CN102123615A - 通过胃肠道中微生物的营养物温度诱导递送 - Google Patents
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Abstract
本发明大体上涉及健康和安宁领域。特别地,本发明涉及温度敏感微生物以及其用作制备递送化合物例如营养物到身体特定区域的组合物之载体的用途。
Description
本发明大体上涉及健康和安宁(well-being)领域。特别地,本发明涉及温度敏感微生物以及其用作制备递送化合物例如营养物(nutrient)到身体特定区域的组合物之载体的用途。
由于某些化合物或其食品制剂本身的特定性能,目前在食物基质中加入这些化合物可能是食品工业的挑战。例如,这些化合物可能是处理敏感性的,可能在储存或运输期间稳定性差,可能与其他食物成分相互作用导致例如脂质氧化和/或变色,可能具有对味道的有害影响,可能在胃液中稳定性差,和/或可能在肠中可用性差。
迄今为止已经开发了许多营养物递送载体,包括蛋白质复合物、植物油或凝胶珠。然而,由于湿度敏感性、食物基质不相容性、处理敏感性、从介质的渗漏以及在胃肠道中没有递送或递送差,它们的用途限于某些应用。
获得下面这样的载体将是有帮助的,该载体允许安全运送敏感化合物,特别是营养物,到身体的特定位置,同时克服了上述的问题。
胃肠道是摄取有机体为维持其健康和安宁所利用的营养化合物的主要器官。肠道中建群有合生(synbiotic)或互利共生微生物,例如拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、消化球菌属(Peptococcus)、消化链球菌属(Pepstreptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium),其主要的贡献之一是进行多种有益的功能,例如分解和促进食物吸收,刺激细胞生长,抑制有害细菌生长,训练免疫系统和抵御一些疾病。
过去,由于发现了一些菌株在摄入后对显示出人和动物的有价值性能,益生生物吸引了许多注意。益生菌被认为是促进个体健康的活微生物(细菌和酵母)。
最近,WO03053474公开了细菌,即乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属(Streptococci)、乳酸小球菌属(Pediococci)、肠球菌属(Enterococci)、乳球菌属(Lactococci)、酒球菌属(Oenococci)、葡萄球菌属(Staphylococci)、拟杆菌属,用于定向递送物质到肠的特定部分的用途。本发明公开了具有特异性和可能改变的对胃液和/或胆汁抗性的微生物用于实现此目的的用途。
但是,由于年龄、健康状态、个体间和种间差异,胃液和胆汁组合物有很大的变化性。为了将化合物递送到大范围的生物体内肠的多个位置,需要开发新的工具。
本发明提供了用于化合物的递送系统的技术,特别是用于将在消化后在身体内释放的营养物的递送系统的技术。另外,本发明在产品的生产和存储期间保护了处理敏感化合物,它确保化合物不与其他食物成分相互作用,导致例如脂质氧化和/或变色,并且其对味道具有积极的影响,对于食用是安全的,例如对于食品产品。
本发明人出人意料地发现,可通过独立权利要求的主题实现这一目的。
从属权利要求进一步发展了本发明。
本发明涉及温度敏感微生物,其在暴露于约32至45摄氏度的温度范围时完全或至少部分裂解,而且其可用作制备用于递送化合物,特别是营养物到身体部分,特别是胃肠道的组合物的载体。
在本发明的优选实施方案中,部分裂解表示至少10%,优选至少20%,更优选至少30%,最优选至少40%的微生物,理想地至少95%的温度敏感微生物在暴露于37摄氏度5分钟至24小时后裂解。如果全部微生物在暴露于37摄氏度下小于24小时后裂解,则是尤其优选的。如果全部温度敏感微生物在暴露于37摄氏度5分钟至24小时后裂解,则实现完全裂解。
至少部分裂解还包括细胞壁和或膜是通透和/或削弱的,使得所运载的化合物可离开细胞,同时一部分(细胞)群体可能保持存活的情况。
如果微生物在暴露于约32至45摄氏度范围的温度至少5分钟后至少部分裂解,则认为其是温度敏感的。
这些裂解测试可以在本领域技术人员已知的任何类型的微生物标准菌种生长培养基中进行。可使用例如YPD培养液。进行这些测试的实例在实施例2中给出。
本发明的一个实施方案是在约32至45摄氏度的温度范围中至少部分裂解的温度敏感微生物用作制备递送营养物到胃肠道的组合物之载体的用途。
该方法也允许化合物例如营养物在身体特定区域(例如胃肠道中)靶向释放,同时改善化合物的生物利用率。
可使用的微生物在32至45摄氏度的温度范围中至少部分裂解。优选使用微生物是食品级的食品应用。如果材料或微生物被批准用于人或动物食用,则其是“食品级”的。
在本发明的特别优选的实施方案中,微生物是酵母,例如低温诱导的(lti)酵母,优选食品级酵母,选自半子囊菌纲(hemiascetomycetous)酵母物种,子囊菌亚门(Ascomycotina)或半知菌亚门(Deuteromycotina)。
更优选地,酵母选自德巴利酵母属(Debaryomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)和红酵母属(Rhodotorula)。
例如,酵母可以是酿酒酵母(面包酵母)(Saccharomyces cerevisiae)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。
