KR20180039093A - 단백질-단백질 상호작용의 초해상도 영상화 - Google Patents

단백질-단백질 상호작용의 초해상도 영상화 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 분자내 및 분자간 상호작용, 예컨대 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이들 방법은 이러한 상호작용을 서브-회절 거리에서 검출하고, 따라서 초해상도 검출 및 영상화 방법으로서 지칭된다.

Description

단백질-단백질 상호작용의 초해상도 영상화
관련 출원
본 출원은 2015년 8월 7일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/202,327의 35 U.S.C. § 119(e) 하의 이익을 주장하며, 그의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
연방 지원 연구
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 수여된 U01-MH106011-01 및 5R01EB018659-02 하에 및 미국 국립 과학 재단에 의해 수여된 CCF-1317291 및 미국 국방부 해군 연구청에 의해 수여된 N00014-13-1-0593 하에 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
게놈 시퀀싱 데이터는 막대한 양의 예측된 단백질 세트를 생성하여 왔다. 그러나, 생의학 연구에 유용한 포괄적 상호작용체 맵의 확립은 단백질 상호작용의 국재화 및 공동-국재화를 연구하는데 정확하고 정밀한 방법을 필요로 한다. 현재 이용가능한 많은 방법은 단세포에서 일시적 상호작용을 검출할 수 없고, 대신에 세포 집단에서 비교적 안정한 단백질 상호작용을 검출할 수 있을 뿐이다 (예를 들어, 공동-면역침전을 사용함).
본 개시내용은 상호작용 모이어티, 예컨대 단백질 및 다른 생체분자의 초해상도 영상화를 위한 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. DNA-PAINT (deoxyribonucleic acid-point accumulation for imaging in nanoscale topography: 나노규모 토포그래피에서 영상화를 위한 데옥시리보핵산-포인트 축적) 기술을 기반으로 하는 이들 감수성이고 특이적인 방법은 '근접 DNA-PAINT' 방법으로 본원에서 지칭된다. 근접 DNA-PAINT는, 일부 실시양태에서, 개별 세포 내 세포내 단백질 (또는 핵산)과 같은 2개의 상이한 분자 사이의 상호작용을 검출/시각화하는데 사용된다. 근접 DNA-PAINT는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 200개 미만의 뉴클레오티드의 길이, 또는 100개 미만의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 단일-스트랜드 핵산)를 사용하며, 각각의 올리고뉴클레오티드는 2개의 절반이 함께 회합되어 완전 도킹 부위를 형성할 때만 표지된 '이미저 스트랜드'가 결합하는 '도킹 부위'의 절반을 형성하는 도메인을 포함한다. 각각의 올리고뉴클레오티드는 또한 안정성 도메인을 포함한다. 한 쌍의 올리고뉴클레오티드의 안정성 도메인은 올리고뉴클레오티드가 연결되어 있는 결합 파트너 (예를 들어, 단백질) 사이의 상호작용에 의해 올리고뉴클레오티드의 쌍이 함께 근접하게 있을 때 올리고뉴클레오티드가 서로 결합하도록 (안정성/스템 도메인을 통함) 서로 상보성이다. 단지 각각이 도킹 부위의 절반을 함유하는 (상보성인) 한 쌍의 2개의 올리고뉴클레오티드가 도 1a-1b에 도시된 바와 같이 서로 결합할 때 (2개의 관심 결합 파트너가 서로 상호작용하거나, 또는 서로에게 매우 근접할 때)에만 완전 도킹 부위가 형성된다. 따라서, 도킹 부위에 대한 이미저 스트랜드의 결합은 한 쌍의 양쪽 올리고뉴클레오티드가 서로에게 충분히 근접하고 그들이 서로 결합할 때 단지 발생할 것이다. 올리고뉴클레오티드의 각각의 쌍을 한 쌍의 표적-특이적 결합 파트너, 예컨대 표적-특이적 항체에 접합시킴으로써, 이러한 표적의 상호작용은 서브-회절 한계 해상도로 직접 관찰될 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 바와 같은 조성물 및 방법은, 예를 들어, 개별 세포에서 내인성 단백질 사이의 상호작용을 시각화하는데 사용될 수 있다. 복합체화는 또한 DNA 도킹 스트랜드의 직교성을 통해 달성될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 시스템, 조성물 및 키트를 제공한다: (a) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제1 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, (b) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제2 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 (a) 및 (b)의 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 완전 도킹 도메인을 형성함, 및 (c) 5' 도메인, 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 링커 도메인을 포함하는 이미저 스트랜드, 여기서 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 3' 도메인은 (b)의 절반-도킹 도메인에 상보성임.
일부 실시양태에서, (a) 및 (b)의 결합 파트너 각각은 항체 또는 항원-결합 항체 단편이다. 항체 (및 항원-결합 항체 단편)은, 예를 들어, 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 키메라 항체 (및 항원-결합 항체 단편) 및 인간화 항체 (및 항원-결합 항체 단편)가 또한 본원에 포괄된다.
일부 실시양태에서, (a) 및 (b)의 결합 파트너 각각은 상이한 단백질에 결합한다. 예를 들어, 한 쌍의 결합 파트너는 단백질 A에 특이적으로 결합하는 하나의 항체, 및 단백질 B에 특이적으로 결합하는 또 다른 항체를 포함할 수 있다. 따라서, 각각의 결합 파트너 (예를 들어, 항체)는 상이한 단백질에 (예를 들어, 하나는 단백질 A에, 그리고 하나는 단백질 B에) 결합한다. 일부 실시양태에서, (a) 및 (b)의 결합 파트너 각각은 동일한 단백질의 상이한 결합 부위 (예를 들어, 에피토프)에 결합한다. 예를 들어, 한 쌍의 결합 파트너는 단백질 A의 에피토프 A에 특이적으로 결합하는 하나의 항체, 및 단백질 A의 에피토프 B에 특이적으로 결합하는 또 다른 항체를 포함할 수 있다. 따라서, 각각의 결합 파트너 (예를 들어, 항체)는 동일한 단백질의 상이한 에피토프에 (예를 들어, 하나는 에피토프 A에, 그리고 하나는 에피토프 B에) 결합한다.
일부 실시양태에서, (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인 각각은 5-15개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 예를 들어, (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인 각각은 5-10개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인 각각은 3-20, 3-15, 3-10, 4-20, 4-15, 4-10, 5-20, 5-15 또는 5-10개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인 각각은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인 각각은 5±2개 뉴클레오티드, 6±2개 뉴클레오티드, 7±2개 뉴클레오티드, 또는 8±2개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인 각각은 5-7개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인 각각은 6개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, (a) 및 (b)의 안정성 도메인 각각은 5-50개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 예를 들어, (a) 및 (b)의 안정성 도메인 각각은 5-40, 5-30, 5-20, 5-10, 10-50, 10-40, 10-30 또는 10-20개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, (a) 및 (b)의 안정성 도메인 각각은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, (a) 및 (b)의 안정성 도메인 각각은 8±2개 뉴클레오티드, 9±2개 뉴클레오티드, 10±2개 뉴클레오티드, 11±2개 뉴클레오티드, 또는 12±2개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, (a) 및 (b)의 안정성 도메인 각각은 9-11개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드는 10-30개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 예를 들어, 이미저 스트랜드는 10-15 또는 10-20개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드는 8±2길이 뉴클레오티드, 9±2개 뉴클레오티드, 10±2개 뉴클레오티드, 11±2개 뉴클레오티드, 12±2개 뉴클레오티드, 13±2개 뉴클레오티드, 14±2개 뉴클레오티드, 15±2개 뉴클레오티드, 또는 16±2개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드는 10-12개 뉴클레오티드 또는 12-14개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드의 5' 도메인 및 3' 도메인 각각은 5-10개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드의 5' 도메인 및 3' 도메인 각각은 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드의 5' 도메인 및 3' 도메인 각각은 6개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드의 5' 도메인 및 3' 도메인 각각은 6±2개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 링커 도메인은 1-5개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 예를 들어, 링커 도메인은 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 도메인은 티민 (T) 뉴클레오티드 (T 잔기)를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커는 TT 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커 도메인은 아데닌 (A) 뉴클레오티드 (A 잔기)를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커는 AA 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커 도메인은 시토신 (C) 뉴클레오티드 (C 잔기)를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커는 CC 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커 도메인은 구아닌 (G) 뉴클레오티드 (G 잔기)를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커는 GG 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드는 검출가능하게 표지된다 (검출될 수 있는 분자를 포함함). 일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드는 형광으로 표지된다 (형광 표지/분자, 예컨대 형광단을 포함함).
일부 실시양태에서, (a) 및 (b)의 결합 파트너 각각은 스트렙타비딘-비오틴 결합 쌍을 통해 (a) 및 (b)의 올리고뉴클레오티드에 각각 접합된다. 예를 들어, 결합 파트너는 스트렙타비딘에 연결될 수 있고, 올리고뉴클레오티드는 비오틴에 연결될 수 있다. 대안적으로, 결합 파트너는 비오틴에 연결될 수 있고, 올리고뉴클레오티드는 스트렙타비딘에 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 2개의 표적 (예를 들어, 서로 결합하거나 또는 달리 상호작용하는 단백질들)을 포함하는 복합체를 추가로 포함하고, 여기서 (a)의 결합 파트너는 2개의 표적 중 하나에 결합하거나 또는 그에 결합되어 있고, (b)의 결합 파트너는 2개의 표적 중 다른 것에 결합하거나 또는 그에 결합되어 있다.
일부 실시양태에서, 2개의 표적 각각은 단백질이다.
일부 실시양태에서, 복수개 내의 상이한 조성물의 이미저 스트랜드는 스펙트럼적으로 구별되는 표지 (예를 들어, 일부는 적색 채널에서 형광화, 나머지는 청색 채널에서 형광화 등)를 포함한다.
또한 하기를 포함하는 복수개 (예를 들어, 10, 100, 1000, 10000개 등)의 조성물이 본원에 제공된다: (a) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제1 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체; (b) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제2 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 (a) 및 (b)의 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 완전 도킹 도메인을 형성함; 및 (c) 5' 도메인, 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 링커 도메인을 포함하는 이미저 스트랜드, 여기서 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 3' 도메인은 (b)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고, 여기서 복수개 내의 상이한 조성물의 이미저 스트랜드는 스펙트럼적으로 구별되지 않는 표지를 포함함.
