifolia), neem ( Azadirachta indica ), cravo da índia ( Syzygium aromaticum). Preferencialmente, um extrato botânico compreendendo alicina é extraído principalmente dos bulbos de alho (Allium sativum ) por apresentar maior concentração do princípio ativo. Estes compostos bioativos derivam de diferentes processos de extração, a partir de solventes com diferentes polaridades, gerando principalmente extratos alcoólicos, extratos aquosos ou hidrolatos e óleos essenciais. Os principais extratores da alicina são: a água, quando empregados de pronto uso; ou por meio de solventes etanólicos, uma vez que apresentam maior eficiência na extração do princípio ativo. Em ambos os métodos, os extratos são passados por um processo de filtração, e em alguns casos o extrato pode seguir a etapa de concentração da alicina. Um extrato botânico compreendendo alicina de acordo com a presente invenção pode ser obtido pelo método tal como descrito em Zahira et al., 1982; Curtis et al., 2004 e Fujisawa et al., 2008 incorporados aqui em sua totalidade por referência.
Componentes que promovem a germinação dos endósporos em formas metabolicamente ativas apenas quando aplicados a campo no contexto da presente invenção compreendem, mas não estão limitados a fontes de carbono como glicose, sacarose, maltose, melaço de cana, fontes de nitrogénio, incluindo extrato de levedura, peptona bacteriológica, aminoácidos livres, entre eles ácido glutâmico, triptofano e glicina e, por fim, extratos metabólicos de origem microbiana, entre eles os ricos em exopolissacarídeos (EPS). Uma composição da presente invenção pode opcionalmente conter aditivos, ou veículos agricolamente aceitáveis, tais como aditivos para tratamento de sementes e sulco de semeadura, protetores celulares para tanques de pulverização, condicionadores de solo, adjuvantes de caídas, polímeros para recobrimento de sementes, polímeros para recobrimentos de grânulos de adubos químicos ou orgânicos, fertilizantes sólidos, fertilizantes líquidos utilizados em formulações para produtos foliares, ativadores de endósporos, entre outras finalidades.
Uma composição de acordo com a presente invenção pode ser acondicionada em uma embalagem adequada conhecida na técnica. Preferencialmente pode ser utilizada uma bolsa e/ou frascos plásticos sem a necessidade de troca de oxigénio do produto final. O acondicionamento do produto apresentado pela presente invenção dispensa a necessidade de proteção luminosa, por apresentar fotoestabilidade. Preferencialmente, o volume envasado pode conter aproximadamente 1 - 20 L e pode ser estocado em ambientes refrigerados, ou à temperatura ambiente, compreendendo a faixa de aproximadamente 10 - 35°C.
A presente invenção fornece ainda um processo de produção de uma composição agrícola compreendendo as etapas de: (a) fermentação dos cultivos microbianos de duas ou mais espécies do gênero Bacillus ;
(b) imposição de uma modalidade de estresse osmótico durante ou depois do processo de fermentação; e
(c) formulação de uma composição agrícola compreendendo a mistura de células bacterianas com o extrato botânico compreendendo alicina em um mesmo recipiente.
A presente invenção fornece também parâmetros adicionais para fermentação das células de Bacillus, e esporulação celular, tais como parâmetros de pressão, temperatura, oxigenação (volume de ar e agitação) e meios de cultura, possibilitando a obtenção dos endósporos de Bacillus utilizados na preparação de uma composição agrícola de acordo com a presente invenção.
Como será entendido pelo técnico no assunto, diferentes parâmetros de fermentação e composição do meio de cultivo podem ser combinados para a presente invenção.
Em uma modalidade preferencial, de acordo com a presente invenção a fermentação da cultura dos diferentes Bacillus por batelada ocorre por aproximadamente 24 - 168 horas. Em uma modalidade preferencial, o método da presente invenção compreende a expansão sequencial (escalonamento) cultura de Bacillus spp. para inoculação da cultura de fermentação. Preferencialmente, a expansão sequencial é iniciada em volumes de 100 ml_, que serve de inoculo para cerca de 1 L. Esse, por sua vez, são inoculados em cerca de 10 L, que, então, são inoculados em tanques de 180L e que, por fim, são transferidos para reatores contendo cerca de 2000 L.
