CN117500531A - 核酸折纸平台及其用途 - Google Patents
核酸折纸平台及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117500531A CN117500531A CN202280041300.7A CN202280041300A CN117500531A CN 117500531 A CN117500531 A CN 117500531A CN 202280041300 A CN202280041300 A CN 202280041300A CN 117500531 A CN117500531 A CN 117500531A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nanostructure
- nucleic acid
- antibodies
- targeting agent
- targeting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 153
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 126
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 126
- 229920001131 Pulp (paper) Polymers 0.000 title description 2
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 claims abstract description 437
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 403
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 377
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 184
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 41
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims abstract description 29
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 194
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 179
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 141
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 91
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 90
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 90
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 62
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 49
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 48
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 47
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 34
- -1 SYTOX Blue Chemical compound 0.000 claims description 28
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 25
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 25
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 22
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 20
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 18
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 18
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 18
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 17
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 16
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 16
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 16
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 15
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 14
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 12
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 claims description 12
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 12
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical compound [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 230000005931 immune cell recruitment Effects 0.000 claims description 7
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 claims description 6
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 claims description 6
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims description 6
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N Pyridoxal Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 6
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 claims description 6
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 claims description 6
- 108700022150 Designed Ankyrin Repeat Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 108091008108 affimer Proteins 0.000 claims description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims description 5
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 4
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 claims description 4
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000023178 Musculoskeletal disease Diseases 0.000 claims description 4
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 claims description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 4
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 claims description 4
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 claims description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 claims description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 4