또한 하기를 포함하는 복수개의 조성물이 본원에 제공된다: (a) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제1 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, (b) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제2 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 (a) 및 (b)의 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 완전 도킹 도메인을 형성함, 및 (c) 5' 도메인, 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 링커 도메인을 포함하는 이미저 스트랜드, 여기서 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 3' 도메인은 (b)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고, 여기서 복수개의 조성물 중 적어도 하나는 복수개 중 다른 조성물과 구별되는 블링킹 빈도 (예를 들어, K온/K오프)를 가짐.
샘플에서 2개의 표적의 복합체를 검출하는 방법이 추가로 본원에 제공되며, 방법은 하기를 포함한다: 샘플을 (a) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제1 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, (b) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제2 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 (a) 및 (b)의 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합되어 완전 도킹 도메인을 형성함, 및 (c) 5' 도메인, 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 링커 도메인을 포함하는 이미저 스트랜드로서, 여기서 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 3' 도메인은 (b)의 절반-도킹 도메인에 상보성인 이미저 스트랜드와 접촉시키는 단계이며, 여기서 (a)의 결합 파트너는 2개의 표적 중 하나에 특이성을 갖고, (b)의 결합 파트너는 2개의 표적 중 다른 하나에 특이성을 갖는 단계; 및 샘플에서 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 샘플은 세포 (예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유동물 세포) 또는 세포 용해물이다.
일부 실시양태에서, 2개의 표적 각각은 단백질이다.
일부 실시양태에서, 2개의 표적 각각은 세포 또는 세포 용해물로부터 수득된다 (예를 들어 그로부터 단리되거나 또는 그로부터 정제됨).
일부 실시양태에서, 방법은 샘플에서 2개의 표적의 복수개의 복합체를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수개의 복합체는 복수개의 상이한 복합체이다. 일부 실시양태에서, 복수개 내의 복합체의 서브세트는 서로의 서브-회절 거리 내에 위치된다.
본 개시내용은 또한 샘플에서 분자내 상호작용을 검출하는 방법을 제공하며, 방법은 하기를 포함한다: 표적 분자를 포함하는 샘플을 (a) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제1 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 (a)의 결합 파트너는 표적 분자 상의 하나의 위치에 대한 특이성을 가짐, (b) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제2 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 (b)의 결합 파트너는 표적 분자 상의 또 다른 위치에 대한 특이성을 갖고, 여기서 (a) 및 (b)의 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 완전 도킹 도메인을 형성함, 및 (c) 검출가능한 표지, 5' 도메인, 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 링커 도메인을 포함하는 이미저 스트랜드로서, 여기서 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 3' 도메인은 (b)의 절반-도킹 도메인에 상보성인 이미지 스트랜드와 접촉시키는 단계; 및 샘플에서 (c)의 이미저 스트랜드의 검출가능한 표지의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
일부 실시양태에서, 샘플은 세포 또는 세포 용해물이다.
일부 실시양태에서, 표적 분자는 단백질이다.
일부 실시양태에서, (a) 및 (b)의 위치 각각은 단백질 상의 상이한 에피토프이다. 따라서, 방법은 관심 단백질 상의 2개의 상이한 결합 부위 (예를 들어, 에피토프)의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다.
또한 하기를 포함하는 시스템, 키트 및 조성물이 본원에 제공된다: (a) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제1 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, (b) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제2 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 (a) 및 (b)의 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 제1 완전 도킹 도메인을 형성함, (c) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제3 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 (a) 및 (c)의 안정성 도메인은 서로 상보성이며, (a) 및 (c)의 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 제2 완전 도킹 도메인을 형성함, (d) 5' 도메인, 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 링커 도메인을 포함하는 제1 이미저 스트랜드, 여기서 제1 이미저 스트랜드의 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 제1 이미저 스트랜드의 3' 도메인은 (b)의 절반-도킹 도메인에 상보성임, 및 (e) 5' 도메인, 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 링커 도메인을 포함하는 제2 이미저 스트랜드, 여기서 제2 이미저 스트랜드의 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 제2 이미저 스트랜드의 3' 도메인은 (c)의 절반-도킹 도메인에 상보성임.
본 개시내용은, 일부 실시양태에서, 하기를 포함하는 시스템, 조성물 및 키트를 제공한다: (a) 5-7개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 절반-도킹 도메인, 9-11개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 항체를 포함하는 제1 항체-올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 항체-DNA) 접합체; (b) 5-7개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 절반-도킹 도메인, 9-11개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제2 항체-올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 항체-DNA) 접합체, 여기서 (a) 및 (b)의 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인은 정렬되어 (예를 들어, 선형으로) 완전 도킹 도메인을 형성함, 및 (c) 5-7개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 5' 도메인, 5-7개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 1-5개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 링커 도메인을 포함하는 이미저 스트랜드, 여기서 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 3' 도메인은 (b)의 절반-도킹 도메인에 상보성임.
도 1a-1c는 근접-PAINT의 예를 제시한다. 도 1a는 2개의 표적 단백질을 제시하며, 각각은 2개의 p-PAINT DNA 올리고 중 하나로 표지된다. 단백질이 상호작용하는 경우에, 상호작용은 DNA-PAINT를 통해 가시적일 것이다. 도 1b는 pPAINT 올리고의 상세한 개략도를 제시한다: 도킹 부위로서 역할을 하는 2개의 올리고는 일시적으로 결합할 짧은 상보성 도메인 (스템)을 갖는다. 이 도메인은 이미저 스트랜드의 평균 결합된 시간보다 더 긴 평균 결합된 시간을 갖도록 디자인된다. 따라서, 2개의 올리고가 도킹 부위를 형성하기에 충분히 근접할 때 이미저 스트랜드는 2개의 올리고가 도킹 부위를 형성하기에 충분히 근접하지 않은 경우보다 더 높은 확률로 도킹 부위에 결합할 것이다. 도킹 부위의 형성 없이, DNA-PAINT 트레이스는 관찰되지 않는다. 이 예에 제시된 pPAINT를 위해 사용된 이미저 스트랜드 (프로브)은 3개의 도메인을 갖는다: 도킹-스트랜드 서열 중 하나의 1개 말단 'a1' (예를 들어, 5' 말단)에 결합하는 말단 도메인 'a1*', TT 링커를 포함하는 중심 도메인, 및 다른 도킹 스트랜드 서열의 1개 말단 '2a' (예를 들어, 3' 말단)에 결합하는 또 다른 말단 도메인 'a2*'. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 링커 및 스페이서는 상호교환가능하게 사용된다. 도 1c는 4개 모서리에서 pPAINT 올리고로 "표지된" DNA 오리가미 구조를 제시한다: pPAINT 올리고의 쌍이 존재했을 때, DNA-PAINT 초해상도 형광 이미지는 Cy3b-표지된 이미저 스트랜드를 사용하여 수득되었다. pPAINT 올리고 중 단지 하나가 존재했을 때, 가시적인 트레이스는 수득되지 않았다. 도 1d는 pPAINT 프로브를 갖는 연장부를 함유하는 DNA 오리가미 나노구조를 제시하며, 이는 목적하는 기하구조가 제어 DNA-PAINT 도킹 부위 (P16 및 P38) 및 pPAINT 도킹 부위 (pP1)로 가시화될 수 있다는 것을 입증한다. 도 1e는 pPAINT 프로브 (i), 모티프 2 (ii) 및 모티프 1(iii)의 쌍에 의해 채택된 2차 구조를 제시한다. 각각의 모티프는 2개의 프로브가 아주 근접해 있을 때 그들이 (i)에 도시된 2차 구조를 채택하는 것을 보장하기에 충분한 약하지만, 다가 상호작용의 형성을 방지하기에 충분한 강한 2차 구조를 채택하도록 디자인되었다. 이 마지막 특색은, 예를 들어, 항체가 통상적으로 1개 초과의 DNA 프로브로 표지되기 때문에 유용하며, 따라서 다가 상호작용은 심지어 표적 중 단지 하나가 존재할 때 pPAINT 도킹 부위 (i)의 형성을 야기할 수 있다.
도 2. pPAINT의 제1 스테이지. (좌측 패널) 3종 유형의 도킹 부위: 스템 및 도킹 부위 중 하나 사이의 에지에 TT, T 및 스페이서 없음은 3종 유형의 이미저로 평가되었다: 중간에 TTTT, TTT 및 TT 링커. (중간 패널) 도킹 부위를 갖는 최고 성능 이미저는 동역학적 분석을 기반으로 선택된다. (우측 패널) 이 쌍은 예로서, 9-11 bp 길이에 걸친 스템 디자인의 풀 내의 최적 스템 길이를 결정하는데 사용된다.
도 3. 3종 유형의 도킹 부위에 대한 평균 결합된 시간: 스템 및 도킹 부위 서열 중 하나 사이에 TT 스페이서 (사각형), T 스페이서 (삼각형) 및 스페이서 없음 (원형), 및 3종 유형의 이미저: 중간에 TTTT (중간 회색), TTT (옅은 회색) 및 TT (짙한 회색) 링커. 일부 경우에, pPAINT에 대한 디자인은 스템의 에지에서 스페이서, 및 이미저 스트랜드에서 TT 링커가 결여된 것에 상응한다.
도 4. 3종 유형의 도킹 부위에 대한 K온: 스템 및 도킹 부위 서열 중 하나 사이에 TT 스페이서 (사각형), T 스페이서 (삼각형) 및 스페이서 없음 (원형), 및 3종 유형의 이미저: 중간에 TTTT (중간 회색), TTT (옅은 회색) 및 TT (진한 회색) 링커.
도 5. 평가된 스템 길이당 최상 디자인에 대한 평균 결합된 시간: S9V2 (사각형), S10V2 (삼각형), S11V1 (원형).
도 6. 평가된 스템 길이당 예시 디자인에 대한 K온: S9V2 (사각형), S10V2 (삼각형), S11V1 (원형).
도 7. pPAINT에 대한 검출 범위. (좌측 패널) DNA 오리가미 중합체는 3개의 상이한 거리에서 pPAINT 올리고로 "표지된다". (중간 패널) 거리가 증가할수록 본 발명자들은 조광기 신호를 참조하는 것으로 예상한다. (상단 우측 패널) 이 특징화로 인해, p-PAINT에 대한 작업 범위를 결정하는 것이 가능할 것이다. (하부 우측 패널) 시험의 예비 결과는 더 큰 거리에서 2개의 도킹 부위로 수행된다. 2개의 pPAINT 올리고뉴클레오티드는 그들 사이에 5nm (상부 패널) 및 20nm (하부 패널)의 거리로 위치되었다. 각각의 패널의 좌측에서, 각각의 육각형이 3'-말단 연장부 (암회색) 및 5'-말단 (흑색) 내 변형에 대해 컬러-코딩된 스테이플을 나타내는 헥스-스테이플 표시는 2개의 절반-도킹 부위가 DNA 오리가미에 놓여진 위치를 도시한다. 이 특징화로 인해, pPAINT의 작업 범위는 적어도 20nm라고 결론짓는 것이 가능하다.