〔优选菌株有温度敏感酿酒酵母菌株CNCM I-4000、CNCM I-4001、CNCM I-4002、CNCM I-4003、CNCM I-4004、CNCM I-4005、CNCM I-4006、CNCM I-4007、CNCM I-4165、CNCM I-4166、CNCM I-4167、和/或CNCM I-4168和温度敏感马克斯克鲁维酵母菌株CNCM I-4009、CNCM I-4010、CNCM I-4011、CNCM I-4160、CNCM I-4161、CNCMI-4162、CNCM I-4163和/或CNCM I-4164,或其组合。
所有菌株按照布达佩斯条约保藏。
酵母具有下列优点,它们通常对产品的味道有积极的影响,易于产生并且有效积累由其菌种生长培养基提供或由它们合成的化合物。
在某些情况下,使用低温诱导(lti)酵母用于本发明目的甚至可能是优选的。Lti酵母描述于例如文献EP 0487878、EP 0663441或EP 1148121。Lti酵母在低温下不增殖,其具有以下优点,例如,在冷冻温度下基本不发生发酵。
或者,微生物也可以是细菌,特别是选自下列的:乳酸菌,特别是乳杆菌属和/或双歧杆菌属和,更优选约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、儒氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animais)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)或其混合物,最优选是来源于约氏乳杆菌菌株NCC 533(CNCM I-1225)、类干酪乳杆菌NCC2461(CNCM I-2116)、鼠李糖乳杆菌NCC4007(CGMC 1.3724)、青春双歧杆菌NCC 251(CNCM I-2168)、长双歧杆菌NCC 490(CNCM I-2170)、NCC 2705(CNCM I-2618)和NCC 3001(ATCC BAA-999)、乳酸双歧杆菌NCC 2818(CNCM I-3446)、短双歧杆菌NCC 2950(CNCM I-3865)、NCC 466(CNCM I-3914)的温度敏感性细菌。
细菌具有下列优点,它们易于大量产生,而且它们经常已经在肠中天然存在,使得身体不面对外源物种。
也可使用不同微生物的混合物。
这些温度敏感微生物可通过例如自然选择来鉴定。用于鉴定温度敏感微生物的一种可能的实验方案描述于实施例1b中。例如,可通过pkc1基因中的突变使得酵母成为温度敏感性的。
或者,微生物也可通过其他方法成为温度敏感性的。例如,微生物可以预先处理。这些预处理可包括减弱微生物的存活力,使得降低其总生长或持久表现。例如,合适的预处理可通过对微生物进行休克处理实现,例如分别将它们暴露于特定的热、低温或者低或高pH值的条件下,将其与将实现细胞早期裂解的噬菌体一起孵育,或将实现细胞早期裂解的重组构建物插入到微生物中,酶处理以损伤细胞壁,使用已知含有原噬菌体的微生物,使得它们处于不利于生长的特定发酵状态下,引发SOS应答或者使在调节或基因表达水平上修复受损胞内蛋白质的内在保护性应激-应答系统失活,使得所得微生物最终显示出存活力和/或对肠中环境条件/改变的抗性下降。
此外,例如可通过常规方法(化学或辐射诱导的诱变)和不想要突变的异型杂交从细菌或半子囊菌纲酵母物种获得温度敏感突变型,例如酿酒酵母(S.cerevisiae),乳酸克鲁维斯酵母(K.lactis)或粟酒裂殖酵母(S.pombe)。所需突变具有条件性温度敏感细胞裂解表型,其导致引入的营养物在高于30摄氏度下释放。文献中已经记载了8种这样的温度敏感突变体(cly1至cly8)(Hartwell,L.H.(1967)Macromolecule synthesis in temperature sensitive mutants of yeast J.Bact.93:1662-1670)。
合适的温度敏感酿酒酵母可选自下列突变株:遗传互补组cly 1、cly 2、cly 3、cly 4、cly 5、cly 6、cly 7、cly 8或其组合。
温度敏感酵母经常描述为在调节极性生长、分隔(septation)和/或细胞壁完整性维持的基因中有改变。
如果酵母是酿酒酵母,这些基因可以优选选自BCK1、CDC12、CDC15、CDC31、CDC24、GLC7、GPI7、HSF1、IQG1、KIC1、LST8、MID2、WSC1、MOT2、MPK1、MPT5、SSD1、MSS4、NUD1、PKC1、PMT2、PMT4、PPH22、PPZ1、PPZ2、RHO3和RHO4、ROM1、ROM2、SRB1、SWI4、SWM1、TIF51A、TSC11、TOR1、TCO89、TAP42、TOR2、BIG1、TUS1、VIG9、WSC1、WSC2、WSC3、YPK1、YPK2、YPK1、YKR2、7个酵母天冬酶,及其组合。
如果酵母是粟酒裂殖酵母,该基因优选选自ags1、bgs3、bgs4、cwg1、orb11、cps1、cwg1、cwg2、ehs1、PP2C、psu1、rgf1、rgf3、rho1、sid1、sid2、sid4、spg1和mob1,以及其组合。
温度敏感酿酒酵母菌株的一个典型实例是cly5突变体;酿酒酵母的靶基因是PKC1,其编码蛋白激酶C。2871位核苷酸的C至T的转换性突变导致958位氨基酸的从苏氨酸变化为异亮氨酸。改变的多肽为突变体赋予了温度敏感性:其在23-25摄氏度下培养时可生长并积累来自培养基的营养物(例如铁),但是在37摄氏度下酵母细胞不能复制并且将裂解,因为ts突变干扰了细胞壁的修复和生长能力。因此,与合适食品产品一起摄取的富含营养物的活突变体细胞将由于开始出芽而在身体内裂解,并且将在37摄氏度下在体内递送营养物。