- SLLFVLKNXABYGI-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-benzoxadiazole Chemical compound C1=CC=C2ON=NC2=C1 SLLFVLKNXABYGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- IHXWECHPYNPJRR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxycyclobut-2-en-1-one Chemical class OC1=CC(=O)C1 IHXWECHPYNPJRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UWAUSMGZOHPBJJ-UHFFFAOYSA-N 4-nitro-1,2,3-benzoxadiazole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC2=C1N=NO2 UWAUSMGZOHPBJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 claims description 3
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 claims description 3
- RURLVUZRUFHCJO-UHFFFAOYSA-N Chromomycin A3 Natural products COC(C1Cc2cc3cc(OC4CC(OC(=O)C)C(OC5CC(O)C(OC)C(C)O5)C(C)O4)c(C)c(O)c3c(O)c2C(=O)C1OC6CC(OC7CC(C)(O)C(OC(=O)C)C(C)O7)C(O)C(C)O6)C(=O)C(O)C(C)O RURLVUZRUFHCJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012129 DRAQ7 reagent Substances 0.000 claims description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 3
- FGBAVQUHSKYMTC-UHFFFAOYSA-M LDS 751 dye Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.C1=CC2=CC(N(C)C)=CC=C2[N+](CC)=C1C=CC=CC1=CC=C(N(C)C)C=C1 FGBAVQUHSKYMTC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J ToTo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2S1 MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 3
- GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J YoYo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3O2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2O1 GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 3
- BGLGAKMTYHWWKW-UHFFFAOYSA-N acridine yellow Chemical compound [H+].[Cl-].CC1=C(N)C=C2N=C(C=C(C(C)=C3)N)C3=CC2=C1 BGLGAKMTYHWWKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- VNDXKMITHCJCOL-UHFFFAOYSA-N acridine-1,2-diamine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=C(N)C(N)=CC=C3N=C21 VNDXKMITHCJCOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000001454 anthracenes Chemical class 0.000 claims description 3
- 229940027998 antiseptic and disinfectant acridine derivative Drugs 0.000 claims description 3
- CZPLANDPABRVHX-UHFFFAOYSA-N cascade blue Chemical compound C=1C2=CC=CC=C2C(NCC)=CC=1C(C=1C=CC(=CC=1)N(CC)CC)=C1C=CC(=[N+](CC)CC)C=C1 CZPLANDPABRVHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZYVSOIYQKUDENJ-WKSBCEQHSA-N chromomycin A3 Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@@H]1OC(C)=O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@@H]1C[C@@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](C)O1 ZYVSOIYQKUDENJ-WKSBCEQHSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001893 coumarin derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 3
- CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N deoliosyl-3C-alpha-L-digitoxosyl-MTM Natural products CC=1C(O)=C2C(O)=C3C(=O)C(OC4OC(C)C(O)C(OC5OC(C)C(O)C(OC6OC(C)C(O)C(C)(O)C6)C5)C4)C(C(OC)C(=O)C(O)C(C)O)CC3=CC2=CC=1OC(OC(C)C1O)CC1OC1CC(O)C(O)C(C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OVTCUIZCVUGJHS-UHFFFAOYSA-N dipyrrin Chemical class C=1C=CNC=1C=C1C=CC=N1 OVTCUIZCVUGJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M malachite green Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 229940107698 malachite green Drugs 0.000 claims description 3
- DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M merocyanine Chemical compound [Na+].O=C1N(CCCC)C(=O)N(CCCC)C(=O)C1=C\C=C\C=C/1N(CCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C2O\1 DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M 0.000 claims description 3
- CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N mithramycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](C)[C@@H](O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N 0.000 claims description 3
- SHXOKQKTZJXHHR-UHFFFAOYSA-N n,n-diethyl-5-iminobenzo[a]phenoxazin-9-amine;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=[NH2+])C2=C1 SHXOKQKTZJXHHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000002790 naphthalenes Chemical class 0.000 claims description 3
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000004866 oxadiazoles Chemical class 0.000 claims description 3