도 8. 계내 벤치마킹 pPAINT.
본 개시내용은 종래 DNA-PAINT 방법론에 대한 변형을 제공한다. 단일 표적, 예컨대 단일 단백질 또는 단일 핵산을 영상화하는 것보다 오히려, 본 개시내용의 방법은 서로 상호작용하고 있는 표적 (예를 들어, 2개의 표적)을 검출한다. 방법은 2개의 표적이 서로 결합하거나 또는 서로 복합체화되는 것으로 간주될 수 있도록 한 쌍의 표적이 서로 매우 근접해 있을 때만 신호를 산출한다. 표적이 서로 충분히 근접하지 않을 때, 신호는 검출되지 않는다. 따라서 본 개시내용은 DNA-PAINT 방법론의 예상치 못한 사용, 뿐만 아니라 이러한 사용에 관련한 조성물을 제공한다.
DNA-PAINT는 회절 제한된 거리보다 적은 거리에 의해 서로 분리되는 표적에 대한 표지된 올리고뉴클레오티드의 확률론적, 기간-지속 결합을 수반하는 초해상도 영상화 방법론이다. 방법은 임의의 주어진 시간에서 올리고뉴클레오티드의 단지 표적의 서브세트에의 결합에 의존한다. 표적의 서브세트는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)일 수 있고, 일부 경우에 표적은 결합될 수 없다. 전체 미만의 표적이 검출가능한 올리고뉴클레오티드에 결합될 때, 개별 표적으로부터의 신호는 서로 더욱 용이하게 식별된다. 이것은 모든 표적이 검출가능한 표지에 결합될 때의 상황과 상반되고, 그런 경우에 다중 표적으로부터의 신호는 식별가능하지 않다. 따라서, 서로 너무 근접한 표적은 그들 각각의 신호를 일시적으로 시차를 두는 방식으로 검출함으로써 공간적으로 해결될 수 있다.
DNA-PAINT 방법에서, 표적은 표적에 특이적으로 결합하는 결합 파트너의 사용을 통해 검출된다. 결합 파트너는 차례로 '도킹 스트랜드'로서 본원에서 지칭된, 올리고뉴클레오티드에 접합된다. 검출은 도킹 스트랜드에 상보성인 '이미저 스트랜드' (프로브)로서 지칭된, 또 다른 올리고뉴클레오티드의 사용을 추가로 요구한다. 도킹 스트랜드는 이미저 스트랜드가 결합하는 도킹 부위를 제공한다. 이미저 스트랜드는 예를 들어 형광으로 표지된 것을 포함하여 검출가능하게 표지된다. DNA-PAINT는 도킹 및 이미저 스트랜드 사이의 상호작용이 단기간-지속되는데 필요하다. 이것은 예를 들어 도킹 및 이미저 스트랜드의 길이를 통해, 도킹 및 이미저 스트랜드의 뉴클레오티드 서열을 통해, 이미저 스트랜드의 농도를 통해, 표적당 도킹 스트랜드의 수를 통해, 결합 상호작용이 발생하는 조건을 통해 수많은 방식으로 달성된다.
다른 기술 예컨대 이분자 형광 상보성 (Hu, Chinenov, & Kerppola, 2002)은 세포 내의 이들 상호작용의 국재화를 가능하게 하지만 융합 단백질의 높은 발현 수준을 필요로 한다. 근접 라이게이션 검정 (PLA)으로 명명되는 상이한 접근법 (Soederberg, et al., 2006)은 높은 감도 및 특이성을 제공하지만, 단백질 사이의 상호작용을 지시하는 시각적 신호는 여전히 회절 한계에 국한되고, 여러 효소적 단계는 이러한 신호를 증폭시키고 검출하기 위해 필요하다.
단일 분자 국재화 (SML) 기술은 무수한 가치있는 생물학적 정보를 밝히는 회절 한계 미만의 시각화를 가능하게 한다. 이들 구현 중 다수는 형광 온 및 오프 상태를 사용하여 회절-한계 영역 내에서 단백질의 국재화를 일시적으로 탈커플링한다. 표적된 (예를 들어 자극 방사 고갈 현미경검사 또는 STED) (Hell, 1994) 및 확률론적 (광활성화 국재화 현미경검사 또는 PALM, 및 확률론적 광학 재구성 현미경검사 또는 STORM) (Rust, Bates, & Zhuang, 2006) (Betzig, et al., 2006) 스위칭 방법 둘 다는 전례가 없는 공간 해상도를 달성한 바 있지만, 이들은 비싼 장비 및/또는 전문화된 실험 조건을 필요로 한다.
대조적으로, DNA-PAINT는 그들의 상보성 '도킹' 스트랜드에 일시적으로 결합하는 짧은 검출가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드 ('이미저' 스트랜드)의 프로그램가능한 능력을 활용하며, 단일 분자 국재화를 위한 필요 확률론적 온- 및 오프-상태를 달성함으로써 초해상도 현미경검사를 용이하게 한다 (Jungmann et al., Nano Lett. 2010 Nov 10;10(11):4756-61, 참조로서 본원에 포함됨). DNA-PAINT는 DNA 나노구조에서 <10 nm 공간 해상도를 갖는 고도로 다중화된 서브-회절 이미지를 달성할 수 있다. 이에 더하여, DNA 올리고뉴클레오티드를 항체와 커플링시킴으로써, DNA-PAINT는 계내 다중화 2- 및 3-차원 초해상도 영상화로 연장될 수 있었다.
SML 접근법의 해상력을 다른 검정과 조합한 기술이 또한 이용가능하다. 이들은 단백질-단백질 상호작용의 초해상도 영상화를 위해 이분자 형광 상보성 (BiFC)과 PALM의 조합 (Liu, et al., 2014) 및 푀르스터 공명 에너지 전달 (FRET)과 범용-PAINT (uPAINT)의 조합 (Winckler, et al., 2013)을 포함한다. 이들 접근법은 서브-회절 한계 해상도를 사용하여 상호작용하는 단백질의 역할로의 가치있는 통찰을 제공하였다. 그럼에도 불구하고, 이들 방법은 의존적이며, 따라서, 매우 높은 수준에서 융합 단백질을 발현하기 위한 필요에 의해 제한된다. 추가로, 이들 방법은 막에서 표적 단백질의 분석으로 제한된다. 게다가, 수많은 단백질 쌍에 대한 다중화는 이들 이용가능한 기술을 사용하는 것이 매우 어렵다.
근접 PAINT
DNA PAINT처럼, 근접 DNA-PAINT는 뉴클레오티드 서열의 알려진 동역학에 의존한다. 올리고뉴클레오티드 쌍의 길이 및 서열을 조정함으로써, 회절-제한 영역 내의 표적 분자, 예컨대 복합체의 국재화를 가능하게 하는 일시적 결합 및 비결합을 달성하는 것이 가능하다. 2014년 7월 30일자로 출원된 국제 공개 번호 WO 2015/017586을 참조하며, 그의 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
일부 실시양태에서, 서로 매우 근접하게 있을 때만 도킹 부위로서 작용하는 한 쌍의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 시스템이 제공된다. 쌍이 매우 근접하지 않을 때, 이미저 스트랜드와 각각의 서열 단독 사이의 임의의 상호작용은 검출되기에 충분하게 안정하지 않다 (도 1a-b).
도 1a-c는 2개의 상호작용 단백질과 관련하여 근접-PAINT (pPAINT) 방법을 예시한다. 도 1a에서, 2개의 표적 단백질은 한 쌍의 p-PAINT 올리고뉴클레오티드 중 하나로 각각 표지된다. 단백질이 상호작용하는 경우에, 상호작용은 DNA-PAINT를 통해 가시적이다.
도 1b는 pPAINT 올리고뉴클레오티드 디자인을 예시한다. 2개의 pPAINT 올리고뉴클레오티드는 조합하여 도킹 부위를 형성한다. 추가적으로, 그들은 올리고뉴클레오티드를 서로 일시적으로 결합할 짧은 상보성 도메인 (안정성 또는 스템 도메인으로서 본원에서 지칭됨)을 갖는다. 이 도메인은 도킹 부위에 결합하는 이미저 스트랜드보다 더 긴 평균 결합된 시간을 갖는다. 따라서, 2개의 올리고뉴클레오티드가 서로 충분히 근접할 때, 이미저 스트랜드는 올리고뉴클레오티드가 함께 충분히 근접하지 않을 경우보다 더 높은 확률로 도킹 부위에 결합할 것이다. 올리고뉴클레오티드가 서로 충분히 근접하지 않을 때, 상당한 DNA-PAINT 트레이스 (예를 들어, 형광 신호)는 수득되지 않는다.
pPAINT 이미저 스트랜드의 한 실시양태는 도 1b에 예시된다. 예시된 이미저 스트랜드는 3개의 도메인을 갖는다: 도킹 부위의 5'-말단 뉴클레오티드 서열에 결합하는 제1 도메인 (즉, 5' 절반-도킹 부위); 도킹 부위의 3'-말단 뉴클레오티드 서열에 결합하는 제2 도메인 (즉, 3' 절반-도킹 부위); 및 5'과 3' 도메인 사이에 위치된 (임의적) 링커 도메인. 존재하는 경우, 링커는 핵산일 수 있거나 또는 비-핵산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 1-5개 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드는 A, T, C 또는 G 잔기 또는 그의 일부 조합, 변이체 또는 그의 변형된 버전일 수 있다. 링커는 무염기성 부위로 구성될 수 있다. 존재하는 경우, 링커 서열이 절반-도킹 부위의 어느 하나에서의 서열에 결합하지 않는 것이 중요하다. 오히려 링커는 절반-도킹 부위에서 그들의 상보성 서열에 결합할 수 있도록 충분히 서로로부터 5' 및 3' 도메인을 분리하는 기능을 한다. 일부 실시양태에서, 링커 도메인은 단지 T 잔기, 예컨대 T, TT, TTT, TTTT 또는 TTTTT로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 도메인은 단지 A 잔기, 예컨대 A, AA, AAA, AAAA 또는 AAAAA로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 도메인은 단지 C 잔기, 예컨대 C, CC, CCC, CCCC 또는 CCCCC로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 도메인은 단지 G 잔기, 예컨대 G, GG, GGG, GGGG 또는 GGGGG로 이루어질 수 있다. 따라서, 링커는, 예를 들어, 단지 A (폴리A), T (폴리T), C (폴리C) 또는 G (폴리G)로 이루어진 단독중합체일 수 있다.
