BR112020008712A2 - composição probiótica de alimento ou de bebida, e, método de preparação de uma composição probiótica - Google Patents

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Abstract

Uma composição e um método para ativação de esporos probióticos em produtos de alimento e de bebida, como chás imergidos, café, sopas, e molhos. Uma composição de germinantes nutrientes compreende um ou mais L-aminoácidos, opcionalmente um ou mais tampões para manter o pH da composição quando adicionada à água em uma faixa de cerca de 6 a 8, opcionalmente D-glicose, D-frutose, ou ambas D-glicose e D-frutose, e opcionalmente, um osmoprotetor. A composição de germinantes nutrientes, uma ou mais espécies de esporos de Bacillus, e um produto de alimento ou de bebida podem ser pré-misturados em qualquer combinação. Água é adicionada à mistura e aquecida para uma faixa de temperatura de 42 a 100°C para germinar os esporos probióticos antes de serem consumidos.

Description

1 / 14 COMPOSIÇÃO PROBIÓTICA DE ALIMENTO OU DE BEBIDA, E,
MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO PROBIÓTICA REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório norte-americana nº 62/581.324 depositado em 3 de novembro de
2017. Este pedido também reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório norte-americana nº 62/596.424 depositado em 8 de dezembro de
2017.
FUNDAMENTOS
[002] Avanços científicos recentes têm esclarecido o significado da relação entre as bactérias intestinais humanas (o microbioma) e a saúde geral. O microbioma humano é um produto de nossa genética, nossas dietas, e nosso ambiente. Probióticos podem ser usados para alterar o microbioma humano. Probióticos para consumo humano estão disponíveis como cápsulas e como produtos de alimento (por exemplo, iogurte, bebidas, etc.). Embora haja exemplos de chá probiótico no comércio, não há nenhum que inclua um componente ativo para germinar esporos probióticos para eficácia aprimorada. É aqui descrita uma invenção que inclui a provisão de compostos ativos com esporos bacterianos de Bacillus para consumo probiótico humano em chá, sopas, caldos de carne, molhos, chocolate quente, e outros produtos de alimento e de bebida, particularmente líquidos e fluidos aquecidos.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[003] O sistema e o método da invenção são adicionalmente descritos e explicados em relação aos seguintes desenhos, nos quais: a Figura 1 mostra fotografias de espécies Bacillus em uma composição de germinantes nutrientes de acordo com uma modalidade preferida no tempo zero (quando água quente é inicialmente adicionada) e após imersão em água quente durante 60 minutos em várias temperaturas de acordo com os métodos preferidos da invenção, as manchas mais escuras
2 / 14 indicam bactérias germinadas e as manchas mais claras/mais brilhantes indicam esporos não germinados; a Figura 2 mostra fotografias de espécies Bacillus e uma composição de germinantes nutrientes de acordo com uma modalidade preferida em chá imergido (chá preto e chá verde) de acordo com um método preferido da invenção, as manchas mais escuras indicam bactérias germinadas e as manchas mais claras/mais brilhantes indicam esporos não germinados.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[004] Avanços científicos recentes têm esclarecido o significado da relação entre as bactérias intestinais humanas (o microbioma) e a saúde geral. O microbioma humano é um produto de nossa genética, nossas dietas, e nosso ambiente. Probióticos podem ser usados para alterar o microbioma humano com o propósito de regular o sistema digestivo e reforçar o sistema imune. Em geral, os probióticos são bactérias não patogênicas que podem incluir espécies de bactérias do ácido láctico (Lactobacillus), Bifidobacterium, e Propionibacterium. As espécies de Bacillus são também comuns como probióticos. Os probióticos têm sido amplamente usados em animais como uma alternativa para os hormônios e os antibióticos, em plantas para melhorar determinadas características de crescimento, e em humanos como um suplemento digestivo. Os probióticos para consumo humano estão disponíveis como cápsulas e como produtos de alimento (por exemplo, iogurte, suco, etc.). Os probióticos distribuídos em chá também estão no comércio. Produtos de chá probiótico contêm bactérias probióticas embaladas com chá em um saco poroso. Os sacos de chá são imergidos durante um período de tempo em água quente e são consumidos. Alternativamente, o chá de Kombucha é um tipo de bebida probiótica na qual uma cultura simbiótica de bactérias e leveduras (SCOBY) é adicionada ao chá contendo açúcar. A SCOBY então atua para fermentar o açúcar no chá para produzir vitaminas e ácidos. Neste caso, o açúcar atua como um substrato e a bebida não contém aminoácidos
3 / 14 que conhecidamente ativam bactérias.
