KR20220148196A - 나노포어 디바이스 및 이를 사용하여 하전된 입자들을 검출하고 분류하는 방법 - Google Patents

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KR20220148196A
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비타 카리미라드
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팔로젠 인코포레이티드
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Abstract

올리고뉴클레오티드 메틸화 백분율을 결정하는 방법은 상부 및 하부 챔버를 갖는 3D 나노포어 디바이스, 및 이에 배치된 3D 나노채널 어레이를 제공하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 올리고뉴클레오티드를 정제하고, 올리고뉴클레오티드 프로브를 커플링함으로써 3D 나노채널 어레이를 기능화하는 것을 포함한다. 상기 방법은 알려진 농도를 갖는 올리고뉴클레오티드 용액을 형성하고, 상기 올리고뉴클레오티드 용액을 상부 및 하부 챔버에 첨가하는 것을 추가로 포함한다. 또한, 상기 방법은 상부 및 하부 전극을 각각 상부 및 하부 챔버에 배치하고, 상부 및 하부 전극 사이에 전기영동 바이어스를 인가하고, 제1 및 제2 게이팅 나노전극에 걸쳐 선택 바이어스를 인가하고, 3D 나노포어 디바이스에서 감지 나노전극을 통해 감지 바이어스를 인가하는 것을 포함한다. 추가로, 상기 방법은 감지 나노전극으로부터의 출력 전류를 검출하고, 감지 나노전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 결정하는 것을 포함한다.

Description

나노포어 디바이스 및 이를 사용하여 하전된 입자들을 검출하고 분류하는 방법
본 발명은 일반적으로 후성적 변경을 특징화하기 위한 시스템 및 디바이스, 및 이러한 시스템 및 디바이스를 사용하여 게놈에서 메틸화 패턴을 검출하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 메틸화 패턴을 검출하기 위한 나노포어 센서에 관한 것이다. 개시된 나노포어 센서는 게놈-유래된 올리고뉴클레오티드에서 메틸화 패턴을 특징화함으로써(예를 들어, 게놈-유래된 올리고뉴클레오티드에서 DNA 메틸화를 검출함으로써) 후성적 변경의 특징화를 용이하게 한다.
조기 암 검출 및 치료는 수백만 명의 생명을 구할 수 있다. 따라서, 게놈에서 특정 유전자의 후성적 변경을 저렴하고, 신속하고, 정확하고, 조기에 검출하기 위한 디바이스(예를 들어, 병상/현장 진료 검출 시스템) 및 방법이 필요하다.
암의 병인은 세포 기능의 다양한 변경을 초래할 수 있는 많은 유형의 유전적 변화를 포함한다. 유전적 돌연변이 이외에, 암의 병인은 유전자 발현 및 암과 직접적으로 관련된 후성적 변화를 포함한다. 후성적 변화를 검출하는 것은 암 검출을 위한 효과적인 선별 기술, 및 특정 조기 검출된 암에 부합하는 치료적 개입에 의한 후속 치료 및 치유를 제공할 수 있다.
사이토신 폴리 구아닌 섬("CpG 섬") 메틸화, 히스톤 변형, 및 염색질의 재구성은 유전자의 활성화 및 침묵화를 조절하는 염색질 다양한 후성적 메커니즘을 포함한다. DNA 메틸화는 DNA 전사 및 복제를 제어할 수 있는 후성적 메커니즘이다. 줄기 세포로부터 조직 특이적 세포 유형 분화 동안 메틸화 패턴은 후속 세포 분열 동안 보존되어 새로 형성된 조직에서 특이적 세포 유형을 유지한다.
많은 유전자가 활성화되거나 침묵화되어 발암을 유발할 수 있다. 일부 돌연변이는 유전자 침묵화를 초래하지만, 상당한 정도의 발암성 유전자 침묵화는 DNA 메틸화의 변경의 결과이다. CpG 섬, 특히 단백질 프로모터 영역에서 다중 CpG 부위에서의 DNA 메틸화 변경은 암 감소 유전자(예를 들어, 오류 수정 효소)의 침묵화를 통해 암을 유발할 수 있다.
다른 과정에 의해 야기된 유전자의 침묵화조차도 유전자 침묵화에 이어 CpG 섬에서 프로모터 메틸화가 뒤따를 때 안정화될 수 있다. 메틸화는 유전자 침묵화에 매우 효과적이다. 예를 들어, 프로모터 영역에서 CpG 섬의 과메틸화는 프로모터 영역 자체의 DNA 돌연변이와 비교하여 유전자 침묵화에 10배 더 효과적이다.
따라서, 관심 표적 유전자/서열의 메틸화 함량의 측정은 특정 서열의 과메틸화에 대한 검출 및 관련 질병의 진단, 질병 예후의 결정, 및/또는 질병의 모니터링을 용이하게 할 수 있다. 메틸화의 측정이 약 10분 내에 완료될 수 있다면, 이러한 신속한 측정은 현장 진단, 예후 결정, 및 질병 모니터링을 용이하게 할 수 있다. 메틸화의 이러한 측정은 질병이 DNA 메틸화와 같은 후성적 변화와 상관관계가 있는 한 다른 질병 모니터링(예를 들어, 암 이외에)을 용이하게 할 수 있다.
나노포어 기반 DNA 염기서열 분석에 대한 초기의 실험 시스템들은, α-헤몰리신(α-hemolysin; αHL) 단백질 나노포어를 통과하는 ssDNA의 검출된 전기 거동을 검출하였다. 그 후, 나노포어 기반 핵산 염기서열 분석 기술은 개선되었다. 예컨대, 고체-상태 나노포어 기반 핵산 염기서열 분석은, 본원에 기재된 바와 같이, 고체-상태(예를 들어, 반도체 금속성 게이트) 나노포어로 생체/단백질 기반 나노포어를 대체한다.
나노포어는, 이온 전류 및/또는 터널링 전류의 변화에 의해 작은 홀(예를 들어, 나노미터 범위의 직경을 갖는)을 통해 하전 입자(예를 들어, 메틸화된 올리고뉴클레오티드 등)의 흐름을 검출할 수 있는 작은 홀이다. 나노포어 기술은 전기 감지에 기반하며, 전기 감지는 다른 통상적인 검출 방법에 요구되는 것보다 훨씬 적은 농도 및 부피의 올리고뉴클레오티드의 메틸화를 검출할 수 있다. 나노포어 기반 메틸화된 올리고뉴클레오티드 검출의 이점들은 긴 판독 길이, 플러그 앤 플레이 능력(plug and play capability), 및 확장성(scalability)을 포함한다. 반도체 제조 기술들에서의 진보들로, 고체-상태 나노포어들은, 우수한 기계적, 화학적, 그리고 열적 특성들, 및 다른 감지 회로소자 및 나노디바이스들과의 통합을 허용하는 반도체 기술과의 호환성으로 인해, 부분적으로 생체 나노포어들에 대한 값싸고 그리고 우수한 대안이 되고 있다.
도 1은 최첨단 고체-상태 기반 2차원("2D") 나노포어 감지 디바이스(100)를 개략적으로 도시한다. 디바이스(100)가 "2차원"으로 지칭되지만, 디바이스(100)는 Z 축을 따른 일부 두께를 갖는다. 현재 최첨단 나노포어 기술들의 이러한 단점들의 일부(감도 및 제조 비용 중 일부)를 해결하기 위해, 생체분자의 병렬 프로세싱을 허용하는 다중-채널 나노포어 어레이들이 사용되어, 무증폭 및 신속 DNA 메틸화 검출을 달성할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 게놈에서 특정 유전자의 후성적 변화를 저렴하고, 신속하고, 정확하고, 조기에 검출하기 위한 디바이스(예를 들어, 병상/현장 진료 검출 시스템) 및 방법이 필요하다. 특히, 게놈 DNA의 메틸화를 검출하기 위한 이러한 디바이스 및 방법이 필요하다.
본원에 기재된 구현예들은 나노포어 기반 전기 보조 메틸화 검출 시스템 및 이를 사용하여 DNA 메틸화를 검출하는 방법에 관한 것이다. 특히, 구현예들은 다양한 타입들(2D 또는 3D)의 나노포어 기반 메틸화 검출 시스템, 나노포어 어레이 디바이스를 사용하는 방법, 및 이를 사용하는 메틸화 검출 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 메틸화 백분율을 결정하는 방법은 상부 및 하부 챔버를 갖는 3D 나노포어 디바이스, 및 상부 및 하부 챔버가 3D 나노채널 어레이의 복수의 나노채널에 의해 유체적으로 커플링되도록 상부 및 하부 챔버에 배치된 3D 나노채널 어레이를 제공하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 올리고뉴클레오티드를 정제하는 것을 포함한다. 상기 방법은 올리고뉴클레오티드 프로브를 나노채널을 한정하는 3D 나노포어 디바이스의 내표면에 커플링함으로써 3D 나노채널 어레이를 기능화시키는 것을 추가로 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드 프로브는 올리고뉴클레오티드에 상보적이다. 또한, 상기 방법은 정제된 올리고뉴클레오티드를 DI 수에 첨가하여 알려진 농도를 갖는 올리고뉴클레오티드 용액을 형성시키는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 용액을 상부 및 하부 챔버에 첨가하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 상부 및 하부 챔버에 각각 상부 및 하부 전극을 배치하는 것을 포함한다. 상기 방법은 상부 전극과 하부 전극 사이에 전기영동 바이어스를 인가하는 것을 추가로 포함한다. 또한, 상기 방법은 3D 나노포어 디바이스에서 제1 및 제2 게이팅 나노전극에 걸쳐 선택 바이어스를 인가하여 복수의 나노채널의 나노채널을 통해 올리고뉴클레오티드의 흐름을 지시하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 3D 나노포어 디바이스에서 감지 나노전극을 통해 감지 바이어스를 인가하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 감지 나노전극으로부터 출력 전류를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 감지 나노전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 방법은 또한 제2 나노채널을 한정하는 3D 나노포어 디바이스의 내표면에 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 커플링함으로써 3D 나노채널 어레이를 기능화하는 것을 포함하며, 여기서 제2 올리고뉴클레오티드 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브와 상이하다. 감지 전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 결정하는 것은 출력 전류 및 감지 바이어스를 알려진 농도에 대한 참조 표의 상응하는 값과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 감지 전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 결정하는 것은 올리고뉴클레오티드의 포스페이트 백본의 전하에 대한 메틸화 효과를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 방법은 또한 3D 나노포어 디바이스에서 감지 나노전극을 통해 제2 감지 바이어스를 인가하는 것을 포함한다. 상기 방법은 추가로 감지 나노전극으로부터 제2 출력 전류를 검출하는 것을 포함한다. 더욱이, 상기 방법은 감지 나노전극으로부터의 제2 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드의 제2 메틸화 백분율을 결정하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율에 올리고뉴클레오티드의 제2 메틸화 백분율을 비교하여 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 확인하는 것을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA 분자 단편 또는 DNA 분자 단편이다. 올리고뉴클레오티드는 무세포 DNA, 조직, 세포 배양 배지, 혈청, 소변, 혈장, 또는 타액으로부터 추출될 수 있다. 3D 나노포어 디바이스에서 전하 운반체는 DI 수, H+ 이온, 및 OH- 이온을 포함할 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 방법은 또한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 용액을 상부 및 하부 챔버로부터 제거하는 것을 포함한다. 상기 방법은 추가로 제2 올리고뉴클레오티드를 정제하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 나노채널을 한정하는 3D 나노포어 디바이스의 내표면에 커플링함으로써 3D 나노채널 어레이를 기능화시키는 것을 포함하고, 여기서 제2 올리고뉴클레오티드 프로브는 제2 올리고뉴클레오티드에 상보적이다. 추가로, 상기 방법은 정제된 제2 올리고뉴클레오티드를 DI 수에 첨가하여 알려진 농도를 갖는 제2 올리고뉴클레오티드 용액을 형성시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드 용액을 상부 및 하부 챔버에 첨가하는 것을 포함한다. 상기 방법은 상부 전극과 하부 전극 사이에 전기영동 바이어스를 인가하는 것을 추가로 포함한다. 또한, 상기 방법은 3D 나노포어 디바이스에서 제1 및 제2 게이팅 나노전극에 걸쳐 선택 바이어스를 인가하여 나노채널을 통해 제2 올리고뉴클레오티드의 흐름을 지시하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 3D 나노포어 디바이스에서 감지 나노전극을 통해 감지 바이어스를 인가하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 감지 나노전극으로부터 제2 출력 전류를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 감지 나노전극으로부터의 제2 출력 전류를 분석하여 제2 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 방법은 또한 3D 나노포어 디바이스에서 제3 및 제4 게이팅 나노전극에 걸쳐 제2 선택 바이어스를 인가하여 복수의 나노채널의 제2 나노채널을 통해 제2 올리고뉴클레오티드의 흐름을 지시하는 것을 포함한다. 상기 방법은 추가로 3D 나노포어 디바이스에서 제2 감지 나노전극을 통해 제2 감지 바이어스를 인가하는 것을 포함한다. 더욱이, 상기 방법은 제2 감지 나노전극으로부터 제2 출력 전류를 검출하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 제2 감지 나노전극으로부터의 제2 출력 전류를 분석하여 제2 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 결정하는 것을 포함한다.
