JP2023516276A - ナノポアデバイスおよびそれを用いる荷電粒子の検出・分類方法 - Google Patents

ナノポアデバイスおよびそれを用いる荷電粒子の検出・分類方法 Download PDF

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Abstract

オリゴヌクレオチドのメチル化率を特定する方法は、上部チャンバおよび下部チャンバを有する３Ｄナノポアデバイス、およびその中に配置された３Ｄナノチャネルアレイを提供するステップを含む。この方法はまた、オリゴヌクレオチドを精製するステップと、オリゴヌクレオチドプローブを結合することによって３Ｄナノチャネルアレイを機能化するステップとを含む。この方法は、既知の濃度を有するオリゴヌクレオチド溶液を形成するステップと、オリゴヌクレオチド溶液を上部チャンバおよび下部チャンバに加えるステップとをさらに含む。さらにこの方法は、上部チャンバと下部チャンバに上部電極と下部電極をそれぞれ配置するステップと、上部電極と下部電極の間に電気泳動バイアスを印加するステップと、第１および第２のゲートナノ電極に選択バイアスを印加するステップと、３Ｄナノポアデバイス検出ナノ電極を介して検出バイアスを印加するステップとを含む。さらにこの方法は、検出用ナノ電極からの出力電流を検出するステップと、検出用ナノ電極からの出力電流を分析してオリゴヌクレオチドのメチル化率を特定するステップとを含む。【選択図】図１４

Description

本発明は、一般に、エピジェネティック異常（epigenetic alterations）を特徴付けるためのシステムおよびデバイス、並びにそのようなシステムおよびデバイスを用いてゲノム中のメチル化パターンを検出する方法に関する。特に、本発明は、メチル化パターンを検出するためのナノポアセンサに関する。開示されるナノポアセンサは、ゲノム由来オリゴヌクレオチドにおけるメチル化パターンを特徴付ける（例えば、ゲノム由来オリゴヌクレオチドにおけるＤＮＡメチル化を検出する）ことにより、エピジェネティック異常の特徴付けを容易にする。
癌の早期発見および治療は、何百万人もの命を救うことができる。したがって、ゲノム内の特定の遺伝子におけるエピジェネティック異常を安価、迅速、正確、かつ早期に検出するための装置（例えば、ベッドサイド／ポイントオブケア検出システム）および方法が必要とされている。
癌の病因には、細胞機能の様々な変化をもたらし得る多くのタイプの遺伝子変化が含まれる。癌の病因には、遺伝子の突然変異に加えて、遺伝子発現と癌に直接関係するエピジェネティック異常が含まれる。エピジェネティック異常を検出することで、癌を検出するための効果的なスクリーニング技術を提供し、その後の治療と、特定の早期発見された癌に適合した治療介入による治癒を実現することができる。
シトシンポリグアニンアイランド（「ＣｐＧアイランド」）のメチル化、ヒストン修飾、およびクロマチンの再編成など、遺伝子の活性化・サイレンシングを制御する様々なエピジェネティックなメカニズムが存在する。ＤＮＡメチル化は、ＤＮＡの転写と複製を制御できるエピジェネティックなメカニズムである。幹細胞から組織特異的な細胞型に分化する際のメチル化パターンは、その後の細胞分裂においても保存され、新しく形成された組織において特定の細胞型が維持される。
多くの遺伝子が活性化または抑制（silenced）されて、発癌を引き起こす可能性がある。いくつかの突然変異は遺伝子のサイレンシングをもたらすが、発癌性の遺伝子サイレンシングの大部分は、ＤＮＡメチル化の結果である。ＣｐＧアイランド内の複数のＣｐＧサイト、特にタンパク質プロモーター領域におけるＤＮＡメチル化は、発癌抑制遺伝子（エラー修正酵素など）のサイレンシングを介して癌を引き起こす可能性がある。
他のプロセスによって引き起こされる遺伝子のサイレンシングも、遺伝子サイレンシングの後にＣｐＧアイランドのプロモーターがメチル化されたら、安定化させることができる。メチル化は、遺伝子サイレンシングに非常に有効である。例えば、プロモータ領域のＣｐＧアイランドのハイパーメチル化は、プロモーター領域自体のＤＮＡ変異と比較して、遺伝子サイレンシングにおいて１０倍の効果がある。
したがって、対象の標的遺伝子／配列のメチル化量を測定することで、特定の配列のハイパーメチル化の検出および関連疾患の診断、疾患予後判定、および／または疾患のモニタリングを実現することができる。メチル化の測定が約１０分で完了できれば、そのような迅速な測定によって、ポイントオブケア診断、予後判定、および疾患のモニタリングが容易になる。そのようなメチル化の測定は、ＤＮＡメチル化のようなエピジェネティック異常を伴う疾患であれば、（例えば、癌に加えて）他の疾患のモニタリングも可能となる。
ナノポアベースのＤＮＡ配列決定のための初期の実験システムは、αヘモリジン（αＨＬ）タンパク質のナノポアを通過するｓｓＤＮＡの電気的挙動を検出するものである。それ以来、ナノポアベースの核酸配列決定技術が改良されてきた。例えば、固体ナノポアベースの核酸配列決定は、本書に記載するように、生物／タンパク質ベースのナノポアを固体（例えば、半導体、金属ゲート）ナノポアに置き換える。
ナノポアは、微小孔（例えば、ナノメートル範囲の直径を有する）であり、イオン電流および／またはトンネル電流の変化により、孔を通る荷電粒子（例えば、メチル化オリゴヌクレオチドなど）の流れを検出することができる。ナノポアは電気的なセンシングに基づく技術であり、従来の検出方法よりもはるかに少ない濃度・量のオリゴヌクレオチドのメチル化を検出することが可能である。ナノポアを用いたメチル化オリゴヌクレオチド検出の利点は、長い読み取り長、プラグアンドプレイ機能、スケーラビリティなどである。半導体製造技術の進歩により、固体ナノポアは、機械的、化学的、熱的特性に優れ、半導体技術との互換性があるため、他の検出回路やナノデバイスと統合できることもあり、生体ナノポアの安価で優れた代替品となった。
図１は、最先端の固体ベースの二次元（「２Ｄ」）ナノポア感知デバイス１００を概略的に示す。デバイス１００は「二次元」と呼ばれるが、デバイス１００はＺ軸に沿ってある程度の厚みを有する。現在の最先端のナノポア技術のこれらの欠点（感度と一部の製造コスト）のいくつかに対処するために、生体分子の並列処理を可能にするマルチチャネルナノポアアレイを使用して、増幅なしの迅速なＤＮＡメチル化検出を達成することができる。
本明細書に記載されるように、ゲノム中の特定の遺伝子におけるエピジェネティック異常を手頃な価格で、迅速に、正確に、かつ早期に検出するためのデバイス（例えば、ベッドサイド／ポイント・オブ・ケア検出システム）および方法が必要とされている。特に、ゲノムＤＮＡメチル化を検出するためのそのようなデバイスおよび方法が必要とされている。
本明細書に記載の実施形態は、ナノポアベースの電気的に補助されたメチル化検出システム、およびそれを用いるＤＮＡメチル化検出方法を対象とする。特に、実施形態は、様々なタイプ（２Ｄまたは３Ｄ）のナノポアベースのメチル化検出システム、ナノポアアレイデバイスの使用方法、およびそれを用いるメチル化検出方法を対象とする。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドのメチル化率を特定する方法は、上部チャンバおよび下部チャンバを有する３Ｄナノポアデバイスと、３Ｄナノチャネルアレイ内の複数のナノチャネルによって上部チャンバおよび下部チャンバが流体結合されるように上部チャンバおよび下部チャンバ内に配置された３Ｄナノチャネルアレイを提供するステップを含む。この方法はまた、オリゴヌクレオチドを精製するステップを含む。この方法はさらに、ナノチャネルを規定する３Ｄナノポアデバイスの内面にオリゴヌクレオチドプローブを結合することによって３Ｄナノチャネルアレイを機能化する（functionalizing）ステップを含み、ここでオリゴヌクレオチドプローブはオリゴヌクレオチドに相補的（complementary）である。さらに、この方法は、精製されたオリゴヌクレオチドを脱イオン水（DI water）に加え、既知の濃度を有するオリゴヌクレオチド溶液を形成するステップを含む。さらにこの方法は、オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド溶液を上部チャンバおよび下部チャンバに加えるステップを含む。この方法はまた、上部チャンバおよび下部チャンバにそれぞれ上部電極および下部電極を配置するステップを含む。この方法は、上部電極と下部電極との間に電気泳動バイアスを印加するステップをさらに含む。さらにこの方法は、３Ｄナノポアデバイス内の第１および第２のゲートナノ電極にわたって選択バイアスを印加して、複数のナノチャネルのうちの１のナノチャネルを通るようにオリゴヌクレオチドの流れを導くステップを含む。さらにこの方法は、３Ｄナノポアデバイスの検出ナノ電極を介して検出バイアスを印加するステップを含む。この方法はまた、検出ナノ電極からの出力電流を検出することも含む。この方法は、オリゴヌクレオチドのメチル化率を特定するために、検出ナノ電極からの出力電流を分析するステップをさらに含む。
１以上の実施形態において、方法はまた、第２のオリゴヌクレオチドプローブを、第２のナノチャネルを規定する３Ｄナノポアデバイスの内面に結合することによって３Ｄナノチャネルアレイを機能化するステップを含み、ここで第２のオリゴヌクレオチドプローブはオリゴヌクレオチドプローブとは異なる。検出電極からの出力電流を分析してオリゴヌクレオチドのメチル化率を特定するステップは、出力電流および検出バイアスを、既知の濃度の参照表の対応する値と比較するステップを含み得る。検出電極からの出力電流を分析してオリゴヌクレオチドのメチル化率を特定するステップは、オリゴヌクレオチドのリン酸バックボーンの電荷に対するメチル化の影響を用いるステップを含み得る。
１以上の実施形態において、方法はまた、３Ｄナノポアデバイスの検出ナノ電極を通して第２の検出バイアスを印加するステップを含む。この方法はさらに、検出ナノ電極からの第２の出力電流を検出するステップを含む。さらにこの方法は、オリゴヌクレオチドの第２のメチル化率を特定するために、検出ナノ電極からの第２の出力電流を分析するを含む。さらにこの方法は、オリゴヌクレオチドのメチル化率を確認するために、オリゴヌクレオチドの第２のメチル化率をオリゴヌクレオチドのメチル化率と比較するステップを含む。