[005] No caso de espécies de Bacillus como probióticos (por exemplo, B. coagulans), as bactérias são providas como esporos. Os esporos representam um estágio de vida exclusivo da espécie específica de bactérias em que estas espécies têm a capacidade de transição para um estágio de esporo dormente se as condições ambientais forem desfavoráveis. Os esporos são naturalmente desidratados, são estáveis durante períodos de tempo prolongados, e são resistentes aos estresses ambientais (por exemplo, calor, sal, pH, etc.). No caso de esporos de Bacillus em produtos de chá, os esporos são preferivelmente mais resistentes às temperaturas altas da água de imersão.
[006] Com o propósito de os esporos retornarem para um estado vivo, de crescimento vegetativo, eles precisam primeiro germinar. A germinação de esporos é um processo de multietapas no qual os esporos são revividos a partir de um estado dormente. A primeira etapa é uma pela qual os esporos são ativados e são induzidos para germinarem, tipicamente por um sinal ambiental chamado de um germinante. Este sinal pode ser um nutriente como um L-aminoácido, íons de potássio (por exemplo, KCI), e/ou compostos osmoprotetores naturais (por exemplo, ectoína). Os germinantes nutrientes ligam-se aos receptores na membrana interna do esporo para iniciar a germinação. Adicionalmente, tem sido mostrado que açúcares aumentam a afinidade de ligação de L-aminoácidos para os seus receptores cognatos.
[007] O sinal germinante inicia uma cascata de eventos irreversível, também conhecida como cometimento. O cometimento é rápido e é tipicamente >90% completo em 2 minutos. À medida que a germinação progride, o esporo rapidamente absorve água. À medida que o esporo absorve água, ele consequentemente perde sua refratividade. Esta perda de refratividade próxima do fim da primeira fase no processo de germinação permite que seja observada a germinação do esporo via microscopia de contraste de fase. A fase inicial é tipicamente completa dentro de 30 a 60
4 / 14 minutos dependendo da temperatura. A segunda fase de germinação é uma etapa de excrescência na qual iniciam as vias metabólicas, biossintéticas, e de replicação/reparo de DNA do esporo. O período de excrescência inclui um período de maturação no qual não ocorrem alterações morfológicas (como crescimento celular), mas é ativado o maquinário molecular do esporo (por exemplo, fatores de transcrição, maquinário de tradução, maquinário de biossíntese, etc.). Este período pode variar em duração com base nos recursos iniciais que estão embalados com o esporo durante o processo de esporulação.
[008] É sabido que os esporos podem ser induzidos para germinarem via ativação térmica. Os esporos de várias espécies de Bacillus têm sido termicamente ativados em temperaturas específicas de cepa (por exemplo, os esporos de B. subtilis podem ser termicamente ativados a 75°C durante 30 minutos, enquanto que os esporos de B. licheniformis podem ser termicamente ativados a 65°C durante 20 minutos). Acredita-se que a ativação térmica causa um desenovelamento transiente, reversível das proteínas do esporo. Se as proteínas do esporo não estiverem presentes com um germinante nutriente, como L-alanina, elas se reenovelarão e eficazmente reverterão o processo de germinação.
