CN103937488A - 基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器及制法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米结构的荧光化学传感器领域，特别涉及基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器及其制备方法，以及该荧光化学传感器的应用。所述的碱性磷酸酶荧光化学传感器是表面修饰有对碱性磷酸酶具有选择性荧光响应的磷酸化荧光素分子的硅纳米线或硅纳米线阵列荧光化学传感器。所述的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器可用于含有碱性磷酸酶分子的溶液体系中的碱性磷酸酶分子的检测；从硅纳米线阵列上刮下来的单根硅纳米线的荧光化学传感器，在单细胞水平上碱性磷酸酶分子的检测上有广泛的应用前景，为直接检测细胞内碱性磷酸酶的活性提供了一种新的传感器。
Description
技术领域
本发明属于纳米结构的荧光化学传感器领域，特别涉及基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器及其制备方法，以及该荧光化学传感器的应用。
背景技术
碱性磷酸酶是一种磷酸水解酶，广泛分布于人体各脏器器官中，其中在肝脏、骨骼和肾脏中含量较多。血清中碱性磷酸酶的含量异常与骨骼疾病、肝功能异常、糖尿病等众多疾病有关。目前，用于碱性磷酸酶检测的技术很多，包括荧光法、比色法、电化学方法和表面增强拉曼散射等。其中，荧光技术因为自身高的灵敏度和高的空间分辨率，使得它在细胞内以及细胞外碱性磷酸酶检测中显示出了极大的优势。文献中已经报道了多种碱性磷酸酶的荧光探针，如T.I.Kim,Chem.Commun.2011,47,9825;Y.Liu,Anal.Chem.2008,80,8605;L.L.An,J.Mater.Chem.2007,17,4147。然而在病理过程中碱性磷酸酶在单细胞水平上如何发挥调控作用的至今尚不清楚。因此，发展一种高灵敏度能够用于检测单细胞内碱性磷酸酶活性的探针对于生物和临床研究是非常必要的。
近些年来的研究表明，利用纳米材料作为基底构筑传感器，能够有效的提高传感器的灵敏度和选择性。文献中已经报道了几种基于零维纳米材料的碱性磷酸酶荧光传感器，如R.Freeman，Nano Lett.2010,10,21192;L.Jia,Chem.Commun,2010,46,7166。与零维纳米材料相比，一维纳米材料更适合于细胞内生物物种的检测。通过将对碱性磷酸酶具有特异性光响应的有机分子固定在一维纳米材料的表面，构筑基于一维纳米材料的碱性磷酸酶传感器，借助微系统操作，将基于一维纳米材料的碱性磷酸酶传感器插入单细胞的特定位置，便能够直接检测单细胞内的碱性磷酸酶的活性。在众多的一维纳米材料中，硅纳米线由于具有无毒性、生物兼容性好以及利于集成等优点，已经被广泛的应用于荧光传感器的构筑，并且这些传感器都展现出了良好的检测性能。
发明内容
本发明的目的之一是提供基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器。
本发明的目的之二是提供基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器的制备方法。
本发明的目的之三是提供基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器的应用。
本发明的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器，是结合硅纳米线的长处和荧光技术在碱性磷酸酶活性检测上的优势，通过将3-丁烯-1-胺作为连接体，将荧光小分子醛基荧光素共价修饰到硅纳米线的表面，再利用三氯氧磷对修饰到硅纳米线表面的荧光素分子进行磷酸化，从而成功制备得到了基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器。本发明的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器在直接检测单细胞内的碱性磷酸酶的活性方面有广泛的应用前景。
本发明的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器是表面修饰有对碱性磷酸酶具有选择性荧光响应的磷酸化荧光素分子的硅纳米线荧光化学传感器或硅纳米线阵列荧光化学传感器。
所述的硅纳米线是由化学气相沉积法制备得到的直径为7～15nm的硅纳米线。
所述的硅纳米线阵列是由化学刻蚀法制备得到的由直径为200～400nm，长度为15～35μm的硅纳米线构成的硅纳米线阵列。