- GHTWDWCFRFTBRB-UHFFFAOYSA-M oxazine-170 Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.N1=C2C3=CC=CC=C3C(NCC)=CC2=[O+]C2=C1C=C(C)C(N(C)CC)=C2 GHTWDWCFRFTBRB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 150000004893 oxazines Chemical class 0.000 claims description 3
- JZRYQZJSTWVBBD-UHFFFAOYSA-N pentaporphyrin i Chemical compound N1C(C=C2NC(=CC3=NC(=C4)C=C3)C=C2)=CC=C1C=C1C=CC4=N1 JZRYQZJSTWVBBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- IEQIEDJGQAUEQZ-UHFFFAOYSA-N phthalocyanine Chemical compound N1C(N=C2C3=CC=CC=C3C(N=C3C4=CC=CC=C4C(=N4)N3)=N2)=C(C=CC=C2)C2=C1N=C1C2=CC=CC=C2C4=N1 IEQIEDJGQAUEQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960003171 plicamycin Drugs 0.000 claims description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 150000003220 pyrenes Chemical class 0.000 claims description 3
- 229960003581 pyridoxal Drugs 0.000 claims description 3
- 235000008164 pyridoxal Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011674 pyridoxal Substances 0.000 claims description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000001834 xanthenyl group Chemical class C1=CC=CC=2OC3=CC=CC=C3C(C12)* 0.000 claims description 3
- VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 2',7'-difluorofluorescein Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(F)C(=O)C=C2OC2=CC(O)=C(F)C=C21 VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZHAFUINZIZIXFC-UHFFFAOYSA-N [9-(dimethylamino)-10-methylbenzo[a]phenoxazin-5-ylidene]azanium;chloride Chemical compound [Cl-].O1C2=CC(=[NH2+])C3=CC=CC=C3C2=NC2=C1C=C(N(C)C)C(C)=C2 ZHAFUINZIZIXFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 197
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 108
- 239000011449 brick Substances 0.000 description 64
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 51
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 36
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 24
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 18
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 17
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 17
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 15
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 14
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 14
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 13
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 10
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 10
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 10
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 9
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 9
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 9
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 7
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 3
- 230000015861 cell surface binding Effects 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 2
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101000924577 Homo sapiens Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 description 2
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 238000001190 Q-PCR Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 2
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000006041 cell recruitment Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000012063 dual-affinity re-targeting Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 2
- 238000012632 fluorescent imaging Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- XFKSLINPMJIYFX-UHFFFAOYSA-N 1-sulfanylpyrrole-2,5-dione Chemical compound SN1C(=O)C=CC1=O XFKSLINPMJIYFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OLQIKGSZDTXODA-UHFFFAOYSA-N 4-[3-(4-hydroxy-2-methylphenyl)-1,1-dioxo-2,1$l^{6}-benzoxathiol-3-yl]-3-methylphenol Chemical compound CC1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C(=CC(O)=CC=2)C)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 OLQIKGSZDTXODA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101100460704 Aspergillus sp. (strain MF297-2) notI gene Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 208000008691 Precursor B-Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 230000006043 T cell recruitment Effects 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004566 building material Substances 0.000 description 1
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002091 elastography Methods 0.000 description 1