１以上の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ分子フラグメントまたはＤＮＡ分子フラグメントである。オリゴヌクレオチドは、無細胞ＤＮＡ、組織、細胞培養培地、血清、尿、血漿、または唾液から抽出することができる。３Ｄナノポアデバイスの電荷キャリアには、脱イオン水、Ｈ＋イオン、およびＯＨ－イオンが含まれ得る。
１以上の実施形態において、この方法はまた、オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド溶液を上部チャンバおよび下部チャンバから除去するステップを含む。この方法はさらに、第２のオリゴヌクレオチドを精製するステップを含む。さらにこの方法は、ナノチャネルを規定する３Ｄナノポアデバイスの内面に第２のオリゴヌクレオチドプローブを結合することによって３Ｄナノチャネルアレイを機能化するステップを含み、ここで第２のオリゴヌクレオチドプローブは第２のオリゴヌクレオチドに相補的である。さらにこの方法は、精製された第２のオリゴヌクレオチドを脱イオン水に加え、既知の濃度を有する第２のオリゴヌクレオチド溶液を形成するステップを含む。この方法はまた、第２のオリゴヌクレオチドを含む第２のオリゴヌクレオチド溶液を上部チャンバおよび下部チャンバに加えるステップを含む。この方法は、上部電極と下部電極との間に電気泳動バイアスを印加するステップをさらに含む。さらにこの方法は、第２のオリゴヌクレオチドの流れをナノチャネルを通るように導くために、３Ｄナノポアデバイスの第１および第２のゲートナノ電極間に選択バイアスを印加するステップを含む。さらにこの方法は、３Ｄナノポアデバイス内の検出ナノ電極を介して検出バイアスを印加するステップを含む。この方法はまた、検出ナノ電極からの第２の出力電流を検出するステップを含む。この方法はさらに、第２のオリゴヌクレオチドのメチル化率を特定するために、検出ナノ電極からの第２の出力電流を分析するステップを含む。
１以上の実施形態において、方法はまた、複数のナノチャネルのうちの第２のナノチャネルを通るように第２のオリゴヌクレオチドの流れを導くために、３Ｄナノポアデバイスの第３および第４のゲートナノ電極にわたって第２の選択バイアスを印加するステップを含む。この方法はさらに、３Ｄナノポアデバイス内の第２の検出ナノ電極を通して第２の感知バイアスを印加するステップを含む。さらにこの方法は、第２の検出ナノ電極からの第２の出力電流を検出するステップを含む。さらにこの方法は、第２のオリゴヌクレオチドのメチル化率を特定するために、第２の検出ナノ電極からの第２の出力電流を分析するステップを含む。
１以上の実施形態において、オリゴヌクレオチドのメチル化率を特定するために検出電極からの出力電流を分析するステップは、メチルシトシンメチル化とヒドロキシメチルシトシンメチル化とを区別するステップ（differentiating）を含む。この方法はまた、疾患を診断するために、オリゴヌクレオチドのメチル化率を既知の突然変異に対応するメチル化パターンのライブラリと比較するステップを含み得る。疾患は、癌、アテローム性動脈硬化症、または老化であり得る。
１以上の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、またはタンパク質プローブである。この方法はまた、オリゴヌクレオチド中のメチル化部位の数を定量化するために、検出ナノ電極からの出力電流を分析するステップを含み得る。この方法はまた、ナノチャネルを通るオリゴヌクレオチドの移動速度を調節するために、３Ｄナノポアデバイスの速度制御ナノ電極に速度制御バイアスを印加するステップを含み得る。電流は、電極電流またはトンネル電流であり得る。
１以上の実施形態において、第１のゲートナノ電極はナノチャネルの第１の端部にアドレスし、第２のゲートナノ電極はナノチャネルの第１の端部の反対側の第２の端部にアドレスし、検出ナノ電極はナノチャネルの第１の端部と第２の端部の間の第１の位置にアドレスする。この方法はまた、電気泳動バイアスと選択バイアスとを交互に反転させて、第１および第２のゲートナノ電極間のナノチャネルをオリゴヌクレオチドが交互に流れるように導くステップを含み得る。
１以上の実施形態において、３Ｄナノポアデバイスは、モバイルアプリケーション、ラップトップコンピュータ、またはデスクトップコンピュータに統合される。３Ｄナノポアデバイスは、マイクロ流体デバイス、ナノ流体デバイス、ナノデバイス、またはラボオンチップシステムに統合することができる。３Ｄナノポアデバイスは、オリゴヌクレオチドの抽出と検出のためのオールインワンＡＳＩＣプラットフォームシステムに統合することができる。
１以上の実施形態において、方法はまた、３Ｄナノポアデバイスが、約１０フェムトモル（検出限界）のオリゴヌクレオチドの最小濃度でオリゴヌクレオチドプローブへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するステップを含む。この方法はまた、３Ｄナノポアデバイスが、オリゴヌクレオチドの増幅またはＰＣＲを用いることなく、オリゴヌクレオチドプローブへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するステップを含み得る。３Ｄナノポアデバイスは、オリゴヌクレオチドの増幅またはＰＣＲを用いることなく検出を行うために、液体生検パネルプラットフォームに統合され得る。
１以上の実施形態において、方法はまた、オリゴヌクレオチドの構造変化を特定するために、検出ナノ電極からの出力電流を分析するステップを含む。この方法はまた、オリゴヌクレオチドの水和変化を特定するために、検出ナノ電極からの出力電流を分析するステップを含んでもよい。
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドの構造変化を特定する方法は、上部チャンバおよび下部チャンバを有する３Ｄナノポアデバイスと、上部チャンバおよび下部チャンバが３Ｄナノチャネルアレイ内の複数のナノチャネルによって流体結合されるように上部チャンバおよび下部チャンバ内に配置された３Ｄナノチャネルアレイを提供するステップを含む。この方法はまた、オリゴヌクレオチドを精製するステップを含む。この方法はさらに、ナノチャネルを規定する３Ｄナノポアデバイスの内面にオリゴヌクレオチドプローブを結合することによって３Ｄナノチャネルアレイを機能化するステップを含み、ここでオリゴヌクレオチドプローブはオリゴヌクレオチドに相補的である。さらにこの方法は、精製されたオリゴヌクレオチドを脱イオン水に加え、既知の濃度を有するオリゴヌクレオチド溶液を形成するステップを含む。さらにこの方法は、オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド溶液を上部チャンバおよび下部チャンバに加えるステップを含む。この方法はまた、上部チャンバおよび下部チャンバにそれぞれ上部電極および下部電極を配置するステップを含む。この方法はさらに、上部電極と下部電極との間に電気泳動バイアスを印加するステップを含む。さらにこの方法は、複数のナノチャネルのうちの１のナノチャネルにオリゴヌクレオチドの流れを導くために、３Ｄナノポアデバイスの第１および第２のゲートナノ電極にわたって選択バイアスを印加するステップを含む。さらにこの方法は、３Ｄナノポアデバイス内の検出ナノ電極を介して検出バイアスを印加するステップを含む。この方法はまた、検出ナノ電極からの出力電流を検出するステップを含む。
さらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドの水和変化を特定する方法は、上部チャンバおよび下部チャンバを有する３Ｄナノポアデバイスと、３Ｄナノチャネルアレイ内の複数のナノチャネルによって上部チャンバおよび下部チャンバが流体結合されるように上部チャンバおよび下部チャンバ内に配置された３Ｄナノチャネルアレイとを提供するステップを含む。この方法はまた、オリゴヌクレオチドを精製するステップを含む。この方法はさらに、ナノチャネルを規定する３Ｄナノポアデバイスの内面にオリゴヌクレオチドプローブを結合することによって３Ｄナノチャネルアレイを機能化するステップを含み、ここでオリゴヌクレオチドプローブはオリゴヌクレオチドに相補的である。さらにこの方法は、精製されたオリゴヌクレオチドを脱イオン水に加え、既知の濃度を有するオリゴヌクレオチド溶液を形成するステップを含む。さらにこの方法は、オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド溶液を上部チャンバおよび下部チャンバに加えるステップを含む。この方法はまた、上部チャンバおよび下部チャンバにそれぞれ上部電極および下部電極を配置するステップを含む。この方法はさらに、上部電極と下部電極との間に電気泳動バイアスを印加するステップを含む。さらにこの方法は、複数のナノチャネルのうちの１のナノチャネルにオリゴヌクレオチドの流れを導くために、３Ｄナノポアデバイス内の第１および第２のゲートナノ電極にわたって選択バイアスを印加するステップを含む。さらにこの方法は、３Ｄナノポアデバイスの検出ナノ電極を介して検出バイアスを印加するステップを含む。この方法はまた、検出ナノ電極からの出力電流を検出するステップを含む。
本発明の前述および他の実施形態は、以下の詳細な説明に記載されている。
以下に説明する図面は、説明のみを目的としている。図面は、本開示の範囲を限定することを意図していない。図面は、本開示の様々な実施形態の設計および有用性を示すものである。図面は縮尺通りに描かれておらず、同様の構造または機能の要素は図面全体を通して同様の参照番号で表されていることに留意されたい。本開示の様々な実施形態の列挙された利点および目的を得る方法をよりよく理解するために、本開示の詳細な説明は、添付の図面に示されるその特定の実施形態を参照することによって提供される。これらの図面は、本開示の典型的な実施形態のみを描いており、したがって、その範囲を限定するものとはみなされないことを理解した上で、本開示は、添付図面の使用を通じて、さらなる具体性および詳細性をもって記載及び説明される。