시험관내 분석을 위해, DNA 오리가미 구조 (나노구조)는 도 1c에 도식적으로 제시된 바와 같이, 그의 4개 모서리에서 pPAINT 올리고뉴클레오티드로 "표지되었다". pPAINT 올리고뉴클레오티드의 쌍이 존재할 때, DNA-PAINT 초해상도 형광 이미지는 Cy3b-표지된 이미저 스트랜드를 사용하여 수득되었다. pPAINT 올리고뉴클레오티드 중 단지 하나만 존재할 때, 가시적 트레이스는 수득되지 않았다.
표적-특이적 결합 파트너에 접합된 pPAINT 올리고뉴클레오티드는 일시적으로 결합할 (서로 혼성화함) 짧은 상보성 (스템 또는 안정성) 도메인으로 디자인된다. 스템 도메인에 대한 평균 결합된 시간은 이미저 - 도킹 부위 결합에 대한 평균 결합된 시간보다 더 길다. 따라서 스템 도메인은 이미저 스트랜드 결합의 확률을 증가시키기 위해 도킹 부위 복합체에 대한 안정성의 특정한 정도를 부여한다. 이미저 스트랜드는 도킹 부위의 5'-말단 (1개의 올리고뉴클레오티드에 의해 부여됨) 및 도킹 부위의 3'-말단 (다른 올리고뉴클레오티드에 의해 부여됨)에 결합한다.
도 1b에 예시된 이미저 스트랜드는 중간에서의 링커 도메인과 함께, 절반-도킹 부위에 각각 결합하는 5' 및 3' 도메인을 포함한다. 이미저는 이전에 사용된 이미저 스트랜드보다 더 길 수 있다. 증가된 길이는 중간에 작은 루프를 갖는 열역학적 페널티를 보상한다 (도 1b).
본 개시내용은, 특히, 상이한 표적 사이의 상호작용, 예컨대 적어도 2개 (예를 들어, 2, 3, 4 또는 5개)의 단백질 사이의 상호작용, 또는 단백질 및 다른 모이어티 사이의 상호작용을 검출하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 방법은 세포에서 또는 세포 용해물에서 상호작용을 연구하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 그들은 시험관내 예컨대 스크리닝 검정 또는 플랫폼의 일부로서 표적 사이의 상호작용을 연구하는데 사용될 수 있다.
도킹 부위, 절반-도킹 부위, 및 절반-도킹 스트랜드
본원에 제공된 방법에서, "도킹 부위"는 2개의 "절반-도킹 부위"를 포함하며, 각각의 반 부위는 표적-특이적 결합 파트너에 의해 기여된다. 따라서, 2개의 표적이 서로 복합체화될 때, 2개의 표적에 결합된 결합 파트너는 올리고뉴클레오티드가 결합 파트너에 접합될 것처럼 서로 매우 근접할 것이다. 올리고뉴클레오티드가 서로 매우 근접할 때, 그들은 함께 이미저 스트랜드가 혼성화할 수 있는 완전 도킹 부위를 형성한다. 표적이 복합체화되지 않는다면, 결합 파트너는 서로 충분히 근접하게 위치될 가능성이 없고, 그들이 결합된 올리고뉴클레오티드는 서로 상호작용하지 않을 것이며, 결론적으로 도킹 부위가 형성되지 않을 것이다.
시스템 및 그의 구성요소는 이미저 스트랜드가 이러한 결합을 관찰하도록 요구된 시간 동안 절반-도킹 부위의 어느 쪽에 결합하지 않도록 디자인된다. 따라서 2개의 절반-도킹 부위의 조합은 이미저 스트랜드 결합을 위해 필요하다. 이미저 스트랜드가 결합된 때만, 초점 평면에서 유래하는 검출가능한 신호가 수득될 것이다. 미결합된 이미저 스트랜드는 전형적으로 초점 평면의 외부에 있고 따라서 검출되지 않을지라도, 그들은 노이즈에 기여할 수 있다.
각각의 결합 파트너에 접합된 올리고뉴클레오티드는 절반-도킹 부위 도메인, 안정성 (또는 스템) 도메인, 임의로 절반-도킹 부위 도메인과 안정성 도메인 사이의 스페이서 도메인, 및 임의로 결합 파트너에 접합된 오릴고뉴클레오티드의 말단과 안정성 도메인 사이의 스페이서 도메인을 포함한다. 절반-도킹 부위 도메인은 상보성 이미저 스트랜드가 결합하는 완전 도킹 부위를 형성하기 위해 또 다른 결합 파트너에 접합된 올리고뉴클레오티드에 의해 부여된 또 다른 절반-도킹 부위 도메인과 조합하는 뉴클레오티드 서열이다. 안정성 도메인은 또 다른 결합 파트너에 접합된 또 다른 올리고뉴클레오티드에서 안정성 도메인에 상보성인 뉴클레오티드 서열이다. 2개의 표적이 상호작용하고 이들 올리고뉴클레오티드가 충분하게 근접하게 있을 때, 이들은 이들의 안정성 도메인을 통해 서로 혼성화되어 이중 스트랜드 스템 도메인을 형성한다. 이러한 혼성화는 2개의 절반-도킹 부위 도메인의 조합에 의해 형성된 완전 도킹 부위를 안정화하는데 도움을 준다. 올리고뉴클레오티드는 임의로 1 또는 2개의 스페이서 도메인을 포함할 수 있다. 스페이서 도메인은 올리고뉴클레오티드의 서로에 대한 혼성화 및/또는 이미저 스트랜드의 도킹 부위로의 혼성화를 용이하게 할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 전형적으로 단일-스트랜드일지라도, 그것은 또 다른 결합 파트너에 접합된 또 다른 올리고뉴클레오티드에 결합 전에 이중 스트랜드 영역을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 2개의 올리고뉴클레오티드 사이의 혼성화가, 그들의 안정성 도메인을 통해, 이미저 스트랜드의 도킹 부위로의 결합보다 더욱 안정할 것으로 고려된다. 본 개시내용은 2개의 복합체의 서로에 결합이 2개의 올리고뉴클레오티드 사이의 혼성화보다 더욱 안정할 것으로 추가로 고려된다. 다시 말해서, 다양한 상호작용의 자유 에너지는 하기와 같다: 표적-표적 상호작용 > 올리고-올리고 혼성화 > 이미저 스트랜드- 도킹 부위.
완전 도킹 부위는 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 뉴클레오티드의 길이를 포함한, 약 8개 뉴클레오티드 내지 약 60개 뉴클레오티드의 길이, 약 8 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 8 내지 약 40개 뉴클레오티드, 약 8 내지 약 30개 뉴클레오티드, 약 8 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 8 내지 약 15개 뉴클레오티드, 또는 약 10 내지 약 14개 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 완전 도킹 부위는 8-14개 뉴클레오티드 길이, 또는 9-13개 뉴클레오티드 길이, 또는 10-12개 뉴클레오티드 길이이다. 이미저 스트랜드 길이는 전형적으로 적어도 완전 도킹 부위의 길이이다.
절반-도킹 부위는 약 4개 뉴클레오티드 내지 약 100개 뉴클레오티드 길이의 범위이다. 일부 실시양태에서, 도킹 스트랜드는 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오티드 길이를 포함한, 약 4 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 4 내지 약 10개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 도킹 스트랜드는 4 내지 50개, 또는 4 내지 100개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 예를 들어, 도킹 스트랜드는 4 내지 10, 4 내지 15, 4 내지 20, 4 내지 25, 4 내지 30, 4 내지 35, 4 내지 40, 4 내지 45, 4 내지 50, 4 내지 55, 4 내지 60, 4 내지 60, 4 내지 70, 또는 4 내지 75개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
절반-도킹 부위는 완전 도킹 부위에 동일한 수의 뉴클레오티드를 기여할 수 있거나, 또는 그들은 완전 도킹 부위에 상이한 수의 뉴클레오티드를 기여할 수 있다. 예를 들어, 절반-도킹 부위는 각각 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 기여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 절반-도킹 부위는 각각 4 또는 5개 뉴클레오티드를 기여한다. 절반-도킹 부위는 5개 뉴클레오티드, 또는 6개 뉴클레오티드, 또는 7개 뉴클레오티드를 기여한다.
안정성 또는 스템 도메인은 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 뉴클레오티드 길이를 포함한, 약 8 내지 약 20개 뉴클레오티드 길이, 또는 약 8 내지 약 15개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 안정성 도메인과 절반-도킹 부위 도메인 사이에 스페이서 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 스페이서 도메인은 예를 들어 1-5개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 뉴클레오티드는 T 잔기일 수 있거나, 또는 그들은 무염기성 잔기일 수 있다. 이러한 스페이서 도메인은 이미저 스트랜드와 혼성화하지 않는다. 일부 실시양태에서, 안정성 도메인과 절반-도킹 부위 사이에 스페이서 도메인이 없다.
올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 접합된 말단과 안정성 도메인 사이에 스페이서 도메인을 포함할 수 있다. 이 스페이서 도메인은 예를 들어 5-100개 뉴클레오티드 길이를 포함한, 1-100개 뉴클레오티드 길이 또는 더 길 수 있다. 스페이서 도메인은 최대 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 및 100개 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서 도메인은 약 2.5 nm, 5 nm, 10 nm, 15 nm, 20 nm, 30 nm, 또는 더 긴 것을 포함한, 최대 또는 약 40 nm 길이이다.
이미저 스트랜드
"이미저 스트랜드"는 일시적으로 도킹 부위에 결합하는 단일-스트랜드 핵산 (예를 들어, DNA)이다. 이미저 스트랜드는 도킹 부위와 거의 동일한 길이일 수 있다. 따라서, 링커 도메인 없이, 이미저 스트랜드는 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 뉴클레오티드 길이를 포함한, 약 8개 뉴클레오티드 내지 약 50개 뉴클레오티드 길이, 약 8 내지 약 40개 뉴클레오티드, 약 8 내지 약 30개 뉴클레오티드, 약 8 내지 약 20개 뉴클레오티드, 약 8 내지 약 15개 뉴클레오티드, 또는 약 10 내지 약 14개 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드는 링커 도메인 또는 서열의 부재 하에, 8-14개 뉴클레오티드 길이, 또는 9-13개 뉴클레오티드 길이, 또는 10-12개 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드는 5' 및 3' 도메인을 포함하는 14개 뉴클레오티드 길이이며, 이들 각각의 도메인은 6개 뉴클레오티드 길이, 및 2개 뉴클레오티드 링커이다.