[009] A presente invenção descreve uma composição e um método para ativação de esporos probióticos em produtos de alimento e de bebida, como chás imergidos, sopas, caldos de carne, molhos, chocolate quente, café, e outros produtos, particularmente líquidos e fluidos aquecidos. O método inclui a provisão de germinantes nutrientes com esporos de Bacillus que serão termicamente ativados e subsequentemente germinados com germinantes nutrientes enquanto o produto de alimento ou de bebida estiver sendo aquecido, como quando um chá estiver imergido em água quente. De acordo com uma modalidade preferida, os dois componentes probióticos (esporos bacterianos e germinantes nutrientes) podem ser providos como componentes secos em uma cápsula de cafeteira automática (por exemplo, Keurig®,
5 / 14 Nespresso®, Tassimo®, etc.) contendo chá ou outro produto de alimento ou de bebida. De acordo com outra modalidade preferida, os ingredientes podem ser providos como ingredientes misturados (composição de germinantes nutrientes e esporos) em uma embalagem de dose unitária a ser adicionada ao chá ou a outro produto de alimento ou de bebida, componentes misturados (composição de germinantes nutrientes e esporos) em um saco único contendo chá ou outro produto de alimento ou de bebida, ou como componentes separados em sacos de chá separados (por exemplo, dois sacos contendo qualquer combinação da composição de germinantes nutrientes, esporos, e chá) ou outro recipiente para outros produtos de alimento ou de bebida. De acordo com uma modalidade preferida, os esporos podem ser termicamente ativados na presença de germinantes nutrientes em um método que é descrito no Pedido de Patente norte-americana nº 15/479.773, que é aqui incorporado como referência. Composições de Nutrientes
[0010] São aqui descritas modalidades preferidas de composições de nutrientes que podem conter um ou mais L-aminoácidos, D-glicose, D- frutose, um tampão biológico, uma fonte de íons de potássio, e/ou um osmoprotetor natural. Todos os componentes na formulação de nutrientes precisam ser Geralmente Considerados como Seguros (GRAS) para consumo humano pela Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos da América (United States Food and Drug Administration). No momento desta redação, a maioria dos, embora não todos os, componentes aqui descritos têm sido considerados como GRAS.
[0011] De acordo com uma modalidade preferida, a composição de germinantes nutrientes pode incluir um ou mais L-aminoácidos. O(s) L- aminoácido(s) incluído(s) na formulação de nutrientes são L-alanina, L- asparagina, L-valina, e/ou L-cisteína. A escolha de L-aminoácidos é determinada pela espécie de Bacillus usada na formulação probiótica. Os L-
6 / 14 aminoácidos podem ser providos na forma de qualquer fonte adequada, como formas puras deles e/ou um hidrolisado de proteína de soja.
[0012] De acordo com outra modalidade preferida, a composição de germinantes nutrientes pode opcionalmente conter uma quantidade de D- glicose e/ou D-frutose. A escolha de açúcar é determinada pela espécie de Bacillus usada na formulação probiótica.
[0013] De acordo com outra modalidade preferida, a composição de germinantes nutrientes pode opcionalmente conter uma ou mais fontes de íons de potássio. Preferivelmente, KCI pode estar incluído como uma fonte de íons de potássio na formulação de nutrientes. A inclusão de íons de potássio é determinada pela espécie de Bacillus usada na formulação probiótica.
[0014] De acordo com outra modalidade preferida, a composição de germinantes nutrientes pode opcionalmente conter um ou mais tampões biológicos. O tampão biológico é um tampão que pode tamponar a formulação de nutrientes e/ou a formulação de nutrientes-esporos, para manter a formulação no pH apropriado para a germinação de esporos (cerca de pH 6 a 8). Os tampões biológicos preferidos incluem, mas não se limitam a, um tampão fosfato ou um sal de sódio de HEPES. De acordo com outra modalidade preferida, fosfato monossódico e fosfato dissódico, preferivelmente usados juntos, podem estar incluídos na formulação de nutrientes como tampões. De acordo com outra modalidade preferida, um tampão HEPES pode ser usado.
[0015] De acordo com outra modalidade preferida, a solução de nutrientes pode opcionalmente conter um composto osmoprotetor. Preferivelmente, ectoína, um osmoprotetor natural produzido por algumas espécies de bactérias, pode estar incluída. A inclusão de um osmoprotetor é determinada pela espécie de Bacillus usada na formulação probiótica.