- 238000002565 electrocardiography Methods 0.000 description 1
- 238000000537 electroencephalography Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 238000002582 magnetoencephalography Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000009206 nuclear medicine Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000002600 positron emission tomography Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000002603 single-photon emission computed tomography Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001931 thermography Methods 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
- G01N33/587—Nanoparticles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
- G01N2001/302—Stain compositions
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种核酸纳米结构，其包含一个或多个、优选地至少两个靶向剂和多个染料分子、优选地至少10个染料分子。本发明还涉及一种包含核酸纳米结构的组合物，优选为药物组合物。本发明还涉及一种纳米结构或组合物，其用于医学，优选地用于医学成像，并用于预防、治疗和/或诊断疾病的方法。此外，本发明涉及一种标记样品中的靶标的方法，涉及纳米结构作为染色剂的用途，并涉及一种试剂盒。此外，本发明还涉及一种制备纳米结构的方法。本发明还涉及一种鉴定具有所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合的方法，并涉及一种生产包含双特异性或多特异性靶向剂的分子的方法。此外，本发明涉及一种筛选样品中具有至少两个靶分子的靶标的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸纳米结构，其包含一个或多个、优选地至少两个靶向剂和多个染料分子、优选地至少10个染料分子。本发明还涉及一种包含核酸纳米结构的组合物，优选为药物组合物。本发明还涉及一种纳米结构或组合物，其用于医学，优选地用于医学成像，并用于预防、治疗和/或诊断疾病的方法。此外，本发明涉及一种标记样品中的靶标的方法，涉及纳米结构作为染色剂的用途，并涉及一种试剂盒。此外，本发明还涉及一种制备纳米结构的方法。本发明还涉及一种鉴定具有所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合的方法，并涉及一种生产包含双特异性或多特异性靶向剂的分子的方法。此外，本发明涉及一种筛选样品中具有至少两个靶分子的靶标的方法。
背景技术
多特异性抗体作为新的药物形式和研究工具具有广阔的前景。例如，抗CD3-抗CD19双特异性抗体贝林妥欧单抗结合细胞毒性T细胞并将它们靶向CD19阳性肿瘤细胞。多价抗体具有巨大潜力，并且许多候选药物目前正在临床前和临床开发中，并且重点从双特异性形式移向具有更高特异性的形式例如三特异性抗体。除了作为治疗剂的应用之外，多特异性抗体还可以作为研究细胞机制(例如细胞表面受体组装)的通用研究工具。
针对许多靶标的单特异性抗体容易获得。然而构建人工多特异性抗体非常具有挑战性。多特异性抗体通常通过将结合位点排列在预先存在的抗体支架上来产生。目前存在超过20种不同的抗体形式，它们具有不同的性质和价数。通常，为了提供多特异性抗体，结合位点的每种新组合都必须单独地进行工程化设计、生产和测试。因此，这个过程是费力、昂贵且缓慢的。因此，必须测试大量候选物的早期研究被放慢了速度。
因此，需要高效提供双特异性或多特异性分子例如双特异性或多特异性抗体的手段。此外，需要提供高效靶向靶标例如细胞的手段。还需要允许标记和/或染色靶标例如细胞的手段。
发明内容
在下文中将描述本发明的要素。这些要素与具体实施方式一起列出，然而应当理解，它们可以以任何方式和任何数量组合，以产生另外的实施方式。各种描述的实例和优选实施方式不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方式。本说明书应当被理解为支持并涵盖将两个或更多个所述明确描述的实施方式相组合或将一个或多个所述明确描述的实施方式与任何数量的所述公开和/或优选的要素相组合的实施方式。此外，除非上下文另有指示，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合都应当被认为由本申请的描述所公开。
第一方面，本发明涉及一种核酸纳米结构，其包含一个或多个、优选地至少两个靶向剂和多个染料分子、优选地至少10个染料分子、更优选地至少20个染料分子、甚至更优选地至少30个染料分子。
在一个实施方式中，所述一个或多个靶向剂独立地选自抗体或其抗原结合片段、抗原结合肽、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体(diabody)、单链Fv片段、(scFv)2、四抗体(tetrabody)、三抗体(triabody)、二硫键稳定性Fv(dsFv)、Fc结构域、工程化Fc结构域、DNA适体、RNA适体、肽核酸(PNA)、多肽、肽、糖蛋白、肽模拟物(peptidomimetic)、anticalin、Affilin、Affimer、Affitin、Alphabody、纳米抗体、DARPin、受体配体、受体、T细胞受体(TCR)样抗体、MHC、pMHC、受体结构域及其片段，
优选独立地选自抗体或其抗原结合片段、抗原结合肽、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、单链Fv片段、(scFv)2、四抗体、三抗体、二硫键稳定性Fv(dsFv)、Fc结构域、工程化Fc结构域、TCR样抗体、MHC、pMHC、受体配体及其片段。
在一个实施方式中，所述染料分子独立地选自有机荧光团，例如花青染料、AlexaFluor染料、Atto染料和FITC；量子点；荧光蛋白，例如GFP、YFP、RFP、APC和EGFP；核酸染料，例如Hoechst、DAPI、SYTOX Blue、色霉素A3、光神霉素、YOYO-1、溴化乙锭、吖啶橙、SYTOXGreen、TOTO-1、碘化丙啶、LDS 751和7-AAD；呫吨衍生物，例如荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、曙红和德克萨斯红；花青衍生物，例如花青、吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫杂羰花青和部花青；方酸菁衍生物和环取代的方酸菁，例如Seta和Square染料；萘衍生物；香豆素衍生物；噁二唑衍生物，例如吡啶并噁唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑；蒽衍生物，例如DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK Orange；芘衍生物，例如级联蓝(cascade blue)；噁嗪衍生物，例如尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫和噁嗪170；吖啶衍生物，例如二氨基吖啶(proflavin)、吖啶橙和吖啶黄；芳基次甲基衍生物，例如金胺、结晶紫和孔雀绿；四吡咯衍生物，例如卟吩、酞菁和胆红素；和二吡咯亚甲基衍生物，例如BODIPY、aza-BODIPY。
在一个实施方式中，所述一个或多个、优选地至少两个靶向剂以距所述纳米结构表面3nm至15nm、优选地7nm至9nm的距离和/或以距所述纳米结构的角<5nm、优选地<2nm的距离附连到所述纳米结构。
另一方面，本发明涉及一种组合物，优选为药物组合物，其包含如上所定义的核酸纳米结构，任选地还包含药学上可接受的赋形剂。
另一方面，本发明涉及如上所定义的纳米结构或如上所定义的组合物，其用于医学，优选地用于医学成像。
另一方面，本发明涉及如上所定义的纳米结构或如上所定义的组合物，其用于预防、治疗和/或诊断疾病的方法，所述疾病选自增殖性疾病如癌症、血管疾病、肌肉骨骼障碍、免疫障碍如自身免疫疾病、传染性障碍例如病毒性疾病如人免疫缺陷病毒(HIV)感染、代谢障碍和/或糖尿病。
另一方面，本发明涉及一种标记样品中的靶标的方法，优选为标记样品中的靶标的体外和/或离体方法，所述方法包括下述步骤：
i)提供样品，
ii)将所述样品与如上所定义的纳米结构接触，
iii)任选地，定性或定量确定所述样品中的标记的靶标，其中优选地所述确定使用流式细胞术、显微术例如荧光显微术、荧光成像、比色法和/或测序例如qPCR来进行。
另一方面，本发明涉及如上所定义的纳米结构作为染色剂，优选地作为体外和/或离体染色剂，例如作为体外和/或离体细胞染色剂的用途。
另一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含：
i)如上所定义的纳米结构；
ii)一种纳米结构，其包含至少一个第一偶联位点和至少一个第二偶联位点，其中所述第一偶联位点被配置成结合多个染料分子、优选地至少10个染料分子、更优选地至少20个染料分子中的至少一个染料分子，并且其中所述第二偶联位点被配置成结合一个或多个、优选地至少两个靶向剂，
