CN108546331A - 酶-金属有机框架复合膜的制备方法及修饰电极生物传感的应用 - Google Patents

酶-金属有机框架复合膜的制备方法及修饰电极生物传感的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶‑金属有机框架复合膜的制备方法及修饰电极生物传感的应用。将葡萄糖氧化酶溶液与含金属离子的第一配体溶液混合，后加入第二配体溶液，使葡萄糖氧化酶和两种配体混合液在常温下反应特定时间，得到GOx‑ZIF‑8悬浊液；然后将悬浊液离心并洗涤后滴涂在金电极表面，获得所述酶‑金属有机框架复合膜修饰电极。本发明实现了酶‑金属有机框架复合膜修饰电极的制备，具有高的酶固定能力和传质效率，修饰电极表现出优良的循环稳定性、耐高温、耐有机溶剂以及长时间储存稳定性，应用于红酒中葡萄糖检测获得满意结果，适用于常规和几种特种检测环境，在检测领域具有可观的应用前景。

Description

酶-金属有机框架复合膜的制备方法及修饰电极生物传感的 应用
技术领域
本发明涉及制备高性能复合膜修饰电极的新方法和应用，具体涉及了一种酶-金属有机框架复合膜的制备方法及修饰电极生物传感的应用，能高效酶固定及生物传感检测。
背景技术
生物分子固定是构建生物传感器的关键要素之一。固定效率通常需要考虑生物分子的负载量和传质效率，同时，防止生物分子泄漏与失活也十分重要。常见的有两种固定方法，即固定在基质的表面或者内部。前者通过物理、化学以及生物的方法在二维表面固定生物分子。这种方法使得生物分子直接接触本体溶液，传质效果良好，但由于生物分子对周围环境的敏感性，使得整体性能会受限于生物分子固定量以及耐受性；相反，固定在基质内部可以拥有高的固定效率并提升耐用性，但在传质效率方面受到影响。因此，发展可以满足所有要求的固定方法仍然面临挑战。同时，对于内部固定方法(如预包埋)，常用基质为一些无定形聚合物，在孔隙率和硬度方面性能较差，因此，引入具有多孔性及高硬度的固定基质并结合基质内部固定方法，有望提高固定效率。
金属有机框架材料(MOFs)是一种由金属离子/簇和芳香酸或碱的氮、氧多齿有机配体通过配位作用形成的立体网络结构晶体材料。MOFs具有大的比表面积以及孔隙率，良好的热/化学稳定性，被广泛应用于气体存储，催化，药物传递，传感，分子分离等领域。但因为多数MOFs是在水热条件下合成的具有规整结构的晶态物质，这限制其原位固定生物分子的应用。近来的报道表明：MOFs可以在生物分子存在的情况下以仿生矿化的方式生长，由此得到大量的生物分子-MOFs复合物被用于各个领域。得益于MOFs的稳定的多孔结构，生物分子可以得到保护，避免构象转变以及有害物质的侵害。因此，将生物分子固定在MOFs中表现出巨大的应用前景，如应用于生物传感和生物催化领域。然而，近来的研究主要集中于溶液中的MOFs生物复合物的应用，将其用于固体表面(如电极)及相关应用少有研究。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，我们提出了一种酶-金属有机框架复合膜的制备方法及修饰电极生物传感的应用，是一种新颖且简单地制备GOx-ZIF-8膜修饰电极用来发展检测性能稳定的电化学传感器的方法。这些将有助于发展高效酶固定的方法及修饰电极更广泛检测应用。
本发明采用的技术方案包括如下步骤：
1)将葡萄糖氧化酶(GOx)溶液与第一配体溶液混合，后加入第二配体溶液，在特定温度下反应特定时间，使得金属离子和2-甲基咪唑生成金属有机框架材料(MOFs)，同时包埋有大量葡萄糖氧化酶，得到GOx-ZIF-8悬浊液；离心并用去离子水清洗三次，最后取沉淀用去离子水分散，得到GOx-ZIF-8的分散液；
2)使用干净的电极，取一定体积的GOx-ZIF-8的分散液滴涂到电极表面，干燥后在金电极表面获得所述酶-金属有机框架复合膜。