[0016] De acordo com outra modalidade preferida, a composição de nutrientes é qualquer uma das composições de nutrientes descritas no Pedido
7 / 14 de Patente norte-americana nº 15/479.773.
[0017] De acordo com ainda outra modalidade preferida, uma composição de nutrientes pode conter ingredientes em uma ou mais categorias de ingredientes acima referidos, e pode conter um ou mais ingredientes daquelas categorias. Formulações de Esporos
[0018] As modalidades preferidas de formulações de esporos incluem uma ou mais espécies de esporos de Bacillus, que incluem mas não se limitam a, Bacillus licheniformis, Bacillus subtillis, Bacillus amyloliquiefaciens, Bacillus polymyxa, Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus lentus, Bacillus clausii, Bacillus circulans, Bacillus firmus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus, Bacillus laevolacticus, Bacillus polymyxa, Bacillus pumilus, Bacillus simplex, Bacillus sphaericus, Bacillus sonorensis, Bacillus, horneckiae, Bacillus axarquiensis, Bacillus mucilaginosus, Bacillus olivae, e qualquer combinações das mesmas. Todas as cepas na formulação probiótica precisam ser Geralmente Consideradas como Seguras (GRAS) para consumo humano pela Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos da América. No momento do depósito deste pedido, várias, embora não todas as, cepas mencionadas acima têm sido consideradas como GRAS. Quaisquer espécies de Bacillus subsequentemente determinadas como sendo GRAS são aqui incluídas como adequadas para uso com as modalidades da invenção.
[0019] As formulações de esporos preferidas podem conter de 1 a 20 ou mais espécies de esporos de Bacillus. De acordo com uma modalidade preferida, uma formulação de esporos pode conter 3 cepas de bactérias Bacillus. De acordo com outra modalidade preferida, 2 cepas das bactérias Bacillus podem ser, cada uma, uma cepa diferente da espécie Bacillus licheniformis e a terceira cepa é uma espécie de Bacillus subtilis. De acordo com outra modalidade preferida, cerca de 80% da formulação pode ser
8 / 14 Bacillus licheniformis (40% de cada cepa) e 20% dos esporos na formulação de esporos podem ser de Bacillus subtilis. De acordo com outra modalidade preferida, os esporos da(s) cepa(s) incluído(s) na fórmula de esporos podem ser misturados com água ou outro carreador adequado e/ou sais orgânicos adequados.
[0020] O mais preferivelmente, a espécie de Bacillus que pode estar contida nas formulações de esporos pode produzir e/ou ser capaz de produzir uma ou mais enzimas que incluem, mas não se limitam a, proteases, amilases, lipases, glicosidases, celulases, esterases, e xilanases. Testes e ensaios para determinação da produção de tais enzimas a partir de uma espécie de Bacillus são geralmente conhecidos na técnica e por uma pessoa comumente versada na técnica.
