CN113502154B - 一种检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器,其特征在于,其是以热共沉淀法合成的稀土上转换发光纳米粒子为基质,通过将该基质表面油酸配体环氧化,与带有氨基的供电子配体发生开环加成反应,将供电子配体键合到上转换发光纳米粒子的表面,在365nm紫外光照射下,利用光生自由电子还原的方式,在上转换发光纳米粒子表面原位生长一层金属银单质,形成表面为金属单质银、内核为稀土上转换发光纳米粒子为基质的核壳结构的纳米生物传感器。本发明还公开了其制备方法及在体表以及细胞层面实现过氧化氢浓度的检测在应用。发明提供的纳米生物传感器在水中具有分散性良好、结构稳定、生物相容性好且传感信号强度较高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及纳米生物材料制造技术领域,具体涉及一种利用上转换发光检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器、制备方法及其应用。
背景技术
近年来,生物传感器在不同领域中均被看作是可取代传统传感器的分析替代方法。生物传感器是一种分析装置,由两个基本部分构成:生物受体(抗体、DNA探针或细胞等),用于利用生物分子相互作用的特异性来特异性检测物质;以及转换器或传感器,能够将所述受体产生的生物识别反应诠释并“转换”为可量化的光信号或电信号。令这些装置成为具有极大吸引力的分析工具的最主要原因,在于其特异性、高敏感度、能缩短分析时间的反应能力、能够在整合系统中进行诱导的能力、自动化之便利,及实时操作能力、多功能性和低成本等。
在光学传感技术中,荧光成像以其灵敏度高、信号强度大、对细胞和生物组织无损伤等优点成为新的研究热点之一。其中,稀土掺杂上转换发光纳米材料作为一种新兴的荧光材料引起了人们的广泛关注,这是因为这类材料的发光属于反斯托克位移,通常采用低能光激发(通常是近红外光980nm或808nm),发射出高能光(紫外光、可见光、近红外光),可以弥补生物应用中背景荧光干扰以及低信噪比的缺点,利用上转换成像信号,可以广泛应用到一系列生物传感领域,如浓度传感、温度传感、pH传感等。
生物体内每个细胞都会产生过氧化氢,其在细胞生理过程中具有重要的生理作用,例如膜信号转导、基因表达、细胞分化、胰岛素代谢、细胞形状确定和生长因子诱导的信号级联反应等。线粒体是细胞的动力源,是耗氧量和活性氧生成的主要细胞区室,在细胞代谢过程中起着关键作用,例如细胞生长、坏死和细胞凋亡。活性氧簇是一类含氧的化学反应性化学物质,可以作为氧化应激的指标,包括超氧阴离子、羟基自由基、单线态氧、过氧化氢、次氯酸等。其中,过氧化氢是一种相对稳定的显著活性氧,通常被认为是氧化损伤的有效诱导剂以及衰老和炎症的介质,使其成为潜在的病理状态诊断标志物。过氧化氢在浓度较低时,作为第二信使刺激细胞增殖、分化和迁移。因此,当过氧化氢产生过量时,会导致氧化应激和炎症,从而涉及癌症、糖尿病、心血管和神经退行性疾病等多种疾病。因此,过氧化氢的检测对于生物医学研究和临床诊断具有重要意义。
中国发明专利申请CN106568820A公开了基于DNA信号放大技术合成银纳米簇的电化学生物传感器的制备方法及其应用,具体步骤如下:(1)将石墨烯溶于醋酸缓冲液中,于超声清洗器中超声分散得到石墨烯分散液;(2)将磷酸缓冲液、延伸后的DNA反应液和硝酸银水溶液溶于二次蒸馏水于PCR管中混合均匀,然后冰浴孵育使银离子与DNA相结合,再加入硼氢化钠水溶液,持续振荡使银离子被还原后,室温下避光反应得到银纳米簇;(3)将石墨烯电沉积到裸玻碳电极,再滴加DNA AgNCs溶液,避光组装冲洗即可,用于检测过氧化氢和TdT酶浓度。
除了上述发明专利方案,迄今为止,还报道了一系列可用于过氧化氢检测的技术,包括电化学、比色法、荧光和化学发光。但是,利用上述现有工艺方法制备的纳米生物传感器,各主要组分差异较大,主要组分来源受限、成本高,制备方法、检测方法复杂、设备价格高昂,且不容易实现稳定量产;其制成品的化学稳定性较差,生物相容性较差,特别是传感信号强度较低,限制了其在生物领域的应用。
因此,亟需开发一种新的克服以上缺点的纳米生物传感器及其制备方法。
发明内容
本发明是针对现有技术的不足,而提供一种检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器、制备方法,改进传感器的结构,以稀土上转换发光纳米粒子为基质,利用其上转换发光性能结合金属单质银,提高传感器的化学稳定性,以解决现有生物传感器组分来源受限、稳定性差,化学组成差异大以及传感信号强度低等问题,克服现有产品的技术缺陷,以实现利用上转换发光信号对过氧化氢浓度的检测、传感;
本发明的目的还在于,提供该纳米生物传感器的制备方法,通过合理调整组分及工艺,减少制备步骤,降低制备成本、使其易于产业化;
本发明的目的还在于,提供该纳米生物传感器在生物领域的应用,利用其发光信号强度,将其应用于体表和细胞层面炎症检测,通过对细胞炎症标志物氧化氢浓度的检测,满足临床获取细胞炎症实时监测数据的需求。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案是:
一种检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器,其特征在于,其是以热共沉淀法合成的稀土上转换发光纳米粒子为基质,通过将该基质表面油酸配体环氧化,与带有氨基的供电子配体发生开环加成反应,将供电子配体键合到上转换发光纳米粒子的表面,在365nm紫外光照射下,利用光生自由电子还原的方式,在上转换发光纳米粒子表面原位生长一层金属银单质,形成表面为金属单质银、内核为稀土上转换发光纳米粒子为基质的核壳结构的纳米生物传感器。
用一端带有巯基的聚乙二醇对纳米生物传感器进行整体表面改性,通过巯基与金属银的强配位能力,增强纳米生物传感器表面的亲水性。
所述的上转换发光纳米粒子基质是以Tm为发光中心,包括:NaYF4:Yb/Er/Tm、NaYF4:Yb/Tm、NaYbF4:Tm、NaYbF4:Er/Tm、NaGdF4:Yb/Tm、NaLuF4:Yb/Tm、LiYF4:Yb/Tm等。
一种所述检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)供电子配体的制备:将组胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)溶于去离子水中,室温下搅拌之后加入丝氨酸,继续室温下搅拌,得到第一分散液;
(2)传感器前驱体的制备:合成表面配体为油酸的油溶性稀土上转换发光纳米粒子,其环己烷分散液与1,2-二氯乙烷混合,加入间氯过氧苯甲酸,超声分散,使用油浴加热并且持续搅拌,离心取固体,分散到乙醇中,与第一分散液混合,加入去离子水,在室温下搅拌,离心取固体,分散到去离子水中,得到第二分散液;
(3)检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器的制备:向第二分散液中加入新鲜的硝酸银水溶液,超声分散均匀,在365nm紫外灯下照射后,离心取固体,分散到去离子水中,加入一端带巯基的聚乙二醇,超声分散均匀,室温下搅拌后,离心取固体,分散到去离子水中,即得到纳米生物传感器。
步骤(1)中所述第一分散液,具体步骤为:
先将0.2~0.4g的组胺和50~100mg的NHS超声溶于去离子水中,以每分钟600~800转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌12小时,充分混合均匀后,逐滴加入浓度为0.1~0.2g/mL的丝氨酸水溶液2mL,继续在室温下持续搅拌12小时,通过旋转蒸发仪除去大部分的溶剂后,用去离子水定容至2~4mL,得到第一分散液。
步骤(2)中所述第二分散液,具体步骤为:
合成表面配体为油酸的稀土上转换发光纳米粒子,将其分散在环己烷中,预备一定体积的1,2-二氯乙烷,然后以体积比1:5~1:10的比例混合,加入0.25~0.5g的间氯过氧苯甲酸,并在室温下超声分散后,在40℃油浴的环境下持续搅拌3~6小时,以每分钟10000转的速度离心,取固体,用乙醇离心、洗涤3次,将所得固体分散到10~20mL乙醇中,加入第一分散液,并加入26~58mL去离子水,以每分钟600~800转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌24小时,以每分钟10000~12000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到10~20mL去离子水中,得到第二分散液。
步骤(3)中的具体步骤为:
向第二分散液中加入浓度为16mg/mL新鲜的硝酸银水溶液10~20mL,超声分散均匀,在365nm紫外灯下照射0.5~1小时后,以每分钟10000~12000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到10mL去离子水中,加入60~120mg一端带巯基的聚乙二醇,超声分散均匀,以每分钟600~800转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌24小时,以每分钟12000~14000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到10~20mL去离子水中,即得到纳米生物传感器。
所述检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器的应用,其特征在于,将该纳米生物传感器作为检测试剂,用于对细胞炎症标志物过氧化氢浓度的检测。
所述的应用,其特征在于,将该纳米生物传感器应用于体表以及细胞层面实现过氧化氢浓度的实时检测,获得临床上细胞层面炎症的实时监测数据。