所述的第一配体溶液采用包含Zn2+金属离子的水溶液，第二配体溶液采用2-甲基咪唑的水溶液。
所述葡萄糖氧化酶溶液、第一配体溶液和第二配体溶液的体积比为1:10-1.5:1，葡萄糖氧化酶溶液的浓度范围为0.5mg mL-1-10mg mL-1；两种配体溶液等体积，第一配体溶液中Zn2+的浓度范围为5mM-40mM，第二配体溶液中2-甲基咪唑的浓度范围为100mM-2M。
所述步骤1)中的反应温度为4-40摄氏度，反应时间为0.01-2小时。
所述步骤1)中的离心速度为5000-10000rpm，离心时间为0.01-0.4小时。
所述步骤2)中的电极为但不限于金电极。
所述步骤2)中的GOx-ZIF-8的分散液体积范围为：2-40μL。
生长的金属有机框架物为ZIF-8，但金属有机框架物为但不限于ZIF-8。
所用的酶为但不限于葡萄糖氧化酶。
本发明还涉及酶-金属有机框架复合膜在电化学生物传感检测的应用。
本发明制备后通过循环伏安法、计时电流法等电化学方法检测所得复合膜修饰电极对目标检测物的响应信号，计算出目标检测物浓度。
现有金属有机框架材料复合膜制备中和本发明的加入顺序不同，通常是先混合第一配体溶液和第二配体溶液再加入酶(GOx)溶液，或是三者的直接混合，并且多是采用高温和有机相的环境反应，主要在光学领域应用。而本发明特殊将葡萄糖氧化酶(GOx)溶液和第一配体溶液先混合，再加入第二配体溶液，并且采用常温和水相环境反应，制备获得了相应形貌尺寸的GOx-ZIF-8产物及其酶-金属有机框架复合膜，另一特殊在于所获得的复合膜在有机相和高温环境中性能稳定，能够用于电化学生物传感检测。
本发明的实施例将上述制备的GOx-ZIF-8滴干在电极表面获得所述酶-金属有机框架复合膜修饰的酶电极，通过构建三电极系统测试其生物催化性能、操作及储存稳定性，应用于极端环境下检测和实际样品中检测。同时通过电子显微镜、X射线衍射、紫外-可见分光光度计、傅里叶红外光谱对所制备的复合物材料进行系统的表征。
基于仿生矿化效应，本发明所制备的GOx-ZIF-8平均粒径约为800nm，对葡萄糖氧化酶的负载量达89％，所得生物复合膜在电极表面具有良好的传质效率。相比常规同类传感器，基于本发明的生物传感器适用于第一代和第二代生物传感模型检，检测限低至微摩尔每升级别，与同类传感器的性能相当或更优。更重要地是，本发明技术涉及到金属有机框架对酶的优异保护作用，基于本发明的生物传感器表现出良好的循环稳定性，耐热、有机溶剂处理稳定性等。基于本发明的生物传感器可实现更灵敏和更复杂环境下的检测。
具体地，本发明制备的酶-金属有机框架复合膜修饰电极具有以下优点：
1、通过仿生矿化方法制备，仅需混合相应反应物、清洗和滴涂步骤，操作简便。
2、酶-金属有机框架复合膜表现出高的酶负载量以及传质效率。
3、所得的生物传感器对重复检测、极端外界环境及储存时间表现出出色的耐受性。
4、所得的生物传感器在第一代和第二代生物传感模型检测葡萄糖方面表现良好。
综合来说，本发明实现了酶-金属有机框架复合膜修饰电极的制备，具有高的酶固定能力和传质效率，修饰电极表现出优良的循环稳定性、耐高温、耐有机溶剂以及长时间储存稳定性，应用于红酒中葡萄糖检测获得满意结果。
本发明技术制备步骤简便、成本低，适用于常规和几种特种检测环境，在检测领域具有可观的应用前景。
附图说明
图1是本发明的原理图。
图2是金属有机框架(ZIF-8)和酶-金属有机框架复合物(GOx-ZIF-8)的扫描电镜图。
图3是模拟ZIF-8，ZIF-8，GOx-ZIF-8的XRD图。
图4是0.5mg mL-1GOx溶液(2倍稀释)(1)，480mM的2-甲基咪唑溶液(2)，8mM六水合硝酸锌溶液，GOx-ZIF-8悬浊液离心后的上清液(4)的紫外可见吸收光谱图。