本发明的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器的制备方法包括以下步骤：
1）室温下，将硅纳米线或硅纳米线阵列浸泡在质量浓度为1%～10%的氢氟酸水溶液中（一般浸泡的时间为1～10分钟），取出硅纳米线或硅纳米线阵列并用去离子水洗干净，真空干燥，得到表面具有Si-H键的硅纳米线或硅纳米线阵列；
2）将步骤1）得到的干燥的表面具有Si-H键的10～30mg的硅纳米线，或将干燥的表面具有Si-H键的硅纳米线阵列，与5～20mL的无水均三甲苯和0.1～0.4mL的3-丁烯-1胺加入到反应器中，在惰性气体保护下加热至90～180℃后，恒温反应2～6小时，冷却至室温，过滤收集硅纳米线或取出硅纳米线阵列，用有机溶剂超声清洗除去未反应的3-丁烯-1-胺，得到表面修饰有氨基的硅纳米线或硅纳米线阵列；其中，硅纳米线阵列的加入量，是以从硅纳米线阵列上刮下来的硅纳米线为10～30mg为基准；
3）将步骤2）得到的表面修饰有氨基的硅纳米线或硅纳米线阵列置于反应器中，加入浓度为0.5～1.5mol/L的醛基荧光素的乙醇溶液，室温下搅拌反应0.5～2小时，然后用有机溶剂反复超声清洗除去未反应的醛基荧光素，直至洗涤液无荧光，得到表面修饰有醛基荧光素分子的硅纳米线或硅纳米线阵列；再加入浓度为0.03～0.06mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的乙醇溶液，在温度为30～65℃下加热反应1.5～4小时，然后用有机溶剂反复超声洗涤除去未反应的三乙酰氧基硼氢化钠，得到表面修饰有荧光素的硅纳米线或硅纳米线阵列；
4）将步骤3）得到的表面修饰有荧光素的硅纳米线或硅纳米线阵列置于反应器中，加入5～10mL的二氯甲烷，冷却至0℃，加入1.2～1.5mmol的吡啶，0.5～1mmol的三氯氧磷，在惰性气体保护下反应0.5～2小时，然后逐滴加入0.5～1mL的体积比为1:1的丙酮与水的混合溶液淬灭反应，用去离子水和有机溶剂超声清洗，真空干燥，硅纳米线或硅纳米线阵列表面的荧光素分子经三氯氧磷磷酸化，得到表面修饰有对碱性磷酸酶具有选择性荧光响应的磷酸化荧光素分子的硅纳米线或硅纳米线阵列的荧光化学传感器。
所述的硅纳米线是由化学气相沉积法制备得到的直径为7～15nm的硅纳米线。
所述的硅纳米线阵列是由化学刻蚀法制备得到的由直径为200～400nm，长度为15～35μm的硅纳米线构成的硅纳米线阵列。
所述的有机溶剂是甲醇、乙醇、二氯甲烷或丙酮。
所述的无水均三甲苯优选是新蒸的无水均三甲苯。
本发明中所述的化学气相沉积法制备硅纳米线的方法可是：室温下，将一氧化硅经研钵研磨后放入瓷舟中，并将瓷舟放在石英管的中部，系统先用机械泵和分子泵对石英管抽真空至10-3Pa，随后以20～50sccm(mL/min)的流速通入氩气(占混合气体的体积95％)与氢气(占混合气体的体积5％)的混合气体，当压力稳定在700～1000Pa时，系统开始升温；系统以10～20℃/min升至300℃，再以10～20℃/min升温至800℃，此时关闭气阀和泵闸，保温10～30分钟后继续升温至1350℃，在1350℃下反应(一般反应时间为3～7小时)，反应结束后，自然冷却至室温，在瓷舟的两侧收集产物硅纳米线。
本发明中所述的化学刻蚀法制备硅纳米线阵列的方法可是：取不同尺寸的n(100)硅片，依次用丙酮、乙醇、蒸馏水进行超声清洗(一般超声清洗的时间为10～30分钟)，将清洗后的硅片置于含有浓度为3～8mmol/L的AgNO3和2～7mol/L的HF的混合水溶液中进行浸泡(一般浸泡的时间为5～10分钟)，将硅片取出后浸入含有浓度为2～7mol/L的HF和0.05～0.4mol/L的H2O2的混合水溶液中，体系由温度为40～60℃的水浴保温，15～45分钟后取出硅片，放入浓盐酸(质量浓度为36％)∶浓硝酸(质量浓度为36％)的体积比为3∶1的混合液中，浸泡0.5～2.5小时后取出硅片，用蒸馏水冲洗后自然晾干，得到由硅纳米线构成的硅纳米线阵列。
本发明的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器可用于含有碱性磷酸酶分子的溶液体系中的碱性磷酸酶分子的检测，在检测碱性磷酸酶分子时，以基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器中的硅纳米线荧光化学传感器，或以从硅纳米线阵列上刮下来的单根硅纳米线荧光化学传感器作为荧光检测的活性基底；联用荧光光谱仪或联用荧光显微镜，在有碱性磷酸酶存在的溶液体系中，所述的硅纳米线荧光化学传感器，或所述的单根硅纳米线荧光化学传感器会产生荧光增强，通过绘制已知碱性磷酸酶的浓度和荧光特征峰相对强度的定标曲线，由所述的硅纳米线荧光化学传感器，或由所述的单根硅纳米线荧光化学传感器检测到的荧光特征峰的荧光增强确定溶液体系中的碱性磷酸酶的浓度，从而实现对溶液体系中的碱性磷酸酶的检测。