所述的应用,其特征在于,将该纳米生物传感器作为检测试剂应用于体表炎症的实时监测时,同时用作抗菌剂。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明提供的利用上转换发光检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器,重点在于基于稀土上转换发光纳米粒子及组胺衍生物,利用光生自由电子还原的方式在上转换发光纳米粒子表面原位生长一层金属银单质,获得表面为金属单质银、内核为稀土上转换发光纳米粒子为基质的核壳结构的纳米生物传感器;该传感器在水中具有分散性良好、结构稳定、化学组成稳定、重复性好、成本低、检测步骤少且传感信号强度较高等优点。
(2)本发明提供的纳米生物传感器的制备方法,通过热共沉淀法发得到稀土上转换发光纳米粒子,利用光生自由电子还原的方法在上转换发光纳米粒子表面原位生长一层金属银单质。该制备方法克服了现有合成方法的不足,简化了制备过程、设备投入较少,反应条件温和且易于控制,制得的纳米粒子生物传感器均匀性好、化学组成稳定、重复性好,易于实现产业化生产。
(3)本发明提供的利用上转换发光检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器的应用,针对性地克服了现有生物传感器单一性应用的局限性,在充分利用上转换发光纳米颗粒荧光成像的同时,还可以利用其发光信号强度对氧化氢浓度进行检测,使其在具备了过氧化氢浓度实时监测功能,同时其还兼顾抗菌抑菌的功能,亲水性好,大大简化了制备和检测步骤,降低了综合成本,扩展了其在生物医药及诊疗一体化领域的应用,具有广泛的应用前景。
下面结合附图与具体实施方式,对本发明进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例1制得的利用上转换发光检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器的透射电镜(TEM)照片;
图2是本发明实施例5制得的利用上转换发光检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器对过氧化氢浓度响应的荧光光谱图;
图3是本发明实施例6制得的纳米生物传感器在475nm处上转换发光强度与对应过氧化氢浓度的线性拟合函数图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供的利用上转换发光检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器,其基于稀土上转换发光纳米粒子及组胺衍生物,具体以热共沉淀法合成的稀土上转换发光纳米粒子NaYF4:Yb/Er/Tm为基质,通过将该基质表面油酸配体环氧化,与带有氨基的供电子配体发生开环加成反应,将供电子配体键合到上转换发光纳米粒子的表面,在365nm紫外光照射下,利用光生自由电子还原的方式,在上转换发光纳米粒子表面原位生长一层金属银单质,形成表面为金属单质银、内核为稀土上转换发光纳米粒子为基质的核壳结构的纳米生物传感器;然后再用一端带有巯基的聚乙二醇对纳米生物传感器进行整体表面改性,通过巯基与金属银的强配位能力,增强纳米生物传感器表面的亲水性。
前述利用上转换发光检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器的制备方法,其包括以下步骤:
(1)供电子配体的制备:将0.2g的组胺和50mg的NHS超声溶于去离子水中,以每分钟600转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌12小时,充分混合均匀后,逐滴加入2mL丝氨酸水溶液(0.1g/mL),继续在室温下持续搅拌12小时,通过旋转蒸发仪除去大部分的溶剂后,用去离子水定容至2mL,得到第一分散液。
(2)传感器前驱体的制备:预备10mL稀土上转换发光纳米粒子NaYF4:Yb/Er/Tm的环己烷分散液,预备100mL的1,2-二氯乙烷,以体积比1:10的比例混合,加入0.5g的间氯过氧苯甲酸,并在室温下超声分散后,在40℃油浴的环境下持续搅拌6小时,以每分钟10000转的速度离心,取固体,用乙醇离心、洗涤3次,将所得固体分散到20mL乙醇中,加入第一分散液,并加入58mL去离子水,以每分钟600转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌24小时,以每分钟10000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到10mL去离子水中,得到第二分散液。
(3)检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器的制备:向第二分散液中加入10mL新鲜的硝酸银水溶液(16mg/mL),超声分散均匀,在365nm紫外灯下照射1小时后,以每分钟12000转的速度离心15分钟取,固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到10mL去离子水中,加入60mg一端带巯基的聚乙二醇,超声分散均匀,以每分钟800转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌24小时,以每分钟14000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到20mL去离子水中,即得到纳米生物传感器。