하나 이상의 구현예에서, 감지 전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 결정하는 것은 메틸 사이토신 메틸화와 하이드록시 메틸 사이토신 메틸화를 구별하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 알려진 돌연변이에 상응하는 메틸화 패턴의 라이브러리와 비교하여 질병을 진단하는 것을 포함할 수 있다. 질병은 암, 죽상동맥경화증, 또는 노화일 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 DNA 프로브, RNA 프로브, 또는 단백질 프로브이다. 상기 방법은 또한 감지 나노전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드에서 다수의 메틸화 부위를 정량화하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 3D 나노포어 디바이스에서 속도 제어 나노전극에 속도 제어 바이어스를 인가하여 나노채널을 통해 올리고뉴클레오티드의 전위 속도를 조절하는 것을 포함할 수 있다. 전류는 전극 전류 또는 터널링 전류일 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 제1 게이팅 나노전극은 나노채널의 제1 단부를 어드레싱하고, 제2 게이팅 나노전극은 제1 단부의 반대편에 있는 나노채널의 제2 단부를 어드레싱하고, 감지 나노전극은 제1 및 제2 단부 사이의 나노채널의 제1 위치를 어드레싱한다. 상기 방법은 또한 대안적으로 전기영동 바이어스 및 선택 바이어스를 역전시켜 제1 및 제2 게이팅 나노전극 사이의 나노채널을 통한 올리고뉴클레오티드의 교대 흐름을 지시하는 것을 포함할 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 3D 나노포어 디바이스는 모바일 애플리케이션, 랩톱 컴퓨터, 또는 데스크탑 컴퓨터에 통합된다. 3D 나노포어 디바이스는 미세유체 디바이스, 나노유체 디바이스, 나노디바이스, 또는 랩-온-칩 시스템에 통합될 수 있다. 3D 나노포어 디바이스는 올리고뉴클레오티드의 추출 및 감지를 위해 올-인-원 ASIC 플랫폼 시스템에 통합될 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 방법은 또한 약 10 펨토몰(검출 한계)의 올리고뉴클레오티드의 최소 농도에서 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 검출하는 3D 나노포어 디바이스를 포함한다. 상기 방법은 또한 올리고뉴클레오티드의 증폭 또는 PCR의 사용 없이 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 검출하는 3D 나노포어 디바이스를 포함할 수 있다. 3D 나노포어 디바이스는 올리고뉴클레오티드의 증폭 또는 PCR의 사용 없이 검출을 수행하기 위해 액체 생검 패널 플랫폼에 통합될 수 있다.
하나 이상의 구현예에서, 상기 방법은 또한 감지 나노전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드의 입체형태 변화를 결정하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 감지 나노전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드의 수화 변화를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 입체형태 변화를 결정하는 방법은 상부 및 하부 챔버를 갖는 3D 나노포어 디바이스, 및 상부 및 하부 챔버가 복수의 3D 나노채널 어레이의 복수의 나노채널에 의해 유체적으로 커플링되도록 상부 및 하부 챔버에 배치된 3D 나노채널 어레이를 제공하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 올리고뉴클레오티드를 정제하는 것을 포함한다. 상기 방법은 올리고뉴클레오티드 프로브를 나노채널을 한정하는 3D 나노포어 디바이스의 내표면에 커플링함으로써 3D 나노채널 어레이를 기능화시키는 것을 추가로 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드 프로브는 올리고뉴클레오티드에 상보적이다. 또한, 상기 방법은 정제된 올리고뉴클레오티드를 DI 수에 첨가하여 알려진 농도를 갖는 올리고뉴클레오티드 용액을 형성시키는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 용액을 상부 및 하부 챔버에 첨가하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 상부 및 하부 챔버에 각각 상부 및 하부 전극을 배치하는 것을 포함한다. 상기 방법은 상부 전극과 하부 전극 사이에 전기영동 바이어스를 인가하는 것을 추가로 포함한다. 또한, 상기 방법은 3D 나노포어 디바이스에서 제1 및 제2 게이팅 나노전극에 걸쳐 선택 바이어스를 인가하여 복수의 나노채널의 나노채널을 통해 올리고뉴클레오티드의 흐름을 지시하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 3D 나노포어 디바이스에서 감지 나노전극을 통해 감지 바이어스를 인가하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 감지 나노전극으로부터 출력 전류를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 감지 나노전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드의 입체형태 변화를 결정하는 것을 추가로 포함한다.
추가의 또 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 수화 변화를 결정하는 방법은 상부 및 하부 챔버를 갖는 3D 나노포어 디바이스, 및 상부 및 하부 챔버가 복수의 3D 나노채널 어레이의 복수의 나노채널에 의해 유체적으로 커플링되도록 상부 및 하부 챔버에 배치된 3D 나노채널 어레이를 제공하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 올리고뉴클레오티드를 정제하는 것을 포함한다. 상기 방법은 올리고뉴클레오티드 프로브를 나노채널을 한정하는 3D 나노포어 디바이스의 내표면에 커플링함으로써 3D 나노채널 어레이를 기능화시키는 것을 추가로 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드 프로브는 올리고뉴클레오티드에 상보적이다. 또한, 상기 방법은 정제된 올리고뉴클레오티드를 DI 수에 첨가하여 알려진 농도를 갖는 올리고뉴클레오티드 용액을 형성시키는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 용액을 상부 및 하부 챔버에 첨가하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 상부 및 하부 챔버에 각각 상부 및 하부 전극을 배치하는 것을 포함한다. 상기 방법은 상부 전극과 하부 전극 사이에 전기영동 바이어스를 인가하는 것을 추가로 포함한다. 또한, 상기 방법은 3D 나노포어 디바이스에서 제1 및 제2 게이팅 나노전극에 걸쳐 선택 바이어스를 인가하여 복수의 나노채널의 나노채널을 통해 올리고뉴클레오티드의 흐름을 지시하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 3D 나노포어 디바이스에서 감지 나노전극을 통해 감지 바이어스를 인가하는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 감지 나노전극으로부터 출력 전류를 검출하는 것을 포함한다. 상기 방법은 감지 나노전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드의 수화 변화를 결정하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 상기 언급된 구현예 및 다른 구현예는 하기 상세한 설명에 기재되어 있다.
하기 설명된 도면은 예시 목적으로만 사용된다. 도면은 본 개시의 범위를 제한하려고 의도된 것이 아니다. 도면은 본 개시의 다양한 구현예의 설계 및 유용성을 예시한다. 도면들은 실척대로 도시되지 않으며, 유사한 구조들 또는 기능들의 엘리먼트들이 도면 전반에 걸쳐 유사한 참조 부호들에 의해 표현된다는 것에 유의해야 한다. 본 개시의 다양한 구현예의 인용된 및 다른 이점 및 목적을 얻는 방법을 더 잘 인지하기 위해, 본 개시의 보다 상세한 설명은 첨부된 도면에 도시된 본 개시의 특정 구현예를 참조하여 제공될 것이다. 이들 도면은 본 개시의 전형적인 구현예만을 도시하고 따라서 그 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것을 이해하고, 본 개시는 첨부 도면의 사용을 통해 추가의 구체적이고 상세하게 기재되고 설명될 것이다.
도 1은 종래 기술의 고체-상태 2D 나노포어 디바이스를 개략적으로 예시한다.
도 2 내지 4는 다양한 구현예에 따른 3D 나노포어 디바이스를 개략적으로 예시한다.
도 5 내지 11은 일부 구현예에 따른 3D 나노포어 디바이스를 사용하여 DNA 메틸화를 검출하기 위한 방법을 개략적으로 도시한다.
도 12a 및 12b는 일부 구현예에 따른 나노포어 디바이스를 제조하기 위한 방법을 개략적으로 도시한다.
도 13은 일부 구현예에 따른 나노포어 메틸화 검출 디바이스에서 DNA 메틸화의 백분율과 출력 전류 사이의 관계를 예시하는 3D 히스토그램이다.
도 14는 일부 구현예에 따른 나노포어 검출 시스템을 사용하여 올리고뉴클레오티드의 메틸화를 검출하는 방법을 도시하는 흐름도이다.
도 15는 일부 구현예에 따른 3D 나노포어 디바이스/센서에서 DNA의 메틸화를 검출/분류하는 메커니즘을 개략적으로 도시한다.
도 16 내지 18은 일부 구현예에 따른 3D 나노포어 디바이스/센서 내부의 이중 가닥 DNA의 입체형태적 변화를 개략적으로 예시한다.
도 19는 일부 구현예에 따른 3D 나노포어 디바이스/센서 내부의 이중 가닥 DNA에서 신호 변화의 수화 매개 메커니즘을 개략적으로 예시한다.