本发明的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器也可用于单细胞内的碱性磷酸酶的活性的检测，在检测单细胞内的碱性磷酸酶的活性时，如以从硅纳米线阵列上刮下来的单根硅纳米线荧光化学传感器作为荧光检测的活性基底；联用荧光显微镜，在含有碱性磷酸酶的单细胞中，所述的单根硅纳米线荧光化学传感器会产生荧光增强，从而实现对含有碱性磷酸酶的单细胞中的碱性磷酸酶的活性检测。
本发明的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器在用于含有碱性磷酸酶分子的溶液体系中的碱性磷酸酶分子的检测时，所述的有碱性磷酸酶存在的溶液体系，是将碱性磷酸酶的溶液直接加入到含有本发明的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器的溶液中，在37℃下作用，之后再进行荧光强度的测试，联用荧光光谱仪或联用荧光显微镜进行检测。所用的激发光源为汞灯(激发波长为450～495nm)、氙灯(激发波长为450～495nm)或激发波长为488nm的激光器，本发明的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器的发射光为绿光。
本发明的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器可用于对溶液中碱性磷酸酶分子的检测，并在单细胞水平上碱性磷酸酶分子的检测上有广泛的应用前景，为直接检测细胞内碱性磷酸酶的活性提供了一种新的传感器。
下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步的说明。
附图说明
图1.本发明实施例1的通过化学气相沉积法制备得到的硅纳米线的TEM照片，插图为HRTEM照片。
图2.本发明实施例2的通过化学刻蚀法制备得到的硅纳米线阵列的SEM照片：左为俯视图，右为侧视图。
图3a.本发明实施例1～5的基于硅纳米线或硅纳米线阵列的碱性磷酸酶荧光化学传感器的制备过程中硅纳米线表面修饰的示意图。
图3b.本发明实施例1～5的基于硅纳米线或硅纳米线阵列的碱性磷酸酶荧光化学传感器与碱性磷酸酶的作用机理示意图。
图4.本发明实施例1的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器的荧光随基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器与碱性磷酸酶的作用时间的变化曲线。
图5.本发明实施例3的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器的相对荧光强度与碱性磷酸酶的浓度的线性曲线。
图6.本发明实施例2的基于单根硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器对溶液中碱性磷酸酶进行检测的荧光图像；其中：a为基于单根硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器（在没有碱性磷酸酶存在时）的明场照片；b为基于单根硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器（在没有碱性磷酸酶存在时）的荧光照片；c为基于单根硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器并置于1mL浓度为0.01M的PBS缓冲溶液中，且加入0.5U/mL的碱性磷酸酶作为被视为待检测的溶液体系，于水浴（37℃）中恒温2小时后在荧光显微镜下进行观察得到的荧光照片；d为b和c中箭头标识位置的荧光强度。
具体实施方式
实施例1
1）室温下，将一氧化硅经研钵研磨后放入瓷舟中，并将瓷舟放置于水平管式炉的石英管的中部，然后对系统先用机械泵和分子泵抽真空至10-3Pa，随后以50sccm(mL/min)的流速通入氩气(占混合气体的体积95％)与氢气(占混合气体的体积5％)的混合气体，当压力稳定在1000Pa时，系统开始升温；系统以10℃/min升至300℃，再以20℃/min升温至800℃，此时关闭气阀和泵闸，保持10分钟后继续升温至1350℃，并保持温度7小时后，管式炉自然降温；在瓷舟的两侧收集产物硅纳米线，所得到的硅纳米线是中心直径为10～12nm的单晶硅线，外边有一层1～2nm的非晶氧化硅层，硅纳米线的TEM照片见图1；
2)室温下，将步骤1)制备得到的硅纳米线浸泡在质量浓度1%的氢氟酸水溶液中5分钟，取出硅纳米线并用去离子水洗干净，真空干燥，得到表面具有Si-H键的硅纳米线；