本发明实施例提供检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器、制备方法,通过改进传感器的结构,以稀土上转换发光纳米粒子为基质,利用其上转换发光性能结合金属单质银,提高传感器的化学稳定性,解决了现有生物传感器组分来源受限、稳定性差,化学组成差异大以及传感信号强度低等问题,克服了现有产品的技术缺陷,较好的实现利用上转换发光信号对过氧化氢浓度的检测、传感;
本发明实施例提供的该纳米生物传感器的制备方法,通过合理调整组分及工艺,减少制备步骤,降低制备成本、使其易于产业化;具有制备工艺简洁、高效、产品质量稳定的特点。
本发明实施例提供的该纳米生物传感器在生物领域的应用,利用其发光信号强度,作为检测试剂将其应用于体表和细胞层面炎症检测,通过对细胞炎症标志物氧化氢浓度的连续、动态检测,满足临床获取细胞炎症实时监测数据的需求。
本发明的电子供体,是指在电子传递中供给电子的物质和接受氧化的物质。在有机光电配体中,通常使用前线轨道理论中“HOMO-LUMO能级”这个概念来解释光生自由电子的产生。HOMO-LUMO能级统称前线轨道,分别指最高占据分子轨道(Highest OccupiedMolecular Orbital)和最低未占分子轨道(Lowest Unoccupied Molecular Orbital)。根据前线轨道理论,处在前线轨道上的电子称为前线电子。因此在分子之间的化学反应过程中,最先作用的分子轨道是前线轨道,起关键作用的电子是前线电子。HOMO与LUMO之间的能量差,称为“能带隙”,可以用来衡量一个分子是否容易被激发:带隙越小,分子越容易被激发。用一定频率的光激发供电子配体,由于分子的HOMO对其电子的束缚较为松弛,分子HOMO中的电子吸收光子能量后,产生光生自由电子。具体来说,组胺衍生物先将Ag+锚定,在吸收紫外线后产生光生电子-空穴对,光生电子转移到金属Ag+,使其原位还原,生成银单质。
参见图1,其为本发明实施例制得的利用上转换发光检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器的TEM照片,从图中可以看出该纳米粒子尺寸均一、分散性好,说明该方法能制得形貌良好、分散性好的纳米粒子;并且功能化后的纳米生物传感器粒径分布在30~40nm范围内,由于小尺寸的纳米粒子更容易被细胞摄取,因此纳米生物传感器更有利于实现细胞内的荧光成像,对于细胞层面炎症的实时监测有重要意义。
实施例2
本实施例提供的利用上转换发光检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器、制备方法及其应用,其与实施例1基本相同,其不同之处在于,该制备方法以稀土上转换发光纳米粒子NaYF4:Yb/Tm为基础,包括以下步骤:
(1)供电子配体的制备:将0.2~0.4g的组胺和50~100mg的NHS超声溶于去离子水中,以每分钟600~800转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌12小时,充分混合均匀后,逐滴加入2mL丝氨酸水溶液(0.1~0.2g/mL),继续在室温下持续搅拌12小时,通过旋转蒸发仪除去大部分的溶剂后,用去离子水定容至2~4mL,得到第一分散液。
(2)传感器前驱体的制备:预备10mL稀土上转换发光纳米粒子NaYF4:Yb/Tm的环己烷分散液,预备50~100mL的1,2-二氯乙烷,以体积比1:5~1:10的比例混合,加入0.25~0.5g的间氯过氧苯甲酸,并在室温下超声分散后,在40℃油浴的环境下持续搅拌3~6小时,以每分钟10000转的速度离心,取固体,用乙醇离心、洗涤3次,将所得固体分散到10~20mL乙醇中,加入第一分散液,并加入26~58mL去离子水,以每分钟600~800转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌24小时,以每分钟10000~12000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到10~20mL去离子水中,得到第二分散液。
(3)检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器的制备:向第二分散液中加入10~20mL新鲜的硝酸银水溶液(16mg/mL),超声分散均匀,在365nm紫外灯下照射0.5~1小时后,以每分钟10000~12000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到10mL去离子水中,加入60~120mg一端带巯基的聚乙二醇,超声分散均匀,以每分钟800转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌24小时,以每分钟12000~14000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到10~20mL去离子水中,即得到纳米生物传感器。