如果使用lti-酵母(低温失活)菌株并且,例如通过如上所述方法之一使得其温度敏感,那么这将具有以下优点,这些lti-酵母菌株会导致在冷藏状态不发酵,同时仅仅在升高的温度下,例如室温或更高,lti-酵母菌株开始增殖。在更高的温度下,例如在高于35摄氏度的温度下,其将裂解并释放其有价值的内含物。
Lti酵母是本领域公知的。因此,EP 0,487,878描述了具有lti性能(换句话说在冷冻期间不是非常有活性的但是在这些温度下存活的性能)的酵母菌株(Lti是表述“低温失活(low-temperature inactive)”的缩写)用作面包制作生产用品的膨胀剂的用途,所述用品在冷冻保存后在烤箱中烘焙。
术语“lti”在说明书中理解为表示显示低温失活的酵母,即基本上无活性但是存活的性能,例如在生面团中,在生面团不冷冻的小于或等于14摄氏度的温度下,并且在含有麦芽糖的介质中高达18摄氏度下基本上没有活性。
因此,在本发明的一个实施方案中,温度敏感性微生物是lti酵母菌株,例如酿酒酵母菌株CNCM I-4006、CNCM I-4007、CNCM I-4167、CNCMI-4168、CNCM I-4165或CNCM I-4166或者马克斯克鲁维酵母菌株CNCMI-4160、CNCM I-4161、CNCM I-4162、CNCM I-4163或CNCM I-4164。
本发明的微生物递送的化合物可通过本领域已知的任何方式引入微生物。
将营养物引入微生物特别是引入酵母有不同的方式。酵母可天然摄取和积累存在于其生长环境中的分子,或者依靠其代谢活性合成和积累所述营养物。
也可通过改变其基因获得在正常培养条件下不由微生物特别是酵母积累或合成的所需物质的合成,例如通过对微生物进行随机诱变并选择表达较高量所需物质的突变体。另外,也可使用重组方式,其中通过例如下列方式增加内源或外源基因的表达,将相应基因与强于内源启动子的启动子相连,或者通过将编码一种或多种目的物质的一种或多种基因插入微生物中的质粒上或其染色体中,任选地与驱动一种或多种目的基因表达的强启动子相连使得重组微生物含有更高量的所需物质。
例如,可由微生物本身合成化合物,优选作为微生物天然代谢的一部分。
也可通过生物技术方式修饰微生物,例如,通过引入导致微生物产生载体所编码的目的化合物的表达载体。类似地,可通过例如引入强启动子增强微生物对化合物的天然合成。
微生物也可积累来自外界的待递送化合物。这些化合物可存在于微生物培养物的培养基中。例如,酵母天然积累许多微量营养物,例如矿物质和维生素。通过这种方法,例如可容易地制备富含硒的酵母,并且可用于补充膳食组合物,以治疗或预防硒缺乏。
当然也可使用这些方法的组合从而将目的化合物包含于可使用的微生物。
因此,在本发明的一个实施方案中,通过将微生物在富含化合物的培养基中培养,将化合物优选营养物引入微生物,优选酵母。
作为替代地或者另外地,微生物可合成化合物本身。
化合物可以是下述任何化合物,即微生物可合成的,可能是在生物技术修饰之后,或者可由微生物在生长和/或培养过程中摄取的。
但是,优选化合物是营养物。
营养物是用于生物体(人、宠物、伴侣动物和家畜)代谢的化合物。优选地,待递送的营养物是食用细胞裂解微生物的生物体自身不能合成或者生物体仅能合成不足量的化合物,使得它们必须从环境中摄取。如果其不能由生物体以充分的量合成并且必须从外部来源获得,则营养物是生物体所必需的。以相对较大的量需要的营养物称为常量营养物,以相对较小的量需要的则称为微量营养物。
本发明的微生物可用于递送常量营养物或微量营养物。
通常,营养物选自矿物质,优选铁、硒、锌、铬、铜;维生素,优选叶酸、烟酸、维生素C;植物多酚,优选儿茶精素、绿原酸、异黄酮;类胡萝卜素,优选β-胡萝卜素、虾青素、玉米黄素、番茄红素(lycopen);生物碱,优选咖啡因;氨基酸,优选半胱氨酸、必需氨基酸例如异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸;抗氧化剂;芳香族化合物,优选柠檬油、橙皮油、百里香、迷迭香油、牛至油(oregano oil)脂质,优选多不饱和脂肪酸、长链多不饱和脂肪酸、脂肪酰胺、甘油磷脂(glycerophospholipids)、甘油酯;酶和/或辅酶,优选辅酶Q10、β-半乳糖苷酶;非分泌性异源蛋白质,优选疫苗或其混合物。
因此,例如,微生物可以是温度敏感lti酵母,待递送化合物可以是常量营养物。
或者,微生物可以是温度敏感lti酵母,待递送化合物可以是微量营养物。
微生物可以是温度敏感lti酵母,待递送化合物可以是矿物质,例如铁、硒、锌、铬或铜,例如铁。
或者,微生物可以是温度敏感lti酵母,待递送化合物可以是维生素,优选叶酸、烟酸或维生素C。
另外或者,微生物可以是温度敏感lti酵母,待递送化合物可以是植物多酚,优选儿茶素、绿原酸或异黄酮。
另外或者,微生物可以是温度敏感lti酵母,待递送化合物可以是类胡萝卜素,优选β-胡萝卜素、虾青素、玉米黄素或番茄红素。
另外或者,微生物可以是温度敏感lti酵母,待递送化合物可以是生物碱,例如咖啡因。
微生物以消费者可接受的产品形式便利地递送,所述形式例如分别是可摄取的介质或支持物。
本发明的用途制备的组合物可以是预定用于人或动物用途的任何组合物。
优选地,组合物预定用于人、宠物、伴侣动物和/或家畜。
组合物可以是食品组合物、膳食补充剂、营养剂(nutraceutical)、饮料、动物饲料组合物、化妆品组合物或药物组合物。
典型的化妆品组合物包含例如美容补充剂,例如营养美容补充剂、营养化妆品、口部化妆品、营养补充剂、口部补充剂和口部皮肤和/或毛发护理产品。