図１は、従来技術の固体２Ｄナノポアデバイスを概略的に示す。 図２は、様々な実施形態による３Ｄナノポアデバイスを概略的に示す。 図３は、様々な実施形態による３Ｄナノポアデバイスを概略的に示す。 図４は、様々な実施形態による３Ｄナノポアデバイスを概略的に示す。 図５は、いくつかの実施形態による、３Ｄナノポアデバイスを用いたＤＮＡメチル化の検出方法を概略的に示す。 図６は、いくつかの実施形態による、３Ｄナノポアデバイスを用いたＤＮＡメチル化の検出方法を概略的に示す。 図７は、いくつかの実施形態による、３Ｄナノポアデバイスを用いたＤＮＡメチル化の検出方法を概略的に示す。 図８は、いくつかの実施形態による、３Ｄナノポアデバイスを用いたＤＮＡメチル化の検出方法を概略的に示す。 図９は、いくつかの実施形態による、３Ｄナノポアデバイスを用いたＤＮＡメチル化の検出方法を概略的に示す。 図１０は、いくつかの実施形態による、３Ｄナノポアデバイスを用いたＤＮＡメチル化の検出方法を概略的に示す。 図１１は、いくつかの実施形態による、３Ｄナノポアデバイスを用いたＤＮＡメチル化の検出方法を概略的に示す。 図１２Ａ、１２Ｂは、いくつかの実施形態による、ナノポアデバイスの製造方法を概略的に示す。 図１３は、いくつかの実施形態による、ナノポアメチル化検出デバイスにおけるＤＮＡメチル化率と出力電流との間の関係を示す３Ｄヒストグラムである。 図１４は、いくつかの実施形態による、ナノポア検出システムを使用してオリゴヌクレオチドのメチル化を検出する方法を示すフローチャートである。 図１５は、いくつかの実施形態による、３Ｄナノポアデバイス／センサにおいてＤＮＡのメチル化を検出／分類するメカニズムを概略的に示す。 図１６は、いくつかの実施形態による、３Ｄナノポアデバイス／センサ内の二本鎖ＤＮＡの構造変化を概略的に示す。 図１７は、いくつかの実施形態による、３Ｄナノポアデバイス／センサ内の二本鎖ＤＮＡの構造変化を概略的に示す。 図１８は、いくつかの実施形態による、３Ｄナノポアデバイス／センサ内の二本鎖ＤＮＡの構造変化を概略的に示す。 図１９は、いくつかの実施形態による、３Ｄナノポアデバイス／センサ内における二本鎖ＤＮＡの信号変化の水和媒介機構を概略的に示す。
様々な実施形態の上記および他の利点および目的を得る方法をよりよく理解するために、添付の図面を参照して実施形態の詳細な説明を提供する。図面は縮尺通りに描かれておらず、同様の構造または機能の要素は全体を通して同様の参照番号で表されていることに留意されたい。これらの図面は、特定の例示された実施形態のみを示し、したがって、実施形態の範囲を限定するものと見なされるべきではないことを理解されたい。
ＤＮＡメチル化の増幅を伴わない迅速な検出（例えば、１０分未満）を達成するための方法が本明細書に記載される。電位を操作してＤＮＡのハイブリダイゼーションを増加させ、メチル化ＤＮＡのハイブリダイゼーションによって生じる電気特性を検出することによって、効率的かつ効果的にＤＮＡメチル化を検出するナノポア電気補助ＤＮＡメチル化検出デバイスが本明細書に記載される。そのような検出デバイスおよび方法は、マイクロアレイ、ＣＭＯＳアレイ、およびナノポアアレイ（例えば、固体およびハイブリッドナノポアアレイ）を含む様々な生体分子アレイで使用することができる。このような検出デバイスおよび方法は、上記の３Ｄマルチチャネルナノポアアレイや平面マルチチャネルナノポアアレイを含む、様々なマルチチャネルナノポアアレイに用いることができる。
ＤＮＡメチル化検出の並行処理を可能にするマルチチャネルナノポアアレイを使用して、増幅なしで迅速なメチル化検出を達成することができる。このようなマルチチャネルナノポアアレイは、これらのマルチチャネルナノポアアレイ内の特定のチャネルに荷電粒子（例えば、メチル化ＤＮＡ）を誘導するように電気的にアドレス指定することができる。他のアレイは、アレイ外部のマイクロ流体チャネルに結合される。マルチチャネルナノポアアレイ内の個々のナノポアチャネルを電気的にアドレス指定して検出することにより、マルチチャネルナノポアアレイをより効率的かつ効果的に使用して、メチル化ＤＮＡの低コスト、高スループット、増幅不要、および迅速な検出を実現することができる。
特徴付けのメカニズム
いくつかの実施形態では、メチル化パターンの特徴付けのメカニズム（例えば、感知メカニズム）は、（例えば、ＤＮＡ分子における）オリゴヌクレオチド塩基の特定の特性を活用する。グアニン塩基は、ＤＮＡ分子の４つの塩基対の１つであり、酸化され易い。エネルギー準位に関しては、グアニン塩基の電荷はわずか０．２ｅＶである。したがって、グアニン塩基の電荷は、ＤＮＡ鎖に沿って次の酸化基や次のグアノシンに容易に移動できる。ＤＮＡのグアニン－シトシン（「ＧＣ」）およびアデニン－チミン（「ＡＴ」）塩基対の電荷／エネルギーは、相対的な電荷キャリアとして機能し、（例えば、グアニン塩基の）電荷が電荷キャリア間のＤＮＡ分子の長さに沿って移動できるようにする。ＤＮＡ分子の正に帯電した「正孔」は、１以上のＧＣ部位でより低いエネルギーを持ち、この正孔は、ＤＮＡ分子のＡＴ部位を通るコヒーレントトンネリングによって１のＧＣペアから次のＧＣペアに移動し得る。したがって、ＤＮＡ分子中の１以上の正に帯電した正孔は、ＤＮＡ分子全体の電荷に影響を与える（例えば、負の電荷を減少させる）ことができる。
メチル化パターンの特徴付けのメカニズム（例えば、検出メカニズム）はまた、ＤＮＡ分子の電場に対する水和効果を活用することができる。いくつかの実施形態では、特徴付けのメカニズム（例えば、検出メカニズム）は、水分子とオリゴヌクレオチドが電荷特性に影響を与える水和バイオ界面を形成するように、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ鎖）の脱イオン（「ＤＩ」）水溶液中で実行される。ＤＮＡ塩基対とＤＮＡ二重らせんの疎水性により、疎水性ＤＮＡ塩基対が脱イオン水溶液内の水から離れて配置される構造が得られる。ＤＮＡ鎖の負に帯電したバックボーンは、正に帯電したイオンをバックボーンの周りに引き寄せる。メチル化によってメチル基が（例えば、シトシンに）付加されると、ほぼ中性のエネルギーレベルになり、ＤＮＡバックボーンの負電荷をカバーできる。さらに、脱イオン水溶液中の水分子は、水和状態でＤＮＡ鎖の周りに水の殻（water shell）を形成することができる。
メチル化パターンの特徴付けのメカニズム（例えば、検出メカニズム）はまた、ＣｐＧアイランドのＤＮＡ分子の水和の電荷効果を活用することができる。水素原子（例えば、水分子から）がＤＮＡのリン酸バックボーンに面すると、互いに影響を及ぼし合う。メチル化によってメチル基に中性が付加され、水分子との界面により、水素原子で覆われたＤＮＡバックボーンが形成される。したがって、これらのメチル化を介した相互作用は、ＤＮＡ分子の電荷に影響を与え、埋め込まれた電極によって検出することができる。本明細書に記載の３次元（「３Ｄ」）センサおよびその使用方法は、溶液中のＤＮＡ分子の総電荷を含む、反応チャンバ内の電荷変化を感知することができる。
ＤＮＡのメチル化（例えば、ＣＧ対におけるシトシン）はまた、メチル化ジヌクレオチドの剛性に影響を与える（例えば、変形モード依存効果）。メチル化は、ジヌクレオチドの剛性をわずかに増加させるが、隣接するジヌクレオチドの剛性をより著しく増加させる。ジヌクレオチドを連続的にメチル化すると剛性はさらに強化され、ハイパーメチル化の効果が生じ得る。多くの実施形態では、付加されたメチル基と隣接するヌクレオチドの非極性基との間の立体的相互作用が剛性化の原因である可能性がある。水和マップは、メチル化が表面の水和構造を様々な方法で変化させることも示している。メチル化ＤＮＡの変形に対する耐性が、立体的相互作用を欠く変形モードのＤＮＡの剛性化に寄与している可能性がある。メチル化がＤＮＡの構造に及ぼす影響は、メチル化部位周辺の局所的な配列に依存すると考えられる。
本明細書に記載のメチル化パターンの特徴付けのメカニズム（例えば、検出メカニズム）のいくつかの実施形態は、ＤＮＡ水和およびＤＮＡバックボーンのメチル基中和に少なくとも部分的に基づいており、これは反応チャンバのＨ＋およびＯＨ－基に影響を与える可能性がある。本明細書に記載のいくつかの３Ｄナノポアセンサアレイは、ナノチャネル内の検出領域のデビーレンズを減少させることによって、感度を高め、検出限界を低下させてメチル化の検出を容易にする。
ＤＮＡを測定または検出するための１つの例示的なアプローチは、３Ｄナノポアセンサアレイ内に埋め込まれた電極によって測定された電気信号に示されるヘリコイドパラメータの変動を分析することである。本明細書に記載されるように、ＤＮＡの構造変化は、電極領域の電荷を変化させて信号を発生させるメカニズムの１つである。ＤＮＡメチル化により、ＤＮＡ構造に微弱な変動が生じ、ＤＮＡの剛性があがる。また、メチル化によってメチル基が付加され、メチル化部位に隣接するＤＮＡ分子の水和環境が変化する。これらの様々なメカニズムにより溶解エネルギーが減少し、メチル基の周りの水和シェルの良好な特徴づけが可能となる。
水はヒドロキシメチルシオシン（「ｈｍＣ」）に対して高い親和性を有するので、Ｇ－ｈｍＣ塩基対は最大の電荷変動を経験する。一方、水はメチルシトシン（「ｍＣ」）の疎水性メチル基を溶かしにくく、Ｇ－ｍＣ塩基対の剛性／非柔軟性を増加させる。置換配列ポリ（デオキシグアニル酸－デオキシシチジル）酸ナトリウム塩（「ポリ（ｄＧ－ｄＣ）」）のシトシンをメチル化すると、メチル化されていないＤＮＡに必要とされるよりも脆弱なイオン質でＺ－ＤＮＡを構成することができる。
他の実施形態では、出力電流の平均値は、ｈｍＣ＜Ｃ＜ｍＣというパターンに従って変化する。その結果、メチル化に対するＤＮＡの適応性に違いが生じうる。
例示的なナノポアデバイス
図２は、一実施形態による三次元（「３Ｄ」）アレイ構造を有するナノポアデバイス２００を概略的に示す。デバイス２００は、Ｚ軸２０４に沿って積み重ねられた複数の２Ｄアレイまたは層２０２Ａ～２０２Ｄを含む。２Ｄアレイ２０２Ａ～２０２Ｄは「二次元」と呼ばれるが、２Ｄアレイ２０２Ａ～２０２Ｄの各々は、Ｚ軸に沿っていくらかの厚さを有する。