所述的纳米生物传感器应用,将该纳米生物传感器作为检测试剂应用于体表炎症的实时监测时,同时发挥其抑菌抗菌作用,用作抗菌剂。
实施例3
本实施例提供的利用上转换发光检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器、制备方法及其应用,其与实施例1、2基本相同,其不同之处在于,该制备方法是以稀土上转换发光纳米粒子NaYbF4:Tm为基础,包括以下步骤:
(1)供电子配体的制备:将0.4g的组胺和100mg的NHS超声溶于去离子水中,以每分钟800转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌12小时,充分混合均匀后,逐滴加入2mL丝氨酸水溶液(0.2g/mL),继续在室温下持续搅拌12小时,通过旋转蒸发仪除去大部分的溶剂后,用去离子水定容至4mL,得到第一分散液。
(2)传感器前驱体的制备:预备10mL稀土上转换发光纳米粒子NaYbF4:Tm的环己烷分散液,预备50mL的1,2-二氯乙烷,以体积比1:5的比例混合,加入0.25g的间氯过氧苯甲酸,并在室温下超声分散后,在40℃油浴的环境下持续搅拌3小时,以每分钟10000转的速度离心,取固体,用乙醇离心、洗涤3次,将所得固体分散到10mL乙醇中,加入第一分散液,并加入26mL去离子水,以每分钟600转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌24小时,以每分钟10000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到10mL去离子水中,得到第二分散液。
(3)检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器的制备:向第二分散液中加入10mL新鲜的硝酸银水溶液(16mg/mL),超声分散均匀,在365nm紫外灯下照射0.5小时后,以每分钟10000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到10mL去离子水中,加入60mg一端带巯基的聚乙二醇,超声分散均匀,以每分钟800转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌24小时,以每分钟12000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到10mL去离子水中,即得到纳米生物传感器。
实施例4
本实施例提供的利用上转换发光检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器、制备方法及其应用,其与实施例1-3基本相同,其不同之处在于,该制备方法是以稀土上转换发光纳米粒子NaYbF4:Er/Tm为基础,包括以下步骤:
(1)供电子配体的制备:将0.3g的组胺和75mg的NHS超声溶于去离子水中,以每分钟700转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌12小时,充分混合均匀后,逐滴加入2mL丝氨酸水溶液(0.15g/mL),继续在室温下持续搅拌12小时,通过旋转蒸发仪除去大部分的溶剂后,用去离子水定容至3mL,得到第一分散液。
(2)传感器前驱体的制备:预备10mL稀土上转换发光纳米粒子NaYF4:Yb/Tm的环己烷分散液,预备75mL的1,2-二氯乙烷,以体积比1:7.5的比例混合,加入0.375g的间氯过氧苯甲酸,并在室温下超声分散后,在40℃油浴的环境下持续搅拌4.5小时,以每分钟10000转的速度离心,取固体,用乙醇离心、洗涤3次,将所得固体分散到15mL乙醇中,加入第一分散液,并加入42mL去离子水,以每分钟700转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌24小时,以每分钟11000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到15mL去离子水中,得到第二分散液。
(3)检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器的制备:向第二分散液中加入15mL新鲜的硝酸银水溶液(16mg/mL),超声分散均匀,在365nm紫外灯下照射45分钟后,以每分钟11000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到10mL去离子水中,加入90mg一端带巯基的聚乙二醇,超声分散均匀,以每分钟800转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌24小时,以每分钟13000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到15mL去离子水中,即得到纳米生物传感器。