일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드는 5' 및 3' 도메인을 포함하는 8-20개 뉴클레오티드 길이이며, 이들 각각의 도메인은 4-8개 뉴클레오티드 길이, 및 1-4개 뉴클레오티드 링커이다.
이미저 스트랜드는 완전 도킹 부위에 상보성이고 그에 일시적으로는 결합한다. 2개의 핵산 또는 핵산 도메인은 그들이 염기-쌍이거나, 또는 왓슨-크릭 상호작용을 통해 이중-스트랜드 핵산 분자를 형성하도록 결합하는 경우에 서로 "상보성"이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "결합"은 생리학적 조건 하에 예를 들어 정전기, 소수성, 이온성 및/또는 수소-결합 상호작용으로 인해 적어도 2개의 분자 사이의 회합을 지칭한다. 이미저 스트랜드는 도킹 부위의 상보성 영역에 결합한 다음 단기간 내에 도킹 부위로부터 해리되는 (미결합되는) 경우에 도킹 부위에 "일시적으로 결합하는" 것으로 고려된다. 이들 상호작용은 일부 실시양태에서 실온에서 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드는 약 0.1 내지 약 10, 또는 약 0.1 내지 약 5초 동안 도킹 스트랜드에 결합되어 남아있다. 예를 들어, 이미저 스트랜드는 약 0.1, 약 1, 약 5 또는 약 10초 동안 도킹 스트랜드에 결합되어 남아있다.
링커 도메인의 존재 하에, 이미저 스트랜드는 상기 언급된 길이보다 적어도 1-5개 뉴클레오티드 더 길 수 있다.
본 개시내용의 이미저 스트랜드는 검출가능한 표지로 표지될 수 있다 (예를 들어, 형광 표지, 이 경우에 그들은 "형광 표지된" 것으로 간주된다). 예를 들어, 일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드는 적어도 1개 (즉, 1개 이상)의 형광단을 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 형광단의 예는 크산텐 유도체 (예를 들어, 플루오레세인, 로다민, 오레곤 그린, 에오신 및 텍사스 레드), 시아닌 유도체 (예를 들어, 시아닌, 인도카르보시아닌, 옥사카르보시아닌, 티아카르보시아닌 및 메로시아닌), 나프탈렌 유도체 (예를 들어, 단실 및 프로단 유도체), 쿠마린 유도체, 옥사디아졸 유도체 (예를 들어, 피리딜옥사졸, 니트로벤족사디아졸 및 벤족사디아졸), 피렌 유도체 (예를 들어, 캐스케이드 블루), 옥사진 유도체 (예를 들어, 나일 레드, 나일 블루, 크레실 바이올렛 및 옥사진 170), 아크리딘 유도체 (예를 들어, 프로플라빈, 아크리딘 오렌지 및 아크리딘 옐로우), 아릴메틴 유도체 (예를 들어, 아우라민, 크리스탈 바이올렛 및 말라카이트 그린), 및 테트라피롤 유도체 (예를 들어, 포르핀, 프탈로시아닌 및 빌리루빈)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 검출가능한 표지, 예를 들어, 금 나노입자 또는 다른 검출가능한 입자 또는 모이어티가 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드는 표적-특이적 방식으로 표지된다. 이것은 복합체 A에 대해 특이적인 이미저 스트랜드가 스펙트럼적으로 구별되는 표지로 표지되는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이, "스펙트럼적으로 구별되는" 표지는 상이한 스펙트럼 신호 또는 파장의 표지 (예를 들어, 형광단)를 지칭한다. 예를 들어, Cy2 형광단으로 표지된 이미저 스트랜드는 약 510 nm의 광의 파장에서 신호를 방출하는 반면, Cy5 형광단으로 표지된 이미저 스트랜드는 약 670 nm의 광의 파장에서 신호를 방출한다. 따라서, Cy2-표지된 이미저 스트랜드는 Cy5-표지된 이미저 스트랜드와는 스펙트럼적으로 구별된다.
역으로, "스펙트럼적으로 구별되지 않는" 표지는 동일한 스펙트럼 신호 또는 파장을 갖는 표지이다 - 즉, 표지의 방출 파장은 파장이 동일하거나 서로 가깝기 때문에 스펙트럼적으로 구별되지 않는 2개의 형광 표지 사이를 구별하는데 사용될 수 없다. 일부 실시양태에서, 이미저 스트랜드는 비-표적 특이적 방식으로 표지된다. 이미저 스트랜드는 동일한 표지로 또는 스펙트럼적으로 구별되지 않는 표지로 표지될 수 있다.
본원에 제공된 방법은 복수개의 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있고, 이러한 방식에서 방법은 다중화 방법 또는 검정으로서 지칭될 수 있다. 상이한 상호작용은 일시적으로, 또는 스펙트럼적으로 구별되는 신호의 사용을 통해, 또는 이미저 스트랜드의 블링킹 빈도의 차이 - 도킹 부위 상호작용을 통해 서로 구별될 수 있다. 상이한 표적은 상이한 이미저 스트랜드를 동시적으로가 아니라 순차적으로 사용하여 일시적으로 구별될 수 있다. 예를 들어, 제1 상호작용에 특이적인 제1 이미저 스트랜드는 제1 상호작용의 존재를 검출하는데 사용되고, 이어서 제2 상호작용에 특이적인 제2 이미저 스트랜드는 제2 상호작용의 존재를 검출하는데 사용된다. 상이한 이미저 스트랜드는 상이한 도킹 부위를 검출하는 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 이미저 스트랜드를 지칭한다. 상이한 표적은 스펙트럼적으로 구별되는 표지로 표지된 상이한 이미저 스트랜드를 사용하여 스펙트럼적으로 구별될 수 있다. 예를 들어, Cy2 표지를 갖는 제1 이미저 스트랜드는 제1 상호작용을 검출하는데 사용되고 Cy5 표지를 갖는 제2 이미저 스트랜드는 제2 상호작용을 검출하는데 사용된다. 이들 스펙트럼적으로 구별되는 이미저 스트랜드는 동시에 사용될 수 있다. 상이한 표적은 이미저 스트랜드 - 상이한 블링킹 빈도를 갖는 도킹 부위 조합에 의해 구별될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 이미저 스트랜드 - 도킹 부위 상호작용의 블링킹 빈도는 한정되고 구별되는 온 및/또는 오프 속도를 갖기 위해 변형될 수 있다. 이러한 방식에서, 일부 이미저 스트랜드 - 도킹 부위 쌍은 더 높은 주파수에서 결합되거나 비결합되고, 이로 인해 다른 쌍보다 더 빈번하게 "블링킹"하는 것으로 보일 수 있다. 이러한 방식에서, 이미저 스트랜드는 동일한 표지를 포함한 스펙트럼적으로 구별되지 않는 표지로 표지될 수 있고, 그들의 블링킹 빈도가 상이하기 때문에 여전히 동시에 사용될 수 있다. 블링킹 빈도는 이미저 스트랜드 길이 및 상응하게는 도킹 부위에서 서열 조성을 변경시키고 (예를 들어, 보다 AT 풍부 또는 보다 GC 풍부), 예를 들어 혼성화 조건을 변경시키는 것을 포함하는 다른 방법을 사용하여 용융 온도를 변경시키고, 표적당 도킹 부위의 수를 변경시키고, 이미저 스트랜드의 농도를 증가시키는 등의 변화에 의해 조정될 수 있다.
결합 파트너
방법은 결합 파트너가 존재하는 동안 실질적으로 임의의 모이어티의 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있거나, 또는 이러한 결합 파트너가 올리고뉴클레오티드에 접합될 수 있도록 제공될 수 있다.
올리고뉴클레오티드에 접합된 결합 파트너는 결합 파트너-핵산 (BP-NA) 접합체 또는 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 (BP-올리고) 접합체로서 여기서 지칭될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, BP-NA 또는 BP-올리고 접합체는 단일-스트랜드 핵산 (예를 들어, DNA)에 연결된 분자를 지칭한다 (예를 들어, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 링커를 통함). 단일-스트랜드 핵산은 절반-도킹 부위, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함한다.
결합 파트너는 관심 표적, 예컨대 생체분자 (예를 들어, 단백질 또는 핵산)에 대해 친화력이 있는 (예를 들어, 이에 결합하는) 임의의 모이어티 (예를 들어, 항체 또는 압타머)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 파트너는 단백질이다. 본 개시내용의 접합체에서 사용하기 위한 단백질의 예는 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체), 항원-결합 항체 단편 (예를 들어, Fab 단편), 수용체, 펩티드 및 펩티드 압타머를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 결합 파트너가 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 정전기 (예를 들어, 정전기 입자), 소수성 또는 자기 (예를 들어, 자기 입자) 상호작용을 통해 표적에 결합하는 결합 파트너가 본원에서 고려된다.
본원에 사용된 바와 같이, "항체"는 전장 항체 및 임의의 항원 결합 단편 (예를 들어, "항원-결합 부분") 또는 그의 단일 쇄를 포함한다. 용어 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날; 이종, 동종 또는 동계; 또는 그의 변형된 형태 (예를 들어, 인간화, 키메라)일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체의 "항원-결합 부분"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포괄된 결합 단편의 예는 하기를 포함한다: (i) Fab 단편, VH, VL, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VH 및 VL 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진, dAb 단편 (Ward et al., Nature 341:544 546, 1989); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 (vii) 임의로 합성 링커에 의해 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합. 게다가, Fv 단편, VH 및 VL의 2개의 도메인이 별도의 유전자에 의해 코드화될지라도, 그들은 재조합 방법을 사용하여, VH 및 VL 영역 쌍이 1가 분자를 형성하도록 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다 (단일 쇄 Fv (scFv)로서 공지됨; 예를 들어, [Bird et al., Science 242:423 426, 1988; 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988] 참조). 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포괄된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성을 위해 스크리닝된다.
본원에 사용된 바와 같이, "수용체"는 예를 들어, 펩티드와 같이 리간드에 결합하는 세포 유도 분자 (예를 들어, 단백질) 또는 소분자 (예를 들어, 저분자량 (<900 달톤) 유기 또는 무기 화합물)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "펩티드 압타머"은 불변 스캐폴드 단백질 내로 삽입된 가변성 펩티드 서열을 갖는 분자를 지칭한다 (예를 들어 [Baines IC, et al., Drug Discov.Today 11:334-341, 2006] 참조). 일부 실시양태에서, BP-NA 접합체의 분자는 예를 들어, 핵산 압타머와 같은 핵산이다. 본원에 사용된 바와 같이, "핵산 압타머"는 단백질 또는 다른 세포 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 2차 및 3차 구조를 형성할 수 있는 소형 RNA 또는 DNA 분자를 지칭한다 (예를 들어, [Ni X, et al., Curr Med Chem. 18(27): 4206-4214, 2011] 참조). 따라서, 일부 실시양태에서, BP-NA 접합체는 압타머-핵산 접합체일 수 있다.