上部の２Ｄアレイ２０２Ａは、第１および第２の選択層２０６、２０８に形成されたナノポア２１０（ピラー、ナノチャネル）を荷電粒子（例えば生体高分子）が通るように導くように構成された第１および第２の選択（抑制ナノ電極）層２０６、２０８を含む。第１の選択層２０６は、２Ｄアレイ２０２Ａ内の複数の行（Ｒ１～Ｒ３）から選択するように構成される。第２の選択層２０８は、２Ｄアレイ２０２Ａ内の複数の列（Ｃ１～Ｃ３）から選択するように構成される。一実施形態では、第１および第２の選択層２０６、２０８は、選択された行および列に隣接する電荷および／または非選択の行および列に隣接する電荷を変更することによって、それぞれ行および列から選択する。他の２Ｄアレイ２０２Ｂ～２０２Ｄは、速度制御／電流検出ナノ電極を含む。速度制御／検出ナノ電極は、Ａｕ－Ｃｒ、ＴｉＮ、ＴａＮ、Ｔａ、Ｐｔ、Ｃｒ、グラフェン、Ａｌ－Ｃｕなどの高導電性金属やポリシリコンで作成することができる。速度制御／検出ナノ電極は、約０．３～約１０００ｎｍの厚さを有し得る。速度制御／検出ナノ電極は、ハイブリッドナノポアの生体層に作成することもできる。各検出ナノ電極は、各ナノポア２１０のピラーが特定のメモリセルに動作可能に結合され得るように、ナノポア２１０のピラーに動作可能に結合／アドレス指定され得る。電気的アドレス指定は、ナノポアデバイスで行うことができる。
ハイブリッドナノポアは、ナノポアの安定性を高めるために半合成膜ポリンを形成する固体成分を有する安定した生物学的／生化学的成分を含む。例えば、生物学的成分はαＨＬ分子であり得る。αＨＬ分子は、ＳｉＮベースの３Ｄナノポアに挿入され得る。αＨＬ分子は、ナノ電極（例えば上部の２Ｄアレイ２０２Ａ内）にバイアスを印加することにより、ＳｉＮベースの３ＤナノポアとのαＨＬ分子の整列を確実にする構造をとるように誘導され得る。
ナノポアデバイス２００は、平面構造を有する従来のナノポアデバイスよりもはるかに大きな電荷検出表面積を提供する３Ｄ垂直ピラースタックアレイ構造を有する。荷電粒子（例えば、生体高分子）がデバイス内の各２Ｄアレイ２０２Ａ～２０２Ｅを通過すると、その電荷は２Ｄアレイ２０２Ｂ～２０２Ｅのいくつかにおいて検出器（例えば、ナノ電極）で検出することができる。したがって、デバイス２００の３Ｄアレイ構造は、より高い感度を実現し、これによって低信号の検出器／ナノ電極を補うことができる。メモリセルを３Ｄアレイ構造に統合することで、メモリ関連の性能制限（例えば、外部メモリデバイスによる）を最小限に抑えることができる。さらに、高度に統合されたスモールフォームファクタ３Ｄ構造は、製造コストを最小限に抑えながら、高密度のナノポアアレイを提供する。
使用時、ナノポアデバイス２００は、上部チャンバと下部チャンバ（図示せず）との間に配置されこれらを分離し、上部チャンバと下部チャンバがナノポアピラー２１０によって流体的に結合される。上部チャンバと下部チャンバは、ナノ電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ２など）および検出対象の荷電粒子（ＤＮＡなど）を含む緩衝液（電解質溶液またはＫＣｌを含む脱イオン水）。異なる荷電粒子の検出には、異なるナノ電極と電解質溶液を使用することができる。
電気泳動による荷電粒子の移動は、ナノポアデバイス２００の上部２Ｄアレイ２０２Ａに隣接する上部チャンバ（図示せず）および下部２Ｄアレイ２０２Ｅに隣接する下部チャンバ（図示せず）に配置されたナノ電極にバイアスを印加することによって駆動することができる。いくつかの実施形態では、ナノポアデバイス２００は、ナノポアデバイス２００のナノポア２１０のピラーによって上部チャンバと下部チャンバとが流体的かつ電気的に結合されるように、上部チャンバと下部チャンバ（図示せず）との間に配置される。上部チャンバおよび下部チャンバは、電解質溶液を含み得る。
図３は、一実施形態によるナノポアデバイス３００を概略的に示す。ナノポアデバイス３００は、絶縁膜層（Ｓｉ３Ｎ４）と、それに続く行および列選択（抑制ナノ電極）３０６および３０８（例えば、金属またはドープされたポリシリコン）のそれぞれ、および複数（第１から第Ｎ）のセルナノ電極３１０（例えば、金属またはドープされたポリシリコン）を含む。ナノポアデバイス３００のナノ電極３０６、３０８、３１０は、絶縁誘電体膜３１２（例えば、Ａｌ２Ｏ３、ＨｆＯ２、ＳｉＯ２、ＺｎＯ）で覆われている。
図４に示すように、列および行電圧（例えば、Ｖｄ）の移動速度制御バイアス信号４１０が３Ｄナノポアセンサアレイ４００に印加されると、行および列抑制電圧／バイアスパルスの後に検証（センシング）電圧／バイアスパルス（例えば、Ｖｇ１、Ｖｇ２）が続く。Ｖｇ３と次の電極（Ｖｇ４～ＶｇＮ）は、検出電極と移動電極である。例示的な信号４１０を、３Ｄナノポアセンサアレイ４００の上に重ねて図４に示す。抑制バイアスを印加して、様々な列および行のナノポアピラーチャネル／ナノチャネルをそれぞれ選択解除する。検出動作中、列および行の両方の（抑制）選択ナノ電極が選択される。結果として生じる表面電荷４１２は、電流などの電気特性の変化として検出することができる。
いくつかの実施形態では、ナノ電極は、イオン遮断、トンネリング、静電容量センシング、圧電、およびマイクロ波センシングを含む様々な原理を用いて電流の変調を検出することができる。図４に示すように、電極内のイオン濃度やいわゆるイオン電流の変化（参照電極によって検出される）を増幅し、付属のＣＭＯＳトランジスタによって正確に検出することも可能である。
例示的なナノポア電気支援ＤＮＡメチル化検出デバイスおよび方法
図５は、いくつかの実施形態による、ナノポア電気支援ＤＮＡメチル化検出デバイスを示す。図５には単一のナノチャネル５１０を含むナノポア検出デバイス５００の一部が示されているが、ナノポア電気支援ＤＮＡメチル化（例えば、エピジェネティック変化）検出デバイスは、複数のナノチャネルを有する３Ｄアレイを含むことができる。図５に示すナノポア検出デバイス５００などのＤＮＡメチル化検出構造は、ナノチャネルの電荷感度と、並列処理および３Ｄアレイから得られる大きな表面積を利用して、ＤＮＡメチル化の増幅なしの迅速な検出を実現する。
ナノポア検出デバイス５００は、ナノ電極５２２、５２４、５２６、５２８を含む。これらのナノ電極５２２、５２４、５２６、５２８は、ナノチャネル５１０を通る流れを制御し（第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４）、ナノチャネル５１０内の電荷検出（第１および第２の検出ナノ電極５２６、５２８）するために、独立して電気的にアドレス指定される。
ナノポア検出デバイス５００は、ナノチャネル５１０の内面５３０に結合されるプローブ（ＰＮＡ、ＤＮＡモルホリノオリゴマー）５３２も含む。内面５３０は、Ａｌ２Ｏ３を含み得る。Ａｌ２Ｏ３は、ナノチャネル５１０の内面５３０上にプローブ５３２を固定化するための機能化を実現するために、多数のヒドロキシル基を含む。プローブ５３２は、ゲノムＤＮＡ内の標的領域（例えば、プロモータ領域内のＣｐＧアイランド）と相補的であるように、既知の分子生物学技術を用いて生成することができる。プローブ（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルフォリノなど）５３２は、様々な長さ（例えば、２４塩基対、４０塩基対など）を有し得る。
プローブ５３２は、気相シラン化を用いて内面に結合／共有結合することができる。プローブ５３２の有機コーティングの厚さは、気相シラン化の時間を変更することによっても調節することができる。
いくつかの実施形態では、ナノポアデバイスを最初にＯ２プラズマで処理して、酸化物誘電体（Ａｌ２Ｏ３、ＨｆＯ２、など）Ａｌ２Ｏ３基板に－ＯＨ基を生成し、この基板を活性化して標的官能基を付着させる。次に、３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を用いてシラン化する。これは、考えられる様々な表面構造に対して有効であり、反応性が非常に高いためである。プローブ５３２の共有結合の前に、ナノポアデバイス５１０は、周囲温度、約３０ｋＰａのベース圧力で、５０μｌのＡＰＴＥＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を含むガラスホルダに隣接する動的ポンプされる低真空チャンバ内に置くことによって気相でシラン（例えば、エタノール中のＡＰＴＥＳとＯＴＭＳの比１：３）に曝露される。次に、ナノポアデバイス５１０を真空チャンバから取り出し、２．５％グルタルアルデヒド溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）に１時間浸漬する。次に、ナノポアデバイス５１０を架橋剤から取り出し、ＩＰＩで２回、再蒸留水で２回洗浄する。最後に、ナノポアデバイス５１０を、１００ｎＭのアミノ修飾プローブで、３７℃で一晩処理する（例えば、浸漬によって）。各ステップの後、ナノポアデバイスをウルトラピュアＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー蒸留水（洗浄バッファとして使用）で洗浄する。このような方法を使用すると、プローブ５３２の共有結合／固定化は、約２４時間または４５℃で８時間で達成することができる。
ナノチャネル５１０の内面５３０に共有結合したプローブ５３２に対する電気的標的生体分子５４０（例えば、メチル化オリゴヌクレオチド）のナノポア検出デバイス５００ハイブリダイゼーションの感度は、結果として生じる電荷の差に基づいて１塩基ミスマッチを検出できるようなものである。ナノポアデバイスの３Ｄアレイ構造に起因する並列処理により、ナノポアデバイスと検出対象のメチル化オリゴヌクレオチドと界面面積が飛躍的に増大し、それによって、様々な疾患（遺伝性疾患など）のポイントオブケア診断および予後判定に十分なレベルまで感度が向上する。