3)将步骤2）得到的干燥的表面具有Si-H键的10mg的硅纳米线、5mL的无水均三甲苯和0.1mL的3-丁烯-1胺加入到反应器中，在氩气保护下加热至90℃后，恒温反应6小时，冷却至室温，过滤收集硅纳米线，用乙醇超声清洗除去未反应的3-丁烯-1-胺，过滤收集表面修饰有氨基的硅纳米线；
4)将步骤3)得到的表面修饰有氨基的硅纳米线置于反应器中，加入浓度为0.5mol/L的醛基荧光素的乙醇溶液，室温下搅拌反应0.5小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的醛基荧光素，直至洗涤液无荧光，再加入浓度为0.03mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的乙醇溶液，在温度为30℃下加热反应4小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的三乙酰氧基硼氢化钠，得到表面修饰有荧光素的硅纳米线；
5）将步骤4）得到的表面修饰有荧光素的硅纳米线置于反应器中，加入5mL的二氯甲烷，冷却至0℃，加入1.2mmol的吡啶，0.5mmol的三氯氧磷，在氩气保护下反应0.5小时，然后逐滴加入0.5mL体积比为1:1的丙酮与水的混合溶液淬灭反应，用去离子水和乙醇超声清洗，过滤，真空干燥得到表面修饰有对碱性磷酸酶具有选择性荧光响应的磷酸化荧光素分子的硅纳米线荧光化学传感器。所述的硅纳米线荧光化学传感器的制备过程中硅纳米线表面的修饰过程如图3a所示。
将上述得到的表面修饰有对碱性磷酸酶具有选择性荧光响应的磷酸化荧光素分子的硅纳米线荧光化学传感器分散在0.01M的PBS缓冲溶液中作为荧光检测的活性基底，用荧光光谱仪对该硅纳米线荧光化学传感器的传感性能进行表征，激发光源为氙灯。在含有上述制备得到的硅纳米线荧光化学传感器的2mL0.01M的PBS缓冲溶液体系中，加入被视为待检测的0.5U/mL的碱性磷酸酶，并于水浴(37℃)中恒温，用480nm的光激发，每隔2分钟进行一次荧光检测，所述的硅纳米线荧光化学传感器会产生荧光增强，并发现随着所述的硅纳米线荧光化学传感器与被视为待检测的碱性磷酸酶反应时间的增加，被视为待检测的溶液体系的荧光强度逐渐增强。如图4所示的所述的硅纳米线荧光化学传感器与被视为待检测的碱性磷酸酶的不同反应时间点所测的硅纳米线荧光化学传感器的荧光光谱的变化曲线。在含有所述的硅纳米线荧光化学传感器的2mL0.01M的PBS缓冲溶液体系中，加入已知的不同浓度的碱性磷酸酶，并于水浴(37℃)中保温，用480nm的光激发，所述的硅纳米线荧光化学传感器与已知的碱性磷酸酶反应20分钟后进行荧光检测，发现随着已知的碱性磷酸酶浓度的增加，已知的溶液体系的荧光特征峰（最大发射波长为517nm）的强度逐渐增强。通过绘制已知的碱性磷酸酶的浓度和荧光特征峰相对强度的定标曲线，并与被视为待检测的溶液体系中的由所述的硅纳米线荧光化学传感器检测到的荧光特征峰的荧光增强进行比较，确定了被视为待检测的溶液体系中的碱性磷酸酶的浓度为0.5U/mL，从而实现了对被视为待检测的溶液体系中的碱性磷酸酶的检测。所述的硅纳米线荧光化学传感器与碱性磷酸酶的作用机理如图3b所示。
实施例2
1)取2cm×1.0cm的n(100)硅片，依次用丙酮、乙醇、蒸馏水各超声清洗10分钟；将清洗后的硅片取出后置于含有浓度为5mmol/L的AgNO3和4.8mol/L的HF的混合水溶液中；浸泡5分钟后取出放入10mL含有浓度为4.8mol/L的HF和0.2mol/L的H2O2的混合水溶液中，体系于50℃水浴保温；15分钟后取出硅片，放入盛有4.5mL浓盐酸(质量浓度为36％)和1.5mL浓硝酸(质量浓度为36％)的混合液中；浸泡0.5小时后取出硅片，用蒸馏水冲洗，洗干净后置于表面皿中自然晾干，得到由硅纳米线构成的硅纳米线阵列，其中硅纳米线阵列中的硅纳米线的直径为200～400nm，长度为15～20μm，硅纳米线阵列的SEM照片见图2；
2)室温下，将步骤1)中制备得到的硅纳米阵列浸泡在质量浓度为10%的氢氟酸水溶液中1分钟，取出硅纳米线阵列并用去离子水洗干净，真空干燥，得到表面具有Si-H键的硅纳米阵列；
3)将步骤1）得到的干燥的表面具有Si-H键的硅纳米线阵列，与20mL的无水均三甲苯和0.4mL的3-丁烯-1胺加入到反应器中，在氩气保护下加热至180℃后，恒温反应2小时，冷却至室温，取出硅纳米线阵列，用乙醇超声清洗除去未反应的3-丁烯-1-胺，得到表面修饰有氨基的硅纳米阵列；其中，硅纳米线阵列的加入量，是以从硅纳米线阵列上刮下来的硅纳米线为10mg为基准；