다양한 구현예들의 위에서 언급된 및 다른 이점들 및 목적들을 어떻게 획득하는지를 더 잘 인식하기 위해, 첨부된 도면들을 참조하여 구현예들의 보다 상세한 설명이 제공된다. 도면들은 실척대로 도시되지 않으며, 유사한 구조들 또는 기능들의 엘리먼트들이 전반에 걸쳐 유사한 참조 부호들에 의해 표현된다는 것에 유의해야 한다. 이들 도면들은 단지 특정한 예시된 구현예들을 도시하고, 따라서 구현예들의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않는다는 것이 이해될 것이다.
예시된 구현예의 상세한 설명
DNA 메틸화의 무증폭 및 신속 검출(예를 들어, 10분 미만 내에)을 달성하기 위한 방법이 본원에 기재된다. DNA의 혼성화를 증가시키기 위해 전위를 조작하고 메틸화된 DNA의 혼성화에 의해 생성된 전기적 특성을 검출함으로써 DNA 메틸화를 효율적이고 효과적으로 검출하는 나노포어 전기 보조 DNA 메틸화 검출 디바이스가 본원에 기재된다. 이러한 검출 디바이스 및 방법은 마이크로어레이, CMOS 어레이 및 나노포어 어레이(예를 들어, 고체-상태 및 하이브리드 나노포어 어레이)를 포함하는 다양한 생체분자 어레이에 사용될 수 있다. 이러한 검출 디바이스 및 방법은 또한, 위에 설명된 3D 다중-채널 나노포어 어레이 및 평면형 다중-채널 나노포어 어레이를 포함하는 다양한 다중-채널 나노포어 어레이와 함께 사용될 수 있다.
DNA 메틸화 검출의 병렬 처리를 가능하게 하는 다중-채널 나노포어 어레이는 무증폭 및 신속 메틸화 검출을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 다중-채널 나노포어 어레이는 하전된 입자(예를 들어, 메틸화된 DNA)를 이러한 다중-채널 나노포어 어레이의 특정 채널로 지시하기 위해 전기적으로 어드레싱될 수 있다. 다른 어레이는 어레이 외부의 미세유체 채널에 커플링된다. 다중-채널 나노포어 어레이 내의 개별 나노포어 채널을 전기적으로 어드레싱하고 감지하는 것은 다중-채널 나노포어 어레이의 보다 효율적이고 효과적인 사용을 용이하게 하여 메틸화된 DNA의 저비용, 고처리량, 무증폭, 및 신속 검출을 달성할 수 있다.
특징화 메커니즘
일부 구현예에서, 메틸화 패턴의 특징화 메커니즘(예를 들어, 감지 메커니즘)은 올리고뉴클레오티드 염기(예를 들어, DNA 분자에서)의 특정 특성을 레버리지한다. 구아닌 염기는 DNA 분자의 4개 염기쌍 중 하나이며, 이는 쉽게 산화된다. 에너지 준위와 관련하여, 구아닌 염기의 전하는 단지 0.2 eV이다. 따라서, 구아닌 염기의 전하는 DNA 사슬을 따라 다음 산화기 또는 다음 구아노신으로 쉽게 이동할 수 있다. DNA에서 구아닌-시토신("G-C") 및 아데닌-티민("A-T") 염기쌍의 전하/에너지는 상대 전하 운반체로서 기능하여, 전하 운반체들 사이에서 DNA 분자의 길이를 따라 전하(예를 들어, 구아닌 염기의)가 호핑하도록 한다. DNA 분자에서 양으로 하전된 "홀"은 하나 이상의 G-C 부위에서 더 낮은 에너지를 가질 수 있고, 이 홀은 DNA 분자에서 A-T 부위를 통한 코히어런트 터널링에 의해 하나의 G-C 쌍에서 다음 G-C 쌍으로 이동할 수 있다. 이와 같이, DNA 분자에서 하나 이상의 양으로 하전된 홀은 전체 DNA 분자의 전하에 영향을 미칠 수 있다(예를 들어, 이의 음전하를 감소시킬 수 있다).
메틸화 패턴의 특징화 메커니즘(예를 들어, 감지 메커니즘)은 또한 DNA 분자의 전기장에 대한 수화 효과를 레버리지할 수 있다. 일부 구현예에서, 특징화 메커니즘(예를 들어, 감지 메커니즘)은 올리고뉴클레오티드(예를 들어, DNA 가닥)의 탈이온("DI") 수용액에서 수행되어, 물 분자 및 올리고뉴클레오티드가 전하 특성에 영향을 주는 수화된 바이오-인터페이스를 형성하도록 한다. DNA 염기쌍 및 DNA 이중 나선의 소수성은 DI 수용액에서 소수성 DNA 염기쌍을 물로부터 멀리 위치시키는 구조를 초래한다. DNA 가닥의 음으로 하전된 백본은 백본 주위에 양으로 하전된 이온을 끌어당긴다. 메틸화는 메틸 기를 (예를 들어, 시토신에) 첨가하여, DNA 백본의 음전하를 커버링할 수 있는 거의 중성 에너지 준위를 초래한다. 또한, DI 수용액 중 물 분자는 수화 상태에서 DNA 가닥 주위에 워터 쉘(water shell)을 형성할 수 있다.
메틸화 패턴의 특징화 메커니즘(예를 들어, 감지 메커니즘)은 또한 CpG 섬에서 DNA 분자의 수화의 전하 효과를 레버리지할 수 있다. 수소 원자(예를 들어, 물 분자로부터의)가 DNA의 포스페이트 백본을 마주할 때, 이들은 서로 영향을 미친다. 메틸화 동안 첨가된 메틸 기의 중성 성질, 및 물 분자와의 이들의 계면은 수소 원자로 커버링된 DNA 백본을 초래한다. 따라서, 이러한 메틸화 매개 상호작용은 DNA 분자의 전하에 대한 이들의 효과에 의해 검출될 수 있으며, 이는 임베딩된 전극에 의해 감지될 수 있다. 본원에 기재된 3-차원("3D") 센서 및 이를 사용하는 방법은 용액 중 DNA 분자의 총 전하를 포함하는 반응 챔버에서의 전하 변화를 감지할 수 있다.
DNA의 메틸화(예를 들어, C-G 쌍의 시토신)는 또한 메틸화된 디뉴클레오티드의 강성도에 영향을 미친다(예를 들어, 변형 모드 의존성 효과). 메틸화는 디뉴클레오티드의 강성도를 미미하게 증가시키되, 이웃하는 디뉴클레오티드의 강성도를 더욱 유의하게 증가시킨다. 강화는 연속적으로 메틸화된 디뉴클레오티드에 대해 추가로 향상되는데, 이는 과메틸화의 효과를 초래할 수 있다. 첨가된 메틸 기와 이웃하는 뉴클레오티드의 비극성 기 사이의 입체 상호작용은 많은 구현예에서 강화에 기인할 수 있다. 수화 맵은 메틸화가 또한 다양한 방식으로 표면 수화 구조를 변화시킨다는 것을 보여준다. 메틸화된 DNA의 변형에 대한 내성은 입체 상호작용이 없는 변형 모드에 대한 DNA의 강화에 기여할 수 있다. DNA의 입체형태 거동에 대한 메틸화의 효과는 메틸화 부위 주위의 국소 서열에 의존할 수 있다.
본원에 기재된 메틸화 패턴의 특징화 메커니즘(예를 들어, 감지 메커니즘)의 일부 구현예는, 반응 챔버에서 H+ 및 OH- 기에 영향을 미칠 수 있는 DNA 수화 및 DNA 백본의 메틸 기 중화에 적어도 부분적으로 기초한다. 본원에 기재된 일부 3D 나노포어 센서 어레이는 나노채널에서 감지 영역의 데비 렌즈를 감소시킴으로써 증가된 감도 및 감소된 검출 한계로 메틸화의 검출을 용이하게 한다.
DNA를 측정 또는 감지하기 위한 한 가지 예시적인 접근법은 본원에 기재된 바와 같이, 3D 나노포어 센서 어레이 내부에 임베딩된 전극에 의해 측정된 전기 신호에 의해 지시된 바와 같이 나선 파라미터의 변동을 분석하는 것이고, DNA 입체형태 변화는 전극 영역의 변화를 변경시키고 신호를 생성할 수 있는 메커니즘 중 하나이다. DNA 메틸화는 DNA 구조에서 약한 변동을 초래하여 더 강성인 DNA를 초래한다. 또한, 메틸화는 메틸화 부위에 인접한 DNA 분자의 수화 환경을 변화시키는 메틸 기를 첨가한다. 이러한 다양한 메커니즘은 메틸 기 주변의 수화 쉘의 더 나은 특징화를 위해 용해 에너지를 감소시킨다.
물은 하이드록시메틸사이오신("hmC")에 대해 높은 친화성을 갖기 때문에, G-hmC 염기쌍은 가장 큰 전하 변동을 겪는다. 대조적으로, 물은 메틸시토신("mC")의 소수성 메틸 기를 덜 용매화하는데, 이는 G-mC 염기쌍의 강성/비가요성을 증가시킨다. 대체 서열 폴리(데옥시구아닐산-데옥시시티딜) 산 소듐 염("폴리(dG-dC)")에서 시토신의 메틸화는 메틸화되지 않은 DNA에 필요한 것보다 더 취약한 이온 품질로 Z-DNA의 발달을 허용한다.
다른 구현예에서, 출력 전류 평균 값은 패턴에 따라 변한다: hmC < C < mC. 결과적으로, 메틸화에 대한 DNA 적응성에 차이가 있을 수 있다.
예시적인 나노포어 디바이스
도 2는 일 구현예에 따른 3차원("3D") 어레이 아키텍처를 갖는 나노포어 디바이스(200)를 개략적으로 도시한다. 디바이스(200)는 Z 축(204)을 따라 적층된 복수의 2D 어레이 또는 층(202A-202D)을 포함한다. 2D 어레이(202A-202D)는 "2차원"으로 지칭되지만, 각각의 2D 어레이(202A-202D)는 Z 축을 따라 일부 두께를 갖는다.