实施例5
上述实施例2制得的利用上转换发光检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器的应用,将该纳米生物传感器作为检测试剂,应用于临床上体表以及细胞层面的过氧化氢浓度的检测,特别是动态、连续的检测,以满足临床上对于获取体表以及细胞层面炎症的实时监测数据的需求。
将实施例2制得的利用上转换发光检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器,将其作为细胞层面过氧化氢浓度的传感器,用于细胞荧光成像;其具体用于细胞荧光成像的方法,包括以下步骤:
(1)预备实施例2得到的纳米生物传感器,用培养基配制成纳米生物传感器的浓度为100~200μg/mL的培养液;
(2)将HepG2细胞在上述培养液中分别培养2、4、6小时;
(3)用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗细胞5次,将没有被细胞吸收的纳米材料洗去;
(4)将培养好的细胞在共聚焦显微镜上进行成像,成像过程使用0~500mW功率可调、连续波激发的稳态980nm激光器作为激发光源,观测到位于450-500nm的发射光。
图2是应用实施例2采用本发明制备方法的纳米生物传感器,在980nm激光激发下的荧光光谱图,从图中可以观察到位于475nm附近的发射峰,对应于Tm3+的1G4→3H6跃迁,而980nm刚好位于生物组织的“光学窗口”,表明纳米生物传感器仍然保持有上转换纳米粒子良好的上转换荧光性能,非常适合于细胞荧光成像。金属银单质包覆到上转换发光纳米粒子表面,会猝灭一部分上转换发光。随着过氧化氢的加入,银单质被刻蚀成银离子,导致上转换发光纳米粒子的发光逐渐恢复。并且随着过氧化氢浓度的增加,上转换发光强度也越来越强。因此,该纳米生物传感器能够实时检测过氧化氢的浓度。
实施例6
上述实施例2制得的利用上转换发光检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器的应用,该纳米生物传感器作为检测试剂,应用于细胞层面过氧化氢浓度的动态检测,以满足临床上获取细胞层面炎症的实时监测数据的需要。
将实施例2制得的利用上转换发光检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器,将其作为过氧化氢浓度的传感器,用于细胞荧光成像;其具体用于细胞荧光成像的方法,包括以下步骤:
(1)预备实施例2得到的纳米生物传感器,用培养基配制成纳米生物传感器的浓度为100~200μg/mL的培养液;
(2)向上述培养液中加入过氧化氢,使过氧化氢的浓度为40-80μmol/L,再将HepG2细胞在上述培养液中分别培养2、4、6小时;
(3)用磷酸盐缓冲溶液冲洗细胞5次,将没有被细胞吸收的纳米材料洗去;
(4)将培养好的细胞在共聚焦显微镜上进行成像,成像过程使用0~500mW功率可调、连续波激发的稳态980nm激光器作为激发光源,观测到位于450-500nm的发射光。
图3是本发明实施例6制得的纳米生物传感器对过氧化氢的浓度滴定图,插图为此纳米生物传感器在475nm处上转换发射发光强度与对应过氧化氢浓度的线性拟合函数图。通过过氧化氢浓度变化对纳米生物传感器蓝光发射强度的影响,证实了该纳米生物传感器可以作为过氧化氢浓度的传感器,用于体表以及细胞层面炎症的实时监测。
本发明的重点在于,本发明基于稀土上转换发光纳米粒子及组胺衍生物,提供利用上转换发光的特性检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器及其制备方法,并扩展其在生物医药、诊疗一体化领域中的应用,以满足临床对于体表以及细胞层面炎症的实时监测的需求。
在其他实施例中,所述的上转换发光纳米粒子基质是以Tm为发光中心,可以是NaGdF4:Yb/Tm、NaLuF4:Yb/Tm、LiYF4:Yb/Tm等其他以Tm为发光中心的上转换发光纳米粒子基质,均可以达到本发明记载的技术效果。
以上所述,仅仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制。任何熟悉本领域的技术人员,在不脱离本发明技术方案范围内,都可以利用本发明所记载的范围内对本发明技术方案做出许多可能的变动或更改为等同变化的等效实施例。故凡是未脱离本技术发明方案的内容,依据本发明之结构、构造及原理所做的等效修改,均应涵盖于本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器,其特征在于,其是以热共沉淀法合成的稀土上转换发光纳米粒子为基质,通过将该基质表面油酸配体环氧化,与带有氨基的供电子配体发生开环加成反应,将供电子配体键合到上转换发光纳米粒子的表面,在365 nm紫外光照射下,利用光生自由电子还原的方式,在上转换发光纳米粒子表面原位生长一层金属银单质,形成表面为金属单质银、内核为稀土上转换发光纳米粒子为基质的核壳结构的纳米生物传感器;用一端带有巯基的聚乙二醇对纳米生物传感器进行整体表面改性,通过巯基与金属银的强配位能力,增强纳米生物传感器表面的亲水性。