第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４は個別にアドレス指定され、したがって、標的生体分子５４０の「ピンポン」運動を生成するように急速に電気的に変更することができ、標的生体分子５４０とプローブ５３２のハイブリダイゼーションを増大させ得る。ナノチャネル５１０内の第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４にまたがる電位は、第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４に電流を加えることによって急速に反転させることができる。第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４はまた、ナノチャネル５１０を通る標的生体分子５４０の移動を制御するようにアドレス指定することができる。
標的電荷生体分子５４０は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの多くの種類の核酸であり得る。プローブ５３２は、相補的ＤＮＡ鎖、ロック核酸（ＬＮＡ）オリゴマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のような中性骨格オリゴマー、ＤＮＡモルフォリノオリゴマー、または標的電荷生体分子５４０とハイブリダイズできる任意のタイプの相補鎖であり得る。
図５に示すように、電流／電位がナノポア検出デバイス５００に印加される前は、標的生体分子５４０はナノチャネル５１０に引き寄せられない。図６は、第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４に正の電位を発生させるための電流の印加を示す。この正の電位は負の標的生体分子５４０をナノチャネル５１０に引き寄せる。
図７は、第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４に正の電位を生成するために電流を継続的に印加した状態を示す。時間の経過とともに、負の標的生体分子５４０の一部がナノチャネル５１０に入り、ナノチャネル５１０の内面５３０に共有結合したプローブ５３２と相互作用する。負の標的生体分子５４０とプローブ５３２との間の相互作用は、２つの分子間のハイブリダイゼーションをもたらす。これにより、負の標的生体分子５４０が、第１および第２の検出ナノ電極５２６、５２８に電気的に接続され、負の標的生体分子５４０に関連する負電荷５３４を検出することができる。
図５は、第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４における電位の変更を示す。図５において、電流は第１のゲートナノ電極５２２にはもはや印加されず、その中の正の電位が除去される。しかしながら、電流は第２のゲートナノ電極５２４にわたって維持され、そこに正の電位が維持される。この電位の変化は、フロー矢印５５０によって示されるように、ナノチャネル５１０内の負の標的生体分子５４０を第２のゲートナノ電極５２４に向かって引き寄せる。図５はまた、より多くの負の標的生体分子５４０がナノチャネル５１０内のプローブ５３２にハイブリダイズしたことを示す。
図９は、第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４における電位の別の変更を示す。図９では、電流は第２のゲートナノ電極５２４にもはや印加されず、その中の正の電位が除去される。しかしながら、第１のゲートナノ電極５２２にわたって電流が印加され、そこに正の電位が維持される。この電位の変化は、フロー矢印５５２によって示されるように、ナノチャネル５１０内の負の標的生体分子５４０を第１のゲートナノ電極５２２の方へ引き戻す。図９はまた、ナノチャネル５１０のプローブ５３２に多くの電荷生体分子５４０が曝されると、さらに多くの負の標的生体分子５４０がプローブ５３２にハイブリダイズすることを示す。
図１０は、第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４における電位のさらに別の変更を示す。図９では、電流は第１のゲートナノ電極５２２にもはや印加されず、その中の正の電位が除去される。しかしながら、第２のゲートナノ電極５２４にわたって電流が印加され、そこに正の電位が維持される。この電位の変化は、フロー矢印５５０によって示されるように、ナノチャネル５１０内の負の標的生体分子５４０を第２のゲートナノ電極５２４の方へ引き戻す。図１０はまた、ナノチャネル５１０のプローブ５３２に多くの電荷生体分子５４０が曝されると、さらに多くの負の標的生体分子５４０がプローブ５３２にハイブリダイズすることを示す。
図５～図１０のフロー矢印５５０、５５２に示される方向転換は、標的生体分子５４０とプローブ５３２のハイブリダイゼーションを増加させる標的生体分子５４０の「ピンポン」運動における最初の２つの方向転換を示す。方向転換は、第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４の電位を変化させることによって制御され、これは、印加される電流を交互に変化させることによって変更される。プロセッサの制御下で、個々に電気的にアドレス指定された第１および第２のゲートナノ電極５２２、５２４に電流を印加できるので、電流および電位の交替を迅速に実行することができる。荷電生体分子５４０の「ピンポン」運動は、荷電生体分子５４０がナノチャネル５１０内のプローブ５３２に露される時間を増加させ、それによって２つの分子間のハイブリダイゼーションの量が増加する。図５～１０には１つまたは２つの方向転換のみが示されているが、生体分子検出方法は、標的生体分子５４０のハイブリダイゼーションを増加させるために、さらに多くの方向転換を含むことができる。
図１１は、生体分子検出方法における一連の「ピンポン」運動の終了を示す。検出方法の最後に、複数の負の標的生体分子５４０（メチル化オリゴヌクレオチド）がプローブ５３２にハイブリダイズし、プローブ５３２自体がナノチャネル５１０の内面５３０に共有結合される。プローブ５３２に負の標的生体分子５４０がそれぞれハイブリダイズすると、その追加の負電荷５３４が、第１および／または第２の検出ナノ電極５２６、５２８によって検出される。検出ナノ電極５２６、５２８は、単一の塩基対のミスマッチを区別するのに十分な感度を有する。したがって、検出ナノ電極５２４、５２８は、各標的生体分子５４０のハイブリダイゼーションに関連する負電荷５３４を検出することができる。このように、ナノポア検出デバイス５００は、溶液中の標的ＤＮＡのメチル化を迅速に（例えば、１０分以内に）検出し定量化することができる。
図５～１１に示されるナノポア検出デバイス５００は、特定の手順中に単一の負に帯電した標的生体分子５４０のみを検出するように構成されているが、他の実施形態によるナノポア検出デバイスは、複数の負に帯電した標的生体分子（例えば、メチル化オリゴヌクレオチド）を検出するように構成することができる。そのようなナノポア検出デバイスは、（１）異なる負に荷電した標的生体分子とハイブリダイズし、（２）異なる長さを有する複数のプローブを含む。プローブの長さが異なるため、異なる負電荷を有する標的生体分子のハイブリダイゼーションにより、ナノチャネルの内面に電気的に付加される負電荷の量が異なることになる。検出ナノ電極は、これらの異なる量の負電荷を識別するのに十分な感度を有し、それによって異なる負電荷を有する標的生体分子のハイブリダイゼーションを識別することが可能である。
例示的なナノポアデバイスの製造方法
図１２Ａおよび１２Ｂは、いくつかの実施形態による、上述のナノポア検出デバイス５００、６００などのナノポアデバイスの製造方法１２１０を概略的に示す。
ステップ１２１２で、ナノポアデバイスの（ナノチャネルの）内面を、Ｏ２プラズマ処理し、洗浄し、活性化する。ステップ１２１４で、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）で処理して表面を官能化することにより、デバイスの表面をシラン化する。ステップ１２１６では、アルデヒドリンカーが官能化された表面に結合される。ステップ１２１８（図１２Ｂ）では、プローブ（例えば、ＰＮＡ）がアルデヒドを介して表面に付着される。ステップ１２２０では、負に帯電した標的生体分子（例えば、メチル化ＤＮＡ）が表面上のプローブに付着し、表面の電荷が変化して、上記のように、負に帯電した標的生体分子が電気的に検出される。
出力電流に対するメチル化の影響
図１３は、様々なメチル化率１３１４について（オリゴヌクレオチドプローブに相補的なオリゴヌクレオチドについて）、測定出力電流１３１２に対する印加検知バイアス１３１０を示す３Ｄヒストグラム１３００である。メチル化率１３１４が０％、１２．５％、２５％、５０％、１００％と異なる５種類のコントロールＤＮＡサンプルを用意し、相補的なプローブを設計した。ＡＰＴＥＳによる単純な官能基化の後、グルタルアルデヒドリンカーを追加し、プローブを３Ｄナノポアセンサアレイの特定の位置にインキュベートした。様々な濃度のＤＮＡメチル化１３１４に対する出力電流１３１２のリアルタイム測定が、様々な検出バイアス１３１０で実行され、結果を図１３にまとめた。図１３に示すように、メチル化率１３１４が増加すると、信号／出力電流は減少する（１３１２）（例えば、ＤＮＡの負のバックボーンと水のメチル化相互作用の中和による）。
電子移動の遮断
図１５は、いくつかの実施形態による３Ｄナノポアデバイス／センサ１５００におけるＤＮＡのメチル化の検出／分類のメカニズムを概略的に示す。１５０１はゲート電極を表し、１５０２はシランを有する誘電体層を表す。１５０３は、設計されたオリゴヌクレオチドプローブ鎖１５０５と３Ｄナノポアデバイス／センサ１５００の表面との間の結合を表す。１５０４は、グアニン塩基間の電子移動を表す。１５０６は、ＡＴ塩基対とＧＣ塩基対との間の異なる水素結合を表す。１５０７は、メチル基を有する臨床サンプルからの標的配列を表す。ある程度メチル化された標的配列／オリゴヌクレオチド鎖１５０７はオリゴヌクレオチドプローブ鎖１５０５と相補的であるため、そこに結合する。１５０８に示すように、塩基から塩基への電子経路は、メチル基１５０９（例えば、メチルシトシン）によってブロックされる。このブロックにより、３Ｄナノポアデバイス／センサ１５００のゲート電極１５０１によって測定される出力電流が減少する。減少量は、標的配列１５０７のメチル化率に関連する（図１３に示されるように）。