중요한 실시양태에서, 결합 파트너는 관심 표적에 결합하는 항체 또는 항원-결합 항체 단편이다.
표적
표적은 임의의 관심 분자 또는 관심 분자 (예를 들어, 생체분자) 상의 임의의 결합 부위일 수 있다. 표적의 예는 단백질 및 핵산 (DNA 및/또는 RNA, 예컨대 mRNA)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 단백질의 예는 효소, 세포 신호전달, 리간드 결합 및/또는 국재화에 수반된 단백질, 뿐만 아니라 구조 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 표적은 단백질의 에피토프이다.
한 쌍의 표적은 동일한 유형의 분자 또는 한 쌍의 상이한 유형의 분자인 경우에 쌍일 수 있다. 예를 들어, 한 쌍의 표적은 단백질 A 및 핵산 A, 단백질 A 및 단백질 B, 또는 핵산 A 및 핵산 B를 포함할 수 있다.
방법
샘플에서 2개의 표적의 (적어도 하나의) 복합체를 검출하는 방법이 또한 본원에 제공되며, 방법은 하기를 포함한다: 샘플을 단락 29-44 중 어느 하나의 이미저 스트랜드 및 단락 29-44 중 어느 하나의 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체와 접촉시키는 단계이며, 여기서 (a)의 결합 파트너는 2개의 표적 중 하나에 대한 특이성을 갖고, (b)의 결합 파트너는 2개의 표적 중 다른 하나에 대한 특이성을 갖는 것인 단계; 및 샘플에서 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
샘플은 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 (예를 들어, 혈청 및/또는 혈장) 샘플, 뇌척수액 샘플, 소변 샘플을 포함하는 조직 샘플, 또는 다른 생물학적 샘플일 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 세포 또는 세포 용해물이다. 세포는 예를 들어 포유동물 세포, 박테리아 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포일 수 있다. 다른 세포 및 세포의 용해물은 여기서 포괄된다.
표적은, 일부 실시양태에서, 생체분자, 예컨대 단백질 또는 핵산이다. 관심 단백질의 예는 효소, 세포 신호전달, 리간드 결합 및/또는 국재화에 수반된 단백질, 뿐만 아니라 구조 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 핵산의 예는 자연 발생 또는 조작된 (예를 들어 합성 또는 재조합) DNA 및 RNA (예를 들어, mRNA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 표적 복합체는 서로의 서브-회절 거리 내에 위치된다. 즉, 광학 영상화 시스템-예를 들어, 현미경-이 사용될 때, 상호작용 표적의 해상도는 회절 제한된다 (회절로 인해 임의의 광학 시스템의 해상도는 근본적으로 최대임).
방법이 수행되는 조건은 핵산 혼성화 동역학의 이해를 갖는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 이러한 조건은 변경될 수 있다. 예를 들어, 표적 검출의 방법은, 필요에 따라, 특정한 농도의 염을 갖는 반응 완충제 또는 세포 용해물, 및 임의의 다른 필요한 시약 중에서 수행되어 핵산 혼성화 및 '블링킹' 동역학을 허용할 수 있다 (상기 논의된 바와 같음).
키트
키트가 또한 본원에 제공된다. 키트는, 예를 들어, 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체 쌍을, 본원에 제공된 바와 같이, 개별 구성요소 (개별적으로 결합 파트너 및 올리고뉴클레오티드)로서 또는 접합체 (올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너)로서 뿐만 아니라 표지가 있거나 없는 이미저 스트랜드로서 포함할 수 있다. 본원에 제공된 바와 같이, 조성물 중에 포함될 수 있는 임의의 구성요소 (예를 들어, 결합 파트너, 핵산, 링커 등)는 또한 키트에 포함될 수 있으며, 여기서 예를 들어, 개별 구성요소는 패키징되고 (예를 들어, 개별 저장 용기 중에), 더 큰 패키지 (예를 들어, 상자) 중에 함께 제공된다.
본 개시내용은 하기 넘버링된 단락에 의해 포괄된 실시양태를 추가로 제공한다:
1. 하기를 포함하는 키트, 시스템 또는 조성물:
제1 올리고뉴클레오티드에 연결된 제1 결합 파트너를 포함하는 제1 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 제1 올리고뉴클레오티드는 제1 절반-도킹 도메인, 제1 안정성 도메인, 및 임의로 제1 스페이서 도메인을 포함함,
제2 올리고뉴클레오티드에 연결된 제2 결합 파트너를 포함하는 제2 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 제2 올리고뉴클레오티드는 제2 절반-도킹 도메인, 제2 안정성 도메인, 및 임의로 제2 스페이서 도메인을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 제1 및 제2 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 완전 도킹 도메인을 형성함, 및
5' 도메인 및 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이의 링커 도메인을 포함하는 이미저 스트랜드, 여기서, 5' 도메인은 제1 절반-도킹 도메인에 상보성이고 3' 도메인은 제2 절반-도킹 도메인에 상보성임.
2. 단락 1에 있어서, 제1 및 제2 결합 파트너가 항체 또는 항원-결합 항체 단편인 키트, 시스템 또는 조성물.
3. 단락 1 또는 2에 있어서, 제1 및 제2 결합 파트너가 제1 및 제2 단백질에 결합하고, 제1 및 제2 단백질이 서로 상이한 것인 키트, 시스템 또는 조성물.
4. 단락 1-3 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 및 제2 절반-도킹 도메인이 5-7개 뉴클레오티드 길이인 키트, 시스템 또는 조성물.
5. 단락 1-4 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 및 제2 절반-도킹 도메인이 둘 다 6개 뉴클레오티드 길이인 키트, 시스템 또는 조성물.
6. 단락 1-5 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 및 제2 안정성 도메인이 9-11개 뉴클레오티드 길이인 키트, 시스템 또는 조성물.
7. 단락 1-6 중 어느 한 단락에 있어서, 이미저 스트랜드가 10-12개 뉴클레오티드 길이 또는 12-14개 뉴클레오티드 길이인 키트, 시스템 또는 조성물.
8. 단락 1-7 중 어느 한 단락에 있어서, 5' 및 3' 도메인이 6개 뉴클레오티드 길이인 키트, 시스템 또는 조성물.
9. 단락 1-8 중 어느 한 단락에 있어서, 링커 도메인이 1-5개 뉴클레오티드 길이인 키트, 시스템 또는 조성물.
10. 단락 1-9 중 어느 한 단락에 있어서, 링커 도메인이 T 잔기를 포함하는 것인 키트, 시스템 또는 조성물.
11. 단락 1-10 중 어느 한 단락에 있어서, 링커 도메인이 TT 서열을 포함하는 것인 키트, 시스템 또는 조성물.
12. 단락 1-11 중 어느 한 단락에 있어서, 이미저 스트랜드가 검출가능하게 표지된 것인 키트, 시스템 또는 조성물.
13. 단락 1-12 중 어느 한 단락에 있어서, 이미저 스트랜드가 형광으로 표지된 것인 키트, 시스템 또는 조성물.
14. 단락 1-13 중 어느 한 단락에 있어서, 결합 파트너가 스트렙타비딘 및 비오틴을 통해 올리고뉴클레오티드에 접합된 것인 키트, 시스템 또는 조성물.
15. 단락 1-14 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 및 제2 표적을 포함하는 복합체를 추가로 포함하고, 여기서 제1 결합 파트너는 제1 표적에 결합하거나 또는 그에 결합되어 있고, 제2 결합 파트너는 제2 표적에 결합하거나 또는 그에 결합되어 있는 것인 키트, 시스템 또는 조성물.
16. 단락 15에 있어서, 제1 및 제2 표적이 단백질인 키트, 시스템 또는 조성물.
17. 단락 1-16 중 어느 한 단락의 키트, 시스템 또는 조성물의 복수개의 키트, 시스템 또는 조성물이며, 여기서 상이한 시스템의 이미저 스트랜드는 스펙트럼적으로 구별되는 표지로 표지된 것인 복수개의 키트, 시스템 또는 조성물.
18. 단락 1-16 중 어느 한 단락의 키트, 시스템 또는 조성물의 복수개의 키트, 시스템 또는 조성물이며, 여기서 상이한 시스템의 이미저 스트랜드는 스펙트럼적으로 구별되지 않는 표지로 표지된 것인 복수개의 키트, 시스템 또는 조성물.
19. 단락 1-16 중 어느 한 단락의 키트, 시스템 또는 조성물의 복수개의 키트, 시스템 또는 조성물이며, 여기서 시스템의 적어도 하나는 복수개 중 다른 시스템과는 구별되는 블링킹 빈도를 갖는 것인 복수개의 키트, 시스템 또는 조성물.
20. 샘플에서 제1 및 제2 표적의 복합체를 검출하는 방법이며, 하기를 포함하는 방법:
샘플을
(a) 단락 1-16 중 어느 한 단락의 제1 및 제2 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 제1 결합 파트너는 제1 표적에 대한 특이성을 갖고 제2 결합 파트너는 제2 표적에 대한 특이성을 가짐, 및
(b) 단락 1-16 중 어느 한 단락의 이미저 스트랜드
와 접촉시키는 단계; 및
샘플에서 제1 및 제2 표적의 복합체의 존재를 검출하는 단계.
21. 단락 20에 있어서, 샘플이 세포 또는 세포 용해물인 방법.
22. 단락 20 또는 21에 있어서, 제1 및/또는 제2 표적이 단백질인 방법.
23. 단락 20-22 중 어느 한 단락에 있어서, 표적이 세포 또는 세포 용해물로부터 수득된 것인 방법.
24. 단락 20-23 중 어느 한 단락에 있어서, 방법이 복수개의 복합체를 검출한 것인 방법.
25. 단락 24에 있어서, 복수개의 복합체가 복수개의 동일한 복합체인 방법.
26. 단락 24에 있어서, 복수개의 복합체가 복수개의 상이한 복합체인 방법.
27. 단락 24-26 중 어느 한 단락에 있어서, 복수개 내의 복합체의 서브세트가 서로의 서브-회절 거리 내에 위치된 것인 방법.