2.根据权利要求1所述检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器,其特征在于,所述的上转换发光纳米粒子基质是以Tm为发光中心,包括:NaYF4:Yb/Er/Tm、NaYF4:Yb/Tm、NaYbF4:Tm、NaYbF4:Er/Tm、NaGdF4:Yb/Tm、NaLuF4:Yb/Tm、LiYF4:Yb/Tm。
3.一种根据权利要求1-2任一项所述检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)供电子配体的制备:将组胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶于去离子水中,室温下搅拌之后加入丝氨酸,继续室温下搅拌,得到第一分散液;
(2)传感器前驱体的制备:合成表面配体为油酸的油溶性稀土上转换发光纳米粒子,其环己烷分散液与1,2-二氯乙烷混合,加入间氯过氧苯甲酸,超声分散,使用油浴加热并且持续搅拌,离心取固体,分散到乙醇中,与第一分散液混合,加入去离子水,在室温下搅拌,离心取固体,分散到去离子水中,得到第二分散液;
(3)检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器的制备:向第二分散液中加入新鲜的硝酸银水溶液,超声分散均匀,在365 nm紫外灯下照射后,离心取固体,分散到去离子水中,加入一端带巯基的聚乙二醇,超声分散均匀,室温下搅拌后,离心取固体,分散到去离子水中,即得到纳米生物传感器。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述第一分散液,具体步骤为:
先将0.2~0.4 g的组胺和50~100 mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺超声溶于去离子水中,以每分钟600~800转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌12小时,充分混合均匀后,逐滴加入浓度为0.1~0.2 g/mL的丝氨酸水溶液2 mL,继续在室温下持续搅拌12小时,通过旋转蒸发仪除去大部分的溶剂后,用去离子水定容至2~4 mL,得到第一分散液。
5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述第二分散液,具体步骤为:
合成表面配体为油酸的稀土上转换发光纳米粒子,将其分散在环己烷中,预备一定体积的1,2-二氯乙烷,然后以体积比1:5~1:10的比例混合,加入0.25~0.5 g的间氯过氧苯甲酸,并在室温下超声分散后,在40 ℃油浴的环境下持续搅拌3~6小时,以每分钟10000转的速度离心,取固体,用乙醇离心、洗涤3次,将所得固体分散到10~20 mL乙醇中,加入第一分散液,并加入26~58 mL去离子水,以每分钟600~800转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌24小时,以每分钟10000~12000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到10~20 mL去离子水中,得到第二分散液。
6.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中的具体步骤为:
向第二分散液中加入浓度为16 mg/mL新鲜的硝酸银水溶液10~20 mL,超声分散均匀,在365 nm紫外灯下照射0.5~1小时后,以每分钟10000~12000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到10 mL去离子水中,加入60~120 mg一端带巯基的聚乙二醇,超声分散均匀,以每分钟600~800转的速度进行磁力搅拌,在室温下持续搅拌24小时,以每分钟12000~14000转的速度离心15分钟,取固体,用去离子水离心、洗涤3次,将所得固体分散到10~20 mL去离子水中,即得到纳米生物传感器。
7.权利要求1~2任一项所述检测过氧化氢浓度的纳米生物传感器在制备对细胞炎症标志物过氧化氢浓度的检测试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,将该纳米生物传感器应用于细胞层面实现过氧化氢浓度的实时检测,获得临床上细胞层面炎症的实时监测数据。
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