Em uma modalidade preferencial, as espécies de Bacillus são expandidas em frascos de cerca de 100 ml_ por incubação em agitador orbital a cerca de 80 rpm a cerca de 200 rpm. O tempo de incubação é de preferencialmente cerca de 8 horas a cerca de 24 horas. Preferencialmente, as espécies de Bacillus são então cultivadas em balões de inox contendo cerca de 1 L de meio de cultura. O tempo de incubação é de preferencialmente cerca de 8 a cerca de 48 horas com vazão de ar de cerca de 0,25 Nm3/h a cerca de 1,0 Nm3/h (=4,16 - 16,67 vvm).
Em uma modalidade preferencial, a vazão de ar dos balões de inox contendo cerca de 10L é, preferencialmente, de cerca de 0,25 a cerca de 1,5 Nm3/h (= 0,41 - 2,5 vvm) e o tempo de incubação é de preferencialmente cerca de 8 horas a cerca de 48 horas.
Em uma modalidade preferencial, a temperatura de cultura para multiplicação das três espécies de Bacillus de acordo com a presente invenção é de cerca de 22 °C a cerca de 38 °C.
Em uma modalidade preferencial, diferentes espécies de Bacillus são inoculadas separadamente no processo de escalonamento até os 180L e misturadas nos fermentadores de 2000L conforme descrito para a presente invenção. Para isso, em uma modalidade preferencial, após o cultivo em dois balões de inox de cerca de 1 L, os referidos balões são inoculados em outros dois balões de inox de cerca de 10L e então transferidos em tanques contendo cerca de 180 L de meio de cultura específico para cada microrganismo, com a adição de um balão de inox contendo cerca de 5 L da solução de sais formadoras de endósporos para os Bacillus spp. (Tabela 4), incubadas por cerca de 24 a cerca de 168 horas. A vazão de ar é, preferencialmente, de cerca de 2,0 a cerca de 15,0 Nm3/h (= 0,16 - 1 ,25 vvm).
Em uma modalidade preferencial, a etapa de mistura das diferentes espécies Bacillus e extrato botânico compreendendo alicina na concentração cerca de 1% a cerca de 30% é conduzida com temperatura de cerca de 22 °C a cerca de 38 °C. A vazão de ar é de preferencialmente cerca de 1 ,0 Nm3/h a cerca de 2,5 Nm3/h (= 0,0085 - 0,021 vvm). A pressão é preferencialmente de cerca de 0,5 a cerca de 1 ,2 kgf/cm3. A agitação é preferencialmente de cerca de 40 hz a cerca de 45 hz.
Em uma modalidade preferencial, o meio de cultura utilizado para escalonamento da cultura dos três Bacillus e/ou de fermentação para as escalas de 100 ml_, 1L e 10 L está descrito conforme tabela 1.
A formação de endósporos pelas células de Bacillus é induzida pela imposição de uma modalidade de estresse osmótico durante ou depois do processo fermentativo de multiplicação celular. O estresse osmótico é simulado através da adição de uma solução concentrada de sais, composta por 50 a 400 g/L de Ca(N03)2, 1 ,0 a 10 g/L de MnCh e 0, 1 a 0,8 g/L de FeS04, que, em combinação, desencadeiam uma série de respostas fisiológicas nas células, resultando na indução da formação dos endósporos. A formação dos endósporos ocorre na fase estacionária do crescimento bacteriano, quando os microrganismos entendem o estresse como uma condição desfavorável à sobrevivência. Isso ocorre ao final da divisão celular, mitose, e compreende as seguintes etapas; replicação do DNA e formação do nucleóide axial, formação do cerne através da concentração de proteínas citoplasmáticas e RNA ao redor do núcleo axial; formação do septo do endósporo pela membrana plasmática; biossíntese de pepetídeoglicanos que são depositados entre a bicamada lipídica compondo uma camada laminar denominada de córtex; deposição de camadas proteicas ao redor do córtex pela célula mãe, impermeabilizando a forma de resistência com a formação da capa de esporo e finaliza o processo. Os endósporos são estruturas de resistência conhecidas para células bacterianas Gram positivas. Utilizando o processo de acordo com a presente invenção, é possível obter esporulação com elevada eficiência, a uma taxa superior a 90% e concentrações acima de 108 endósporos/mL, independendo de fatores aleatórios. Preferencialmente, o estresse osmótico é induzido mediante incubação das células em meio contendo uma concentração salina de 1 g/L a cerca de 15 g/L. Preferencialmente, os sais são Ca(N03)2, MnCh e FeS04. Mais preferencialmente, é adicionada ao caldo de cultura e/ou fermentação uma solução como descrita na Tabela 4 em proporção de cerca de 1 de solução salina formado de esporos para cerca 36 de caldo de cultura de Bacillus. Preferencialmente, as células são incubadas com a solução salina por cerca de 24 a cerca de 168 horas.