4)将步骤3)得到的表面修饰有氨基的硅纳米阵列置于反应器中，加入浓度为1.5mol/L的醛基荧光素的乙醇溶液，室温下搅拌反应2小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的醛基荧光素，直至洗涤液无荧光，再加入浓度为0.06mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的乙醇溶液，在温度为65℃下加热反应1.5小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的三乙酰氧基硼氢化钠，得到表面修饰有荧光素的硅纳米线阵列；
5）将步骤4）得到的表面修饰有荧光素的硅纳米线阵列置于反应器中，加入10mL的二氯甲烷，冷却至0℃，加入1.5mmol的吡啶，1.0mmol的三氯氧磷，在氩气保护下反应2小时，然后逐滴加入1mL体积比为1:1的丙酮与水的混合溶液淬灭反应，用去离子水和乙醇超声清洗，真空干燥得到表面修饰有对碱性磷酸酶具有选择性荧光响应的磷酸化荧光素分子的硅纳米线阵列荧光化学传感器。所述的硅纳米线阵列荧光化学传感器的制备过程中硅纳米线表面的修饰过程如图3a所示。
从所述的硅纳米线阵列荧光化学传感器上刮取1mg的单根纳米线并置于2mL乙醇中，超声使其分散后滴在硅片上，得到表面修饰有对碱性磷酸酶具有选择性荧光响应的磷酸化荧光素分子的单根硅纳米线荧光化学传感器。
将上述得到的单根硅纳米线荧光化学传感器用于含有碱性磷酸酶分子的溶液体系中的碱性磷酸酶分子的检测，在检测碱性磷酸酶分子时，以所述的单根硅纳米线传感器作为荧光检测的活性基底，联用荧光显微镜，激发光源为汞灯（450～480nm），在有碱性磷酸酶存在的溶液体系中，所述的单根硅纳米线荧光化学传感器会产生荧光增强。如图6所示的基于单根硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器对溶液中碱性磷酸酶进行检测的荧光图像，其中：a为基于单根硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器（在没有碱性磷酸酶存在时）的明场照片；b为基于单根硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器（在没有碱性磷酸酶存在时）的荧光照片；c为基于单根硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器并置于1mL浓度为0.01M的PBS缓冲溶液中，且加入0.5U/mL的碱性磷酸酶作为被视为待检测的溶液体系，于水浴（37℃）中恒温2小时后在荧光显微镜下进行观察得到的荧光照片；d为b和c中箭头标识位置的荧光强度。通过绘制已知的碱性磷酸酶的浓度和单根硅纳米线荧光传感器在同一位置（如图6b箭头表示位置）的荧光特征峰相对强度的定标曲线，并与被视为待检测的溶液体系中的由所述的单根硅纳米线荧光化学传感器检测到的荧光特征峰的荧光增强进行比较，确定了被视为待检测的溶液体系中的碱性磷酸酶的浓度为0.5U/mL，从而实现了对被视为待检测的溶液体系中的碱性磷酸酶的检测。所述的硅纳米线荧光化学传感器与碱性磷酸酶的作用机理如图3b所示。
实施例3
1）室温下，将一氧化硅经研钵研磨后放入瓷舟中，并将瓷舟放置于水平管式炉的石英管的中部，然后对系统先用机械泵和分子泵抽真空至10-3Pa，随后以20sccm(mL/min)的流速通入氩气(占混合气体的体积95％)与氢气(占混合气体的体积5％)的混合气体，当压力稳定在700Pa时，系统开始升温；系统以20℃/min升至300℃，再以10℃/min升温至800℃，此时关闭气阀和泵闸，保持30分钟后继续升温至1350℃，并保持温度3小时后，管式炉自然降温；在瓷舟的两侧收集产物硅纳米线，所得到的硅纳米线是中心直径为6～8nm的单晶硅线，外边有一层1～2nm的非晶氧化硅层；
2)室温下，将步骤1)制备得到的硅纳米线浸泡在质量浓度10%的氢氟酸水溶液中10分钟，取出硅纳米线并用去离子水洗干净，真空干燥，得到表面具有Si-H键的硅纳米线；
3)将步骤2）得到的干燥的表面具有Si-H键的30mg的硅纳米线、20mL新蒸的无水均三甲苯和0.4mL的3-丁烯-1胺加入到反应器中，在氩气保护下加热至180℃后，恒温反应2小时，冷却至室温，过滤收集硅纳米线，用乙醇超声清洗除去未反应的3-丁烯-1-胺，过滤收集表面修饰有氨基的硅纳米线；
4)将步骤3)得到的表面修饰有氨基的硅纳米线置于反应器中，加入浓度为1.5mol/L的醛基荧光素的乙醇溶液，室温下搅拌反应2小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的醛基荧光素，直至洗涤液无荧光，再加入浓度为0.06mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的乙醇溶液，在温度为65℃下加热反应1.5小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的三乙酰氧基硼氢化钠，得到表面修饰有荧光素的硅纳米线；