상부 2D 어레이(202A)는 제1 및 제2 선택 층(206, 208)에 형성된 나노포어(210)(기둥, 나노채널)를 통해 하전된 입자(예를 들어, 바이오폴리머)의 이동을 지시하도록 구성된 제1 및 제2 선택(억제 나노전극) 층(206, 208)을 포함한다. 제1 선택 층(206)은 2D 어레이(202A)의 복수의 행(R1-R3)으로부터 선택하도록 구성된다. 제2 선택 층(208)은 2D 어레이(202A)에서 복수의 열(C1-C3)로부터 선택하도록 구성된다. 일 구현예에서, 제1 및 제2 선택 층(206, 208)은 선택된 행 및 열에 인접하고/하거나 선택되지 않은 행 및 열에 인접하여 전하를 변형시킴으로써 행 및 열로부터 각각 선택된다. 다른 2D 어레이(202B-202D)는 속도 제어/전류 감지 나노전극을 포함한다. 속도 제어/감지 나노전극들은, Au-Cr, TiN, TaN, Pt, Cr, 그래핀(graphene), Al-Cu 등과 같은 고도의 전도성 금속들 및 폴리실리콘으로 제조될 수 있다. 속도 제어/감지 나노전극들은 약 0.3nm 내지 약 1000nm의 두께를 가질 수 있다. 속도 제어/감지 나노전극들은 또한, 하이브리드 나노포어들에서 생체 층(biological layer)에서 만들어질 수 있다. 각각의 감지 나노전극은 나노포어(210) 필라에 동작가능하게 커플링/어드레싱될 수 있어서, 각각의 나노포어(210) 필라가 특정 메모리 셀에 동작가능하게 커플링될 수 있다. 전기적 어드레싱은 나노포어 디바이스에서 수행될 수 있다.
하이브리드 나노포어는 나노포어의 안정성을 향상시키기 위해 반-합성 멤브레인 포린을 형성하기 위해 고체-상태 성분을 갖는 안정한 생물학적/생화학적 성분을 포함한다. 예를 들어, 생물학적 성분은 αHL 분자일 수 있다. αHL 분자는 SiN 기반 3D 나노포어에 삽입될 수 있다. αHL 분자는 나노전극에 바이어스(예를 들어, 상부 2D 어레이(202A)에서)를 가함으로써 αHL 분자와 SiN 기반 3D 나노포어의 정렬을 보장하는 구조를 취하도록 유도될 수 있다.
나노포어 디바이스(200)는, 평면 구조를 갖는 통상적인 나노포어 디바이스의 표면적보다 훨씬 더 큰, 전하 검출을 위한 표면적을 제공하는 3D 수직 필라 스택 어레이 구조를 갖는다. 하전된 입자(예컨대, 바이오폴리머)는 디바이스에서 각각의 2D 어레이(202A-202E)를 통과함에 따라, 이의 전하는 2D 어레이들(202B-202E) 중 일부에서 검출기(예컨대, 나노전극)로 검출될 수 있다. 따라서, 디바이스(200)의 3D 어레이 구조는 보다 높은 민감성을 용이하게 하며, 이는 낮은 신호 검출기/나노전극을 보상할 수 있다. 메모리 셀들을 3D 어레이 구조에 통합하는 것은 임의의 메모리 관련 성능 제한들을 최소화한다(예컨대, 외부 메모리 디바이스를 사용하여). 추가적으로, 고도로 통합된 작은 형상 계수(form factor) 3D 구조는, 제조 비용을 최소화하면서, 고밀도 나노포어 어레이를 제공한다.
사용 시에, 나노포어 디바이스(200)는, 상부 및 하부 챔버들이 나노포어 필라들(210)에 의해 유체적으로 커플링되도록 상부 챔버와 하부 챔버들(도시되지 않음) 사이에 배치되어 이들을 분리한다. 상부 챔버 및 하부 챔버는 나노전극(예컨대, Ag/AgCl2 등) 및 검출될 하전 입자들(예컨대, DNA)을 포함하는 완충제(전해질 용액 또는 KCl을 갖는 DI 수)를 포함한다. 상이한 나노전극 및 전해질 용액은 상이한 하전된 입자의 검출을 위해 사용될 수 있다.
전기영동 하전된 입자 전좌는 나노포어 디바이스(200)의 상부 2D 어레이(202A)에 인접한 상부 챔버(도시되지 않음) 및 나노포어 디바이스(200)의 하부 2D 어레이(202E)에 인접한 하부 챔버(도시되지 않음)에 배치되는 나노전극들에 바이어스를 인가함으로써 구동될 수 있다. 일부 구현예에서, 나노포어 디바이스(200)는, 상부 및 하부 챔버가 나노포어 디바이스(200)의 나노포어 필라(210)에 의해 유체적으로 그리고 전기적으로 커플링되도록 상부 챔버와 하부 챔버(도시되지 않음) 사이에 배치된다. 상부 및 하부 챔버들은 전해질 용액을 보유할 수 있다.
도 3은 일 구현예에 따른 나노포어 디바이스(300)를 개략적으로 도시한다. 나노포어 디바이스(300)는 절연 멤브레인 층(Si3N4) 각각 다음에 행 및 열 선택(억제 나노전극들)(306 및 308)(예컨대, 금속 또는 도핑된 폴리실리콘), 및 복수(첫 번째 내지 N 번째)의 셀 나노전극(310)(예컨대, 금속 또는 도핑된 폴리실리콘)을 포함한다. 나노포어 디바이스(300)의 나노전극들(306, 308, 310)은 절연체 유전체 막(312)(예컨대, Al2O3, HfO2, SiO2, ZnO)에 의해 커버링된다.
도 4에 도시된 바와 같이, 열 및 행 전압들(예컨대, Vd)에 대한 전좌 레이트 제어 바이어스 신호(410)가 3D 나노포어 센서 어레이(400)에 인가될 때, 본원에 기재된 바와 같이 행 및 열 억제 전압/바이어스 펄스들 다음에 검증(감지) 전압/바이어스 펄스(예컨대, Vg1, Vg2)가 후속된다. Vg3 및 후속 전극들(Vg4 ~ VgN)은 감지 및 전좌 전극들이다. 예시적인 신호(410)는 3D 나노포어 센서 어레이(400)의 상부 상에 오버레이된 것으로 도 4에 도시된다. 다양한 열 및 행 나노포어 필라 채널들/나노채널들을 각각 선택 해제하기 위한 억제 바이어스들이 인가된다. 감지 동작 동안에, 열 및 행(억제) 선택 나노전극들 둘 모두가 선택된다. 결과적인 표면 전하(412)는 전류와 같은 전기적 특성의 변화로서 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 나노전극들은, 이온 차단(blockade), 터널링, 용량성 감지, 압전 및 마이크로파 감지를 포함하는, 다양한 원리들을 사용하여 전류 변조들을 검출할 수 있다. 또한, 도 4에 도시된 바와 같이, 전극의 이온 농도 또는 소위 이온 전류 변화(기준 전극에 의해 검출됨)가 부착된 CMOS 트랜지스터에 의해 증폭되고 정확하게 감지될 수 있는 것이 가능하다.
예시적인 나노포어 전기 보조 DNA 메틸화 검출 디바이스 및 방법
도 5는 일부 구현예들에 따른 나노포어 전기 보조 DNA 메틸화 검출 디바이스를 도시한다. 단일 나노채널(510)을 포함하는 나노포어 검출 디바이스(500)의 일부가 도 5에 도시되지만, 나노포어 전기 보조 DNA 메틸화(예컨대, 후성적 변화) 검출 디바이스들은 복수의 나노채널을 갖는 3D 어레이를 포함할 수 있다. 도 5에 도시된 나노포어 검출 디바이스(500)와 같은 DNA 메틸화 감지 구조는 나노채널들의 전하 감도, 및 병렬 프로세싱 및 3D 어레이들로 기인한 넓은 표면적을 레버리지하여, DNA 메틸화의 신속한 무증폭 검출을 용이하게 한다.
나노포어 검출 디바이스(500)는 나노전극들(522, 524, 526, 528)을 포함한다. 이러한 나노전극들(522, 524, 526, 528)은, 나노채널(510)(제1 및 제2 게이팅 나노전극들(522, 524))을 통한 흐름을 제어하고 나노채널(510)(제1 및 제2 감지 나노전극들(526, 528))에서 전하들을 검출하도록 독립적으로 전기적으로 어드레싱된다.
나노포어 검출 디바이스(500)는 또한, 나노채널(510)의 내표면(530)에 커플링되는 프로브들(PNA, DNA 모르폴리노 올리고머들)(532)을 포함한다. 내표면(530)은 Al2O3을 포함할 수 있다. Al2O3은, 나노채널(510)의 내표면(530) 상의 프로브들(532)의 고정화를 위한 기능화를 용이하게 하기 위해 매우 많은 히드록실기를 포함한다. 프로브(532)는 게놈 DNA(예를 들어, 프로모터 영역 내 CpG 섬) 내의 표적 영역에 상보적이게 되도록 알려진 분자 생물학 기법들을 사용하여 생성될 수 있다. 프로브(예를 들어, DNA, RNA, PNA, LNA, 모르폴리노스 등)(532)는 다양한 길이(예를 들어, 24개 염기쌍, 40개 염기쌍 등)를 가질 수 있다.
프로브(532)는 기상 실란화를 사용하여 내표면에 커플링/공유 결합될 수 있다. 프로브들(532)의 유기 코팅의 두께는 또한 기상 실란화의 시간을 수정함으로써 조절될 수 있다.
일부 구현예에서, 나노포어 디바이스는 먼저 O2 플라즈마로 처리되어 옥사이드 유전(Al2O3, HfO2 등) Al2O3 기판 상에 -OH 기들을 생성하고, 이로써 표적 작용기를 부착하기 위해 기판을 활성화시킨다. 그런 다음, 3-아미노프로필 트리에옥시 실란(APTES)은, 가능한 다양한 표면 구조들에 효과적이기 때문에 그리고 반응성이 매우 높기 때문에, 실란화에 사용된다. 프로브(532)의 공유 부착 전에, 나노포어 디바이스(510)는, 주변 온도 및 약 30 kPa의 기저 압력에서, 50 ㎕의 APTES(Sigma-Aldrich로부터)를 함유하는 유리 홀더에 인접한 동적 펌핑된 저진공 챔버에 배치함으로써 기상에서 실란들(예컨대, 에탄올에서 APTES 및 OTMS 1:3 비율)에 노출된다. 그런 다음, 나노포어 디바이스(510)는 진공 챔버에서 제거되고, 2.5 % 글루타르알데하이드 용액(Sigma-Aldrich)에 1 시간 동안 침지된다. 다음에, 나노포어 디바이스(510)는 가교제로부터 제거되고, IPI에서 2번 그리고 이중 증류수에서 2번 세척된다. 마지막으로, 나노포어 디바이스(510)는 100 nM 아미노-변성된 프로브로 37℃에서 밤새 처리된다(예를 들어, 침지에 의해). 각각의 단계 후에, 나노포어 디바이스는 초순수 DNase/RNase-비함유 증류수(세척 완충제로서 사용됨)로 세척된다. 이러한 방법들을 사용하여, 프로브(532)의 공유 부착/고정화는 대략 24 시간 내에 또는 45℃에서 8 시간 내에 달성될 수 있다.
나노채널(510)의 내표면(530)에 공유 결합된 프로브(532)에 대한 전기적 표적 생체분자(540)(예를 들어, 메틸화된 올리고뉴클레오티드)의 나노포어 검출 디바이스(500) 혼성화의 감도는, 단일 염기 불일치가 전하의 결과적인 차이에 기반하여 검출될 수 있도록 한다. 나노포어 디바이스들의 3D 어레이 구조로 인한 병렬 프로세싱은, 검출될 메틸화된 올리고머뉴클레오티드와 나노포어 디바이스들 사이의 계면 영역을 극적으로 증가시키고, 이로써 다양한 장애(예를 들어, 유전적 장애)의 현장 진단 및 예후의 결정에 충분한 수준으로 감도를 증가시킨다.