Em uma modalidade alternativa, a presente invenção fornece um produto compreendendo uma composição de acordo com a presente invenção como promotor de crescimento de plantas, especialmente gramíneas.
A presente invenção fornece ainda uso das composições de acordo com a presente invenção para controle de nematódeos e/ou para a promoção do crescimento vegetal em culturas agrícolas. A presente invenção fornece ainda métodos de controle de nematódeos e/ou de promoção do crescimento vegetal em culturas agrícolas compreendendo a aplicação de uma composição de acordo com a presente invenção em culturas agrícolas. Em uma modalidade preferencial, os métodos da presente invenção são aplicados a culturas de gramíneas, preferencialmente milho.
Preferencialmente, uma composição agrícola de acordo com a presente invenção é aplicada em sementes e/ou no sulco de plantio. Os exemplos que se seguem pretendem ilustrar, porém não limitar, a invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1 - Escalonamento da cultura
Espécies de Bacillus são inoculadas separadamente em frascos contendo 100 mL de meio de cultura conforme descrito na Tabela 1 para B. amyloliquefacies e B. velezensis e Tabela 3 para B. thurigiensis, sendo incubados em agitador orbital de 80-200 rpm, à 22-38 °C por aproximadamente 8-48 horas. A próxima etapa de escalonamento consiste da inoculação de balões de inox contendo 1 L de meio cultura (Tabela 1 e Tabela 3), na qual as espécies são cultivadas separadamente e incubadas por aproximadamente 8 - 48 horas, com vazão de ar 0,25- 1 ,0 Nm3/h (=4,16 - 16,67 vvm) e temperatura aproximadamente de 22-38 °C. Decorrido esse tempo, a cultura é inoculada em balões de inox contendo 10 L de meio de cultura e incubados por aproximadamente 18 - 96 horas, com vazão de ar 0,25 - 1,5 Nm3/h (= 0,41 - 2,5 vvm) e temperatura variando de 22-38 °C.
Decorrido esse tempo, cada cultura contendo dois balões de inox com 10 L de meio de cultura é inoculada em um tanque contendo cerca de 180 L de meio de cultura específico para cada microrganismo, sendo na Tabela 2 meio de cultura específico para os B. amyloliquefaciens e B. velezensis; e na Tabela 3 para o meio de cultura específico para B. thuringiensis com a adição de um balão de inox contendo cerca de 5 L da solução de sais formadoras de endósporos para os Bacillus spp. (Tabela 4) e incubados por aproximadamente 24 -168 horas, com vazão de ar 3 10,0 Nm3/h (= 0,25 - 0,83 vvm) e temperatura variando de 22 - 38 °C.
Tabela 1. Meio de cultura utilizado para o crescimento do B. amyloliquefaciens e B. velezensis até a escala de 10L
Figure imgf000014_0001
Tabela 2. Meio de cultura utilizado para o crescimento dos Bacillus spp. para tanques de 200 L.
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Tabela 3. Meio de cultura utilizado para o crescimento do B. thuringiensis para tanques de 200 L.
Figure imgf000014_0003
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Tabela 4. Solução formadora de esporos para as três espécies de
Bacillus.
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Exemplo 2 - Mescla de Bacillus e Extrato Botânico em biorreator
Para a mescla dos três diferentes Bacillus e extrato botânico em fermentador de 2000 L, preferencialmente o processo de esterilização utilizando 1400 L de água com antiespumante é realizado por aproximadamente 60 a 120 minutos, a uma temperatura de aproximadamente 121 °C a aproximadamente 130 °C. Preferencialmente, a esterilização é realizada a uma pressão de aproximadamente 1,0 - 2,0 Kgf/cm2. A vazão de ar é de preferencialmente cerca de 1 ,0 Nm3/h a cerca de 2,5 Nm3/h (= 0,0085 - 0,021 vvm). A pressão é preferencialmente de cerca de 1,0 a cerca de 1,2 kgf/cm3. A agitação é preferencialmente de cerca de 40 hz a cerca de 45 hz. Preferencialmente, o processo de estabilização, as três espécies de Bacillus contendo cerca de 1 a cerca de 30% de extrato botânico a base de alicina é então inoculada e misturada ao fermentador, preferencialmente cerca de 30 a cerca de 120 minutos. Preferencialmente, o produto final é envasado em galões ou em bolsas, embalagens em que o produto é armazenado e comercializado.