典型的食物组合物可选自谷物产品,例如谷物条、儿童谷物和婴儿谷物或者冷藏乳制品例如奶酪、奶、发酵乳饮料、基于乳的发酵产品、凝乳、冰淇淋、酸牛乳、奶粉和加强粉末饮料例如婴儿配方奶和成长奶、饮料、运动营养品和饮料组合物、汤、厨房产品、宠物食品、片剂、液体细菌悬液、干的口服补充剂、湿的口服补充剂、用于干管喂饲(dry tube feeding)的组合物和/或用于湿管喂饲(wet tube feeding)的组合物。
这些组合物可以通过选择已经含有一种或多种待递送物质或者将修饰从而提供足够量的这类或这些物质的微生物来制备。
一旦选择以及任选地预处理微生物,则根据待递送物质的性质和各个微生物中所含物质的量,该微生物可以下述量包含在上述产品中,该量在非液体组合物的情况为104-1012cfu/g组合物干重,在液体组合物的情况为104-1012cfu/ml组合物。
然后,可通过本领域中已知的方法,例如用于益生菌的方法,将所含微生物引入食物基质。例如,可通过将富含铁的酵母生物质加入发酵的白色基层制备含有本发明所用微生物的酸牛乳。可通过将干谷物与干酵母粉末共同混合制备包含本发明所用微生物的婴儿谷物制品。
组合物还可含有保护性水状胶体(hydrocolloid)(例如树胶、蛋白质、改性淀粉)、粘合剂、成膜剂、包封剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、涂层、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油类、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、介质、填料、共同化合物、分散剂、润湿剂、处理助剂(溶剂)、流动活性剂(flowing agent)、掩味剂、增重剂、胶凝剂、成胶剂(jellifying agent)、抗氧化剂和抗微生物。
它们也可含有常规药物补充剂和佐剂、赋形剂和稀释剂,包括但不限于:水、任何来源的明胶、植物树胶、磺酸木质素(ligninsulfonate)、滑石、糖类、淀粉、阿拉伯树胶、植物油、聚亚烷基二醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、润滑剂、着色剂、润湿剂、填料等。
另外,它们可含有适于口服或经肠施用的有机或无机的介质物质,以及维生素、矿物微量元素及其他根据政府机构例如USRDA推荐的微量营养物。
本发明的组合物可含有蛋白质来源、脂肪来源和/或糖类来源,可以预定用于口、肠、肠胃外或局部施用。
如果组合物包含脂肪来源,脂肪来源更优选地提供5%至40%的组合物能量,例如20%至30%的能量。可添加DHA。可使用菜籽油、玉米油和高油酸葵花籽油的混合物获得合适的脂肪分布。
糖类来源可优选地提供40%至80%的组合物能量。可以使用任何合适的糖类,例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糖糊精和其混合物。
可使用任何合适的膳食蛋白质,例如动物性蛋白质(例如乳蛋白质、肉蛋白质和卵蛋白类);植物蛋白(例如大豆蛋白质、小麦蛋白质、稻蛋白质和豌豆蛋白质);游离氨基酸的混合物;或其组合。乳蛋白质例如酪蛋白和乳清,以及大豆蛋白质是特别优选的。
本发明组合物还可含有益生元(prebiotics)。
“益生元”表示促进肠中益生菌生长的食物物质。它们在胃和/或上肠道中不分解或者在摄取它们的人的胃肠道中吸收,但是它们由胃肠微生物区系和/或益生菌发酵(Gibson和Roberfroid,(1995),Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota:Introducing the Concept of Prebiotics,J.Nutr.125:1401-1412)。
“益生菌”表示对宿主的健康或安宁具有有益作用的微生物细胞制剂或微生物细胞的成分。(Salminen S等,(1999),Probiotics:how should they be defined.Trends Food Sci.Technol.10:107-10)。
可用于本发明范围的一些微生物具有益生菌的资格。
益生元的存在将支持温度敏感微生物存活直至它们受到高于32摄氏度的温度。
可用于本发明的益生元没有特别限制,包括所有促进益生菌生长的食物物质。优选地,其可选自寡糖类,任选地含有果糖、半乳糖、甘露糖;膳食纤维,特别是可溶性纤维、大豆纤维;菊粉;或其混合物。优选的益生元有果寡糖(FOS)、半乳寡糖(GOS)、异麦芽寡糖、木寡糖(XOS)、大豆寡糖、葡萄糖基蔗糖(glycosylsucrose,GS)、乳糖基蔗糖(lactosucrose,LS)、乳酮糖(LA)、巴拉金糖寡糖(palatinose-oligosaccharides,PAO)、麦芽糖寡糖(MOS)、树胶和/或其水解产物、果胶和/或其水解产物。
因此,可利用微生物和上述产品支持个体的安宁和/或治疗和/或预防疾病。
本发明的用途所制备的组合物还可用于改善营养物的稳定性,例如在生产或存储期间。
其也可用来降低待递送化合物例如营养物对组合物味道的可能的有害影响。
将目的化合物引入如上所述微生物内还会避免化合物与其他化合物相接触,例如食物基质中的,并由此防止不希望的相互作用。
另外,在使用本发明教导时化合物的温度依赖性释放会使得能够实现化合物例如营养物的靶向释放,优选在肠中或者消化道的特定位置。
另外,本发明的用途使其能够改善待递送化合物的生物接近性和/或生物利用率。