5）将步骤4）得到的表面修饰有荧光素的硅纳米线置于反应器中，加入10mL的二氯甲烷，冷却至0℃，加入1.5mmol的吡啶，4mmol的三氯氧磷，在氩气保护下反应2小时，然后逐滴加入1.0mL体积比为1:1的丙酮与水的混合溶液淬灭反应，用去离子水和乙醇超声清洗，过滤，真空干燥得到表面修饰有对碱性磷酸酶具有选择性荧光响应的磷酸化荧光素分子的硅纳米线荧光化学传感器。所述的硅纳米线荧光化学传感器的制备过程中硅纳米线表面的修饰过程如图3a所示。
将上述得到的表面修饰有对碱性磷酸酶具有选择性荧光响应的磷酸化荧光素分子的硅纳米线荧光化学传感器分散在0.01M的HEPES缓冲溶液中作为荧光检测的活性基底，用荧光光谱仪对该硅纳米线荧光化学传感器的传感性能进行表征，激发光源为氙灯。在含有上述制备得到的硅纳米线荧光化学传感器的2mL0.01M的HEPES缓冲溶液体系中，加入被视为待检测的0.25U/mL的碱性磷酸酶，并于水浴(37℃)中恒温，用480nm的光激发，每隔5分钟进行一次荧光检测，所述的硅纳米线荧光化学传感器会产生荧光增强，并发现随着所述的硅纳米线荧光化学传感器与被视为待检测的碱性磷酸酶反应时间的增加，被视为待检测的溶液体系的荧光强度逐渐增强。在含有所述的硅纳米线荧光化学传感器的2mL0.01M的HEPES缓冲溶液体系中，加入已知的不同浓度的碱性磷酸酶，并于水浴(37℃)中保温，用480nm的光激发，所述的硅纳米线荧光化学传感器与已知的碱性磷酸酶反应20分钟后进行荧光检测，发现随着已知的碱性磷酸酶浓度的增加，已知的溶液体系的荧光特征峰（最大发射波长为517nm）的强度逐渐增强。通过绘制已知的碱性磷酸酶的浓度和荧光特征峰相对强度的定标曲线(如图5所示)，并与被视为待检测的溶液体系中的由所述的硅纳米线荧光化学传感器检测到的荧光特征峰的荧光增强进行比较，确定了被视为待检测的溶液体系中的碱性磷酸酶的浓度为0.25U/mL，从而实现了对被视为待检测的溶液体系中的碱性磷酸酶的检测。所述的硅纳米线荧光化学传感器与碱性磷酸酶的作用机理如图3b所示。
实施例4
1)取1.5cm×1cm的n(100)硅片，依次用丙酮、乙醇、蒸馏水各超声清洗30分钟；将清洗后的硅片取出后置于含有浓度为5mmol/L的AgNO3和4.8mol/L的HF的混合水溶液中；浸泡10分钟后取出放入10mL含有浓度为4.8mol/L的HF和0.2mol/L的H2O2的混合水溶液中，体系于50℃水浴保温；45分钟后取出硅片，放入盛有4.5mL浓盐酸(质量浓度为36％)和1.5mL浓硝酸(质量浓度为36％)的混合液中；浸泡2.5小时后取出硅片，用蒸馏水冲洗，洗干净后置于表面皿中自然晾干，得到由硅纳米线构成的硅纳米线阵列，其中硅纳米线阵列中的硅纳米线的直径为200～400nm，长度为30～35μm；
2)室温下，将步骤1)中制备得到的硅纳米阵列浸泡在质量浓度为1%的氢氟酸水溶液中5分钟，取出硅纳米线阵列并用去离子水洗干净，真空干燥，得到表面具有Si-H键的硅纳米阵列；
3)将步骤1）得到的干燥的表面具有Si-H键的硅纳米线阵列，与5mL新蒸的无水均三甲苯和0.1mL的3-丁烯-1胺加入到反应器中，在氩气保护下加热至90℃后，恒温反应6小时，冷却至室温，取出硅纳米线阵列，用丙酮超声清洗除去未反应的3-丁烯-1-胺，得到表面修饰有氨基的硅纳米阵列；其中，硅纳米线阵列的加入量，是以从硅纳米线阵列上刮下来的硅纳米线为30mg为基准；
4)将步骤3)得到的表面修饰有氨基的硅纳米阵列置于反应器中，加入浓度为0.5mol/L的醛基荧光素的乙醇溶液，室温下搅拌反应0.5小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的醛基荧光素，直至洗涤液无荧光，再加入浓度为0.03mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的乙醇溶液，在温度为30℃下加热反应4小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的三乙酰氧基硼氢化钠，得到表面修饰有荧光素的硅纳米线阵列；
5）将步骤4）得到的表面修饰有荧光素的硅纳米线阵列置于反应器中，加入5mL的二氯甲烷，冷却至0℃，加入1.2mmol的吡啶，0.5mmol的三氯氧磷，在氩气保护下反应0.5小时，然后逐滴加入0.5mL体积比为1:1的丙酮与水的混合溶液淬灭反应，用去离子水和丙酮超声清洗，真空干燥得到表面修饰有对碱性磷酸酶具有选择性荧光响应的磷酸化荧光素分子的硅纳米线阵列荧光化学传感器。所述的硅纳米线阵列荧光化学传感器的制备过程中硅纳米线表面的修饰过程如图3a所示。