图5是裸金电极(1)GOx-ZIF-8修饰的金电极(2)在pH为7.4的PBS中，0.7V(相对于饱和甘汞电极)的外加电压条件下对加入1mM和2mM过氧化氢(H2O2)的计时安培响应值。
图6是GOx-ZIF-8修饰的金电极在pH为7.4的PBS中，0.7V(相对于饱和甘汞电极)的外加电压条件下对加入葡萄糖的计时安培响应值。
图7是GOx-ZIF-8修饰的金电极在pH为7.4的PBS中，0.7V(相对于饱和甘汞电极)的外加电压条件下对加入葡萄糖的计时安培响应值校准曲线。
图8是GOx-ZIF-8修饰的金电极在pH为7.4的含有1mM K4Fe(CN)6和1mM K3Fe(CN)6的PBS溶液中的不同圈数的循环伏安图。
图9是GOx-ZIF-8修饰的金电极在PBS(4℃)中的不同存储时间其对葡萄糖响应电流与初始值的比率。
图10是GOx-ZIF-8修饰的金电极在pH为7.4的含有1mM对苯琨以及0，2，4，6，8，10mM葡萄糖的PBS中循环伏安图及校准曲线(插图)，扫速为0.1V s-1。
图11是GOx-ZIF-8修饰的金电极在90℃热水(A)和丙酮(B)处理后对葡萄糖的记时安培响应值(多次重复)与初始状态的比值。
图12是GOx(1)，GOx-ZIF-8，GOx-ZIF-8(丙酮处理)，GOx-ZIF-8(90℃热水处理)，ZIF-8的傅里叶红外光谱图。
图13是GOx-ZIF-8修饰的金电极在pH为7.4的PBS中，0.7V(相对于饱和甘汞电极)的外加电压条件下对依次加入的1mM葡萄糖，1mM果糖，1mM乳糖，1mM麦芽糖，1mM半乳糖以及1mM甘露糖的计时安培响应值。
具体实施方式
下面将结合附图及具体实施例对本发明做进一步详细说明。
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明技术方案，下面结合实施实例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
本发明的实施例如下：
原位制备GOx-ZIF-8复合膜及表征
将120μL，6mg mL-1的GOx溶液与300μL，19.2mM的六水合硝酸锌溶液混合，随后加入300μL，1.152M的2-甲基咪唑溶液，震荡10s后在常温下静置30min。随后，将形成的悬浊液离心去除上清液得到沉淀物，加入去离子水，重复洗三次。最后加入120μL去离子水分散清洗后的沉淀物。
清洗获得干净金电极：将金电极依次在砂纸、0.5μm和0.05μm直径的氧化铝粉末中打磨，再用去离子水、无水乙醇、去离子水超声交替清洗各5分钟，配置体积比为1:3的30％过氧化氢和浓硫酸混合液，滴加在电极表面，保持15s，再用去离子水清洗；将电极置于0.5MH2SO4溶液中依次通过恒电位(2V,5s；-0.35V,10s)和循环伏安法(-0.35～1.55V,4V s-1,6圈)处理；最后用去离子水清洗电极。
取20μL上述获得的GOx-ZIF-8的分散液滴涂到干净的金电极表面，常温下干燥得到GOx-ZIF-8复合膜，如图1所示。
实施例的实验测试如下：
1、GOx-ZIF-8复合膜表征
用场发射扫描电镜观察单一金属有机框架(ZIF-8)和制备获得的GOx-ZIF-8复合膜的情况，对比如图2所示。结果显示，相比于ZIF-8(图2A)(其制备过程同GOx-ZIF-8，其余条件不变，将GOx溶液换成去离子水，具体如下：将120μL的去离子水溶液与300μL，19.2mM的六水合硝酸锌溶液混合，随后加入300μL，1.152M的2-甲基咪唑溶液，震荡10s后在常温下静置30min)，复合物(图2B)的尺寸约为其四倍，说明生物矿化作用加速晶体生长。同时可以发现，相比于ZIF-8清晰的边界，GOx-ZIF-8颗粒之间呈现黏连的状态，这有可能是一些小尺寸的GOx-ZIF-8，ZIF-8或者是一些非晶产物的作用。