多个染料分子，其被配置成结合到所述第一偶联位点，
一个或多个、优选地至少两个靶向剂，其被配置成结合到所述第二偶联位点；和/或
iii)至少一个支架链和多个单链寡核苷酸装订链，其中每个装订链与至少一个支架链至少部分互补，并且其中每个所述装订链被配置成在至少一个位置、优选地在两个或更多个不同位置与所述至少一个支架链中的至少一者结合，其中所述至少一个支架链被折叠和/或排布，以便形成所需纳米结构，
还包含多个染料分子，其被配置成结合到支架链或装订链的至少一个第一偶联位点，和
至少一个靶向剂，其被配置成结合到支架链或装订链的至少一个第二偶联位点。
在一个实施方式中，所述纳米结构、所述靶向剂和/或所述染料分子如上所定义。
另一方面，本发明涉及一种制备如上所定义的纳米结构的方法，所述方法包括下述步骤：
i)提供核酸纳米结构、靶向剂和多个染料分子，
ii)获得包含所述靶向剂和所述多个染料分子的核酸纳米结构，优选地通过所述纳米结构的自组装获得。
在一个实施方式中，所述纳米结构、所述靶向剂和/或所述染料分子如上所定义。
另一方面，本发明涉及一种鉴定具有所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合的方法，其中所述方法包括下述步骤：
a)提供至少一个核酸纳米结构、优选核酸纳米结构文库，其中所述纳米结构包含至少两种靶向剂的靶向剂组合，
其中任选地，所述至少两种靶向剂具有规定的空间组织，
b)将样品、优选细胞与所述纳米结构接触，
c)定性或定量确定所述样品中对所述纳米结构的响应，其中所述响应指示了所述所需性质、所需效果和/或所需空间组织，
d)通过鉴定包含具有所述所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合的纳米结构，来鉴定具有所述所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合，
其中所述所需性质是
1)对靶标、优选受体或配体的亲和性或特异性，
2)生物分布特性和/或药代动力学特性，
其中所述所需效果是
3)通过受体聚集的细胞应答，
4)细胞和/或受体激活，
5)细胞和/或受体抑制，
6)受体和/或纳米结构内化的激活或抑制，和/或
7)细胞的聚集，优选为诱导免疫细胞激活的细胞的聚集，
和/或其中所述所需空间组织是
8)表位至细胞表面距离，例如受体高度，和/或
9)表位至表位距离，例如受体接近度。
在一个实施方式中，所述纳米结构还包含至少一个染料分子，和/或其中所述纳米结构是如上所定义的纳米结构。
在一个实施方式中，所述步骤c)中定性或定量确定响应使用任何荧光测量例如流式细胞术、荧光显微术或通过微孔板读板器、发光测量、显微术、比色测量和/或细胞表面标志物染色来进行。
在一个实施方式中，所述纳米结构、所述靶向剂、所述染料分子和/或所述定性或定量确定如上所定义。
另一方面，本发明涉及一种生产包含双特异性或多特异性靶向剂的分子、优选双特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括下述步骤：
i)执行如上所定义的鉴定靶向剂组合的方法，和
ii)生产具有在所述鉴定靶向剂组合的方法的步骤d)中鉴定到的靶向剂组合的包含双特异性或多特异性靶向剂的分子，优选为双特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方式中，所述靶向剂和/或所述鉴定靶向剂组合的方法如上所定义。
另一方面，本发明涉及一种筛选样品中具有至少两个靶分子的靶标的方法，所述方法包括下述步骤：
1)提供包含至少两种靶向剂的靶向剂组合的核酸纳米结构，
其中任选地，所述纳米结构还包含至少一个染料分子和/或所述纳米结构是如上所定义的纳米结构，
2)将所述纳米结构与待测试具有至少两个靶分子的靶标的样品接触，
3)定性或定量确定所述样品中的靶标。
在一个实施方式中，所述样品、所述纳米结构、所述靶向剂、所述染料分子和/或所述定性或定量确定如上所定义。
另一方面，本发明涉及如上所定义的纳米结构或如上所定义的组合物的用途，其用于制备药物，例如用于预防、治疗和/或诊断疾病的药物，所述疾病优选地选自增殖性疾病例如癌症、血管疾病、肌肉骨骼障碍、免疫障碍例如自身免疫疾病、传染性障碍例如病毒性疾病如人免疫缺陷病毒(HIV)感染、代谢障碍和/或糖尿病。
另一方面，本发明涉及一种预防、治疗和/或诊断疾病的方法，所述疾病优选地选自增殖性疾病例如癌症、血管疾病、肌肉骨骼障碍、免疫障碍例如自身免疫疾病、传染性障碍例如病毒性疾病如人免疫缺陷病毒(HIV)感染、代谢障碍和/或糖尿病，所述方法包括向有需要的患者施用如上所定义的纳米结构和/或如上所定义的组合物。
在一个实施方式中，所述施用包括向有需要的患者施用有效量的如上所定义的纳米结构和/或如上所定义的组合物。
另一方面，本发明涉及优选如上所定义的纳米结构或优选如上所定义的组合物，其用于鉴定具有例如如上所定义的所需性质、所需效果和/或所需空间组织、优选为所需生物分布特性和/或药代动力学特性的靶向剂组合的方法，其中所述方法包括：
a)提供至少一个核酸纳米结构、优选核酸纳米结构文库，其中所述纳米结构包含至少两种靶向剂的靶向剂组合；其中任选地，所述纳米结构包含DNA条形码；其中任选地，所述至少两种靶向剂具有规定的空间组织；
b)将所述至少一个核酸纳米结构施用到受试者，优选为人或动物，例如通过注射；
c)定性或定量确定所述受试者和/或从所述受试者获得的样品中对所述纳米结构的响应，其中所述响应指示了所述所需性质、所需效果和/或所需空间组织，优选为所需生物分布特性和/或药代动力学特性；
d)通过鉴定包含具有所述所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合的纳米结构，来鉴定具有所述所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合。
在一个实施方式中，所述步骤c)中定性或定量确定响应包括分析从所述受试者获得的血液样品、体液样品、组织样品和/或器官样品中纳米结构的存在，例如通过鉴定所述纳米结构的DNA条形码。
在一个实施方式中，所述步骤c)中定性或定量确定响应和/或所述步骤d)中鉴定所述靶向剂组合包括对所述纳米结构的DNA条形码进行测序。
在一个实施方式中，所述纳米结构、所述组合物、所述方法、所述所需性质、所需效果、所需空间组织、所述靶向剂、所述DNA条形码、所述测序、所述施用、所述定性或定量确定和/或所述鉴定靶向剂组合如上所定义。
另一方面，本发明涉及一种鉴定具有所需性质、所需效果和/或所需空间组织、优选为所需生物分布特性和/或药代动力学特性的靶向剂组合的方法，其中所述方法包括：
a)提供至少一个核酸纳米结构、优选核酸纳米结构文库，其中所述纳米结构包含至少两种靶向剂的靶向剂组合；其中任选地，所述纳米结构包含DNA条形码；其中任选地，所述至少两种靶向剂具有规定的空间组织；
b)将所述至少一个核酸纳米结构施用到受试者，优选为人或动物，例如通过注射；
c)定性或定量确定所述受试者和/或从所述受试者获得的样品中对所述纳米结构的响应，其中所述响应指示了所述所需性质、所需效果和/或所需空间组织，优选为所需生物分布特性和/或药代动力学特性；
d)通过鉴定包含具有所述所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合的纳米结构，来鉴定具有所述所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合。
在一个实施方式中，所述纳米结构、所述方法、所述所需性质、所需效果、所需空间组织、所述靶向剂、所述DNA条形码、所述施用、所述定性或定量确定和/或所述鉴定靶向剂组合如上所定义。
具体实施方式
对现有蛋白质支架进行工程化改造以产生多价和多特异性抗体通常是耗时、费力和昂贵的。作为高价物的本发明的纳米结构的构建和使用是有利的，因为此类纳米结构依赖于已建立的偶联技术例如抗体偶联技术和模块化DNA折纸平台即核酸纳米结构，而不是依赖于复杂的蛋白质工程。因此，所述纳米结构充当蛋白质支架是容易获得的、成本效益高的模块化替代品，尤其是在需要测试大量变体的环境中，例如在筛选方法中。此类纳米结构具有广泛的应用，包括分子有效载荷例如治疗剂的封装和靶向递送，从单特异性抗体库中高效筛选大量抗体组合，以及可用作研究工具来研究细胞过程例如溶细胞突触的形成的多价和多特异性装置的构建。DNA折纸技术、特别是本发明的纳米结构的模块化，有利地允许针对不同适应症、测定方法和设置进行快速有效的调节。
具体来说，DNA折纸方法允许在纳米尺度上创建用户定义的生物相容性结构。基于核酸例如DNA的分子可编程性，任何3D形状都可以在一些核酸链例如DNA链的序列中编码。单个结构在自组装过程中产生，产率接近100％。核酸纳米结构例如DNA折纸物是高度可处理的，并且可以用几种分子例如蛋白质、抗体、荧光染料或化学部分修饰。发明人开发了模块化核酸纳米结构以快速有效地产生多特异性靶向剂组合，例如从预先存在的单特异性抗体文库中产生例如抗体组合。本发明的手段的优点在于此类纳米结构可以提供具有用户定义的价态、用户定义的几何取向，并且可以用于许多已建立的体外和体内测定中。例如，此类纳米结构如多价DNA折纸-蛋白质杂交物，可用于高效筛选有效的抗体或蛋白质组合。此外，此类纳米结构如多价DNA折纸-蛋白质杂交物，可用于产生高亲和性和明亮的细胞染色，用于不同细胞染色方法中。
发明人提供了一种从具有已知特征的预先存在的单特异性抗体文库中快速高效地产生多特异性抗体组合的方法。本发明所实施的纳米结构使用DNA折纸方法设计，这使得能够从核酸组分例如DNA组分构建具有结构明确的3D形状的离散纳米结构。本发明的手段的优点在于核酸纳米结构可以用各种生物分子高效修饰，从而充当理想的多价靶向剂连接物。本发明的手段的另一个优点在于提供了多价和多特异性的结合效应。此外，本发明的手段的优点在于可以将用户定义的价态和特异性并入到本发明的纳米结构、试剂盒、用途和/或方法中。