[0021] De acordo com uma modalidade preferida, a formulação de esporos pode conter cerca de 0,1% a 90% em peso de esporos, juntamente com sal ou outro carreador adequado, como bicarbonato de sódio, ou maltodextrina, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a formulação de esporos contém cerca de 5% em peso de esporos. A formulação de esporos pode ser e/ou incluir um pó ou outra forma seca (por exemplo, forma secada por atomização de um concentrado líquido de esporos, ou formulação de esporos liofilizada) contendo esporos. De acordo com outra modalidade preferida, a concentração total de esporos na formulação de esporos pode estar na faixa de cerca de 1 x 105 UFC/mL ou esporos/g a 1 x 1014 UFC/mL ou esporos/g ou qualquer concentração específica ou faixa específica dentro da mesma. A concentração total preferida de esporos na formulação de esporos pode ser de cerca de 1, 1,125, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5, 5,25, 5,5, 5,75, 6, 6,25, 6,5, 6,75, 7, 7,25, 7,5, 7,75, 8, 8,25, 8,5, 8,75, 9, 9,25, 9,5, ou 9,75 x 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, ou 1014 UFC/mL ou esporos/g ou qualquer faixa ou outro valor dentro da mesma. De acordo com outra modalidade preferida,
9 / 14 qualquer uma espécie de esporo específica pode estar presente na formulação de esporos em uma concentração que pode estar na faixa de cerca de 1 x 105 UFC/mL a 1 x 1014 UFC/mL ou qualquer faixa específica dentro da mesma. A concentração preferida de qualquer uma espécie de esporo específica presente nas modalidades preferidas de formulações de esporos de acordo com a invenção pode ser de cerca de 1, 1,125, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5, 5,25, 5,5, 5,75, 6, 6,25, 6,5, 6,75, 7, 7,25, 7,5, 7,75, 8, 8,25, 8,5, 8,75, 9, 9,25, 9,5, ou 9,75 x 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, ou 1014 UFC/mL ou esporos/g ou qualquer faixa ou outro valor dentro da mesma. Preferivelmente, a formulação de esporos é biodegradável. De acordo com outra modalidade preferida, a formulação de esporos concentrada pode conter cerca de 1 a 9 x 109 ou 1010 UFC/mL ou esporos/g. De acordo com outra modalidade preferida, a formulação de esporos concentrada pode conter cerca de 1010 UFC/mL ou esporos/g.
[0022] De acordo com uma modalidade preferida de uma composição de chá probiótico, a composição compreende uma composição de nutrientes, uma formulação de esporos, e chá. De acordo com outra modalidade preferida ou uma composição probiótica para consumo humano, a composição compreende composição probiótica para consumo humano, a composição compreende uma composição de nutrientes, uma formulação de esporos, e um produto de alimento ou de bebida, como sopas, caldos de carne, molhos, chocolate quente. O mais preferivelmente, a composição de nutrientes e a formulação de esporos nestas modalidades são uma das modalidades descritas acima, ambas na forma de pó seco ou outra forma sólida seca. Qualquer variedade de chá ou de outro produto de alimento ou de bebida pode ser usada. O mais preferivelmente, o produto de alimento ou de bebida é um que é aquecido antes de ser consumido.
[0023] De acordo com um método preferido de prover chá probiótico para consumo humano, uma composição de nutrientes e uma formulação de
10 / 14 esporos são adicionadas a qualquer variedade de chá.
O mais preferivelmente, a composição de nutrientes e a formulação de esporos são uma das modalidades descritas acima.
De acordo com uma modalidade preferida, a composição de nutrientes, a formulação de esporos, e o chá ou outro produto de alimento ou de bebida são combinados em uma mistura antes de serem imergidos em água quente ou de outro modo aquecer o produto de alimento ou de bebida.
De acordo com outras modalidades preferidas, a composição de nutrientes, a formulação de esporos, e o chá podem ser componentes separados que são adicionados juntos à água quente para preparar o chá probiótico ou adicionados ao outro produto de alimento ou de bebida a ser aquecido ou já aquecido, ou qualquer combinação de dois dos componentes pode ser pré-misturada junta e adicionada ao terceiro componente antes ou depois da adição de água quente para preparar o chá probiótico ou antes ou depois do aquecimento do outro produto de alimento ou de bebida.
A ordem de adição dos três componentes e da água quente ou do alimento quente ou da bebida quente não é crítica e qualquer ordem pode ser usada.
Quando usada para chá, após mistura e adição dos três componentes, individualmente ou como uma combinação pré-misturada, com água quente, a mistura é permitida imergir, preferivelmente durante 2 a 10 minutos antes de ser consumida por um humano.
Dois minutos é a quantidade mínima de tempo de imersão, mas o tempo total pode variar com base no tipo de chá usado e na concentração do chá desejada pela pessoa que consumirá o chá probiótico.
Por exemplo, o chá verde é tipicamente imergido durante 2 a 4 minutos, enquanto que o chá de Oolong é tipicamente imergido durante 5 a 8 minutos.