28. 하기를 포함하는 키트, 시스템 또는 조성물:
제1 올리고뉴클레오티드에 연결된 제1 결합 파트너를 포함하는 제1 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 제1 올리고뉴클레오티드는 제1 절반-도킹 도메인, 제1 안정성 도메인, 및 임의로 제1 스페이서 도메인을 포함함,
제2 올리고뉴클레오티드에 연결된 제2 결합 파트너를 포함하는 제2 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 제2 올리고뉴클레오티드는 제2 절반-도킹 도메인, 제2 안정성 도메인, 및 임의로 제2 스페이서 도메인을 포함하고, 여기서 제1 및 제2 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 제1 및 제2 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 제1 완전 도킹 도메인을 형성함,
제3 올리고뉴클레오티드에 연결된 제3 결합 파트너를 포함하는 제3 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 제3 올리고뉴클레오티드는 제3 절반-도킹 도메인, 제3 안정성 도메인, 및 임의로 제3 스페이서 도메인을 포함하고, 여기서 제1 및 제3 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 제1 및 제3 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 제2 완전 도킹 도메인을 형성함,
제1 5' 도메인 및 제1 3' 도메인, 및 제1 5' 도메인과 제1 3' 도메인 사이에 제1 링커 도메인을 포함하는 제1 이미저 스트랜드, 여기서 제1 5' 도메인은 제1 절반-도킹 도메인에 상보성이고 3' 도메인은 제2 절반-도킹 도메인에 상보성임, 및
제2 5' 도메인 및 제2 3' 도메인, 및 제2 5' 도메인과 제2 3' 도메인 사이에 제2 링커 도메인을 포함하는 제2 이미저 스트랜드, 여기서 제2 5' 도메인은 제1 절반-도킹 도메인에 상보성이고 제2 3' 도메인은 제3 절반-도킹 도메인에 상보성임.
29. 하기를 포함하는 조성물:
(a) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제1 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체;
(b) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제2 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체;
여기서 (a) 및 (b)의 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 완전 도킹 도메인을 형성함; 및
(c) 5' 도메인, 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 링커 도메인을 포함하는 이미저 스트랜드, 여기서 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 3' 도메인은 (b)의 절반-도킹 도메인에 상보성임.
30. 단락 29에 있어서, (a) 및 (b)의 결합 파트너 각각이 항체 또는 항원-결합 항체 단편인 조성물.
31. 단락 29 또는 30에 있어서, (a) 및 (b)의 결합 파트너 각각이 상이한 단백질에 결합하는 것인 조성물.
32. 단락 29-31 중 어느 한 단락에 있어서, (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인 각각이 5-15개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 조성물.
33. 단락 32에 있어서, (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인 각각이 5-10개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 조성물.
34. 단락 29-33 중 어느 한 단락에 있어서, (a) 및 (b)의 안정성 도메인 각각이 5-50개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 조성물.
35. 단락 34에 있어서, 이미저 스트랜드가 10-30개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 조성물.
36. 단락 29-35 중 어느 한 단락에 있어서, 이미저 스트랜드의 5' 도메인 및 3' 도메인 각각이 5-10개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 조성물.
37. 단락 29-36 중 어느 한 단락에 있어서, 링커 도메인이 1-5개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 조성물.
38. 단락 29-37 중 어느 한 단락에 있어서, 링커 도메인이 티민 (T) 뉴클레오티드를 포함하는 것인 조성물.
39. 단락 29-38 중 어느 한 단락에 있어서, 링커 도메인이 TT 서열을 포함하는 것인 조성물.
40. 단락 29-39 중 어느 한 단락에 있어서, 이미저 스트랜드가 검출가능하게 표지된 것인 조성물.
41. 단락 29-39 중 어느 한 단락에 있어서, 이미저 스트랜드가 형광으로 표지된 것인 조성물.
42. 단락 29-41 중 어느 한 단락에 있어서, (a) 및 (b)의 결합 파트너 각각이 스트렙타비딘-비오틴 결합 쌍을 통해 (a) 및 (b)의 올리고뉴클레오티드에 각각 접합된 것인 조성물.
43. 단락 29-42 중 어느 한 단락에 있어서, 2개의 표적을 포함하는 복합체를 추가로 포함하고, 여기서 (a)의 결합 파트너는 2개의 표적 중 하나에 결합하거나 또는 그에 결합되어 있고, (b)의 결합 파트너는 2개의 표적 중 다른 하나에 결합하거나 또는 그에 결합되어 있는 것인 조성물.
44. 단락 43에 있어서, 2개의 표적 각각이 단백질인 조성물.
45. 단락 29-44 중 어느 한 단락에 있어서, 복수 내에 상이한 조성물의 이미저 스트랜드가 스펙트럼적으로 구별되는 표지를 포함하는 것인 복수개의 조성물.
46. 단락 29-44 중 어느 한 단락에 있어서, 복수개 내의 상이한 조성물의 이미저 스트랜드가 스펙트럼적으로 구별되지 않는 표지를 포함하는 것인 복수개의 조성물.
47. 단락 29-44 중 어느 한 단락에 있어서, 복수개의 조성물 중 적어도 하나가 복수개 중 다른 조성물과 구별되는 블링킹 빈도를 갖는 것인 조성물.
48. 샘플에서 2개의 표적의 복합체를 검출하는 방법이며, 하기를 포함하는 방법:
샘플을 단락 29-44 중 어느 하나의 이미저 스트랜드 및 단락 29-44 중 어느 하나의 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체와 접촉시키는 단계이며, 여기서 (a)의 결합 파트너는 2개의 표적 중 하나에 대한 특이성을 갖고, (b)의 결합 파트너는 2개의 표적 중 다른 하나에 대한 특이성을 갖는 것인 단계; 및
샘플에서 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
49. 단락 48에 있어서, 샘플이 세포 또는 세포 용해물인 방법.
50. 단락 48 또는 49에 있어서, 2개의 표적 각각이 단백질인 방법.
51. 단락 50에 있어서, 2개의 표적 각각이 세포 또는 세포 용해물로부터 수득된 것인 방법.
52. 단락 48-51 중 어느 한 단락에 있어서, 샘플에서 2개의 표적의 복수개의 복합체를 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
53. 단락 48-52 중 어느 한 단락에 있어서, 복수개의 복합체가 복수개의 상이한 복합체인 방법.
54. 단락 48-53 중 어느 한 단락에 있어서, 복수개 내의 복합체의 서브세트가 서로의 서브-회절 거리 내에 위치하는 것인 방법.
55. 샘플에서 분자내 상호작용을 검출하는 방법이며, 하기를 포함하는 방법:
표적 분자를 포함하는 샘플을
(a) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제1 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 (a)의 결합 파트너는 표적 분자 상의 하나의 위치에 대한 특이성을 가짐,
(b) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제2 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 (b)의 결합 파트너는 표적 분자 상의 또 다른 위치에 대한 특이성을 갖고, 여기서 (a) 및 (b)의 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 완전 도킹 도메인을 형성함, 및
(c) 검출가능한 표지, 5' 도메인, 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 링커 도메인을 포함하는 이미저 스트랜드로서, 여기서 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 3' 도메인은 (b)의 절반-도킹 도메인에 상보성인 이미저 스트랜드
와 접촉시키는 단계; 및
샘플에서 (c)의 이미저 스트랜드의 검출가능한 표지의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
56. 단락 27에 있어서, 샘플이 세포 또는 세포 용해물인 방법.
57. 단락 55 또는 56에 있어서, 표적 분자가 단백질인 방법.
58. 단락 57에 있어서, (a) 및 (b)의 위치 각각이 단백질 상의 상이한 에피토프인 방법.
59. 하기를 포함하는 조성물:
(a) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제1 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체;
(b) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제2 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체,
여기서 (a) 및 (b)의 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 제1 완전 도킹 도메인을 형성함;
(c) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제3 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체,
여기서 (a) 및 (c)의 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 (a) 및 (c)의 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 제2 완전 도킹 도메인을 형성함;
(d) 5' 도메인, 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 링커 도메인을 포함하는 제1 이미저 스트랜드, 여기서 제1 이미저 스트랜드의 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 제1 이미저 스트랜드의 3' 도메인은 (b)의 절반-도킹 도메인에 상보성임; 및
(e) 5' 도메인, 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 링커 도메인을 포함하는 제2 이미저 스트랜드, 여기서 제2 이미저 스트랜드의 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 제2 이미저 스트랜드의 3' 도메인은 (c)의 절반-도킹 도메인에 상보성임.
실시예
실시예 1
본 실시예에서, 링커의 길이 및 디자인을 분석하였다. 2, 3 또는 4개의 티민 (T) 잔기로 이루어진 링커를 서로 비교하였다. 이에 더하여, 1 또는 2개의 T 잔기의 짧은 스페이서를 절반-도킹 부위 도메인 및 스템 (또는 안정성) 도메인 사이에 pPAINT 올리고뉴클레오티드 중 하나로 도입하였다. 이들 상이한 이미저 스트랜드 및 올리고뉴클레오티드는 도 2a에 예시된다. 3종 유형의 도킹 부위: 스템 도메인 및 절반-도킹 도메인 사이에 TT, T, 및 스페이서 없음 (녹색)을 3종 유형의 이미저로 평가하였다: 중간에 TTTT, TTT 및 TT 링커 (오렌지색). 이들 조합을 그의 특징적인 동역학적 파라미터에 대해 분석하였다. 그의 도킹 부위를 갖는 최상 성능 이미저 스트랜드를, 도 2b에 의해 나타낸 바와 같이, 동역학적 분석을 기반으로 선택하였다. 이 쌍을 도 2c에 예시된 바와 같이, 9-11bp 길이에 걸친 스템 디자인의 풀 내에서의 최적 스템 길이를 결정하는데 사용하였다.
또 다른 실험에서, 이미저 스트랜드의 결합 전에 pPAINT 올리고뉴클레오티드와 함께 보유하는 스템 도메인의 길이를 양쪽 스트랜드가 각각의 실험에서 서로의 사이에 0.35 nm의 거리에 위치된 9, 10 및 11bp 스템 도메인으로 시도함으로써 초기에 결정하였다 (표 1은 길이당 예시 서열을 나열함). 이들 결과로부터, 본 발명자들은 5'과 3' 도메인 사이에서 TT 링커를 갖는 이미저 스트랜드 및 스페이서가 없는 도킹 부위가 도 3 및 4에 제시된 바와 같이 가장 긴 평균 결합된 시간 및 가장 큰 K온으로 최상으로 수행되는 것으로 결론내렸다. 이들 결과로부터 본 발명자들은 최상 스템 도메인이 도 5 및 6에서 제시된 바와 같이, 11 및 10 bp 길이인 것으로 결론내렸다. 양쪽 길이는, 일시적으로 결합할 것이지만, 이미저 스트랜드가 도킹 부위에 결합할 수 있기에 충분히 긴 스템 도메인을 제공해야 한다.