发明人构建了带有多个靶向剂例如抗体的纳米结构，特别是DNA折纸纳米物体(DNA-origaminano-object)。在一个实施方式中，靶向剂的附连位置和附连策略(近端与远端)决定了靶向剂的可及性，从而决定了其与靶分子如细胞表面结合抗原的结合亲和性。通过调节靶向剂的可及性，发明人能够以一个数量级的精度滴定细胞结合亲和性。发明人还通过结合针对同一抗原的多个靶向剂例如抗体，探索了纳米结构与细胞表面的多价结合。随着负载的靶向剂的数量增加，结合速率和结合产率增加，而释放速率降低，表明了多价结合。因此，可以容易地利用超出标准IgG分子提供的天然存在的两个结合位点的多价结合效应。发明人的模块化方法允许构建双特异性DNA物体，其能够靶向不同的靶标，例如CD3阳性T细胞到CD19阳性B细胞，并在靶细胞处激活T细胞。发明人通过依靠多价B细胞靶向进一步改善了T细胞激活。所述双特异性DNA折纸物体在细胞毒性T细胞介导的杀伤测定中特异性耗尽CD19阳性B细胞，突出了所述纳米结构的适用性和治疗潜力。最后，发明人使用所述纳米结构作为平台组装了105种独特的多特异性人工抗体，并在T细胞激活测定中对它们进行了测试。在一个实施方式中，通过附连其他细胞信号传导分子例如白介素或通过进一步提高价态，对所述纳米结构进行了修饰。例如，发明人将额外的共刺激性抗CD28抗体附连到已经带有抗CD3抗体的纳米结构上，从而证实了与单一抗CD3抗体刺激相比增强的T细胞激活。
本文所使用的术语“纳米结构”是指核酸纳米结构，优选为由一个或多个DNA折纸亚基(实体)组成的DNA折纸结构。在一个实施方式中，所述纳米结构是DNA折纸纳米结构。可以使用容易获得的核酸纳米结构技术，例如与标准的纳米制造技术相比涉及相对不太复杂的组装程序的DNA折纸技术来制造所述纳米结构。在一个实施方式中，所述纳米结构至少部分使用DNA折纸技术制造。归因于DNA折纸结构的自组装和用于设计相应的支架链和装订链的软件容易获得，与标准的纳米制造技术相比，这是相对不太复杂的制造过程。在一个实施方式中，纳米结构是DNA折纸结构。在一个实施方式中，包含靶向剂的纳米结构是附连有所述靶向剂的纳米结构。例如，所述靶向剂可以通过偶联位点，例如通过接头、通过所述纳米结构的任何表面和/或通过所述纳米结构的核心结构(例如通过所述核心结构和/或纳米结构的内部部分)附连到所述纳米结构。在一个实施方式中，包含靶向剂的纳米结构是附连有所述靶向剂的DNA折纸。在一个实施方式中，包含靶向剂的纳米结构的核心结构是DNA折纸，并且所述靶向剂附连到这种作为DNA折纸的核心结构。在一个实施方式中，所述靶向剂不是核心结构的一部分，但任选地通过与所述靶向剂偶联的核酸链附连到所述核心结构例如DNA折纸。在一个实施方式中，纳米结构的最大长度小于1000nm，例如在约10nm至约70nm、优选地约20nm至约50nm范围内。在一个实施方式中，靶向剂以距所述纳米结构的表面3nm至15nm、优选地7nm至9nm的距离和/或以距所述纳米结构的角<5nm、优选地<2nm的距离附连到所述纳米结构。在一个实施方式中，术语“以距所述纳米结构的表面3nm至15nm的距离附连”意味着靶向剂优选地通过接头附连到所述纳米结构，其中所述靶向剂与纳米结构的表面之间的距离，例如由接头的长度提供的距离，在3nm至15nm的范围内。例如，靶向剂的位置离所述纳米结构3nm至15nm，但例如通过接头结合到所述纳米结构。在一个实施方式中，所述靶向剂与纳米结构的表面相隔3nm至15nm、优选地7nm至9nm的距离。这种距离的优点在于所述靶向剂具有高可及性，并提供与不具有这种距离的靶向剂相比提高的可及性。在一个实施方式中，本文所使用的术语“可及的”意味着能够与靶分子结合和/或被靶分子结合。在一个实施方式中，在涉及表面的上下文中，术语靶向剂是“可及的”意味着这种表面不在空间上阻碍这种靶向剂的可及性。在一个实施方式中，靶向剂与纳米结构的表面之间的这种间隔(即距离)具有降低空间位阻的优点。在一个实施方式中，纳米结构的靶向剂在距所述纳米结构的表面3nm至15nm、优选地7nm至9nm的距离处是可及的。在一个实施方式中，靶向剂以距所述纳米结构的角<5nm、优选地<2nm的距离附连到所述纳米结构，例如附连到所述靶向剂的接头被附连在距所述纳米结构的角<5nm、优选地<2nm的距离处。因此，附连位置例如直接附连靶向剂的位置和/或附连接头例如靶向剂结合的接头(即结合到靶向剂的接头)的位置，具有距所述纳米结构的角<5nm、优选地<2nm的距离。在一个实施方式中，靶向剂以相对于所述纳米结构的表面3nm至15nm、优选地7nm至9nm的距离附连到所述纳米结构和/或与所述纳米结构隔开，并在距所述纳米结构的角<5nm、优选地<2nm的距离的位置处例如通过接头附连。在一个实施方式中，靶向剂附连在所述纳米结构的远端构型处。在一个实施方式中，通过将接头的DNA附连柄的3’末端从纳米结构突出并通过将互补的接头DNA的5’末端附连到靶向剂来实现远端构型。在一个实施方式中，通过将接头的DNA附连柄的5’末端从纳米结构突出并通过将互补的接头DNA的3’末端附连到靶向剂来实现远端构型。在一个实施方式中，接头具有至少16个、优选地至少20个、更优选地至少26个核酸碱基。在一个实施方式中，使用具有至少16个、优选地至少20个、更优选地至少26个核酸碱基的接头将靶向剂与纳米结构隔开和/或附连到纳米结构。
在一个实施方式中，核酸纳米结构例如DNA折纸结构包含至少一个支架链和多个单链寡核苷酸装订链。在一个实施方式中，支架链构成和/或横穿DNA折纸结构和/或DNA折纸亚基(“实体”)的主要部分。在一个实施方式中，实体是DNA折纸亚基。本发明中所使用的术语“装订链”应该是指单链寡核苷酸分子，其与支架链至少部分互补。通常，装订链可用于将例如偶联位点引入到DNA折纸结构和/或DNA折纸亚基(“实体”)中。
所述纳米结构例如DNA折纸纳米结构可以包含至少一个支架链，即具有已知序列的单链多核苷酸支架DNA。所述DNA折纸结构还可以包含多个单链寡核苷酸装订链，其中每个装订链可以与至少一个支架链至少部分互补。此外，每个装订链可以被配置成与至少一个支架链结合，其中所述至少一个支架链可以被折叠和/或排布，以便可以形成所需纳米结构。本文所使用的术语“链”是指核酸链，例如DNA和/或RNA链。三维纳米结构可以使用DNA折纸来实现，即通过将支架链和装订链组合以形成所需部分和整体装置。这种设计可以例如使用软件如caDNAno来进行。也就是说，在某些实施方式中，包含多个部分的纳米结构可以由一个支架链制成，而在其他实施方式中，纳米结构的多个部分可以利用多个支架链构建。
在一个实施方式中，例如当所述纳米结构至少部分由DNA折纸结构形成并且其中所述DNA折纸结构包含至少一个支架链和多个装订链时，所述染料和/或靶向剂可以利用接头分子结合到所述至少一个支架链或装订链之一，其中所述接头分子可以连接到与所述至少一个支架链的一部分或装订链的一部分互补的DNA链部分。在一个实施方式中，所述染料和/或靶向剂通过接头分子偶联到所述纳米结构。在一个实施方式中，接头分子是一个或多个核酸碱基，例如单个核酸碱基或核酸序列。在一个实施方式中，靶向剂的接头分子被连接到所述纳米结构的DNA链。在一个实施方式中，偶联位点包含接头和/或被配置成与接头结合的位点。
在一个实施方式中，纳米结构的形状可以是任何形状，例如砖形、棒形、三角形、圆形、长方体即矩形、星形或任何其他形状。在一个实施方式中，所述纳米结构不是球形结构。本发明的纳米结构可以具有任何长度。在优选实施方式中，所述纳米结构包含最大长度，并且在特别优选实施方式中，所述最大长度小于1000nm，优选地小于500nm，例如约100nm或更小。
在一个实施方式中，所述纳米结构包含至少一个核酸，其中所述核酸可以包含至少一个修饰，例如选自修饰的核苷间键、修饰的核碱基或修饰的糖部分的化学修饰，例如2’-O-烷基修饰如2’-O-甲氧基-乙基(MOE)或2’-O-甲基(OMe)修饰、乙烯桥接核酸(ENA)、2’-氟(2'-F)核酸例如2’-氟N3-P5’-亚磷酰胺、1’,5’-失水己糖醇核酸(HNA)或锁核酸(LNA)。在一个实施方式中，术语“纳米结构”、“纳米物体”和“核酸纳米结构”可互换使用。在一个实施方式中，当提及纳米结构的“核心结构”时，意味着没有靶向剂的核酸纳米结构，例如核酸纳米结构所包含的DNA折纸。
在一个实施方式中，每个装订链被配置成在至少一个、优选地两个或更多个不同位置与所述至少一个支架链中的至少一者结合。在一个实施方式中，核酸纳米结构和/或核酸纳米结构所包含的DNA折纸具有支架链和一个或多个装订链。在一个实施方式中，核酸纳米结构和/或核酸纳米结构所包含的DNA折纸包含≤100个装订链。在一个实施方式中，核酸纳米结构和/或DNA折纸结构包含≥10个DNA链，优选地≥15个DNA链，例如至少一个支架链和至少9个装订链。在一个实施方式中，装订链具有20至100个核酸碱基的长度。在一个实施方式中，支架链具有100至20000个核酸碱基、优选地120至10000个核酸碱基、更优选地150至8064个核酸碱基的长度。在一个实施方式中，靶向剂通过与所述靶向剂偶联的核酸序列附连和/或结合到所述核酸纳米结构，优选通过与所述核酸纳米结构的核酸序列互补的核酸序列，例如与所述核酸纳米结构的支架链互补和/或与附连到和/或掺入到所述核酸纳米结构中的核酸柄、优选为DNA柄(DNA handle)互补的核酸序列。本发明的核酸纳米结构例如DNA折纸结构的优点在于所述结构可以容易地调整尺寸和形状，因此靶向剂和/或染料分子可以以所需的量提供，而不增加DNA修饰化学的复杂性。通常，在不显著增加DNA修饰化学的复杂性的情况下，附连位点和/或化学修饰的数量受到核酸链数量的限制；具体而言，提供每条链一个附连位点和/或一个化学修饰。例如，如果结构包含6条核酸链，则可以附连6个染料分子。DNA折纸结构的优点在于可以附连更多的分子，因为DNA折纸结构更加复杂(特别是由多个核酸链组成)并且可以调整尺寸和形状。例如，本发明的纳米结构有利地可以带有至少10个染料分子，例如约20个或更多染料分子；有利地，DNA折纸可以被提供有约80个染料分子。在一个实施方式中，本发明的DNA折纸结构包含多个附连有染料分子的DNA链。例如，所述DNA折纸结构包含至少10个DNA链，并且所述10个DNA链中的每一者附连有至少一个染料分子。在一个实施方式中，所述DNA折纸结构可以包含每个DNA链至少一个染料分子，和/或可以包含其他染料分子例如通过接头连接到所述DNA折纸结构的染料分子。此外，所述DNA折纸结构可以被稳定化以对抗低盐或核酸酶降解。