図１５の上部の実施形態は、正のゲートバイアスを３Ｄナノポアデバイス／センサ１５００のゲート電極１５０１に印加すると、デバイス１５００の表面に付着したオリゴヌクレオチドプローブ１５０５内の電子がゲート電極１５０１に移動することを示す。電子は、ＤＮＡ鎖１５０５の最も酸化され易い部位であるグアニン塩基間を移動する（１５０４）。電子は、ＤＮＡ鎖１５０５を通して次に酸化され易い塩基である次のグアニン塩基への移動を続け、これがゲート電極１５０１に到達するまで続け、ここで電子が検知される（例えば、出力電流として）。
図１５の下部の実施形態は、標的配列／オリゴヌクレオチド鎖１５０７が３Ｄナノポアデバイス／センサ１５００に追加されると、標的オリゴヌクレオチド鎖１５０７がオリゴヌクレオチドプローブ１５０５に結合することを示している。ゲート電極１５０１に正のゲートバイアスが印加されると（１５０７）、メチル化シトシンベースのメチル基１５０９が電子伝達機構を妨害し、標的オリゴヌクレオチド鎖１５０７のメチル化率に応じて電子伝達と信号が減少する。測定された電気信号（例えば、出力電流）は、参照メチル化率プロファイル（図１３を参照）と比較して、標的オリゴヌクレオチド鎖１５０７のメチル化パターンを特定することができる。
構造変化（Conformational Changes）
いくつかの実施形態では、メチル化および非メチル化オリゴヌクレオチドは異なる構造（conformation）を有し、メチル化によって構造が変化する。メチル化オリゴヌクレオチドの構造が異なると、３Ｄナノポアデバイス／センサ電極の表面における電荷信号が変化し得る。表面電荷信号が変化すると、電極によって読み取られる信号（例えば、出力電流）が変化し得る。測定された信号の変化を分析して、構造変化を判定することができる。
図１６～１８は、いくつかの実施形態による３Ｄナノポアデバイス／センサ１６００内の二本鎖ＤＮＡの構造変化を概略的に示す。１６０１は、デバイス１６００の電極（例えば、ゲート電極または検出電極）および表面構造を表し、１６０２は、シランを有する誘電体層を表す。１６０２は、設計されたオリゴヌクレオチドプローブ鎖１６０３と３Ｄナノポアデバイス／センサ１６００の表面との間の結合部位を表す。１６０４は、標的配列／オリゴヌクレオチド鎖を表す。ＤＮＡの構造／構成は、ＤＮＡ分子の環境に基づいて変化し得る。例えば、様々なイオンがＤＮＡの構造／構成を異なる形態に変更することができる。図１６は、Ｂ－ＤＮＡ構成における標的配列／オリゴヌクレオチド鎖１６０４を示す。図１７は、Ｚ－ＤＮＡ構成における標的配列／オリゴヌクレオチド鎖１６０４’を示す。図１８は、「ヘアピン」構成の標的配列／オリゴヌクレオチド鎖１６０４”を示す。３Ｄナノポアデバイス／センサ１６００は、標的配列／オリゴヌクレオチド鎖１６０４、１６０４’、１６０４”が、脱イオン水環境においてオリゴヌクレオチドプローブ１６０３に結合したときの信号変化を測定することができる。これらのリアルタイムの信号変化を分析して、構造変化を判定することができる。
水和変化（Hydration Changes）
いくつかの実施形態では、メチル化は、オリゴヌクレオチドの水和に変化をもたらし得る。水和の変化は、相補鎖間の水素結合中にオリゴヌクレオチドの構成を変化させることにより、検出メカニズムに影響を与え得る。構成が変化すると、電極によって読み取られる信号（例えば、出力電流）が変化し得る。測定されたシグナルの変化を分析して、水和変化を判定することができる。
図１９は、いくつかの実施形態による、メチル化シトシン塩基を有するＤＮＡ分子における信号変化の水和媒介機構を模式的に示す。メチル化シトシン塩基は、標的配列／オリゴヌクレオチド鎖の水和の程度に影響を与える。水和変化は、今度は、配列／オリゴヌクレオチド鎖およびオリゴヌクレオチドプローブにおける電荷構成に影響を与える。３Ｄナノポアデバイス／センサは、標的配列／オリゴヌクレオチド鎖が脱イオン水環境でオリゴヌクレオチドプローブに結合するときの信号変化を測定することができる。これらのリアルタイム信号の変化を分析して、水和変化を判定することができる。
ナノポア検出システムを使用してＤＮＡのメチル化を検出する方法
図１３に示すような参照データを用いて、本明細書に記載のナノポア検出システムを、オリゴヌクレオチドのメチル化を検出する方法に使用することができる。例えば図１４は、いくつかの実施形態によるナノポア検出システムを使用するオリゴヌクレオチドのメチル化検出方法１４００を示す。ステップ１４１０で、標的オリゴヌクレオチドを精製する。標的オリゴヌクレオチドは、遺伝子（例えば、癌抑制遺伝子）のプロモーターにおけるＣｐＧアイランドであってもよい。
ステップ１４１２で、ナノチャネルが機能化（functionalize）される。ナノチャネルは、上部チャンバと下部チャンバを有する３Ｄナノポアデバイス内にあり、上部チャンバと下部チャンバが３Ｄナノチャネルアレイ内の複数のナノチャネルによって流体結合されるように、３Ｄナノチャネルアレイが上部チャンバと下部チャンバに配置される。ナノチャネルは、ナノチャネルを規定する３Ｄナノポアデバイスの内面にオリゴヌクレオチドプローブを結合することによって機能化することができ、ここでオリゴヌクレオチドプローブはオリゴヌクレオチドに相補的である。
ステップ１４１４で、オリゴヌクレオチドを含む脱イオン水溶液を３Ｄナノポアデバイスに加える。
ステップ１４１６で、電気泳動バイアスを、３Ｄナノポアデバイスの上部チャンバおよび下部チャンバ内の上部電極および下部電極に印加し、ナノチャネルを通して荷電粒子を駆動する。
ステップ１４１８で、３Ｄナノポアデバイス内の複数のナノチャネルのうちの１のナノチャネルにオリゴヌクレオチドの流れを導くために、３Ｄナノポアデバイス内の第１および第２のゲートナノ電極に選択バイアスを印加する。
ステップ１４２０で、出力電流を引き出すために、３Ｄナノポアデバイス内の検出電極に検出バイアスを印加する。
ステップ１４２２で、検出電極から出力電流を検出する。
ステップ１４２４で、オリゴヌクレオチドのメチル化率を特定するために、検出ナノ電極からの出力電流を測定する。例えば出力電流は、図１３に示すような参照データと比較することができる。３Ｄナノポアデバイスに印加される検出バイアスを変更／スイープしながら複数の出力電流測定を行うと、メチル化率の判定精度を向上させることができる。
本明細書に記載のナノポア検出システムは、脱イオン水を緩衝液として使用する３Ｄセンサである。ナノスケールの小空間における水分子の機能と正確な作用メカニズムは、これまで調査も理解もされていなかったが、本明細書に記載された３Ｄアレイの高感度で明確な分解能は、好感度センサのノイズレベルを増加させる電解質や他の緩衝液の代わりに脱イオン水を使用する利点を証明するものである。
本明細書に記載のナノポア検出システムにおける反応および信号生成のメカニズムは、上記のプローブに付着したメチル化ＤＮＡ分子の水和による表面の電荷分布の変化に基づく。この水和は、ゲートナノ電極で電荷密度の再分布を伴う電極の変化を引き起こす。ナノポア内のナノ電極は、ナノポアを取り囲むように全周または帯状の形態をとるため、ナノポアセンサの感度が向上する。
各ナノポアで異なる電位勾配を用いることにより、ユーザは、各ナノポア内および各ナノポアを通過する荷電生体分子の速度を制御することができる。低濃度のバッファ／電解質または脱イオン水を使用して、ナノポアの検出領域のデバイ長を増加させることは、本明細書に記載の３Ｄナノポア検出システムの固有の特性の１つである。ユーザは、各ナノ電極の電位量と持続時間を変更して、帯電した標的生体高分子の動きと、上記のナノ電極間のピンポン運動を電気泳動的に制御することにより、ナノポア検出システムを幅広く制御することができる。前述のように、荷電した標的生体高分子がナノ電極間を行き来し、ナノ電極の電位を変化／交互にさせると、荷電した標的生体高分子がプローブに付着するのに必要な時間が１０分未満に短縮される。この付着時間の短縮は、標的とプローブ間の相互作用が増加し、より短時間で相互結合できるようになるためである。
本明細書に記載のようなナノポア検出システムのいくつかの実施形態では、ナノポア構造のサイズ、形状、および深さは、プローブのサイズに基づいて変更することができる。例えば、直径５０ｎｍ（５００Å）の細孔サイズを、４０ｂｐプローブを用いて標的生体高分子を検出するために使用することができる。他の実施形態では、直径１００ｎｍの細孔サイズを、１００ｂｐを超えるプローブを用いて標的生体高分子の検出に使用することができる。さらに他の実施形態では、直径２００ｎｍの細孔サイズを、さらに長いプローブで標的生体高分子を検出するのに用いることができる。
本明細書に記載の３Ｄナノポアアレイセンサは、２Ｄまたは平面構造センサと比較して、より高感度でコンパクトである。なぜなら、ナノポアの３Ｄアレイは、表面積対体積比を増加させ、ナノポアアレイのナノチャネル内のスマート表面の小型化を可能にするからである。表面積／体積比が高いため、非常に低い濃度（例えば１０フェムトモル）のＤＮＡメチル化を検出することができる。
本明細書に記載の３Ｄナノポアアレイセンサは、電荷摂動または電気化学ベースのセンサシステムと比較して、誘電体層が各ナノチャネルの内面を絶縁し、それによって各ナノチャネルの静電容量効果および電場効果の制御が強化されるため、より優れた制御を提供する。
本明細書に記載の３Ｄナノポアアレイセンサは、固定化されたプローブを用いてＤＮＡメチル化を検出するために容量変化を利用することができる。標的ＤＮＡ分子がアレイ構造のナノポアを通過すると（外部電圧によって電気泳動的に駆動）、上部電極と下部電極がナノポア構造内のＤＮＡ分子の通過に起因する電位の変化を記録し、ナノポアをコンデンサのように分極させる。その結果生じる静電容量の変化を電子的に測定することで、標的ＤＮＡ分子の通過を検出することができる。ＤＮＡ分子の速度は、印加する正のゲートバイアスを制御することで制御でき、３Ｄナノポアアレイセンサをメチル化検出に利用することができる。本明細書に記載の３Ｄナノポアアレイセンサは、トンネル電流と静電容量変化の両方を検出することにより、ＤＮＡメチル化反応を検出することができる。従来の生物学的ナノポアは、構造内にナノ電極が埋め込まれていないため、トンネル電流と静電容量の変化を検出できなかった。