本领域技术人员会理解,它们可自由地组合本文所述本发明的全部特征,而不脱离所公开的本发明范围。
由下列实施例和附图显示本发明的其他优点和特征。
图1A显示在酿酒酵母裂解突变体中和野生型面包酵母中,当37摄氏度引发细胞裂解时,通过测量595nm处的相对发光单位(RLU)测得的胞内腺苷酸激酶(AK)释放(Levure Boulangère Bleue(LBB),ex.Lesaffre,Marcq en Baroeul,法国)。
图1B显示在马克斯克鲁维酵母裂解突变体中和野生型(L46)中,当37摄氏度引发细胞裂解时,通过测量595nm处的相对发光单位(RLU)测得的胞内AK释放。
图1C显示在粟酒裂殖酵母裂解突变体(Sp132)中和野生型对照(Sp968)中,37摄氏度下通过测量595nm处的相对发光单位(RLU)测得的胞内AK释放。
图2显示在非许可温度(37摄氏度)下,模拟十二指肠液中野生型和突变体酿酒酵母菌株的活细胞滴度和铁释放测量。
图3显示胃和小肠多区室模型示意图:(a)胃区室;(b)十二指肠区室;(c)空肠区室;(d)回肠区室;(e)基本单元;(f)玻璃套;(g)柔性壁;(h)旋转泵;(i)水浴;(j)蠕动泵;(l,m)pH电极;(n,o)注射器泵;(p)中空纤维装置。(来自Larrsson等(1997) Estimation of the bioavailability of phosphorus in cereals using a dynamic in vitro gastrointestinal
图4显示动态胃肠模型中添加了1.6%野生型或细菌裂解突变酵母的原味酸牛乳消化后,活酿酒酵母的百分比。
实施例
实施例1:细胞裂解酵母菌株的开发
a)酿酒酵母
Hartwell(Hartwell,L.H.(1967)Macromolecule synthesis in temperature sensitive mutants of yeast J.Bact.,93:,662-1670)所述的裂解突变体(cly1至cly8)(表1)获得自Yeast Genetic Stock Centre(UCLA Berkeley),现在并入到了ATCC(Rockville,Maryland,USA)。
表1:单倍体酿酒酵母细胞裂解菌株:
初始细胞裂解突变体(ex.YGSC):
YGSC突变体 基因型
269 a ade1 ade2 ura1 his7 lys2 tyr1 gal1 cly1-1
315 a ade1 ade2 ura1 his7 lys2 tyr1 gal1 ade9 cly2-1
X3124-4B a arg4 lys7 trp1 gal1 cly3-1
233 a ade1 ade2 ura1 his7 lys2 tyr1 gal1 ade cly4-1
254 a ade1 ade2 ura1 his7 lys2 tyr1 gal1 cly5-1
308 a ade1 ade2 ura1 his7 lys2 tyr1 gal1 cly6-1
X3119-2B a ura1 leu2 aro7 gal1 ade2 his2 lys cly7-1
197 a ade1 ade2 ura1 his7 lys2 tyr1 gal1 ade6 cly8-1
带有一系列营养突变型的这些菌株分别连续回交野生型菌株:接合型a(X2180-1A)或α(X2180-1B)(由Thomas R.Manney惠赠),以异型杂交所有营养突变型。
具有初始温度敏感性cly突变的原养分离子与带有相反接合型的样品纯合重构为二倍体(表2)。
表2:二倍体酿酒酵母细胞裂解菌株:
cly2:
CNCM I-4000 a/α cly2/cly2
cly3:
CNCM I-4001 a/α cly3/cly3
cly4:
CNCM I-4002 a/α cly4/cly4
cly5:
CNCM I-4003 a/α cly5/cly5
cly6:
CNCM I-4004 a/α cly6/cly6
cly8:
CNCM I-4005 a/α cly8/cly8
二倍体cly4/lti和cly8/lti双突变体
为了将细胞裂解(Cly)表型与低温失活(Lti)表型相组合,将带有初始温度敏感型cly4或cly8突变的原养单倍体分离子与相反接合型的带有低温失活突变的单倍体菌株杂交。
使得此二倍体合子形成孢子,分离同时具有两种突变的后代孢子,带有相反接合型的分离株重构形成带有cly和lti突变的纯合二倍体,由此同时显示(Cly和Lti)表型。
此系列的保藏菌株:
-DCL445 基因型:a/α cly4/cly4 lti/lti (CNCM I-4167)
-DCL448 基因型:a/α cly4/cly4 lti/lti (CNCM I-4168)
-DCL814 基因型:a/α cly8/cly8 lti/lti (CNCM I-4165)
-DCL869 基因型:a/α cly8/cly8 lti/lti (CNCM I-4166)
根据专利EP 1 148 121中所述的方法,将具有初始温度敏感性cly突变的原养分离子用于产生四倍体菌株,该专利的公开通过引用并入本文。
为了将细胞裂解(Cly)表型和低温失活(Lti)表型相组合,将对于交配型和cly突变来说纯合的二倍化原养分离子与如EP 1 148 121所述带有纯合低温失活突变且相反接合型纯合的二倍体分离子杂交。使得此四倍体合子形成孢子,分离显示Cly表型和Lti表型的二倍体分离子,带有相反接合型的分离株重构形成带有cly和lti突变的纯合四倍体,由此同时显示(Cly和Lti)表型。(表3)
表3:四倍体酿酒酵母细胞裂解菌株:
CNCM I-4006 a/a/α/α cly5/cly5/cly5/cly5
CNCM I-4007 a/a/α/α cly5/cly5/cly5/cly5 lti/lti/lti/lti
b)马克斯克鲁维酵母
诱变:马克斯克鲁维酵母菌株L46(CNCM I-4008)(来自Nestlé菌株库的天然分离株)在搅拌(200转/分钟)的5ml YPD(1%Difco Bacto酵母提取物、2%Difco Bacto蛋白胨、2%葡萄糖)中25摄氏度下预培养16小时。通过离心收获细胞,用无菌水清洗两遍。将细胞悬于5ml无菌水,在计数板(Bürki-Türk chamber,来自Assistent(Sondheim,德国))的帮助下确定细胞浓度。将含有2x108细胞的等分试样转移到微离心管,通过离心沉淀细胞,悬于1ml pH7的100mM磷酸钠缓冲液中。加入30μl的甲磺酸乙酯(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Buchs,瑞士)目录号M-0880),将管在30摄氏度下保持搅拌1小时。
再次沉淀细胞,用1ml水洗一遍,用1ml 5%五水合硫代硫酸钠(Fluka,Buchs,瑞士)目录号72048洗两遍。将存活细胞涂布于YPD平板(1%Difco Bacto酵母提取物、2%Difco Bacto蛋白胨、2%葡萄糖,由2%Difco Bacto琼脂固化)并培养产生菌落。将之复印到新的YPD平板,在37摄氏度下孵育,分离温度敏感克隆(在37摄氏度显示不生长)用于实施例2中所述的细胞裂解测定(表4)。
表4:马克斯克鲁维酵母野生型和细胞裂解菌株
初始马克斯克鲁维酵母分离株:L46
在细胞裂解测定中显示阳性反应的温度敏感性(ts)突变体例如:
CNCM I-4009
CNCM I-4010
CNCM I-4011
马克斯克鲁维酵母cly/lti双突变体
为了将细胞裂解(Cly)表型与低温失活(Lti)表型相组合,将实施例1B中所述的马克斯克鲁维酵母细胞裂解菌株CNCM I-4009在搅拌(200转/分钟)的5ml YPD(1%Difco Bacto酵母提取物、2%Difco Bacto蛋白胨、2%葡萄糖)中25摄氏度下预培养16小时。通过离心收获细胞,用无菌水清洗两遍。将细胞悬于5ml无菌水,在计数板(Bürki-Türk chamber,来自Assistent(Sondheim,德国))的帮助下确定细胞浓度。将含有2x108细胞的等分试样转移到微离心管,通过离心沉淀细胞,悬于1ml pH7的100mM磷酸钠缓冲液中。加入30μl的甲磺酸乙酯(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Buchs,瑞士)目录号M-0880),将管在30摄氏度下保持搅拌1小时。再次沉淀细胞,用1ml水洗一遍,用1ml 5%五水合硫代硫酸钠(Fluka,Buchs,瑞士)目录号72048洗两遍。将存活细胞涂布于YPD平板(1%Difco Bacto酵母提取物、2%Difco Bacto蛋白胨、2%葡萄糖,由2%Difco Bacto琼脂固化)并培养产生菌落。将之复印到新的YPD平板,在8摄氏度下孵育,分离低温失活克隆(在8摄氏度下3周显示不生长,但是转移到25摄氏度时恢复生长),再次检查以下两者的存在:37摄氏度下细胞裂解和低温失活表型。
此系列的保藏菌株:
KM5-L3(CNCM I-4160)
KM5-L7(CNCM I-4161)
KM5-L15(CNCM I-4162)
KM5-L18(CNCM I-4163)
KM5-L23(CNCM I-4164)
c)粟酒裂殖酵母
粟酒裂殖酵母野生型菌株968(接合型h90)由P.Munz(Bern,Berne,瑞士)惠赠;裂解菌株Sp132(mat h-cwg1-1 leu1-32)(Ribas,J.C等(1991)Isolation and Characterization of Schizosaccharomycespombe.Mutants Defective in Cell Wall(1-3)β-D-Glucan,J.Bact.173:3456-3462)由J.C.Ribas,Universidad de Salamanca,Salamanca,Spain惠赠。
实施例2:通过腺苷酸激酶活性测量检测细胞裂解表型
为了评估非许可温度下的细胞裂解,我们使用了市售ToxiLight测定(Cambrex Bio Science,Rockland,ME USA),其定量测定裂解细胞在上清中释放的细胞内腺苷酸激酶(AK)。
将酵母菌株在40ml YD培养基(0.5%Difco Bacto酵母提取物、1.5%葡萄糖)中预培养至600nm的光密度(OD)约为0.5-4.0。
通过离心收获细胞,悬于MV(0.67%无氨基酸酵母氮源Difco(Difco Yeast Nitrogen Base w/o amino acid)、2%葡萄糖、2%琥珀酸钠)至600nm的OD为1.0。在100ml锥形瓶中37摄氏度下搅拌(120转/分钟)孵育20ml此悬液。在所需的时间点,将20μl培养物转移到与发光相容的96孔平板,在565nm读取发光,其与释放的AK量成正比。37摄氏度下来自裂解和对照菌株的AK释放显示于图1A-1C。值得注意地,不同突变导致不同的细胞裂解速率,使得能够实现沿消化道不同位置的化合物靶向释放。
实施例3:分批发酵的酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母中的铁累积