本文所使用的术语“DNA折纸结构”或“DNA折纸物体(DNA-origami object)”是指包含DNA作为制造纳米级形状的建造材料的纳米结构。制备和/或提供DNA折纸涉及使用多个合理设计的“装订”DNA链通过例如自组装将一个或多个“支架”DNA链折叠成特定形状。支架链通常比装订链更长。装订链的核酸序列被设计成使得装订链与支架链的特定部分杂交，并且由于杂交而获得纳米结构的特定形状。在一个实施方式中，术语核酸“柄”是指能够与部分结合的核酸序列延伸部，例如具有能够与组分例如附连到靶向剂的核酸序列结合的延伸部的装订链。本文所使用的术语“核酸”是指核苷酸序列，例如核糖核酸或脱氧核糖核酸。在优选实施方式中，所述核酸纳米结构是DNA纳米结构。本发明的纳米结构的优点在于其在任何缓冲液以及甚至是样品例如血液样品中是稳定的。在一个实施方式中，纳米结构包含DNA条形码，例如作为支架链和/或装订链的一部分的DNA条形码。在优选实施方式中，核酸纳米结构例如本发明的纳米结构和/或在本发明的任何方法中提供的纳米结构是DNA折纸结构。在优选实施方式中，所述核酸纳米结构包含DNA折纸结构或由其组成。在一个实施方式中，所述核酸纳米结构以DNA折纸结构的形式提供。DNA折纸结构的优点在于DNA折纸结构可以包含许多靶向剂和许多染料(例如约80个染料)，例如由于它们的合理设计。有利地，使用DNA折纸结构，可以精确地控制靶向剂的数量和染料分子的数量。此外，可以精确地控制靶向剂的排布和染料分子的排布。DNA折纸结构的另一个优点在于它们可以对核酸酶稳定。在一个实施方式中，所述纳米结构被配置成使其对核酸酶稳定。DNA折纸结构的另一个优点在于与非DNA折纸核酸纳米结构例如DNA四面体或RNA组装体相比，所述结构的组装例如自组装和纯化更加稳健且简单。本发明的DNA折纸结构的又一个优点在于它们可用于提供和分析许多不同的靶向剂构型和排布，这在使用更简单的核酸组装体例如DNA四面体时是不可能的，并且它们也可用于鉴定抗体组合和对特定靶标例如稀有靶标进行染色。本文针对“一个/该/所述核酸纳米结构”或“一个/该/本发明的所述核酸纳米结构”描述的所有实施方式意在被理解为也涉及被本发明的试剂盒所包含的纳米结构和在本发明的任何方法中提供的纳米结构。
本文所使用的术语“患者”可以是指人类或动物。在一个实施方式中，当提及方法时，所述方法是体内、离体、体外或原位方法，例如体外方法。在一个实施方式中，当提及用途时，所述用途是体内、离体、体外或原位用途，例如体外用途。在一个实施方式中，本发明的纳米结构用于体内或体外用途，优选为体内。本发明的组合物、优选为药物组合物，应该被配制成与其预期施用途径相配。在特别优选实施方式中，本发明的药物和/或化合物的施用途径的实例包括静脉内、口服、鼻内、鞘内、动脉内、真皮内、皮下、透皮(局部)、侧脑室内、实质内、肿瘤内、透黏膜、直肠、阴道、支气管、肠胃外施用，以及用于药物和/或化合物施用的任何其他临床/医学上可接受的方法。本文所使用的术语“有效量”是指足以引起所需效果例如用于体内成像的足够标记的量。
在一个实施方式中，术语“靶向剂”是指能够结合靶标和/或靶分子，例如细胞表面上的靶标，优选为特异性结合所述靶标的部分，例如抗原结合肽。在一个实施方式中，靶向剂是任何抗体或其抗原结合肽，例如IgG、Fab片段、单链Fab片段或单域抗体、DNA和/或RNA适体、肽、结合蛋白、细胞表面受体的配体(例如PD-L1)或脂质，例如任何抗体或其抗原结合片段、抗原结合肽、Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、双抗体、单链Fv片段、(scFv)2、四抗体、三抗体、二硫键稳定性Fv(dsFv)、Fc结构域、工程化Fc结构域、DNA适体、RNA适体、肽核酸(PNA)、多肽、肽、糖蛋白、肽模拟物、anticalin、Affilin、Affimer、Affitin、Alphabody、纳米抗体、DARPin、受体配体、受体、T细胞受体(TCR)样抗体、主要组织相容性复合物(MHC)、装载肽的主要组织相容性复合物(pMHC)、受体结构域及其片段。在优选实施方式中，例如在鉴定靶向剂组合的方法和/或筛选样品中的靶的方法中，靶向剂独立地选自抗体或其抗原结合片段、抗原结合肽、Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、双抗体、单链Fv片段、(scFv)2、四抗体、三抗体、二硫键稳定性Fv(dsFv)、Fc结构域、工程化Fc结构域、TCR样抗体、MHC、pMHC、受体配体及其片段。在一个实施方式中，所述靶向剂不是适体。在一个实施方式中，所述靶向剂是蛋白质。在一个实施方式中，所述靶向剂是细胞因子。在一个实施方式中，所述靶向剂是抗原结合肽，例如抗体、抗体样分子、抗体模拟物、抗原结合衍生物或其抗原结合片段。在一个实施方式中，靶向剂与其靶标之间的相互作用的特征在于抗体-抗原相互作用和/或配体-受体相互作用的特异性结合。本领域技术人员能够识别类似的特异性相互作用，这也应当在本发明的范围之内。例如，也可以使用适体与分子或受体配体与其受体的特异性结合，反之亦然。然而，在这种纳米结构中可以利用各种各样的相互作用，这与依赖于特异性且有限的相互作用例如受体和配体的相互作用的现有技术相比可能是有利的。因此，由于可用的相互作用范围广，因此与现有技术中公开的纳米结构相比提供了更加通用且可调节的手段，例如DNA纳米结构平台。例如，所述靶向剂可以是IgG抗体、IgG抗体片段、IgG抗体模拟物、IgM抗体、IgM抗体片段、IgM抗体模拟物、IgD抗体、IgD抗体片段、IgD抗体模拟物、IgA抗体、IgA抗体片段、IgA抗体模拟物、IgE抗体、IgE抗体片段或IgE抗体模拟物。在一个实施方式中，MHC是I类MHC或II类MHC。在一个实施方式中，pMHC是I类pMHC或II类pMHC。在一个实施方式中，所述靶向剂不是链霉亲和素或生物素。在一个实施方式中，所述纳米结构不包含i)荧光蛋白和ii)生物素或链霉亲和素。在一个实施方式中，所述纳米结构包含第一靶向剂和第二靶向剂，其中所述第一靶向剂和第二靶向剂的靶是不同的，例如两种不同受体分子。在一个实施方式中，所述纳米结构包含第一靶向剂和第二靶向剂，其中所述第一靶向剂和第二靶向剂是不同的靶向剂，例如两种不同的受体配体。在一个实施方式中，所述至少两个靶向剂是两种不同靶向剂，例如靶向不同的靶标。
根据本发明，本文所使用的术语“特异性”或“特异性结合”意指靶向剂例如抗体或抗原结合肽能够与特定靶标或一组特定靶标特异性相互作用和/或结合，但基本上不与其他分子例如抗原结合。这种结合可以用锁钥原理的特异性示例。在一个实施方式中，当提及术语“结合”时，该术语应当被解释为包含术语“特异性结合”。在一个实施方式中，当提及“靶向”时，该术语应当被解释为包含术语“特异性靶向”。
在一个实施方式中，所述靶向剂与其靶标可逆或不可逆地结合。例如，可逆结合分子可以是抗体、抗体片段、DNA链、生物素分子、链霉亲和素分子，而不可逆结合分子可以是马来酰亚胺-硫醇化学分子或点击化学分子。在一个实施方式中，当纳米结构包含超过一个靶向剂时，所述靶向剂可以是相同类型或不同类型的。在一个实施方式中，当纳米结构包含超过一个靶向剂时，所述靶向剂可以靶向相同靶分子和/或不同靶分子，优选地靶向不同靶分子。在一个实施方式中，示例性靶向剂是抗CD3ε抗体(例如Fab)、抗CD28抗体(例如Fab)、IL2、抗CD19抗体(例如Fab)、抗CD123抗体(例如Fab)和抗CD33抗体(例如Fab)、抗CD137抗体、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、PD-L1中的任一者或其组合。
本文所使用的术语“抗原结合肽”是指与抗原特异性结合的肽。在一个实施方式中，抗原结合分子是基于免疫球蛋白例如多克隆或单克隆抗体，或基于具有抗原结合能力的蛋白质支架结构，例如anticalin蛋白、Affilin、Affimer、Affitin、Alphabody、纳米抗体或DARPin。在一个实施方式中，抗原结合肽是指抗体或抗体片段。在一个实施方式中，术语“抗体”、“抗体片段”和“抗原结合肽”可互换使用。抗体、特别是人类抗体存在几种类别例如IgA、IgG、IgM、IgD和IgE以及亚类例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD和IgE。本发明也可以使用作为天然人类IgG同型的混合组合物的IgG。在一个实施方式中，抗原结合肽和/或抗体可以包含任何抗体类别、亚类和/或链的结构域。在一个实施方式中，可以通过蛋白质工程修饰抗原结合肽的氨基酸序列，例如以包含来自其他免疫球蛋白类别的恒定区，其介导提高的结合特性，例如效应功能特性，例如免疫细胞刺激或免疫细胞抑制功能。
根据本发明，抗原结合肽可以是指例如人抗体、人嵌合抗体、人源化抗体和抗体片段。抗体通过包含补位的Fab片段可变区识别抗原。所述补位特异性靶向抗原上的表位。根据本发明，抗原结合肽还可以是指抗体的片段，例如基本上完整的抗体、Fab片段、F(ab’)2片段、双抗体、单链Fv片段、四抗体、三抗体、二硫键稳定性Fv(dsFv)或来自骆驼的重链VHH片段。然而，本发明也设想了其他形式的抗原结合肽。例如，抗原结合肽可以是源自小且稳健的非免疫球蛋白支架的另一种(非抗体)受体蛋白，例如通过使用组合蛋白质设计方法而配备有结合功能的受体蛋白。此类非抗体抗原结合肽可以是例如Affibody分子、Affilin、Affimer、Affitin、Alphabody、Anticalin、纳米抗体或DARPin。抗原结合肽也可以是指其他抗体模拟物分子，例如双亲和性重靶向抗体(DART)。在一个实施方式中，抗原结合肽优选地是指抗体或抗体片段。在一个实施方式中，抗原结合肽可以是指模拟抗体与抗原的结合特性，但在结构上不同于天然存在的抗体的任何抗体模拟物分子。