제1 및 제2 게이팅 나노전극들(522, 524)은 독립적으로 어드레싱되고, 따라서 표적 생체분자(540) 및 프로브(532)의 혼성화를 증가시키는 표적 생체분자들(540)의 "핑-퐁(ping-pong)" 운동을 생성하도록 빠르게 전기적으로 변성될 수 있다. 나노채널(510)에서 제1 및 제2 게이팅 나노전극들(522, 524)에 걸친 전위는 제1 및 제2 게이팅 나노전극들(522, 524)에 전류를 인가함으로써 빠르게 반전될 수 있다. 제1 및 제2 게이팅 나노전극들(522, 524)은 또한 나노채널(510)을 통한 표적 전하 생체분자(540)의 전좌를 제어하도록 어드레싱될 수 있다.
표적 전하 생체분자(540)는 DNA, cDNA, mRNA 등과 같은 매우 다양한 핵산일 수 있다. 프로브(532)는 상보적인 DNA 가닥, 잠금 핵산(LNA) 올리고머, 펩티드 핵산(PNA)과 같은 중성 백본 올리고머, DNA 모르폴리노 올리고머, 또는 표적 전하 생체분자(540)와 혼성화될 수 있는 임의의 타입의 상보적 가닥일 수 있다.
도 5에 도시된 바와 같이, 임의의 전류/전위가 나노포어 검출 디바이스(500)에 인가되기 전에, 표적 생체분자(540)는 나노채널(510)에 유인되지 않는다. 도 6은 제1 및 제2 게이트 나노전극(522, 524)에서 양의 전위를 생성하기 위한 전류의 인가를 도시한다. 이러한 양의 전위는 음의 표적 생체분자(540)를 나노채널(510) 쪽으로 유인한다.
도 7은 제1 및 제2 게이트 나노전극(522, 524)에서 양의 전위를 생성하기 위한 전류의 연속 인가를 도시한다. 시간이 지남에 따라, 음의 표적 생체분자(540) 중 일부는 나노채널(510)에 진입하고, 나노채널(510)의 내표면(530)에 공유 결합된 프로브(532)와 상호작용한다. 음의 표적 생체분자(540)와 프로브(532) 사이의 이러한 상호작용은 2개의 분자들 사이의 혼성화를 초래한다. 이는 음의 표적 생체분자(540)를 제1 및 제2 감지 나노전극들(526, 528)에 전기적으로 연결하고, 이들은 음의 표적 생체분자(540)와 연관된 음전하(534)를 검출할 수 있다.
도 5는 제1 및 제2 게이트 나노전극들(522, 524)에서 전위들의 변성을 도시한다. 도 5에서, 전류는 더 이상 제1 게이트 나노전극(522)에 인가되지 않아서, 내부의 양의 전위를 제거한다. 그러나, 전류는 내부의 양의 전위를 유지하기 위해 제2 게이트 나노전극(524)에 걸쳐 유지된다. 이러한 전위 변화는, 흐름 화살표(550)로 표시된 바와 같이, 나노채널(510)에서 음으로 하전된 생체분자(540)를 제2 게이트 나노전극(524) 쪽으로 흡인한다. 도 5는 또한, 더 많은 음의 표적 생체분자(540)가 나노채널(510)에서 프로브(532)에 혼성화되었음을 도시한다.
도 9는 제1 및 제2 게이트 나노전극들(522, 524)에서 전위들의 또 다른 변성을 도시한다. 도 9에서, 전류는 더 이상 제2 게이트 나노전극(524)에 인가되지 않아서, 내부의 양의 전위를 제거한다. 그러나, 전류는 내부의 양의 전위를 유지하기 위해 제1 게이트 나노전극(522)에 걸쳐 인가된다. 이러한 전위 변화는, 흐름 화살표(552)로 표시된 바와 같이, 나노채널(510)에서 음의 표적 생체분자(540)를 제1 게이트 나노전극(522) 쪽 뒤로 흡인한다. 도 9는 또한 나노채널(510)에서 프로브(532)에 대한 전하 생체분자(540)의 더 많은 노출과 함께, 훨씬 더 음의 표적 생체분자(540)가 프로브(532)에 혼성화되었음을 보여준다.
도 10은 제1 및 제2 게이트 나노전극들(522, 524)에서 전위들의 추가의 또 다른 변성을 도시한다. 도 9에서, 전류는 더 이상 제1 게이트 나노전극(522)에 인가되지 않아서, 내부의 양의 전위를 제거한다. 그러나, 전류는 내부의 양의 전위를 유지하기 위해 제2 게이트 나노전극(524)에 걸쳐 인가된다. 이러한 전위 변화는, 흐름 화살표(550)로 표시된 바와 같이, 나노채널(510)에서 음의 표적 생체분자(540)를 제2 게이트 나노전극(524) 쪽 뒤로 흡인한다. 도 10은 또한 나노채널(510)에서 프로브(532)에 대한 전하 생체분자(540)의 더욱 더 많은 노출과 함께, 훨씬 더 음의 표적 생체분자(540)가 프로브(532)에 혼성화되었음을 보여준다.
도 5 내지 10의 흐름 화살표(550, 552)에 도시된 방향 변화들은, 표적 생체분자들(540)과 프로브(532)의 혼성화를 증가시키는, 표적 생체분자(540)의 "핑-퐁" 운동의 첫 번째 2번의 방향 변화들을 도시한다. 방향 변화들은 제1 및 제2 게이트 나노전극들(522, 524)의 전위들을 변경함으로써 제어되고, 이는 차례로 그에 인가된 전류를 교번함으로써 변성된다. 전류들이 프로세서 제어 하에서 개별적으로 전기적으로 어드레싱된 제1 및 제2 게이트 나노전극들(522, 524)에 인가될 수 있기 때문에, 전류 및 전위들의 교번이 빠르게 실행될 수 있다. 하전된 생체분자(540)의 "핑-퐁" 운동이 하전된 생체분자(540)가 나노채널(510)에서 프로브(532)에 노출되는 시간의 양을 증가시키고, 이로써 2개의 분자들 사이의 혼성화의 양을 증가시킨다. 도 5 내지 10에는 단지 1개 또는 2개의 방향 변화들이 도시되며, 생체분자 검출 방법은 표적 생체분자(540)의 혼성화를 증가시키기 위해 더 많은 방향 변화들을 포함할 수 있다.
도 11은 생체분자 검출 방법에서 일련의 "핑-퐁" 운동들의 끝을 도시한다. 검출 방법의 끝에서, 복수의 음의 표적 생체분자(540)(메틸화된 올리고뉴클레오티드)은 프로브(532)에 혼성화되었고, 이들 자체들은 나노채널(510)의 내표면(530)에 공유 결합된다. 각각의 음의 표적 생체분자(540)가 프로브들(532)에 혼성화될 때, 이의 부가적인 음전하(534)는 제1 및/또는 제2 감지 나노전극들(526, 528)에 의해 검출된다. 감지 나노전극들(526, 528)은 단일 염기쌍 불일치들을 구별하기에 충분히 민감하다. 따라서, 감지 나노전극들(524, 528)은 각각의 표적 생체분자(540)의 혼성화와 연관된 음전하(534)를 검출할 수 있다. 이로써, 나노포어 검출 디바이스(500)는 용액에서 표적 DNA 메틸화를 신속하게(예컨대, 10 분 미만으로) 검출 및 정량화할 수 있다.
도 5 내지 11에 도시된 나노포어 검출 디바이스(500)가 특정 절차 동안 단일의 음으로 하전된 표적 생체분자(540)만을 검출하도록 구성되지만, 다른 구현예들에 따른 나노포어 검출 디바이스들은 다수의 음으로 하전된 표적 생체분자(예를 들어, 메틸화된 올리고뉴클레오티드)를 검출하도록 구성될 수 있다. 이러한 나노포어 검출 디바이스들은 (1) 상이한 음으로 하전된 표적 생체분자들과 혼성화되고 (2) 다른 길이들을 갖는 복수의 프로브들을 포함한다. 프로브들이 상이한 길이들을 갖기 때문에, 상이한 음으로 하전된 표적 생체분자들의 혼성화는 상이한 양의 음으로 하전된 전하가 나노채널의 내표면에 전기적으로 첨가되게 할 것이다. 감지 나노전극들은 이러한 상이한 양의 음전하를 구별할 수 있을 만큼 충분히 민감하고, 이로써 상이한 음으로 하전된 표적 생체분자들의 혼성화를 구별한다.
예시적인 나노포어 디바이스 제조 방법
도 12a 및 12b는, 일부 구현예들에 따라 위에 설명된 나노포어 검출 디바이스들(500, 600)과 같은 나노포어 디바이스를 제조하기 위한 방법(1210)을 개략적으로 도시한다.
단계(1212)에서, 나노포어 디바이스의 (나노채널 내의) 내표면은 O2 플라즈마 처리, 세정 및 활성화된다. 단계(1214)에서, 디바이스의 표면은 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES)으로 처리하여 표면을 기능화함으로써 실란화된다. 단계(1216)에서, 알데하이드 링커가 기능화된 표면에 부착된다. 단계(1218)(도 12b)에서, 프로브(예컨대, PNA)는 알데하이드를 통해 표면에 부착된다. 단계(1220)에서, 음으로 하전된 표적 생체분자(예를 들어, 메틸화된 DNA)는 표면 상의 프로브에 부착되고, 위에 설명된 바와 같이, 음으로 하전된 표적 생체분자를 전기적으로 검출하기 위해 표면의 전하를 변경한다.
출력 전류에 대한 메틸화 효과
도 13은 다양한 메틸화 백분율(1314)(올리고뉴클레오티드 프로브에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 경우)에 대해 측정된 출력 전류(1312) 대 인가된 감지 바이어스(1310)를 나타내는 3D 히스토그램(1300)이다. 상이한 백분율의 메틸화 0%, 12.5%, 25%, 50% 및 100%(1314)를 함유하는 5개 유형의 대조 DNA 샘플을 제조하고 상보적인 프로브를 설계하였다. APTES로 간단한 작용기화 후, 글루타르알데하이드 링커를 첨가하고, 프로브를 3D 나노포어 센서 어레이의 특정 위치로 인큐베이션하였다. 상이한 농도의 DNA 메틸화(1314)에 대한 출력 전류(1312)의 실시간 측정은 다양한 감지 바이어스(1310)에서 수행되었고, 결과는 도 13에 요약되어 있다. 도 13에 도시된 바와 같이, 메틸화의 백분율(1314)이 증가함에 따라, 신호/출력 전류는 감소한다(1312)(예를 들어, DNA의 음성 백본 및 물 메틸 상호작용의 중화로 인해).