Exemplo 3 - A indução e estabilização de endósporos possibilita (i) a combinação de diferentes espécies de Bacillus (Figura 1) e (ii) a associação destas com extratos botânicos (Figura 2). Quando as células das três espécies de Bacillus, B. amyloliquefaciens, B. velezensis e B. thuringiensis, em suas formas vegetativas foram acrescidas do extrato botânico de alho, ocorreu forte queda na viabilidade de celular, em apenas 24 horas, e, ainda mais acentuado depois de 48 horas. Em contrapartida, quando as células das espécies em suas respectivas formas de resistência foram submetidas às mesmas condições, adição do extrato botânico e tempo de armazenamento, obteve-se grande estabilidade da composição, sem diferenças significativas na concentração e viabilidade das células. A estabilidade e a compatibilidade obtidas no ensaio empregando células esporuladas em mistura com alicina viabiliza a tecnologia para a produção industrial e aplicação agronómica.
Exemplo 4 - A combinação de três espécies de Bacillus e extrato botânico potencializa o efeito nematicida sobre alvos de relevância agrícola Em bioensaios in vitro, avaliou-se a mortalidade de juvenis J2 de nematoides da espécie Meloidogyne javanica, comumente chamado de “nematoides de galhas”, ou root-knot nematode em inglês, sendo considerado ums dos grupos de fitonemtaoides de maior relevância económica no país. Os juvenis do estádio J2 são a forma infectante dos nematoides, ou seja, constiuem a forma móvel e ativa do nematoide que penetram na zona de alongamento celular da raiz e inicia o processo de parasitismo.
Bacillus spp. são reconhecidos por seu potencial nematicida graças a sua capacidade de sintetizar uma ampla gama de antibióticos, polipeptídeos, enzimas hidrolíticas e endotoxinas que interferem no ciclo reprodutivo dos nematoides, e atuam sobre formas adultas e juvenis (Machado et al., 2012). O extrato de alho, por sua vez, possui ingredientes biologicamente ativos dentre os quais se destaca a alicina e polisulfitos, que possuem ação dobre insetos e nematoides, e tem sido utilizado como componente de produtos nematicidade de nova geração (Umetsu e Shirai, 2020).
Todavia, como o técnico no assunto poderá verificar na Figura 3, a combinação das três espécies de Bacillus associadas ao extrato botânico resulta em efeito sinérgico surpreendente, atingindo percentuais de mortalidade superiores aos obtidos pelo uso dos Bacillus spp. e do extrato botânico de forma separada. Tal efeito inesperado pode ser atribuído à combinação e potencialização dos mecanismos de ação evolvidos no antagonismo aos nematoides, de tal sorte que seu efeito é maior do que a soma dos efeitos de cada um dos agentes aplicados isoladamente. Este efeito surpreeendente só foi possível graças à presente invenção, que tornou possível a mistura das três diferentes espécies de Bacillus (em sua forma de endósporo) com o extrato botânico rico em alicina.
Vantajosamente, a invenção atuou sobre as formas móveis do nematoide (J2), que apresentam maior poder de infecção das raízes, detacando o enorme potencial desta tecnologia para o manejo deste grande desafio da agricultura atual.
Exmplo 5 - Além de potencializar o efeito nematicida, a combinação de três espécies de Bacillus e extrato botânico atua sinérgicamente na promoção do crescimento das plantas.
Apesar de existirem indicativos irrefutáveis da ação nematicida do extrato de alho, existem evidências de que algumas concentrações deste extrato botânico podem impactar negativamente no crescimento e microbiota de algumas culturas (Adeleke et al., 2016).
De forma inesperada, a presente invenção, que é constituída da combinação de três espécies de Bacillus e extrato de alho, proporcionou promoção de crescimento de plantas, como pode ser verificado nas figuras 4 e 5. Assim como observado para o efeito nematicida, foi verificada ação sinérgica dos componentes da presente inovação, de modo que seu efeito é maior do que a soma dos efeitos de cada um dos agentes aplicados isoladamente.
REFERÊNCIAS
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Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Composição agrícola, caracterizada pelo fato de que compreende endósporos de duas ou mais espécies de bactérias do gênero Bacillus e um extrato botânico compreendendo alicina.
2. Composição agrícola de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende endósporos de três ou mais espécies de bactérias do gênero Bacillus.
3. Composição agrícola de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as bactérias do gênero Bacillus são selecionadas do grupo consistindo em B. amyloliquefaciens, B. thuringiensis e B. velezensis.
4. Composição agrícola de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o extrato botânico compreendendo alicina é extrato de alho.