XRD图(图3)中可以看出尽管GOx促进ZIF-8的快速生长，但GOx-ZIF-8的晶体衍射峰相比于模拟以及合成的ZIF-8的粉末衍射峰没有变化，表明合成的是GOx-ZIF-8的复合物。
2、固定效率
通过紫外分光光度计来测定制备复合物过程中酶的固定效率。分别测100μL，0.5mg mL-1的GOx溶液，480mM的2-甲基咪唑溶液，8mM的六水合硝酸锌溶液，以及GOx-ZIF-8悬浊液离心后的上清液在吸收光谱图，如图4。六水合硝酸锌溶液，2-甲基咪唑溶液在280nm波长处的吸收峰可以忽略，GOx-ZIF-8上清液的吸光值为0.076±0.004，是对照GOx溶液吸光值的11％(0.673±0.001)(上述吸光值均为2倍稀释)，表明制备复合物过程中对1mg mL-1的GOx固定效率为89％。
3、传质效率
采用三电极电化学系统，GOx-ZIF-8修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，碳棒为对电极，通过滴加1mM，2mM的H2O2溶液，测试电极对于H2O2的计时安培响应值，以此来计算传质效率。如图5所示，GOx-ZIF-8修饰的金电极对H2O2的响应值为16±0.7μAmM-1，而同样条件下，裸金电极对H2O2的响应值为46±0.1μA mM-1，计算可得出制备的复合膜的传质效率为35％。
4、GOx-ZIF-8复合膜用于构建第一代酶生物传感器
采用三电极电化学系统，GOx-ZIF-8修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，碳棒为对电极，依次向10mL反应液(PBS)中滴加10μM，100μM，1mM的葡萄糖溶液，获得该条件下酶电极对葡萄糖响应的计时安培响应曲线(图6)，第一代酶生物传感器，葡萄糖被葡萄糖氧化酶催化产生H2O2，H2O2随即被电极氧化会得到相应的响应电流。通过相应计算拟合得到校准曲线(图7)。所得酶电极检测葡萄糖的灵敏度为21μA cm-2mM-1，线性范围是10-1555μM，检测限(S/N＝3)为2.2μM。
连续测试稳定性
采用三电极电化学系统，GOx-ZIF-8修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，碳棒为对电极，通过循环伏安扫描测试GOx-ZIF-8修饰电极的稳定性。如图8所示，200次循环后，酶修饰电极的循环伏安曲线保持不变，表明连续检测的可行性。
储存稳定性
采用三电极电化学系统，GOx-ZIF-8修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，碳棒为对电极，连续多天测试酶电极对葡萄糖催化的计时安培响应值，电极不用时保存在4℃的PBS中，保存54天后酶电极对葡萄糖的响应性能基本保持不变(图9)。
5、GOx-ZIF-8复合膜用于构建第二代酶生物传感器
采用三电极电化学系统，GOx-ZIF-8修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，碳棒为对电极，首先在10mL反应液(PBS)中加入1mM对苯琨(BQ)作为电子酶介体，随后依次加入2mM葡萄糖溶液，可以发现随着葡萄糖浓度的增加(图10)，0.1/0V附近的氧化峰值不断增加，还原峰值不断减小，且氧化峰电流的增加幅度和葡萄糖浓度递增幅度有明显的正线性关系，这些表明，可以通过简单加入电子酶介体来制备第二代酶生物传感器。
6、酶-金属有机框架复合膜修饰电极在不同环境下的检测应用
热/有机溶剂稳定性
将制备的酶-金属有机框架复合膜修饰电极置于90-℃热水中浸泡1h(图11A)，或用丙酮浸泡1h(图11B)，在这些处理之后，经过7次电化学测试仍可保持原有的催化性能。傅里叶红外光谱(图12)显示出处理前后所得复合物中蛋白质在1653cm-1处的酰胺Ⅰ带特征峰，来源于C＝O的伸缩振动。