전자 이동 차단
도 15는 일부 구현예에 따른 3D 나노포어 디바이스/센서(1500)에서 DNA의 메틸화를 검출/분류하는 메커니즘을 개략적으로 도시한다. 1501은 게이트 전극을 나타내고, 1502는 실란을 갖는 유전체 층을 나타낸다. 1503은 설계된 올리고뉴클레오티드 프로브 가닥(1505)과 3D 나노포어 디바이스/센서(1500)의 표면 사이의 결합을 나타낸다. 1504는 구아닌 염기 사이의 전자 이동을 나타낸다. 1506은 A-T와 G-C 염기쌍 사이의 상이한 수소 결합을 나타낸다. 1507은 메틸 기를 보유하는 임상 샘플로부터의 표적 서열을 나타낸다. 특정 정도로 메틸화된 표적 서열/올리고뉴클레오티드 가닥(1507)은 올리고뉴클레오티드 프로브 가닥(1505)에 상보적이며, 따라서 이에 결합하고; 1508에 도시된 바와 같이, 염기에서 염기로의 전자 경로는 메틸 기(1509)(예를 들어, 메틸 시토신에서)에 의해 차단된다. 이러한 차단은 3D 나노포어 디바이스/센서(1500)의 게이트 전극(1501)에 의해 측정된 출력 전류를 감소시킨다. 감소의 양은 표적 서열(1507)의 메틸화 백분율과 관련이 있다(도 13에 도시된 바와 같음).
도 15의 상단 구현예는 3D 나노포어 디바이스/센서(1500)에서 게이트 전극(1501)에 양의 게이트 바이어스가 가해질 때, 디바이스(1500)의 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드 프로브(1505)의 전자가 게이트 전극(1501)으로 이동한다. 전자는 구아닌 염기인 DNA 가닥(1505)에서 가장 쉽게 산화된 부위 사이에서 이동한다(1504). 전자는 전자가 감지되는(예를 들어, 출력 전류로서) 게이트 전극(1501)에 도달할 때까지, 다음 구아닌 염기인 DNA 가닥(1505)을 통해 다음 쉽게 산화된 염기로 계속 이동한다.
도 15의 하단 구현예는 표적 서열/올리고뉴클레오티드 가닥(1507)이 3D 나노포어 디바이스/센서(1500)에 첨가될 때, 표적 올리고뉴클레오티드 가닥(1507)이 올리고뉴클레오티드 프로브(1505)에 결합한다는 것을 예시한다. 표적 올리고뉴클레오티드 가닥(1507)의 부착 후, 양의 게이트 바이어스가 게이트 전극(1501)에 가해질 때, 메틸화된 시토신 기반의 메틸 기(1509)는 전자 전달 메커니즘을 방해하여, 표적 올리고뉴클레오티드 가닥(1507)의 메틸화의 백분율에 따라 전자 전달 및 신호를 감소시킨다. 측정된 전기 신호(예를 들어, 출력 전류)는 표적 올리고뉴클레오티드 가닥(1507)의 메틸화 패턴을 결정하기 위해 참조 메틸화 백분율 프로파일(도 13 참조)과 비교될 수 있다.
입체형태 변화
일부 구현예에서, 메틸화된 및 비메틸화된 올리고뉴클레오티드는 상이한 입체형태를 가지며, 메틸화는 입체형태 변화를 초래한다. 메틸화된 올리고뉴클레오티드의 상이한 입체형태는 3D 나노포어 소자/센서 전극의 표면에서 전하 신호를 변화시킬 수 있다. 표면 전하 신호의 변화는 전극에 의해 판독된 신호(예를 들어, 출력 전류)의 변화를 초래할 수 있다. 신호에서 측정된 변화는 입체형태 변화를 결정하기 위해 분석될 수 있다.
도 16 내지 18은 일부 구현예에 따른 3D 나노포어 디바이스/센서(1600) 내부의 이중 가닥 DNA의 입체형태적 변화를 개략적으로 예시한다. 1601은 전극(예를 들어, 게이트 또는 감지 전극)을 나타내고, 디바이스(1600, 1602)의 표면 구조는 실란을 갖는 유전체 층을 나타낸다. 1602은 설계된 올리고뉴클레오티드 프로브 가닥(1603)과 3D 나노포어 디바이스/센서(1600)의 표면 사이의 결합 부위를 나타낸다. 1604는 표적 서열/올리고뉴클레오티드 가닥을 나타낸다. DNA 입체형태/배열은 DNA 분자의 환경에 기초하여 변할 수 있다. 예를 들어, 다양한 이온은 DNA 입체형태/배열을 상이한 형태의 배열로 변화시킬 수 있다. 도 16은 B-DNA 배열의 표적 서열/올리고뉴클레오티드 가닥(1604)을 보여준다. 도 17은 Z-DNA 배열의 표적 서열/올리고뉴클레오티드 가닥(1604')을 보여준다. 도 18은 "헤어핀" 배열의 표적 서열/올리고뉴클레오티드 가닥(1604")을 보여준다. 3D 나노포어 디바이스/센서(1600)는 표적 서열/올리고뉴클레오티드 가닥(1604, 1604', 1604'')이 DI 수 환경에서 올리고뉴클레오티드 프로브(1603)에 결합할 때 신호 변화를 측정할 수 있다. 이러한 실시간 신호 변화는 입체형태 변화를 결정하기 위해 분석될 수 있다.
수화 변화
일부 구현예에서, 메틸화는 올리고뉴클레오티드의 수화에 대한 변화를 초래할 수 있다. 수화 변화는 상보적 가닥 사이의 수소 결합 동안 올리고뉴클레오티드 구성을 변화시킴으로써 감지 메커니즘에 영향을 미칠 수 있다. 구성 변화는 전극에 의한 신호 판독(예를 들어, 출력 전류)의 변화를 초래할 수 있다. 신호에서 측정된 변화는 수화 변화를 결정하기 위해 분석될 수 있다.
도 19는 일부 구현예에 따른 메틸화된 시토신 염기를 갖는 DNA 분자에서 신호 변화의 수화 매개 메커니즘을 개략적으로 예시한다. 메틸화된 시토신 염기는 표적 서열/올리고뉴클레오티드 가닥의 수화 정도에 영향을 미친다. 수화 변화는 차례로 서열/올리고뉴클레오티드 가닥 및 올리고뉴클레오티드 프로브의 전하 배열에 영향을 미친다. 3D 나노포어 디바이스/센서는 표적 서열/올리고뉴클레오티드 가닥이 DI 수 환경에서 올리고뉴클레오티드 프로브에 결합할 때 신호 변화를 측정할 수 있다. 이러한 실시간 신호 변화는 수화 변화를 결정하기 위해 분석될 수 있다.
나노포어 검출 시스템을 사용하여 DNA의 메틸화를 검출하는 방법
도 13에 도시된 것과 같은 참조 데이터로, 본원에 기재된 나노포어 검출 시스템은 올리고뉴클레오티드의 메틸화를 검출하는 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 14는 일부 구현예에 따른 나노포어 검출 시스템을 사용하여 올리고뉴클레오티드의 메틸화의 방법(1400)을 도시한다. 단계(1410)에서, 표적 올리고뉴클레오티드가 정제된다. 표적 올리고뉴클레오티드는 유전자(예를 들어, 암 억제 유전자)의 프로모터에서 CpG 섬일 수 있다.
단계(1412)에서, 나노채널이 기능화된다. 나노채널은 상부 및 하부 챔버가 3D 나노채널 어레이에서 복수의 나노채널에 의해 유체 커플링되도록 상부 및 하부 챔버에 배치된 3D 나노채널 어레이와 함께, 상부 및 하부 챔버를 갖는 3D 나노포어 디바이스에 있다. 나노채널은 올리고뉴클레오티드 프로브를 나노채널을 한정하는 3D 나노포어 디바이스의 내표면에 커플링함으로써 기능화될 수 있고, 여기서 올리고뉴클레오티드 프로브는 올리고뉴클레오티드에 상보적이다.
단계(1414)에서, 올리고뉴클레오티드를 갖는 DI 수용액이 3D 나노포어 디바이스에 첨가된다.
단계(1416)에서, 3D 나노포어 디바이스의 상부 및 하부 챔버에서 상부 및 하부 전극에 전기영동 바이어스가 인가되어 나노채널을 통해 하전된 입자를 구동시킨다.
단계(1418)에서, 3D 나노포어 디바이스에서 복수의 나노채널의 나노채널을 통해 올리고뉴클레오티드의 흐름을 지시하기 위해 3D 나노포어 디바이스에서 제1 및 제2 게이팅 나노전극에 선택 바이어스가 인가된다.
단계(1420)에서, 출력 전류를 유발하기 위해 3D 나노포어 디바이스의 감지 전극에 감지 바이어스가 인가된다.
단계(1422)에서, 감지 전극으로부터 출력 전류가 검출된다.
단계(1424)에서, 감지 나노전극으로부터의 출력 전류로 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 결정한다. 예를 들어, 출력 전류는 도 13에 도시된 것과 같은 참조 데이터와 비교될 수 있다. 3D 나노포어 디바이스에 인가된 감지 바이어스를 변경/스위핑하면서 다중 출력 전류 측정을 수행하면 메틸화 백분율 결정의 정확도를 개선할 수 있다.
본원에 기재된 나노포어 검출 시스템은 완충제로서 DI 수와 함께 작동하는 3D 센서이다. 나노규모의 작은 공간 내에서 물 분자에 대한 기능 및 정확한 작용 메커니즘은 이전에 조사 및 이해되지 않았지만, 본원에 기재된 3D 어레이의 매우 민감하고 명확한 분해능은 전해질 또는 다른 완충 용액 대신에 DI 수를 사용하는 이점으로서, 그러한 민감한 센서 내의 소음 수준을 증가시키는 이점을 입증할 수 있다.
본원에 기재된 나노포어 검출 시스템에서 반응 및 신호 생성의 메커니즘은 상기 기재된 프로브에 부착되는 메틸화된 DNA 분자의 수화로 인해 표면에서 전하 분포를 변화시키는 것에 기초한다. 이러한 수화는 게이트 나노전극에서 전하 밀도의 재분배와 함께 전극에 변화를 일으킨다. 나노포어 내부의 나노전극은 나노포어를 둘러싸는 올-어라운드(all-around) 또는 벨트-유사 형태를 가지며, 이는 나노포어 센서의 감도를 증가시킨다.