从所述的硅纳米线阵列荧光化学传感器上刮取1mg的单根纳米线并置于2mL乙醇中，超声使其分散后滴在硅片上，得到表面修饰有对碱性磷酸酶具有选择性荧光响应的磷酸化荧光素分子的单根硅纳米线荧光化学传感器。
将上述得到的单根硅纳米线荧光化学传感器用于含有碱性磷酸酶分子的溶液体系中的碱性磷酸酶分子的检测，在检测碱性磷酸酶分子时，以所述的单根硅纳米线传感器作为荧光检测的活性基底，联用荧光显微镜，激发光源为汞灯（450～480nm），在有碱性磷酸酶存在的溶液体系中，所述的单根硅纳米线荧光化学传感器会产生荧光增强。通过绘制已知的碱性磷酸酶的浓度和单根硅纳米线荧光传感器在同一位置的荧光特征峰相对强度的定标曲线，并与待检测的溶液体系中的由所述的单根硅纳米线荧光化学传感器检测到的荧光特征峰的荧光增强进行比较，以确定待检测的溶液体系中的碱性磷酸酶的浓度，从而实现了对待检测的溶液体系中的碱性磷酸酶的检测。所述的硅纳米线荧光化学传感器与碱性磷酸酶的作用机理如图3b所示。
实施例5
1）室温下，将一氧化硅经研钵研磨后放入瓷舟中，并将瓷舟放置于水平管式炉的石英管的中部，然后对系统先用机械泵和分子泵抽真空至10-3Pa，随后以30sccm(mL/min)的流速通入氩气(占混合气体的体积95％)与氢气(占混合气体的体积5％)的混合气体，当压力稳定在900Pa时，系统开始升温；系统以10℃/min升至300℃，再以20℃/min升温至800℃，此时关闭气阀和泵闸，保持20分钟后继续升温至1350℃，并保持温度5小时后，管式炉自然降温；在瓷舟的两侧收集产物硅纳米线，所得到的硅纳米线是中心直径为10～12nm的单晶硅线，外边有一层2～3nm的非晶氧化硅层；
2)室温下，将步骤1)制备得到的硅纳米线浸泡在质量浓度4%的氢氟酸水溶液中2分钟，取出硅纳米线并用去离子水洗干净，真空干燥，得到表面具有Si-H键的硅纳米线；
3)将步骤2）得到的干燥的表面具有Si-H键的20mg的硅纳米线、10mL的无水均三甲苯和0.2mL的3-丁烯-1胺加入到反应器中，在氩气保护下加热至120℃后，恒温反应4小时，冷却至室温，过滤收集硅纳米线，用乙醇超声清洗除去未反应的3-丁烯-1-胺，过滤收集表面修饰有氨基的硅纳米线；
4)将步骤3)得到的表面修饰有氨基的硅纳米线置于反应器中，加入浓度为1mol/L的醛基荧光素的乙醇溶液，室温下搅拌反应1小时，然后用丙酮反复超声清洗除去未反应的醛基荧光素，直至洗涤液无荧光，再加入浓度为0.04mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的乙醇溶液，在温度为50℃下加热反应3小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的三乙酰氧基硼氢化钠，得到表面修饰有荧光素的硅纳米线；
5）将步骤4）得到的表面修饰有荧光素的硅纳米线置于反应器中，加入8mL的二氯甲烷，冷却至0℃，加入1.4mmol的吡啶，0.8mmol的三氯氧磷，在氩气保护下反应1小时，然后逐滴加入0.8mL体积比为1:1的丙酮与水的混合溶液淬灭反应，用去离子水和乙醇超声清洗，过滤，真空干燥得到表面修饰有对碱性磷酸酶具有选择性荧光响应的磷酸化荧光素分子的硅纳米线荧光化学传感器。所述的硅纳米线荧光化学传感器的制备过程中硅纳米线表面的修饰过程如图3a所示。
将上述得到的表面修饰有对碱性磷酸酶具有选择性荧光响应的磷酸化荧光素分子的硅纳米线荧光化学传感器分散在0.01M的PBS缓冲溶液中作为荧光检测的活性基底，用荧光光谱仪对该硅纳米线荧光化学传感器的传感性能进行表征，激发光源为氙灯。在含有上述制备得到的硅纳米线荧光化学传感器的2mL0.01M的PBS缓冲溶液体系中，加入被视为待检测的0.5U/mL的碱性磷酸酶，并于水浴(37℃)中恒温，用480nm的光激发，每隔2分钟进行一次荧光检测，所述的硅纳米线荧光化学传感器会产生荧光增强，并发现随着所述的硅纳米线荧光化学传感器与被视为待检测的碱性磷酸酶反应时间的增加，被视为待检测的溶液体系的荧光强度逐渐增强。在含有所述的硅纳米线荧光化学传感器的2mL0.01M的PBS缓冲溶液体系中，加入已知的不同浓度的碱性磷酸酶，并于水浴(37℃)中保温，用480nm的光激发，所述的硅纳米线荧光化学传感器与已知的碱性磷酸酶反应20分钟后进行荧光检测，发现随着已知的碱性磷酸酶浓度的增加，已知的溶液体系的荧光特征峰（最大发射波长为517nm）的强度逐渐增强。通过绘制已知的碱性磷酸酶的浓度和荧光特征峰相对强度的定标曲线，并与被视为待检测的溶液体系中的由所述的硅纳米线荧光化学传感器检测到的荧光特征峰的荧光增强进行比较，确定了被视为待检测的溶液体系中的碱性磷酸酶的浓度为0.5U/mL，从而实现了对被视为待检测的溶液体系中的碱性磷酸酶的检测。所述的硅纳米线荧光化学传感器与碱性磷酸酶的作用机理如图3b所示。