O consumo é preferivelmente por ação de beber ou por ingestão oral de outro modo do chá probiótico.
O mais preferivelmente, a água quente está a uma temperatura na faixa de 42 a 100°C quando inicialmente adicionada aos outros componentes.
A temperatura da água quente é preferivelmente não abaixo de 42°C, e a faixa pode variar com base no tipo de chá sendo usado.
Por exemplo, o chá verde é
11 / 14 tipicamente imergido na faixa de 65 a 80°C e o chá preto é tipicamente imergido na faixa de 80 a 100°C.
[0024] Várias composições de acordo com as modalidades preferidas da invenção foram testadas de acordo com o método preferido da invenção. As composições, os métodos, e os resultados são descritos abaixo.
[0025] EXEMPLO 1 - Uma mistura probiótica de esporos de Bacillus (B. subtilis e B. licheniformis) em uma concentração final de aproximadamente 4 x 106 UFC/mL, onde UFC refere-se às unidades formadoras de colônias, e a composição de germinantes nutrientes de acordo com uma modalidade preferida da invenção compreendendo L-alanina (0,21 g), fosfato monossódico (0,14g), e fosfato dissódico (0,5g), foram adicionadas a aproximadamente 8 onças fluidas (237 centímetros cúbicos) de água de torneira em várias temperaturas.
[0026] A quantidade de esporos adicionada representa uma “dose” de 109 UFC de bactérias probióticas, conforme recomendada por um estudo de Saúde de Harvard. A quantidade de germinantes nutrientes usada representa a concentração mínima de germinantes necessária para iniciar a germinação. As temperaturas usadas representam uma faixa de temperaturas de imersão de chá.
[0027] Os esporos de cada reação foram observados no tempo 0 e após 60 minutos usando microscopia de contraste de fase. As lâminas foram preparadas usando procedimentos padrão. Os esporos foram vistos em um microscópio Olympus BX41 (lente objetiva de emersão em óleo 100X) e imageados usando uma câmera Olympus UC30 controlada pelo pacote de software cellSens Dimension.
[0028] A Figura 1 mostra imagens representativas destes testes no tempo 0 (isto é, imediatamente após a adição de água) e após 60 minutos na água. As manchas mais escuras mostram esporos germinados, as manchas mais claras mostram esporos não germinados. As imagens no grupo A
12 / 14 representam esporos que haviam sido germinados usando uma composição de germinantes nutrientes e aquecidos durante o período de incubação a 42°C de acordo com uma composição preferida e um método preferido da invenção. As imagens no grupo B representam esporos que haviam sido germinados usando uma composição de germinantes nutrientes e aquecidos durante o período de incubação a 65°C de acordo com uma composição preferida e um método preferido da invenção. As imagens no grupo C representam esporos que haviam sido germinados usando uma composição de germinantes nutrientes e aquecidos durante o período de incubação a 75°C de acordo com uma composição preferida e um método preferido da invenção. As imagens no grupo D representam esporos que haviam sido germinados usando uma composição de germinantes nutrientes e aquecidos durante o período de incubação a 85°C de acordo com uma composição preferida e um método preferido da invenção. As imagens no grupo E representam esporos que haviam sido germinados usando uma composição de germinantes nutrientes e aquecidos durante o período de incubação a 100°C de acordo com uma composição preferida e um método preferido da invenção.
[0029] Consideradas juntas, estas imagens mostram que os esporos de Bacillus são germinados nas composições e condições de modalidades preferidas da presente invenção.
[0030] EXEMPLO 2 - Uma mistura probiótica de esporos de Bacillus (B. subtilis e B. licheniformis) em uma concentração final de aproximadamente 4 x 106 UFC/mL e uma composição de germinantes nutrientes, de acordo com uma modalidade preferida da invenção, compreendendo L-alanina (0,21 g), fosfato monossódico (0,14g), e fosfato dissódico (0,5g), foram adicionadas a aproximadamente 8 onças fluidas (237 centímetros cúbicos) de água de torneira a 85°C. Um saco de chá contendo a variedade indicada de chá (chá preto ou chá verde conforme mostrado na Figura 2) foi imergido na água durante aproximadamente 3 minutos,
13 / 14 conforme recomendado pelo fabricante do chá. Após a imersão, os sacos de chá foram removidos enquanto que os esporos permaneceram na mistura a ser ingerida com uma dose probiótica.