각 나노포어에서 상이한 전위 구배를 사용함으로써, 사용자는 각 나노포어 내부 및 이를 통해 이동하는 하전된 생체분자의 속도를 제어할 수 있다. 나노포어에서 감지 영역의 데바이(Debye) 길이를 증가시키기 위해 저농도 완충제/전해질 또는 DI 수를 사용하는 것은 본원에 기재된 3D 나노포어 검출 시스템의 독특한 특성 중 하나이다. 사용자는 상기 기재된 바와 같이 하전된 표적 바이오폴리머의 이동 및 나노전극 사이의 핑-퐁 운동을 전기영동적으로 제어하기 위해 각각의 나노전극에 대한 전위의 양 및 지속기간을 변화시킴으로써 나노포어 검출 시스템을 광범위하게 제어할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 하전된 표적 바이오폴리머가 나노전극 전위를 변화/교대시키면서 나노전극 사이에서 앞뒤로 이동할 때, 하전된 표적 바이오폴리머가 프로브에 부착되는 데 필요한 시간은 10분 미만으로 감소될 것이다. 부착 시간의 이러한 감소는 표적과 프로브 사이의 상호작용이 증가하여 이들이 더 짧은 시간에 서로 결합할 수 있게 한다.
본원에 기재된 것과 같은 나노포어 검출 시스템의 일부 구현예에서, 나노포어 구조의 크기, 형상, 및 깊이는 프로브의 크기에 기초하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 50 nm(500 Å)의 직경을 갖는 공극 크기는 40 bp 프로브로 표적 바이오폴리머를 감지하는 데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 100 nm의 직경을 갖는 공극 크기는 100 bp 초과의 프로브를 갖는 표적 바이오폴리머를 감지하는 데 사용될 수 있다. 추가의 다른 구현예에서, 200 nm의 직경을 갖는 공극 크기는 여전히 더 긴 프로브를 갖는 표적 바이오폴리머를 감지하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 3D 나노포어 어레이 센서는 2D 또는 평면 구조 센서에 비해 더 민감하고 컴팩트한데, 그 이유는 나노포어의 3D 어레이가 표면 대 부피 비율을 증가시켜 나노포어 어레이의 나노채널 내부의 스마트 표면의 소형화를 가능하게 하기 때문이다. 높은 표면 대 부피 비율은 매우 낮은 농도(예를 들어, 10 펨토몰)의 DNA 메틸화를 감지할 수 있게 한다.
본원에 기재된 3D 나노포어 어레이 센서는 유전체 층이 각 나노채널의 내표면을 절연시켜, 각각의 나노채널에 대한 커패시턴스 효과 및 전기장 효과의 제어를 향상시키기 때문에 전하 섭동 또는 전기화학 기반 센서 시스템과 비교하여 더 나은 제어를 제공한다.
본원에 기재된 3D 나노포어 어레이 센서는 고정된 프로브로 DNA 메틸화를 감지하기 위해 커패시턴스 변화를 이용할 수 있다. 표적 DNA 분자가 어레이 구조의 나노포어 내를 통과할 때(외부 전압에 의해 전기영동적으로 구동됨), 상부 및 하부 전극은 나노포어 구조 내에서 통과하는 DNA 분자로부터 야기되는 전위의 변화를 기록하여, 커패시터와 같이 나노포어를 분극화시킨다. 생성된 커패시턴스 변동은 표적 DNA 분자의 통과를 검출하기 위해 전자적으로 측정될 수 있다. DNA 분자의 속도는 인가된 포지티브 게이트 바이어스를 제어함으로써 제어될 수 있어, 3D 나노포어 어레이 센서가 메틸화 검출에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 3D 나노포어 어레이 센서는 터널링 전류와 커패시턴스 변화 둘 모두를 검출함으로써 DNA 메틸화의 통과를 검출할 수 있다. 이전의 기존 생물학적 나노포어는 이들의 구조에 나노전극이 내장되어 있지 않기 때문에 터널링 전류 및 커패시턴스 변화를 검출할 수 없다.
본원에 기재된 3D 나노포어 어레이 센서에 사용되는 프로브는 이들의 표면 화학을 변경하여 더 많은 시스템 제어 및 설계 옵션을 허용하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 티올 변형은 티올 골드 결합에 사용될 수 있다. 아비딘/비오틴 및 EDC 가교제/N-하이드록시석신이미드(NHS)는 고정화 기술의 구조 및 화학의 변형으로 본원에 기재된 3D 나노포어 어레이 센서와 함께 사용될 수 있는 다른 프로브 변형 및 표적 쌍이다.
아래의 청구항들의 모든 수단들 또는 단계 + 기능 요소들의 대응하는 구조들, 재료들, 작용들 및 등가물들은 구체적으로 청구된 바와 같이 다른 청구된 요소들과 조합하여 기능을 수행하기 위한 임의의 구조들, 재료들, 작용들 및 등가물들을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명이 위의 구현예들과 연계하여 설명되었지만, 이전의 설명 및 청구항들은 본 발명의 범위를 제한하지 않아야 하는 것이 이해되어야 한다. 본 발명에 대한 범위 내의 다른 양상들, 이점들 및 수정들은 본 발명이 속하는 당업자들에게 명백할 것이다.
본 발명의 다양한 예시적인 구현예들이 본원에서 설명된다. 이러한 예들에 대한 참조는 비제한적인 의미로 이루어진다. 이들은 본 발명의 보다 폭넓게 적용가능한 양상들을 예시하도록 제공된다. 설명된 본 발명에 대한 다양한 변경들이 이루어질 수 있으며, 등가물들은 본 발명의 진정한 사상 및 범주로부터 벗어나지 않고 치환될 수 있다. 또한, 본 발명의 물질, 공정, 공정 행위(들) 또는 단계(들)의 특정 상황, 재료, 조성을 본 발명의 목적(들), 사상 또는 범위에 맞게 조정하도록 다수 변형들이 이루어질 수 있다. 추가로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에서 설명된 그리고 예시된 각각의 개별적인 변형들은 본 발명들의 범주 또는 사상으로부터 벗어나지 않고 다른 수개의 구현예들 중 임의의 구현예의 특징들로부터 쉽게 분리될 수 있거나 이 특징들과 조합될 수 있는 별개의 컴포넌트들 및 특징들을 갖는다. 모든 이러한 수정들은 본 개시와 연관된 청구항들의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
대상 진단 또는 중재 절차들을 실행하기 위해 설명되는 디바이스들 중 임의의 디바이스는 이러한 중재들을 실행할 때의 사용을 위해 패키징된 조합으로 제공될 수 있다. 이러한 공급 "키트들"은, 사용을 위한 설명서들을 더 포함할 수 있고, 이러한 목적들을 위해 일반적으로 채택되는 바와 같은 살균 트레이들 또는 용기들에서 패키징될 수 있다.
본 발명은 대상 디바이스들을 사용하여 수행될 수 있는 방법들을 포함한다. 상기 방법은 이러한 적합한 디바이스를 제공하는 작용을 포함할 수 있다. 이러한 제공은 최종 사용자에 의해 수행될 수 있다. 다시 말해서, "제공" 작용은 단지, 대상 방법에서 필수 디바이스를 제공하기 위해 최종 사용자 획득, 접근, 접근법, 포지션, 셋-업, 활성화, 파워-업 또는 그렇지 않으면 작용을 요구한다. 본원에서 인용되는 방법들은, 상황들의 인용된 순서뿐만 아니라 논리적으로 가능한 인용된 상황들의 임의의 순서로 실행될 수 있다.
본 발명의 예시적인 양태는 재료 선택 및 제조와 관한 세부 사항과 함께 상기 기재되어 있다. 본 발명의 다른 세부 사항으로서, 이들은 상기 참조된 특허 및 간행물과 연관하여 인지될 수 있을 뿐만 아니라, 당업자에게 일반적으로 공지되거나 인지될 수 있다. 이는 일반적으로 또는 논리적으로 사용되는 추가 작용과 관련하여 본 발명의 방법-기반 양태에 대하여 동일하게 적용될 수 있다.
또한, 비록 본 발명이 다양한 특징들을 선택적으로 포함하는 수개의 예들을 참조하여 설명되었지만, 본 발명은 본 발명의 각각의 변형에 대해 고려되는 바와 같이 설명되거나 표시되는 것에 제한되지 않는다. 설명된 발명들에 대한 다양한 변경들이 이루어질 수 있으며, (본원에 인용되거나 일부 간결성을 위해 포함되지 않은 것과 관계없이) 등가물들은 본 발명의 진정한 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 치환될 수 있다. 또한, 값들의 범위가 제공되는 경우, 이러한 범위의 상한 및 하한 사이의 각각의 사이 값(intervening value) 및 언급된 이러한 범위에서 임의의 다른 언급된 값 또는 사이 값은 본 발명 내에 포함되는 것이 이해된다.
또한, 설명되는 발명의 변형들의 임의의 선택적인 특징이 독립적으로, 또는 본원에 설명되는 특징들 중 임의의 하나 이상과 조합하여 제시될 수 있고 청구될 수 있는 것이 고려된다. 단수형 용어에 대한 참조는 복수의 동일한 물품들이 존재하는 가능성을 포함한다. 보다 구체적으로, 본원에 그리고 이에 연관된 청구항들에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태들은 문맥에서 명확하게 달리 표현되지 않는 한 복수의 언급들을 포함한다. 다시 말해서, 관사들(articles)의 사용은 본 개시와 연관된 청구항들뿐만 아니라 위의 설명에서 대상 항목 중 "적어도 하나"를 허용한다. 이러한 청구항들이 임의의 선택적인 요소를 제외하도록 작성될 수 있는 것이 추가적으로 유의된다. 이로써, 이러한 언급은 청구항 요소들의 인용, 또는 "부정적인" 제한의 사용과 연관되어 "오직", "단지" 등과 같은 이러한 배타적인 전문용어의 사용을 위한 선행어 기초로서의 역할을 하는 것으로 의도된다.
이러한 배타적인 전문용어의 사용 없이, 본 개시와 연관된 청구항들에서의 용어 "포함하는"은 ─ 주어진 수의 요소들이 이러한 청구항들에서 열거되거나 특징의 추가가 이러한 청구항들에서 제시되는 요소의 특성을 변형하는 것으로 간주될 수 있는 여부와 관계 없이 ─ 임의의 부가의 요소의 포함을 허용한다. 본원에서 구체적으로 규정되는 바를 제외하고, 본원에서 사용되는 모든 기술적 그리고 과학적 용어들은, 청구항 유효성을 유지하면서, 가능한 폭넓게 일반적으로 이해되는 의미로서 제공되어야 한다.
본 발명의 범위(breadth)는 제공되는 예들 및/또는 대상 규격에 제한되지 않아야 하며, 오히려 단지 본 개시와 연관된 청구항 언어의 범위에 의해서만 제한되어야 한다.