5. Composição agrícola de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda componentes adicionais que promovem a germinação dos endósporos em formas metabolicamente ativas apenas quando aplicados a campo.
6. Processo de produção de uma composição agrícola, caracterizado pelo fato de que compreende:
(a) fermentação dos cultivos microbianos de duas ou mais espécies do gênero Bacillus ;
(b) imposição de uma modalidade de estresse osmótico durante ou depois do processo de fermentação; e (c) formulação de uma composição agrícola compreendendo a mistura de células bacterianas com o extrato botânico compreendendo alicina em um mesmo recipiente.
7. Processo de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que três ou mais espécies de Bacillus são empregadas.
8. Processo de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que as três espécies de Bacillus são selecionadas do grupo consistindo em Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis e Bacillus thuringiensis.
9. Processo de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que a indução na formação de endósporos da etapa (a) ocorre no ambiente de tanques.
10. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fermentação da cultura é por batelada.
11. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o processo de estabilização do produto da etapa (b) é realizado por aproximadamente de 60 a aproximadamente 120 minutos.
12. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o processo de indução na formação de endósporos da etapa
(a) é realizado a uma temperatura de aproximadamente 22 °C a aproximadamente 37 °C.
13. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o processo de indução na formação de endósporos da etapa (a) é realizado a uma vazão de ar de aproximadamente 3,0 Nm3/h (0,25 vvm) de aproximadamente 10,0 Nm3/h (=0,83 vvm).
14. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a expansão sequencial da cultura de diferentes Bacillus spp. para inoculação da cultura de fermentação.
15. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as espécies de Bacillus são inoculadas separadamente.
16. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a expansão sequencial é feita em volumes de cerca de 100 ml_, para cerca de 10 L, cerca de 180 L até cerca de 2000 L.
17. Processo caracterizado pelo fato de que as espécies de Bacillus são expandidas por incubação em agitador orbital a cerca de 80 rpm a cerca de 200 rpm.
18. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as espécies de Bacillus são expandidas por incubação por cerca de 8 horas a cerca de 48 horas.
19. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as espécies de Bacillus são expandidas em balões de inox contendo cerca de 1 L de meio cultura e cerca de 10 L de meio de cultura.
20. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as espécies são incubadas por aproximadamente cerca de 8 a cerca de 48 horas.
21. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as cepas são incubadas com vazão de ar de cerca de 0,25 Nm3/h a cerca de 1,0 Nm3/h (=4,16 - 16,67 vvm) para 1L de meio de cultura e vazão de ar cerca de 0,25 Nm3/h a cerca de 1,0 Nm3/h (=0,41 - 1 ,67 vvm) para 10 L de meio de cultura.
22. Processo de acordo qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que após o cultivo segregado das espécies em dois balões de inox de cerca de 10 L, os referidos dois balões são inoculados em tanques contendo cerca de 180 L de meio de cultura.
23. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as cepas são incubadas por cerca de 24 a cerca de 168 horas.
24. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as cepas são incubadas com vazão de ar de cerca de 1,0 a cerca de 15,0 Nm3/h (= 0,16 - 1,25 vvm).
25. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a temperatura de incubação é de cerca de 27 °C a cerca de 37 °C.
26. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação é conduzida com pressão de cerca de 1 ,0 a cerca de 2,0 kgf/cm3.
27. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação é conduzida com agitação de cerca de 40 hz a cerca de 45 hz.
28. Processo caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação é conduzida com temperatura de cerca de 27 °C a cerca de 37 °C.
29. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de fermentação é conduzida com vazão de ar de cerca de 1 ,0 Nm3/h a cerca de 2,5 Nm3/h (= 0,0085 - 0,021 vvm).
30. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de mescla de Bacillus spp. e extrato botânico é conduzida durante cerca de 30 a cerca de 120 minutos.
31. Processo caracterizada pelo fato de que é obtida através do processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26.
32. Uso de uma composição como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para aplicação em culturas agrícolas.
33. Uso de uma composição como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para aplicação em sementes ou sulco de semeadura.
34. Método de controle de nematódeos em culturas agrícolas, caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação de uma composição como definida na reivindicação 1 à cultura agrícola.
35. Método de promoção do crescimento vegetal em culturas agrícolas, caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação de uma composição como definida na reivindicação 1 à cultura agrícola.
36. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concretizações ou quaisquer categorias de reivindicação aplicáveis, por exemplo, produto, processo ou uso, englobadas pela matéria inicialmente revelada, descrita ou ilustrada no pedido de patente.
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