7、选择性及红酒中葡萄糖检测应用
采用三电极电化学系统，GOx-ZIF-8修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，碳棒为对电极，依次向10mL反应液(PBS)中滴加1mM葡萄糖溶液，1mM果糖溶液，1mM乳糖溶液，1mM麦芽糖溶液，1mM半乳糖溶液以及1mM甘露糖溶液，可以发现，所得的复合膜修饰的电极表现出优异的抗干扰性能，添加干扰物质后得到的电流响应值均小于加入葡萄糖后电流响应值的3％(图13)。进一步探究所得复合膜修饰电极对红酒样品中葡萄糖检测的可能性。利用高效液相色谱法对样品进行检测，葡萄糖含量为27.61±0.01mM(n＝3)，酶电极的检测结果为27.42±1.51mM(n＝3)，表现出较好的一致性。表明本发明生物传感器适应于实际样品检测，具有较好的应用前景。

Claims (10)

1.一种酶-金属有机框架复合膜的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将葡萄糖氧化酶溶液与第一配体溶液混合，后加入第二配体溶液，在特定温度下反应特定时间，使得金属离子和2-甲基咪唑生成金属有机框架材料，同时包埋有葡萄糖氧化酶，得到GOx-ZIF-8悬浊液；离心并用去离子水清洗三次，最后取沉淀用去离子水分散，得到GOx-ZIF-8的分散液；
2)使用干净的电极，取GOx-ZIF-8的分散液滴涂到电极表面，干燥后在金电极表面获得所述酶-金属有机框架复合膜。
2.根据权利要求1所述的一种酶-金属有机框架复合膜的制备方法，其特征在于：所述的第一配体溶液采用包含Zn2+金属离子的水溶液，第二配体溶液采用2-甲基咪唑的水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种酶-金属有机框架复合膜的制备方法，其特征在于：所述葡萄糖氧化酶溶液、第一配体溶液和第二配体溶液的体积比为1:10-1.5:1，葡萄糖氧化酶溶液的浓度范围为0.5mg mL-1-10mg mL-1；两种配体溶液等体积，第一配体溶液中Zn2+的浓度范围为5mM-40mM，第二配体溶液中2-甲基咪唑的浓度范围为100mM-2M。
4.根据权利要求1所述的一种酶-金属有机框架复合膜的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的反应温度为4-40摄氏度，反应时间为0.01-2小时。
5.根据权利要求1所述的一种酶-金属有机框架复合膜的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的离心速度为5000-10000rpm，离心时间为0.01-0.4小时。
6.根据权利要求1所述的一种酶-金属有机框架复合膜的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的电极为但不限于金电极。
7.根据权利要求1所述的一种酶-金属有机框架复合膜的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中的GOx-ZIF-8的分散液体积范围为：2-40μL。
8.根据权利要求1-7任一所述的一种酶-金属有机框架复合膜的制备方法，其特征在于：生长的金属有机框架物为ZIF-8，但金属有机框架物为但不限于ZIF-8。
9.根据权利要求1-7任一所述的一种酶-金属有机框架复合膜的制备方法，其特征在于：所用的酶为但不限于葡萄糖氧化酶。
10.根据权利要求1-7任一所述方法制备获得的酶-金属有机框架复合膜的应用，其特征在于：所述酶-金属有机框架复合膜在电化学生物传感检测的应用。
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