[0031] Os esporos de cada reação foram observados após 60 minutos usando microscopia de contraste de fase. As lâminas foram preparadas usando procedimentos padrão. Os esporos foram vistos em um microscópio Olympus BX41 (lente objetiva de emersão em óleo 100X) e imageados usando uma câmera Olympus UC30 controlada pelo pacote de software cellSens Dimension.
[0032] A Figura 2 mostra imagens representativas destes testes após 60 minutos na água. As manchas mais escuras mostram esporos germinados, as manchas mais claras/mais brilhantes mostram esporos não germinados. As imagens superiores representam esporos germinados em chá preto imergido (Lipton™) enquanto que as imagens inferiores representam esporos germinados em chá verde imergido (Bigelow®).
[0033] Consideradas juntas, estas imagens mostram que os esporos de Bacillus são germinados nas composições e condições de modalidades preferidas da presente invenção e que os compostos que são extraídos do chá durante a imersão não mitigam o processo de germinação.
[0034] Embora os exemplos acima sejam com referência ao uso de composições probióticas com chá, as composições e os métodos da invenção podem ser usados(as) com outros tipos de produtos de alimento ou de bebida, como sopas, caldos de carne, ou chocolate quente. O mais preferivelmente, tais produtos de alimento e de bebida são líquidos ou fluidos e são consumidos após aquecimento, mas outros tipos de produtos de alimento e de bebida podem também ser usados.
[0035] Todas as quantidades de ingredientes ou as proporções de ingredientes aqui indicadas como uma faixa incluem cada quantidade ou proporção individual dentro daquelas faixas e qualquer uma e todas as
14 / 14 combinações de subconjunto dentro das faixas, incluindo subconjuntos que envolvem desde uma faixa preferida até uma faixa mais preferida.
Aqueles técnicos no assunto reconhecerão após leitura deste relatório descritivo, incluindo os exemplos aqui contidos, que modificações e alterações na composição e na metodologia para preparação da composição podem ser realizadas dentro do escopo da invenção e é pretendido que o escopo da invenção aqui revelado seja limitado apenas pela interpretação mais ampla das reivindicações anexadas às quais o inventor é legalmente intitulado.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição probiótica de alimento ou de bebida para consumo humano, a composição probiótica caracterizada pelo fato de que compreende: uma ou mais espécies de Bacillus na forma de esporo; um ou mais L-aminoácidos; qualquer variedade de produto de alimento ou de bebida que é aquecido antes de ser consumido; um ou mais tampões para manter o pH da composição quando adicionada à água em uma faixa de cerca de 6 a 8; e em que todos os ingredientes são GRAS (Geralmente Considerados como Seguros) para consumo humano sob as normas federais dos Estados Unidos.
2. Composição probiótica de alimento ou de bebida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os um ou mais L- aminoácidos são L-alanina, L-asparagina, L-valina, L-cisteína, um hidrolisado de proteína de soja, ou uma combinação dos mesmos.
3. Composição probiótica de alimento ou de bebida de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a composição compreende adicionalmente pelo menos um dos seguintes: (1) D-glicose, (2) D-frutose, (3) um osmoprotetor ou (4) uma fonte de íons de potássio.
4. Composição probiótica de alimento ou de bebida de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende adicionalmente pelo menos dois dos seguintes: (1) D-glicose, (2) D-frutose, (3) um osmoprotetor ou (4) uma fonte de íons de potássio.
5. Composição probiótica de alimento ou de bebida de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o tampão é um tampão fosfato.
6. Composição probiótica de alimento ou de bebida de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente cloreto de potássio.