Figure pct00001
표 1. 최적화 동안 시험된 스템 도메인의 서열.
이미저 및 2개의 절반-도킹 부위에 대한 서열을 선택한 후에, 이들을 서로의 사이에 5 및 20 nm의 거리로 다시 DNA 오리가미 구조에서 실험하였다. 도 7에 제시된 바와 같이, DNA-PAINT 신호가 수득되었으며, 따라서 이는 pPAINT의 작업 범위가 본 실시예에서, 적어도 20nm임을 입증한다.
실시예 2
본 실시예는 계내 벤치마킹 pPAINT 실험을 기재한다. 알파 및 베타 튜불린을 2개의 표적으로서 선택하였다. 양성 대조군 (상단 3개 패널)은 알파 및 베타 튜불린에 대해 1차 항체 및 pPAINT 모티프 중 하나로 각각 표지된 그의 1차 항체 표적 각각에 대한 2차 항체의 사용을 포함하였다 (도 8). 미세관은 pP1, P16 및 P38로 영상화했을 때 가시적이었다. 음성 대조군은 단지 1개의 1차 항체 및 양쪽의 2차 항체를 첨가하는 것을 포함하였다. 첫번째 경우에, 단지 항 알파 튜불린을 첨가하였고 (중간 3개 패널) 따라서 미세관은 단지 P16을 사용했을 때 가시적이었다. 두번째 음성 대조군의 경우에, 단지 항 베타 튜불린을 첨가하였고 미세관은 P38을 사용했을 때만 관찰되었다. 도 1a-1e에 기재된 실시양태와 관련하여, pPAINT는, 예를 들어, 과량의 올리고-표지된 항체를 세척 제거하기 위해 단지 PBS를 필요로 하는 종래 면역표지 기술을 사용함으로써 단백질 상호작용을 검출하는데 사용될 수 있다.
프로브 사이의 거리의 범위: 최대 10nm
pP1.모티프1.10nm: ATACAACGAACTATTCGTTAGTTTGTTT (서열식별번호: 4)
pP1.모티프2.10nm: TATTTAGTGTTCGAATAGTTCGATCTAG (서열식별번호: 5)
프로브 사이의 거리의 범위: 최대 15nm
pP1.모티프1.15nm: ATA CAA CGA ACT ATT CGT TAG TTT GTT TTT TT (서열식별번호: 6)
pP1.모티프2.15nm: TT TTT ATT TAG TGT TCG AAT AGT TCG ATC TAG (서열식별번호: 7)
참고문헌
Betzig, E., Patterson, G., Sougrat, R., Lindwasser, O., Olenych, S., Bonifacino, J., et al. (2006). Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution . Science, 313, 1642-5.
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본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각 인용된 대상과 관련하여 참조로 포함되고, 일부 경우에 그 문헌의 전체를 포괄할 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 단수 용어는 명백하게 달리 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
명백하게 달리 나타내지 않는 한, 하나를 초과하는 단계 또는 작용을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 작용의 순서는 반드시 방법의 단계 또는 작용이 언급되어 있는 순서에 제한되지는 않는 것으로 또한 이해되어야 한다.
상기 명세서 뿐만 아니라 청구범위에서, 모든 연결 어구 예컨대 "포함하는", "비롯한", "보유하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "수용하는", "로 이루어진" 등은 개방형, 즉 포함하지만 이에 제한되지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 다만 연결 어구 "로 이루어진" 및 "로 본질적으로 이루어진"은 문헌 [United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03]에서 제시된 바와 같이, 각각 폐쇄형 및 반-폐쇄형 연결 어구일 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> President and Fellows of Harvard College <120> SUPER RESOLUTION IMAGING OF PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS <130> H0498.70557WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/202,327 <151> 2015-08-07 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 gatgacatc 9 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 2 taataaggat 10 <210> 3 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 3 ctaactaatt a 11 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 4 atacaacgaa ctattcgtta gtttgttt 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 5 tatttagtgt tcgaatagtt cgatctag 28 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 6 atacaacgaa ctattcgtta gtttgttttt tt 32 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 7 tttttattta gtgttcgaat agttcgatct ag 32

Claims (31)

  1. 하기를 포함하는 조성물:
    (a) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제1 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체;
    (b) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제2 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체;
    여기서 (a) 및 (b)의 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 완전 도킹 도메인을 형성함; 및
    (c) 5' 도메인, 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 링커 도메인을 포함하는 이미저 스트랜드, 여기서 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 3' 도메인은 (b)의 절반-도킹 도메인에 상보성임.
  2. 제1항에 있어서, (a) 및 (b)의 결합 파트너 각각이 항체 또는 항원-결합 항체 단편인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, (a) 및 (b)의 결합 파트너 각각이 상이한 단백질에 또는 동일한 단백질의 상이한 에피토프에 결합하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인 각각이 5-15개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인 각각이 5-10개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, (a) 및 (b)의 안정성 도메인 각각이 5-50개 뉴클레오티드인 길이를 갖는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 이미저 스트랜드가 10-30개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 이미저 스트랜드의 5' 도메인 및 3' 도메인 각각이 5-10개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 링커 도메인이 1-5개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 링커 도메인이 티민 (T) 뉴클레오티드를 포함하는 것인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 링커 도메인이 TT 서열을 포함하는 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 이미저 스트랜드가 검출가능하게 표지된 것인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 이미저 스트랜드가 형광으로 표지된 것인 조성물.
  14. 제1항에 있어서, (a) 및 (b)의 결합 파트너 각각이 스트렙타비딘-비오틴 결합 쌍을 통해 (a) 및 (b)의 올리고뉴클레오티드에 각각 접합된 것인 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 2개의 표적을 포함하는 복합체를 추가로 포함하며, 여기서 (a)의 결합 파트너는 2개의 표적 중 하나에 결합하거나 또는 그에 결합되어 있고, (b)의 결합 파트너는 2개의 표적 중 다른 하나에 결합하거나 또는 그에 결합되어 있는 것인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 2개의 표적 각각이 단백질인 조성물.
  17. 제1항의 조성물의 복수개의 조성물이며, 여기서 복수개 내의 상이한 조성물의 이미저 스트랜드는 스펙트럼적으로 구별되는 표지를 포함하는 것인 복수개의 조성물.
  18. 제1항의 조성물의 복수개의 조성물이며, 여기서 복수개 내의 상이한 조성물의 이미저 스트랜드는 스펙트럼적으로 구별되지 않는 표지를 포함하는 것인 복수개의 조성물.
  19. 제1항의 조성물의 복수개의 조성물이며, 여기서 복수개의 조성물 중 적어도 하나는 복수개 중 다른 조성물과 구별되는 블링킹 빈도를 갖는 것인 복수개의 조성물.
  20. 샘플에서 2개의 표적의 복합체를 검출하는 방법이며, 하기를 포함하는 방법:
    샘플을 제1항의 이미저 스트랜드 및 제1항의 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체와 접촉시키는 단계이며, 여기서 (a)의 결합 파트너는 2개의 표적 중 하나에 대해 특이성을 갖고, (b)의 결합 파트너는 2개의 표적 중 다른 하나에 대해 특이성을 갖는 것인 단계; 및
    샘플에서 복합체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
  21. 제20항에 있어서, 샘플이 세포 또는 세포 용해물인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 2개의 표적 각각이 단백질인 방법.
  23. 제20항에 있어서, 2개의 표적 각각이 세포 또는 세포 용해물로부터 수득된 것인 방법.
  24. 제20항에 있어서, 샘플에서 2개의 표적의 복수개의 복합체를 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 복수개의 복합체가 복수개의 상이한 복합체인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 복수개 내의 복합체의 서브세트가 서로의 서브-회절 거리 내에 위치된 것인 방법.
  27. 샘플에서 분자내 상호작용을 검출하는 방법이며, 하기를 포함하는 방법:
    표적 분자를 포함하는 샘플을
    (a) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제1 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 (a)의 결합 파트너는 표적 분자 상의 하나의 위치에 대한 특이성을 가짐,
    (b) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제2 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 (b)의 결합 파트너는 표적 분자 상의 또 다른 위치에 대한 특이성을 갖고, 여기서 (a) 및 (b)의 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 완전 도킹 도메인을 형성함, 및
    (c) 검출가능한 표지, 5' 도메인, 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 링커 도메인을 포함하는 이미저 스트랜드로서, 여기서 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 3' 도메인은 (b)의 절반-도킹 도메인에 상보성인 이미저 스트랜드
    와 접촉시키는 단계; 및
    샘플에서 (c)의 이미저 스트랜드의 검출가능한 표지의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
  28. 제27항에 있어서, 샘플이 세포 또는 세포 용해물인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 표적 분자가 단백질인 방법.
  30. 제29항에 있어서, (a) 및 (b)의 위치 각각이 단백질 상의 상이한 에피토프인 방법.
  31. 하기를 포함하는 조성물:
    (a) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제1 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체;
    (b) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제2 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체;
    여기서 (a) 및 (b)의 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 (a) 및 (b)의 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 제1 완전 도킹 도메인을 형성함;
    (c) 절반-도킹 도메인, 안정성 도메인, 및 임의로 스페이서 도메인을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 연결된 결합 파트너를 포함하는 제3 결합 파트너-올리고뉴클레오티드 접합체,
    여기서 (a) 및 (c)의 안정성 도메인은 서로 상보성이고, 여기서 (a) 및 (c)의 절반-도킹 도메인은 선형으로 조합하여 제2 완전 도킹 도메인을 형성함;
    (d) 5' 도메인, 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 링커 도메인을 포함하는 제1 이미저 스트랜드, 여기서 제1 이미저 스트랜드의 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 제1 이미저 스트랜드의 3' 도메인은 (b)의 절반-도킹 도메인에 상보성임; 및
    (e) 5' 도메인, 3' 도메인, 및 5' 도메인과 3' 도메인 사이에 위치된 링커 도메인을 포함하는 제2 이미저 스트랜드, 여기서 제2 이미저 스트랜드의 5' 도메인은 (a)의 절반-도킹 도메인에 상보성이고 제2 이미저 스트랜드의 3' 도메인은 (c)의 절반-도킹 도메인에 상보성임.
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