Claims (8)
1.一种基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器，其特征是：所述的碱性磷酸酶荧光化学传感器是表面修饰有对碱性磷酸酶具有选择性荧光响应的磷酸化荧光素分子的硅纳米线荧光化学传感器或硅纳米线阵列荧光化学传感器。
2.根据权利要求1所述的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器，其特征是：所述的硅纳米线是由化学气相沉积法制备得到的直径为7～15nm的硅纳米线；
所述的硅纳米线阵列是由化学刻蚀法制备得到的由直径为200～400nm，长度为15～35μm的硅纳米线构成的硅纳米线阵列。
3.一种权利要求1或2所述的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器的制备方法，其特征是，所述的制备方法包括以下步骤：
1）室温下，将硅纳米线或硅纳米线阵列浸泡在质量浓度为1%～10%的氢氟酸水溶液中，取出硅纳米线或硅纳米线阵列并用去离子水洗干净，真空干燥，得到表面具有Si-H键的硅纳米线或硅纳米线阵列；
2）将步骤1）得到的干燥的表面具有Si-H键的10～30mg的硅纳米线，或将干燥的表面具有Si-H键的硅纳米线阵列，与5～20mL的无水均三甲苯和0.1～0.4mL的3-丁烯-1胺加入到反应器中，在惰性气体保护下加热至90～180℃后，恒温反应2～6小时，冷却至室温，过滤收集硅纳米线或取出硅纳米线阵列，用有机溶剂超声清洗除去未反应的3-丁烯-1-胺，得到表面修饰有氨基的硅纳米线或硅纳米线阵列；其中，硅纳米线阵列的加入量，是以从硅纳米线阵列上刮下来的硅纳米线为10～30mg为基准；
3）将步骤2）得到的表面修饰有氨基的硅纳米线或硅纳米线阵列置于反应器中，加入浓度为0.5～1.5mol/L的醛基荧光素的乙醇溶液，室温下搅拌反应0.5～2小时，然后用有机溶剂反复超声清洗除去未反应的醛基荧光素，直至洗涤液无荧光；再加入浓度为0.03～0.06mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的乙醇溶液，在温度为30～65℃下加热反应1.5～4小时，然后用有机溶剂反复超声洗涤除去未反应的三乙酰氧基硼氢化钠，得到表面修饰有荧光素的硅纳米线或硅纳米线阵列；
4）将步骤3）得到的表面修饰有荧光素的硅纳米线或硅纳米线阵列置于反应器中，加入5～10mL的二氯甲烷，冷却至0℃，加入1.2～1.5mmol的吡啶，0.5～1mmol的三氯氧磷，在惰性气体保护下反应0.5～2小时，然后逐滴加入0.5～1mL的体积比为1:1的丙酮与水的混合溶液淬灭反应，用去离子水和有机溶剂超声清洗，真空干燥，得到表面修饰有对碱性磷酸酶具有选择性荧光响应的磷酸化荧光素分子的硅纳米线荧光化学传感器或硅纳米线阵列荧光化学传感器。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：步骤1）所述的硅纳米线是由化学气相沉积法制备得到的直径为7～15nm的硅纳米线；
步骤1）所述的硅纳米线阵列是由化学刻蚀法制备得到的由直径为200～400nm，长度为15～35μm的硅纳米线构成的硅纳米线阵列。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：所述的将硅纳米线或硅纳米线阵列浸泡在质量浓度为1%～10%的氢氟酸水溶液中的时间是1～10分钟。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：所述的有机溶剂是甲醇、乙醇、二氯甲烷或丙酮。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：所述的无水均三甲苯是新蒸的无水均三甲苯。
8.一种权利要求1或2所述的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器的应用，其特征是：所述的基于硅纳米线的碱性磷酸酶荧光化学传感器用于含有碱性磷酸酶分子的溶液体系中的碱性磷酸酶分子的检测，以硅纳米线荧光化学传感器，或以从硅纳米线阵列上刮下来的单根硅纳米线荧光化学传感器作为荧光检测的活性基底；联用荧光光谱仪或联用荧光显微镜，在有碱性磷酸酶存在的溶液体系中，所述的硅纳米线荧光化学传感器，或所述的单根硅纳米线荧光化学传感器会产生荧光增强，通过绘制已知碱性磷酸酶的浓度和荧光特征峰相对强度的定标曲线，由所述的硅纳米线荧光化学传感器，或由所述的单根硅纳米线荧光化学传感器检测到的荧光特征峰的荧光增强确定溶液体系中的碱性磷酸酶的浓度。
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