本明細書に記載の３Ｄナノポアアレイセンサで使用されるプローブは、それらの表面化学を変更するために変更することができ、これによって多くのシステム制御および設計オプションが可能となる。例えば、チオール修飾は、チオール金結合に使用することができる。アビジン／ビオチンおよびＥＤＣ架橋剤／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）は、他のプローブ修飾および標的対であり、固定化技術の構造および化学的修飾により、本明細書に記載の３Ｄナノポアアレイセンサに使用することができる。
以下の特許請求の範囲におけるすべての手段またはステッププラスファンクション要素に対応する構造、材料、動作、およびその均等物は、具体的に規定された他の請求項の要素と組み合わせて機能を実行するための任意の構造、材料、行為、および均等物を含むことを意図している。本発明を上記の実施形態に関して説明したが、上記の説明および特許請求の範囲は本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。本発明の範囲内の他の態様、利点、および変更は、本発明が属する技術分野の当業者には明らかであろう。
本発明の様々な例示的実施形態が本明細書に記載されている。これらの例は、非限定的な意味で参照される。それらは、本発明のより広く適用可能な態様を説明するために提供される。本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、記載された本発明に対して様々な変更を行うことができ、均等物を代用することができる。さらに、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセス行為またはステップを本発明の目的、精神または範囲に適合させるために、多くの変更を行うことができる。さらに、当業者は理解するように、本明細書に記載および図示された個々のバリエーションのそれぞれは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離または組み合わせることができる別個の構成要素および特徴を有する。そのような変更はすべて、本開示に関連する特許請求の範囲内にあることを意図している。
本発明の診断または介入手順を実行するために説明されたデバイスのいずれも、そのような介入の実行に使用するためにパッケージ化された組み合わせで提供され得る。これらの供給「キット」は、使用説明書をさらに含んでもよく、そのような目的で一般的に使用される滅菌トレイまたは容器に包装されてもよい。
本発明は、本発明のデバイスを使用して実行できる方法を含む。方法は、そのような適切なデバイスを提供する行為を含み得る。このような提供は、エンドユーザによって実行されてもよい。換言すれば、「提供する」行為は、エンドユーザが本方法において必要なデバイスを提供するために取得、アクセス、接近、配置、設定、起動、電源投入、またはその他の行為を必要とするだけである。本明細書に列挙された方法は、列挙されたイベントの順序だけでなく、論理的に可能である列挙されたイベントの任意の順序で実行され得る。
本発明の例示的な態様を、材料の選択および製造に関する詳細とともに上述した。本発明の他の詳細は、上記の特許および刊行物、並びに当業者によって一般に知られているか、または理解されていることに関連して理解され得る。同じことが、本発明の方法ベースの態様に関して、一般的または論理的に使用される追加の行為に関して当てはまる場合がある。
さらに、本発明は、様々な特徴を随意に組み込んだいくつかの実施例を参照して説明されたが、本発明は、本発明の各変形例に関して企図されたものとして説明または示されたものに限定されるものではない。本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、記載された本発明に様々な変更を加えることができ、均等物（本書に記載されているか、または簡潔にするために含まれていないかに拘わらず）を代用することができる。さらに、ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限の間のすべての介在値と、述べられた範囲内の任意の他の述べられた値または介在する値が本発明に包含されることが理解される。
また、記載された本発明のバリエーションの任意の特徴は、独立して、または本明細書に記載された特徴の任意の１つ以上と組み合わせて、規定および請求され得ることが企図される。単一のアイテムへの言及には、同じアイテムが複数存在する可能性が含まれる。より具体的には、本明細書および本明細書に関連する特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｓａｉｄ」、および「ｔｈｅ」は、特に明記しない限り、複数の指示対象を含む。換言すれば、冠詞の使用は、上記の説明および本開示に関連する特許請求の範囲における主題項目の「１以上」を許容する。そのような請求項は、任意の要素を除外するように起草され得ることにさらに留意されたい。したがって、本明細書は、請求項の要素の記載に関連して「単独で」「のみ」などの排他的な用語を使用したり、「否定的」な限定を使用するための先行根拠として機能することを意図するものである。
このような排他的な用語を使用することなく、本開示に関連する請求項における「含む」という語は、所定の数の要素がその請求項に列挙されているか否か、または特徴の追加がその請求項に規定される要素の性質を変えるものと見なされ得るか否かに拘わらず、任意の追加要素を含めることを許容するものとする。本明細書で特に定義された場合を除き、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、請求項の有効性を維持しつつ、一般に理解されるできるだけ広い意味を与えるものとする。
本発明の範囲は、提供された実施例および／または明細書の主題に限定されるべきではなく、むしろこの開示に関連する特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。

Claims (33)

  1. オリゴヌクレオチドのメチル化率を判定する方法であって、
    上部チャンバおよび下部チャンバを有する３Ｄナノポアデバイスと、前記上部チャンバおよび下部チャンバ内に配置された３Ｄナノチャネルアレイとを用意するステップであって、前記上部チャンバおよび下部チャンバが前記３Ｄナノチャネルアレイ内の複数のナノチャネルによって流体結合されるようにするステップと、
    オリゴヌクレオチドを精製するステップと、
    前記ナノチャネルを規定する前記３Ｄナノポアデバイスの内面にオリゴヌクレオチドプローブを結合することによって前記３Ｄナノチャネルアレイを機能化するステップであって、前記オリゴヌクレオチドプローブは前記オリゴヌクレオチドに相補的である、ステップと、
    前記精製したオリゴヌクレオチドを脱イオン水に加えて、既知濃度のオリゴヌクレオチド溶液を構成するステップと、
    前記オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド溶液を前記上部チャンバおよび下部チャンバにそれぞれ加えるステップと、
    前記上部チャンバおよび下部チャンバに上部電極および下部電極をそれぞれ配置するステップと、
    前記上部電極と下部電極の間に電気泳動バイアスを印加するステップと、
    前記複数のナノチャネルのうちの１のナノチャネルを通るように前記オリゴヌクレオチドの流れを誘導するために、前記３Ｄナノポアデバイス内の第１および第２のゲートナノ電極にわたって選択バイアスを印加するステップと、
    前記３Ｄナノポアデバイスの検出ナノ電極を介して検出バイアスを印加するステップと、
    前記検出ナノ電極からの出力電流を検出するステップと、
    前記オリゴヌクレオチドのメチル化率を判定するために、前記検出ナノ電極からの出力電流を分析するステップと、を含むことを特徴とする方法。
  2. さらに、第２のナノチャネルを規定する前記３Ｄナノポアデバイスの内面に第２のオリゴヌクレオチドプローブを結合することによって前記３Ｄナノチャネルアレイを機能化するステップを含み、
    前記第２のオリゴヌクレオチドプローブは前記オリゴヌクレオチドプローブとは異なる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記オリゴヌクレオチドのメチル化率を判定するために前記検出電極からの出力電流を分析するステップが、前記出力電流と前記検出バイアスを既知の濃度についての参照テーブルの対応する値と比較するステップを含む、請求項１記載の方法。
  4. 前記オリゴヌクレオチドのメチル化率を判定するために前記検出電極からの出力電流を分析するステップが、前記オリゴヌクレオチドのリン酸バックボーンの電荷に対するメチル化の効果を用いるステップを含む、請求項１記載の方法。
  5. さらに、前記３Ｄナノポアデバイスの前記検出ナノ電極を介して第２の検出バイアスを印加するステップと、
    前記検出ナノ電極からの第２の出力電流を検出するステップと、
    前記オリゴヌクレオチドの第２のメチル化率を判定するために前記検出ナノ電極からの第２の出力電流を分析するステップと、
    前記オリゴヌクレオチドのメチル化率を確認するために、前記オリゴヌクレオチドの第２のメチル化率を前記オリゴヌクレオチドのメチル化率と比較するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡ分子片である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡ分子片である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記オリゴヌクレオチドが無細胞ＤＮＡから抽出される、請求項１に記載の方法。
  9. 前記オリゴヌクレオチドが組織または細胞培養培地から抽出される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記オリゴヌクレオチドが、血清、尿、血漿、または唾液から抽出される、請求項１記載の方法。
  11. 前記３Ｄナノポアデバイス内の電荷担体が、脱イオン水、Ｈ＋イオン、およびＯＨ－イオンを含む、請求項１に記載の方法。