富含铁的生物质获得自在1L,0.5%bacto酵母提取物(Difco),1.5%葡萄糖(Merck),和5、10、15、20和25mM柠檬酸铁(Sigma)中培养的酵母。在25摄氏度下3天后,收获细胞,在冷蒸馏水中清洗3遍,以除去未结合的铁盐。通过对灰分的ICP-AES(感应耦合等离子体原子发射光谱)确定铁负荷。通过在马弗炉中550摄氏度下8小时破坏有机物获得灰分。使用培养基中不同柠檬酸铁浓度的培养所导致的结合铁的值在表5中显示。
表5:补充柠檬酸铁培养基中分批条件下酿酒酵母野生型和突变株以及克鲁维酵母中的铁积累
n.d.:未测得
n.a.:不生长
实施例4:胃液模拟物中在非许可条件(37摄氏度)下酿酒酵母野生型和突变株的细胞裂解和铁释放
在胃液/十二指肠液模拟物中37摄氏度下在引发细胞裂解的碳源存在下测定酵母的铁释放(图2)。
5g铁负荷酵母生物质(水含量25%w/w)首先置于37摄氏度下搅拌的80ml含有0.23%猪胃蛋白酶(Sigma)、0.5%NaCl、2%葡萄糖,pH2的胃液模拟物中30分钟。30分钟后,离心沉淀酵母细胞,取出上清并用于ICP-AES测定铁释放。
对于酵母沉淀,加入含有0.2M,pH7的磷酸盐缓冲液中的0.27%胰酶制剂(Sigma)、0.54%胆汁提取物和2%葡萄糖的十二指肠液模拟物的溶液,在37摄氏度下搅拌下再将样品孵育24小时。
在0分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时和24小时取出样品等分试样,测定存活细胞滴度。在离心和用0.45μm注射器滤器过滤后的上清中测定释放的铁的量。
在系列稀释样品等分试样并涂布于YPD平板(1%Difco Bacto酵母提取物、2%Difco Bacto蛋白胨、2%葡萄糖,用2%Difco Bacto琼脂固化)后,测定活细胞滴度。
实施例5:动态体外胃肠模型(TIM-1)中添加酵母的酸牛乳的消化
模型由四个连续区室组成(图3),模拟胃、十二指肠、空肠和回肠。胃肠体外模型已有详细描述(Minekus等,(1995)A multicompartmental computer-controlled model simulating the stomach and the small intestine.Alternative to laboratory animals(ATLA),23:197-209)。每个区室由两个相连的基本单位形成,所述基本单位由具有内部柔性壁的玻璃套组成。将水从水浴泵入柔性壁周围的玻璃套,以控制单元内的温度和对柔性壁的压力。水压力的改变由计算机激活的旋转泵实现。这通过柔性壁的交替压缩和松弛实现了食糜的混合。区室由蠕动阀式泵相连,所述泵由三个相连的T形管组成,每个在内部具有分开的管样柔性壁。在开放位置,柔性壁利于食糜通过,如果对柔性壁外部施加压力,则阀闭合。通过调节阀-泵的三个部分的开放和闭合的次序实现蠕动泵工作。在每个蠕动周期期间,转移相同体积的食糜。蠕动循环的频率由计算机支配,使得能够控制食糜的流速。每个区室中体积由连接计算机的压力传感器监测。
胃和十二指肠区室装有pH电极。通过计算机,经注射器泵,释放水或1M HCl进入胃,或者通过释放水或1M NaHCO3进入十二指肠,来调节pH值。使用电脑控制的注射器泵调节胃电解质和酶、胆汁和胰液的分泌。空肠和回肠区室以中空纤维装置相连,以吸收来自食糜的消化产物和水,并调节系统(chime)中的电解质和胆汁盐浓度。
已经设计了计算机程序来接受得自动物或人志愿者体内研究的参数和数据,例如胃和十二指肠的pH曲线、不同区室的分泌速率、小肠的水吸收以及胃和回肠递送。为了控制食糜的通过,使用胃和回肠递送的幂指数公式,如下所述(Elashoff等(1982)Analysis of gastric juice emptying data.Gastroenterology,83:1306-1312)。
在实验开始时,将测试材料引入胃区室。测试餐由300g添加了5.5%葡萄糖和1.6%野生型或细胞裂解突变体酵母细胞(干重)的Hirz低脂原味酸牛乳组成。
通过注射器直接从区室中抽取收集胃液、十二指肠液和回肠液。在60分钟后(收集)胃液和十二指肠液,2和4小时后(收集)空肠液和回肠液。2、4和6小时后在瓶中收集回肠递送。2、4和6小时后收集空肠和回肠透析液,测定体积。结果显示于图4。
在胃肠系统中37摄氏度下,野生型菌株分裂,而突变体在相同条件下裂解。在动态体外系统中6小时后,仅回收到43%的细胞。
实施例6:包含富含铁的酵母的营养组合物的说明
酸牛乳组合物
g/100g
乳脂肪 3.730
乳 89.010
脱脂奶粉 1.980
淀粉 0.240
糖 2.360
发酵剂 2.505
富含铁的酵母 0.175
新鲜白芝士(cheese white)
g/100g
乳SNF 14.1530
蔗糖 7.4963
乳脂肪 2.3858
植物脂肪 1.7641
乳酸培养物 0.0019
维生素D3 0.0003
水 74.0236
富含铁的酵母 0.1750
婴儿配方
g/100g
蛋白质当量 1.40
酪蛋白 0.6
乳清蛋白 0.8
糖类 7.0
乳糖 1.3
葡萄糖 0.2
麦芽糖 2.1
多糖 3.5
脂质 3.6
饱和的 1.4
单不饱和的 1.7
多不饱和的 0.5
其他 0.1
富含铁的酵母 0.175
水 87.725
Claims (15)
1.在约32至45摄氏度的温度范围中至少部分裂解的温度敏感微生物的用途,其用作制备递送化合物,特别是营养物到身体的部分,特别是胃肠道的组合物的载体。