7. Composição probiótica de alimento ou de bebida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que as espécies de Bacillus são uma ou mais dentre Bacillus licheniformis, Bacillus subtillis, Bacillus amyloliquiefaciens, Bacillus polymyxa, Bacillus thuringiensis, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus lentus, Bacillus clausii, Bacillus circulans, Bacillus firmus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus, Bacillus laevolacticus, Bacillus pumilus, Bacillus simplex, Bacillus sphaericus, Bacillus sonorensis, Bacillus, horneckiae, Bacillus axarquiensis, Bacillus mucilaginosus, Bacillus olivae.
8. Composição probiótica de alimento ou de bebida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que as espécies de Bacillus são Bacillus licheniformis, ou Bacillus subtilis, ou uma combinação das mesmas.
9. Composição probiótica de alimento ou de bebida de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que as espécies de Bacillus são duas cepas diferentes de Bacillus licheniformis e pelo menos uma cepa de Bacillus subtilis.
10. Composição probiótica de alimento ou de bebida de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a espécie de Bacillus compreende cerca de 40% de uma primeira cepa de Bacillus licheniformis, cerca de 40% de uma segunda cepa de Bacillus licheniformis, e cerca de 20% da pelo menos uma cepa de Bacillus subtilis.
11. Composição probiótica de alimento ou de bebida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o alimento ou a bebida é qualquer variedade de chá, café, chocolate quente, sopa, caldo de carne, ou molho.
12. Método de preparação de uma composição probiótica de alimento ou de bebida para consumo humano, o método caracterizado pelo fato de que compreende: aquecer (1) uma composição probiótica ou (2) pelo menos um componente da composição probiótica se pelo menos um componente é separado de um ou mais outros componentes, para uma temperatura na faixa de 42°C a 100°C; misturar os componentes da composição probiótica se eles estiverem separados; em que a composição probiótica compreende os seguintes componentes: uma ou mais espécies de Bacillus na forma de esporo, um ou mais L-aminoácidos, um ou mais tampões, e qualquer produto de alimento ou de bebida; em que um ou mais tampões mantêm o pH da composição probiótica em uma faixa de cerca de 6 a 8 quando o produto de alimento ou de bebida compreende água ou quando água é adicionada à composição probiótica; e em que todos os ingredientes em cada um dos componentes são GRAS (Geralmente Considerados como Seguros) para consumo humano sob as normas federais dos Estados Unidos.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a etapa de aquecimento compreende adicionar um líquido quente à composição probiótica ou o pelo menos um componente da composição probiótica.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os componentes da composição probiótica são misturados em um recipiente permeável à água e em que o produto de alimento ou de bebida é qualquer variedade de chá, e em que a etapa de aquecimento compreende; colocar o primeiro recipiente permeável à água dentro de um segundo recipiente com água quente; e imergir os componentes para formar um chá bebível.
15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os componentes probióticos são misturados em um primeiro recipiente permeável à água, e em que a etapa de aquecimento compreende colocar o primeiro recipiente permeável à água em um segundo recipiente com água quente em uma faixa de temperatura de 42 a 100°C.
16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a etapa de aquecimento compreende adicionalmente deixar o primeiro recipiente permeável à água no segundo recipiente com a água quente durante 2 a 10 minutos antes de o alimento ou a bebida probiótico ser consumido por um humano.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que o alimento ou a bebida é qualquer variedade de chá, café, chocolate quente, sopa, caldo de carne, ou molho.
18. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizada pelo fato de que a composição probiótica é em uma forma de pó ou sólida.
19. Composição de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o produto de alimento ou de bebida é um em que um líquido é adicionado antes de ser aquecido ou consumido.
20. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o alimento ou a bebida é qualquer variedade de chá, café, chocolate quente, sopa, caldo de carne, ou molho.
21. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o produto de alimento ou de bebida é aquecido para uma faixa de temperatura de 42 a 100°C antes de ser consumido.
22. Composição de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o alimento ou a bebida é qualquer variedade de chá, café, chocolate quente, sopa, caldo de carne, ou molho.
23. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma fonte de íons de potássio.
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