Claims (33)

  1. 올리고뉴클레오티드 메틸화 백분율을 결정하는 방법으로서,
    상부 및 하부 챔버를 갖는 3D 나노포어 디바이스, 및 상기 상부 및 하부 챔버가 3D 나노채널 어레이에서 복수의 나노채널에 의해 유체 커플링되도록 상기 상부 및 하부 챔버에 배치되는 상기 3D 나노채널 어레이를 제공하고;
    올리고뉴클레오티드를 정제하고;
    올리고뉴클레오티드 프로브를 상기 나노채널을 한정하는 상기 3D 나노포어 디바이스의 내표면에 커플링함으로써 상기 3D 나노채널 어레이를 기능화시키고(여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적임);
    상기 정제된 올리고뉴클레오티드를 DI 수에 첨가하여 알려진 농도를 갖는 올리고뉴클레오티드 용액을 형성시키고;
    상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 상기 올리고뉴클레오티드 용액을 상기 상부 및 하부 챔버에 첨가하고;
    상기 상부 및 하부 챔버에 각각 상부 및 하부 전극을 배치하고;
    상기 상부 전극과 하부 전극 사이에 전기영동 바이어스를 인가하고;
    상기 3D 나노포어 디바이스에서 제1 및 제2 게이팅 나노전극에 걸쳐 선택 바이어스를 인가하여 상기 복수의 나노채널의 나노채널을 통해 상기 올리고뉴클레오티드의 흐름을 지시하고;
    상기 3D 나노포어 디바이스에서 감지 나노전극을 통해 감지 바이어스를 인가하고;
    상기 감지 나노전극으로부터 출력 전류를 검출하고;
    상기 감지 나노전극으로부터의 상기 출력 전류를 분석하여 상기 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 결정함을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 제2 나노채널을 한정하는 3D 나노포어 디바이스의 내표면에 커플링함으로써 3D 나노채널 어레이를 기능화시키는 것을 추가로 포함하고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드 프로브가 상기 올리고뉴클레오티드와 상이한, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 감지 전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 결정하는 것이 출력 전류 및 감지 바이어스를 알려진 농도에 대한 참조 표의 상응하는 값과 비교하는 것을 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 감지 전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 결정하는 것이 올리고뉴클레오티드의 포스페이트 백본의 전하에 대한 메틸화 효과를 이용하는 것을 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    3D 나노포어 디바이스에서 감지 나노전극을 통해 제2 감지 바이어스를 인가하고;
    상기 감지 나노전극으로부터 제2 출력 전류를 검출하고;
    상기 감지 나노전극으로부터의 상기 제2 출력 전류를 분석하여 상기 올리고뉴클레오티드의 제2 메틸화 백분율을 결정하고;
    상기 올리고뉴클레오티드의 상기 제2 메틸화 백분율을 상기 올리고뉴클레오티드의 상기 메틸화 백분율과 비교하여 상기 올리고뉴클레오티드의 상기 메틸화 백분율을 확인하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 RNA 분자 단편인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 DNA 분자 단편인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 무세포 DNA로부터 추출되는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 조직 또는 세포 배양 배지로부터 추출되는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 혈청, 소변, 혈장, 또는 타액으로부터 추출되는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 3D 나노포어 디바이스에서 전하 운반체가 DI 수, H+ 이온, 및 OH- 이온을 포함하는, 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 용액을 상부 및 하부 챔버로부터 제거하고;
    제2 올리고뉴클레오티드를 정제하고;
    제2 올리고뉴클레오티드 프로브를 나노채널을 한정하는 3D 나노포어 디바이스의 내표면에 커플링함으로써 3D 나노채널 어레이를 기능화시키고(여기서, 상기 제2 올리고뉴클레오티드 프로브는 상기 제2 올리고뉴클레오티드에 상보적임);
    상기 정제된 제2 올리고뉴클레오티드를 DI 수에 첨가하여 알려진 농도를 갖는 제2 올리고뉴클레오티드 용액을 형성시키고;
    상기 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 상기 제2 올리고뉴클레오티드 용액을 상기 상부 및 하부 챔버에 첨가하고;
    상기 상부 전극과 하부 전극 사이에 전기영동 바이어스를 인가하고;
    상기 3D 나노포어 디바이스에서 제1 및 제2 게이팅 나노전극에 걸쳐 선택 바이어스를 인가하여 상기 나노채널을 통해 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 흐름을 지시하고;
    상기 3D 나노포어 디바이스에서 상기 감지 나노전극을 통해 감지 바이어스를 인가하고;
    상기 감지 나노전극으로부터 제2 출력 전류를 검출하고;
    상기 감지 나노전극으로부터의 상기 제2 출력 전류를 분석하여 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    3D 나노포어 디바이스에서 제3 및 제4 게이팅 나노전극에 걸쳐 제2 선택 바이어스를 인가하여 복수의 나노채널의 제2 나노채널을 통해 제2 올리고뉴클레오티드의 흐름을 지시하고;
    상기 3D 나노포어 디바이스에서 제2 감지 나노전극을 통해 제2 감지 바이어스를 인가하고;
    상기 제2 감지 나노전극으로부터 제2 출력 전류를 검출하고;
    상기 제2 감지 나노전극으로부터의 상기 제2 출력 전류를 분석하여 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 감지 전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 결정하는 것이 메틸 시토신 메틸화와 하이드록시 메틸 시토신 메틸화를 구별하는 것을 포함하는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 메틸화 백분율을 알려진 돌연변이에 상응하는 메틸화 패턴의 라이브러리와 비교하여 질병을 진단하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 질병이 암, 죽상동맥경화증, 또는 노화인, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프로브가 DNA 프로브, RNA 프로브, 또는 단백질 프로브인, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 감지 나노전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드에서 다수의 메틸화 부위를 정량화하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 3D 나노포어 디바이스에서 속도 제어 나노전극에 속도 제어 바이어스를 인가하여 나노채널을 통해 올리고뉴클레오티드의 전위 속도를 조절하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 전류가 전극 전류인, 방법.
  21. 제1항에 있어서, 전류가 터널링 전류인, 방법.
  22. 제1항에 있어서,
    제1 게이팅 나노전극이 나노채널의 제1 말단을 어드레싱하고,
    제2 게이팅 나노전극이 상기 제1 단부 반대편에 있는 상기 나노채널의 제2 단부를 어드레싱하고,
    감지 나노전극이 상기 제1 말단과 제2 말단 사이의 상기 나노채널에서 제1 위치를 어드레싱하는, 방법.
  23. 제1항에 있어서, 대안적으로 전기영동 바이어스 및 선택 바이어스를 역전시켜 제1 및 제2 게이팅 나노전극 사이의 나노채널을 통한 올리고뉴클레오티드의 교대 흐름을 지시하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 3D 나노포어 디바이스가 모바일 애플리케이션, 랩톱 컴퓨터, 또는 데스크탑 컴퓨터에 통합되는, 방법.
  25. 제1항에 있어서, 3D 나노포어 디바이스가 미세유체 디바이스, 나노유체 디바이스, 나노디바이스, 또는 랩-온-칩 시스템에 통합되는, 방법.
  26. 제1항에 있어서, 3D 나노포어 디바이스가 올리고뉴클레오티드의 추출 및 감지를 위해 올-인-원 ASIC 플랫폼 시스템에 통합되는, 방법.
  27. 제1항에 있어서, 약 10 펨토몰(검출 한계)의 올리고뉴클레오티드의 최소 농도에서 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 검출하는 3D 나노포어 디바이스를 추가로 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 증폭 또는 PCR의 사용 없이 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 검출하는 3D 나노포어 디바이스를 추가로 포함하는, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 3D 나노포어 디바이스가 올리고뉴클레오티드의 증폭 또는 PCR의 사용 없이 검출을 수행하기 위해 액체 생검 패널 플랫폼에 통합되는, 방법.
  30. 제1항에 있어서, 감지 나노전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드의 입체형태 변화를 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  31. 제1항에 있어서, 감지 나노전극으로부터의 출력 전류를 분석하여 올리고뉴클레오티드의 수화 변화를 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  32. 올리고뉴클레오티드 입체형태 변화를 결정하는 방법으로서,
    상부 및 하부 챔버를 갖는 3D 나노포어 디바이스, 및 상기 상부 및 하부 챔버가 3D 나노채널 어레이에서 복수의 나노채널에 의해 유체 커플링되도록 상기 상부 및 하부 챔버에 배치되는 상기 3D 나노채널 어레이를 제공하고;
    올리고뉴클레오티드를 정제하고;
    올리고뉴클레오티드 프로브를 상기 나노채널을 한정하는 상기 3D 나노포어 디바이스의 내표면에 커플링함으로써 상기 3D 나노채널 어레이를 기능화시키고(여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적임);
    상기 정제된 올리고뉴클레오티드를 DI 수에 첨가하여 알려진 농도를 갖는 올리고뉴클레오티드 용액을 형성시키고;
    상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 상기 올리고뉴클레오티드 용액을 상기 상부 및 하부 챔버에 첨가하고;
    상기 상부 및 하부 챔버에 각각 상부 및 하부 전극을 배치하고;
    상기 상부 전극과 하부 전극 사이에 전기영동 바이어스를 인가하고;
    상기 3D 나노포어 디바이스에서 제1 및 제2 게이팅 나노전극에 걸쳐 선택 바이어스를 인가하여 상기 복수의 나노채널의 나노채널을 통해 상기 올리고뉴클레오티드의 흐름을 지시하고;
    상기 3D 나노포어 디바이스에서 감지 나노전극을 통해 감지 바이어스를 인가하고;
    상기 감지 나노전극으로부터 출력 전류를 검출하고;
    상기 감지 나노전극으로부터의 상기 출력 전류를 분석하여 상기 올리고뉴클레오티드의 입체형태 변화를 결정함을 포함하는, 방법.
  33. 올리고뉴클레오티드 수화 변화를 결정하는 방법으로서,
    상부 및 하부 챔버를 갖는 3D 나노포어 디바이스, 및 상기 상부 및 하부 챔버가 3D 나노채널 어레이에서 복수의 나노채널에 의해 유체 커플링되도록 상기 상부 및 하부 챔버에 배치되는 상기 3D 나노채널 어레이를 제공하고;
    올리고뉴클레오티드를 정제하고;
    올리고뉴클레오티드 프로브를 상기 나노채널을 한정하는 상기 3D 나노포어 디바이스의 내표면에 커플링함으로써 상기 3D 나노채널 어레이를 기능화시키고(여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적임);
    상기 정제된 올리고뉴클레오티드를 DI 수에 첨가하여 알려진 농도를 갖는 올리고뉴클레오티드 용액을 형성시키고;
    상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 상기 올리고뉴클레오티드 용액을 상기 상부 및 하부 챔버에 첨가하고;
    상기 상부 및 하부 챔버에 각각 상부 및 하부 전극을 배치하고;
    상기 상부 전극과 하부 전극 사이에 전기영동 바이어스를 인가하고;
    상기 3D 나노포어 디바이스에서 제1 및 제2 게이팅 나노전극에 걸쳐 선택 바이어스를 인가하여 상기 복수의 나노채널의 나노채널을 통해 상기 올리고뉴클레오티드의 흐름을 지시하고;
    상기 3D 나노포어 디바이스에서 감지 나노전극을 통해 감지 바이어스를 인가하고;
    상기 감지 나노전극으로부터 출력 전류를 검출하고;
    상기 감지 나노전극으로부터의 상기 출력 전류를 분석하여 상기 올리고뉴클레오티드의 수화 변화를 결정함을 포함하는, 방법.
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