2.根据权利要求1的用途,其中微生物是酵母,例如低温诱导的酵母,优选食品级酵母,其选自半子囊菌纲酵母物种、子囊菌亚门或半知菌亚门,更优选地,酵母选自德巴利酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、酵母属、耶氏酵母属、接合酵母属、假丝酵母属和红酵母属,优选地酵母可以是酿酒酵母(面包酵母),更优选温度敏感酿酒酵母菌株CNCM I-4000、CNCM I-4001、CNCM I-4002、CNCM I-4003、CNCMI-4004、CNCM I-4005、CNCM I-4006、CNCM I-4007、CNCM I-4165、CNCM I-4166、CNCM I-4167和/或CNCM I-4168,或者温度敏感马克斯克鲁维酵母菌株CNCM I-4009、CNCM I-4010、CNCM I-4011、CNCM I-4160、CNCM I-4161、CNCM I-4162、CNCM I-4163和/或CNCM I-4164;或者细菌,特别选自乳酸菌,特别是乳杆菌属和/或双歧杆菌属,更优选约氏乳杆菌、儒氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、假小链双歧杆菌、链状双歧杆菌或其混合物,最优选是来源于约氏乳杆菌菌株NCC 533(CNCM I-1225)、类干酪乳杆菌NCC2461(CNCM I-2116)、鼠李糖乳杆菌NCC4007(CGMC 1.3724)、青春双歧杆菌NCC 251(CNCM I-2168)、长双歧杆菌NCC 490(CNCM I-2170)、NCC 2705(CNCM I-2618)和NCC 3001(ATCC BAA-999)、乳酸双歧杆菌NCC 2818(CNCM I-3446)、短双歧杆菌NCC 2950(CNCM I-3865)、NCC 466(CNCM I-3914)的温度敏感性细菌或其混合物。
3.根据前述任一项权利要求的用途,其中温度敏感微生物由自然选择获得。
4.根据前述任一项权利要求的用途,其中酵母由于pkc1基因中的突变而温度敏感。
5.根据前述任一项权利要求的用途,其中温度敏感酿酒酵母选自下列突变株:遗传互补组cly 1、cly 2、cly 3、cly 4、cly 5、cly 6、cly 7、cly 8或其组合。
6.根据前述任一项权利要求的用途,其中酵母是酿酒酵母并且由于调节极性生长、分隔和/或细胞壁完整性维持的基因中的变化而温度敏感,其中所述基因优选选自BCK1、CDC12、CDC15、CDC31、CDC24、GLC7、GPI7、HSF1、IQG1、KIC1、LST8、MID2、WSC1、MOT2、MPK1、MPT5、SSD1、MSS4、NUD1、PKC1、PMT2、PMT4、PPH22、PPZ1、PPZ2、RHO3和RHO4、ROM1、ROM2、SRB1、SWI4、SWM1、TIF51A、TSC11、TOR1、TCO89、TAP42、TOR2、BIG1、TUS1、VIG9、WSC1、WSC2、WSC3、YPK1、YPK2、YPK1、YKR2、7个酵母天冬酶及其组合,和/或其中酵母是粟酒裂殖酵母且由于调节极性生长、分隔和/或细胞壁完整性维持的基因中的变化而温度敏感,其中所述基因优选选自ags1、bgs3、bgs4、cwg1、orb11、cps1、cwg1、cwg2、ehs1、PP2C、psu1、rgf1、rgf3、rho1、sid1、sid2、sid4、spg1和mob1以及其组合。
7.根据前述任一项权利要求的用途,其中温度敏感微生物是lti酵母。
8.根据前述任一项权利要求的用途,其中营养物选自矿物质,优选铁、硒、锌、铬、铜;维生素,优选叶酸、烟酸、维生素C;植物多酚,优选儿茶精素、绿原酸、异黄酮;类胡萝卜素,优选β-胡萝卜素、虾青素、玉米黄素、番茄红素;生物碱,优选咖啡因;氨基酸,优选半胱氨酸、必需氨基酸例如异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸;抗氧化剂;芳香族化合物,优选柠檬油、橙皮油、百里香、迷迭香油、牛至油;脂质,优选多不饱和脂肪酸、长链多不饱和脂肪酸、脂肪酰胺、甘油磷脂、甘油酯;酶和/或辅酶,优选辅酶Q10、β-半乳糖苷酶;非分泌性异源蛋白质,优选疫苗或其混合物。
9.根据前述任一项权利要求的用途,其中通过将酵母在富含化合物的培养基中培养和/或通过酵母自身合成化合物将这些化合物特别是营养物引入酵母。
10.根据前述任一项权利要求的用途,其改善化合物的稳定性,特别是营养物的稳定性,和/或减少化合物,特别是营养物对味道的有害影响。
11.根据前述任一项权利要求的用途,其限制化合物特别是营养物与其他化合物的相互作用。
12.根据前述任一项权利要求的用途,其实现化合物特别是营养物的靶向释放,优选靶向释放到肠,或者靶向释放到消化道中特定位置。
13.根据前述任一项权利要求的用途,其改善化合物特别是营养物的生物接近性和/或生物利用率。
14.酵母菌株,其选自:CNCM I-4000、CNCM I-4001、CNCM I-4002、CNCM I-4003、CNCM I-4004、CNCM I-4005、CNCM I-4006、CNCM I-4007、CNCM I-4165、CNCM I-4166、CNCM I-4167、CNCM I-4168、CNCM I-4009、CNCM I-4010、CNCM I-4011、CNCM I-4160、CNCM I-4161、CNCM I-4162、CNCM I-4163和CNCM I-4164。
15.包含权利要求14的一个或多个酵母菌株的食物组合物。
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