  12. さらに、前記オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド溶液を前記上部チャンバおよび下部チャンバから除去するステップと、
    第２のオリゴヌクレオチドを精製するステップと、
    第２のオリゴヌクレオチドプローブを前記ナノチャネルを規定する前記３Ｄナノポアデバイスの内面に結合することによって、前記３Ｄナノチャネルアレイを機能化するステップであって、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブは前記第２のオリゴヌクレオチドに相補的である、ステップと、
    前記精製された第２のオリゴヌクレオチドを脱イオン水に加え、既知の濃度を有する第２のオリゴヌクレオチド溶液を構成するステップと、
    前記第２のオリゴヌクレオチドを含む第２のオリゴヌクレオチド溶液を前記上部チャンバおよび下部チャンバに加えるステップと、
    前記上部電極と下部電極の間に電気泳動バイアスを印加するステップと、
    前記ナノチャネルを通るように前記第２のオリゴヌクレオチドの流れを誘導するために、前記３Ｄナノポアデバイス内の第１および第２のゲートナノ電極にわたって選択バイアスを適用するステップと、
    前記３Ｄナノポアデバイスの検出ナノ電極を介して検出バイアスを印加するステップと、
    前記検出ナノ電極からの第２の出力電流を検出するステップと、
    前記第２のオリゴヌクレオチドのメチル化率を判定するために、前記検出ナノ電極からの第２の出力電流を分析するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
  13. さらに、前記複数のナノチャネルのうちの第２のナノチャネルを通るように前記第２のオリゴヌクレオチドの流れを誘導するために、前記３Ｄナノポアデバイス内の第３および第４のゲートナノ電極にわたって第２の選択バイアスを適用するステップと、
    前記３Ｄナノポアデバイスの第２の検出ナノ電極を介して第２の検出バイアスを印加するステップと、
    前記第２検出ナノ電極からの第２出力電流を検出するステップと、
    前記第２のオリゴヌクレオチドのメチル化率を判定するために、前記第２の検出ナノ電極からの第２の出力電流を分析するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
  14. 前記オリゴヌクレオチドのメチル化率を判定するために前記検出電極からの出力電流を分析するステップが、メチルシトシンメチル化とヒドロキシメチルシトシンメチル化とを区別することを含む、請求項１に記載の方法。
  15. さらに、疾患を診断するために、前記オリゴヌクレオチドのメチル化率を既知の突然変異に対応するメチル化パターンのライブラリと比較するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  16. 前記疾患は、癌、アテローム性動脈硬化症、または老化である、請求項１５記載の方法。
  17. 前記オリゴヌクレオチドプローブが、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、またはタンパク質プローブである、請求項１に記載の方法。
  18. さらに、前記オリゴヌクレオチド中のメチル化部位の数を定量化するために、前記検出ナノ電極からの出力電流を分析するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  19. さらに、前記ナノチャネルを通るオリゴヌクレオチドの移動速度を調節するために、前記３Ｄナノポアデバイス内の速度制御ナノ電極に速度制御バイアスを印加するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  20. 前記電流が電極電流である、請求項１に記載の方法。
  21. 前記電流がトンネル電流である、請求項１に記載の方法。
  22. 前記第１のゲートナノ電極が前記ナノチャネルの第１の端部をアドレス指定し、
    前記第２のゲートナノ電極が前記ナノチャネルの前記第１の端部と反対側の第２の端部をアドレス指定し、
    前記検出ナノ電極が前記ナノチャネルの第１の端部と第２の端部の間の第１の位置をアドレス指定する、請求項１に記載の方法。
  23. さらに、前記第１および第２のゲートナノ電極の間のナノチャネルを通るように前記オリゴヌクレオチドの交互の流れを方向付けるために、電気泳動バイアスと選択バイアスとを交互に逆にするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  24. 前記３Ｄナノポアデバイスが、モバイルアプリケーション、ラップトップコンピュータ、またはデスクトップコンピュータに組み込まれている、請求項１に記載の方法。
  25. 前記３Ｄナノポアデバイスが、マイクロ流体デバイス、ナノ流体デバイス、ナノデバイス、またはラボオンチップシステムに組み込まれている、請求項１に記載の方法。
  26. 前記３Ｄナノポアデバイスが、オリゴヌクレオチドの抽出および検出のためのオールインワンＡＳＩＣプラットフォームシステムに組み込まれている、請求項１に記載の方法。
  27. さらに、前記３Ｄナノポアデバイスが、約１０フェムトモル（検出限界）のオリゴヌクレオチドの最小濃度で、前記オリゴヌクレオチドプローブへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  28. さらに、前記３Ｄナノポアデバイスが、オリゴヌクレオチドの増幅またはＰＣＲを使用することなく前記オリゴヌクレオチドプローブへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するステップを含む、請求項２７記載の方法。
  29. 前記３Ｄナノポアデバイスが液体生検パネルプラットフォームに組み込まれて、オリゴヌクレオチドの増幅またはＰＣＲを使用することなく検出を行う、請求項２７に記載の方法。
  30. さらに、前記オリゴヌクレオチドの構造変化を特定するために、前記検出ナノ電極からの出力電流を分析するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  31. さらに、前記オリゴヌクレオチドの水和変化を特定するために、前記検出ナノ電極からの出力電流を分析するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  32. オリゴヌクレオチド構造の変化を特定する方法であって、
    上部チャンバおよび下部チャンバを有する３Ｄナノポアデバイスと、前記上部チャンバおよび下部チャンバに配置された３Ｄナノチャネルアレイとを提供して、前記上部チャンバおよび下部チャンバが前記３Ｄナノチャネルアレイ内の複数のナノチャネルに流体結合するようにする、ステップと、
    オリゴヌクレオチドを精製するステップと、
    前記ナノチャネルを規定する前記３Ｄナノポアデバイスの内面にオリゴヌクレオチドプローブを結合することによって前記３Ｄナノチャネルアレイを機能化するステップであって、前記オリゴヌクレオチドプローブはオリゴヌクレオチドに相補的である、ステップと、
    前記精製したオリゴヌクレオチドを脱イオン水に加えて、既知の濃度のオリゴヌクレオチド溶液を構成するステップと、
    オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド溶液を前記上部チャンバおよび下部チャンバに加えるステップと、
    前記上部チャンバおよび下部チャンバに上部電極および下部電極をそれぞれ配置するステップと、
    前記上部電極と下部電極の間に電気泳動バイアスを印加するステップと、
    前記複数のナノチャネルのうちの１のナノチャネルを通るようにオリゴヌクレオチドの流れを誘導するために、前記３Ｄナノポアデバイスの第１および第２のゲートナノ電極にわたって選択バイアスを印加するステップと、
    前記３Ｄナノポアデバイスの検出ナノ電極を介して検出バイアスを印加するステップと、
    前記検出ナノ電極からの出力電流を検出するステップと、
    前記オリゴヌクレオチドの構造変化を特定するために前記検出ナノ電極からの出力電流を分析するステップと、を含むことを特徴とする方法。
  33. オリゴヌクレオチドの水和変化を特定する方法であって、
    上部チャンバおよび下部チャンバを有する３Ｄナノポアデバイスと、前記上部チャンバおよび下部チャンバに配置された３Ｄナノチャネルアレイとを提供して、前記上部チャンバおよび下部チャンバが前記３Ｄナノチャネルアレイ内の複数のナノチャネルに流体結合するようにする、ステップと、
    オリゴヌクレオチドを精製するステップと、
    前記ナノチャネルを規定する前記３Ｄナノポアデバイスの内面にオリゴヌクレオチドプローブを結合することによって前記３Ｄナノチャネルアレイを機能化するステップであって、前記オリゴヌクレオチドプローブはオリゴヌクレオチドに相補的である、ステップと、
    前記精製したオリゴヌクレオチドを脱イオン水に加えて、既知の濃度のオリゴヌクレオチド溶液を構成するステップと、
    オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド溶液を前記上部チャンバおよび下部チャンバに加えるステップと、
    前記上部チャンバおよび下部チャンバに上部電極および下部電極をそれぞれ配置するステップと、
    前記上部電極と下部電極の間に電気泳動バイアスを印加するステップと、
    前記複数のナノチャネルのうちの１のナノチャネルを通るようにオリゴヌクレオチドの流れを誘導するために、前記３Ｄナノポアデバイスの第１および第２のゲートナノ電極にわたって選択バイアスを印加するステップと、
    前記３Ｄナノポアデバイスの検出ナノ電極を介して検出バイアスを印加するステップと、
    前記オリゴヌクレオチドの水和変化を特定するために前記検出ナノ電極からの出力電流を分析するステップと、を含むことを特徴とする方法。
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