本文所使用的术语“人抗体”是指仅包含人序列的抗体或其片段。在一个实施方式中，人类抗体通过展示技术例如噬菌体展示或核糖体展示来产生。本文所使用的术语“人源化抗体”是指免疫球蛋白链或其片段，例如抗体的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段或另一种抗原结合片段，其含有来自非人类免疫球蛋白的序列。在一个实施方式中，人源化抗体是其中某些CDR残基被具有所需特异性和亲和性质的来自非人类的CDR残基代替的人抗体。本文所使用的术语“嵌合人抗体”是指已通过遗传工程或蛋白质工程设计的，通过组合不同物种例如小鼠和人的序列产生的人工抗体。在一个实施方式中，人嵌合抗体是来自小鼠抗体的抗原结合结构域和人类抗体的恒定结构域的杂合蛋白。本文所使用的术语“基本上完整的抗体”是指未被片段化、截短或以其他方式缩短，并保留了与靶标例如抗原特异性结合的能力的抗体。
本文所使用的术语“靶向”是指分子结构例如靶向剂如抗体、抗原结合肽或细胞毒性T细胞的表面分子通过特异性相互作用结合到某些结构例如抗原、特别是表位的能力。在一个实施方式中，靶标上的分子即靶分子被靶向剂靶向。在一个实施方式中，术语“靶向”和“识别”可互换使用。本文所使用的术语“交叉反应”是指与非靶标的结构和/或分子的脱靶结合。在一个实施方式中，在本发明的方法中使用的多功能纳米结构减少交叉反应，因为只有在所述靶标上的至少两个靶分子被结合时靶标才被结合，因此特异性提高，并且脱靶结合和副作用减少。
在一个实施方式中，在靶向剂的上下文中，术语“一个或多个”和“至少一个”可以是指存在一种或多种类型的靶向剂的一个或多个分子。例如，可以存在两个靶向剂分子，其中所述两个靶向剂分子是相同类型或不同类型的，例如是相同类型的，例如靶向同一抗原的两个相同类型的抗体，或者是不同类型的，例如靶向一种靶分子例如抗原的抗体和靶向不同靶分子的受体，或靶向不同抗原的两种抗体。此外，可能存在额外的靶向剂例如第三、第四、第五或第六靶向剂，其中所述第三、第四、第五或第六靶向剂中的每一者可以是相同或不同类型的。
本文所使用的术语“多个染料分子”是指多个例如至少3个染料分子。例如，多个染料分子可以是指至少3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个染料分子。在一个实施方式中，多个染料分子优选为至少10个染料分子，更优选为至少20个染料分子，甚至更优选为至少30个染料分子，甚至更优选为至少40个染料分子，甚至更优选为至少50个染料分子。在一个实施方式中，所述多个染料分子包含相同类型或不同类型的染料分子。例如，包含10个染料分子的多个染料分子可以包含5个一种类型的染料分子例如Alexa Fluor染料和5个不同类型的染料分子例如GFP。本发明的纳米结构的优点在于提供了多个染料分子，其允许对靶标进行明亮染色。因此，令人惊奇的是，以低数量存在的靶分子可以被高效标记。出人意料的是，此类纳米结构甚至能够对以低丰度和/或表达为特征的靶分子进行高效成像。因此大大增强了成像例如荧光成像。此外，本发明的纳米结构可以提供有独特的染料或染料组合，允许使用超过一种纳米结构对一个样品中的几种靶分子进行同时成像，其中每种纳米结构具有独特的染料或染料组合。本发明的纳米结构的优点在于，即使对于具有低表达水平的靶标和/或不存在特异性的靶标或亲和抗体(affine antibody)存在时，染色也是可能的。在一个实施方式中，通过使用超过一个靶向剂和/或利用亲合力，甚至可以进一步增强使用本发明的纳米结构的染色/标记的特异性。
本发明的纳米结构与现有的抗体偶联物相比具有至少三个优点，即增强的亮度、提高的亲和性和模块性。
增强的亮度
对于具有低表达水平的抗原，即细胞表面上抗原数量低的抗原来说，很少能获得明亮的抗体偶联物。这是因为每个抗体的荧光染料的数量有限。增加染料数量通常会损害抗体的亲和性或其生物物理性质(例如溶解性)或降低染料的荧光。相反，本文提出的纳米结构可以用大量荧光染料(例如>100个染料分子)修饰，而不会损害染料亮度或抗体的结合亲和性。因此，所述纳米结构是极为明亮的靶向剂，例如可以染色和检测低表达抗原的抗体偶联物。
提高的亲和性
新的抗原或现有抗原的变体不断被发现。对于这些新鉴定的抗原或抗原变体来说，通常没有具有足够高亲和性的抗体可用。本发明的纳米结构不是通过昂贵且耗时的选择方法来增加抗体的亲和性，而是利用亲合力来产生具有高亲和性和高特异性的靶向剂-纳米结构偶联物。所述亲合力通过在同一载体平台(即纳米结构)上安装多个靶向剂(例如弱结合的抗体)来获得。当配体与细胞受体之间的键天然较弱时，例如在pMHC-TCR免疫细胞筛选(四聚体筛选)中，使用许多相互作用例如许多弱相互作用来产生强相互作用的方法特别有吸引力。
模块性
由于核酸例如DNA可以用多种染料例如荧光分子修饰，因此可以根据用户的要求来调节性质例如荧光性质(例如激发波长、发射波长、光稳定性和亮度)。此外，可以精确控制附连的靶向剂例如抗体的数量和类型从而可以精确控制偶联物的有效亲和性。最后，由于所述方法可以利用预先存在的抗体或其文库，因此可以以最小的成本或精力快速组装抗体和染料的新组合。
因此，本发明的纳米结构允许从预先存在的靶向剂例如抗体或蛋白质快速产生高亲和性和明亮的靶向剂偶联物，例如抗体或蛋白质偶联物。由于这些优点，所述纳米结构对于各种应用是非常有利的，例如流式细胞术、荧光显微术和免疫染色中的用户可配置染料，或者作为生物化学和诊断测定中的试剂。本发明的试剂盒、本发明的用途和本发明的方法受益于纳米结构的上述优点。
本文所使用的术语“染料分子”是指可以使用任何成像技术可视化的任何分子，例如本领域技术人员已知的染料或染色剂，例如荧光染料、量子点、磁性粒子、金粒子或有色底物转化酶例如过氧化物酶或碱性磷酸酶。例如，染料分子选自有机荧光团例如花青染料、Alexa Fluor染料、Atto染料和FITC，量子点，荧光蛋白例如GFP、YFP、RFP、APC和EGFP，核酸染料例如Hoechst、DAPI、SYTOX Blue、色霉素A3、光神霉素、YOYO-1、溴化乙锭、吖啶橙、SYTOX Green、TOTO-1、碘化丙啶、LDS 751和7-AAD，呫吨衍生物例如荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、曙红和德克萨斯红，花青衍生物例如花青、吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫杂羰花青和部花青，方酸菁衍生物和环取代的方酸菁例如Seta和Square染料，萘衍生物，香豆素衍生物，噁二唑衍生物例如吡啶并噁唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑，蒽衍生物例如DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK Orange，芘衍生物例如级联蓝，噁嗪衍生物例如尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170，吖啶衍生物例如二氨基吖啶、吖啶橙、吖啶黄，芳基次甲基衍生物例如金胺、结晶紫、孔雀绿，四吡咯衍生物例如卟吩、酞菁和胆红素，二吡咯亚甲基衍生物例如BODIPY、aza-BODIPY。在优选实施方式中，染料分子独立地选自有机荧光团例如花青染料、Alexa Fluor染料、Atto染料和FITC，量子点，荧光蛋白例如GFP、YFP、RFP、APC和EGFP，以及核酸染料例如Hoechst和DAPI。在特别优选实施方式中，染料分子是荧光染料，例如非蛋白质有机荧光团例如花青染料、Alexa Fluor染料、Atto染料和/或FITC。在一个实施方式中，化合物的“衍生物”是通过化学反应从所述相应化合物衍生的化合物、结构上基于所述相应化合物的化合物，和/或是所述化合物的结构类似物。在一个实施方式中，所述染料不是嵌入染料。在一个实施方式中，所述纳米结构包含多个染料分子，优选为至少10个染料分子，更优选为至少20个染料分子，甚至更优选为至少30个染料分子，甚至更优选为至少40或50个染料分子。在一个实施方式中，所述多个染料分子包含至少10个染料分子、优选地至少20个染料分子，例如30、40或50个染料分子。在一个实施方式中，所述纳米结构包含约20至约80个染料分子。发明人已令人惊奇地发现，包含至少10个染料分子例如约20至约80个染料分子的纳米结构提供了靶标的高效染色，例如用于超高分辨率荧光显微术的靶标的高效荧光染色。具体而言，多个染料分子的优点在于靶标的染色被极大增强，并且可以减少超高分辨率显微术期间的染料漂白。此外，即使是罕见的靶标和/或以低数量存在的靶标也可以被包含多个染料分子的纳米结构染色。
在一个实施方式中，所述核酸纳米结构被配置成使得所述多个染料分子中的每个染料分子与所述多个染料分子中的任何其他染料分子具有至少2nm、优选地至少3nm的距离。在一个实施方式中，所述核酸纳米结构被配置成使得所述多个染料分子中的相邻染料分子具有至少2nm、优选地至少3nm的距离，例如所述多个染料分子的所有相邻染料分子均相隔至少3nm的距离。
在一个实施方式中，本文所使用的术语“独立地选自”意味着如果存在和/或将要选择某种类型的超过一个分子例如两个或更多个靶向剂或两个或更多个染料分子，则这两个或更多个分子可以是相同类型或不同类型的，其中所述两个或更多个分子中的每一个独立地其他分子选择。在一个实施方式中，在包含靶向剂的纳米结构的上下文中，术语“一个或多个、优选地至少两个”是指纳米结构包含至少一个，例如一个或超过一个，例如2、3、4、5个或更多个靶向剂。在一个实施方式中，这种超过一个靶向剂例如2个或更多个靶向剂是相同类型的靶向剂(例如靶向同一抗原的抗体)或不同类型的靶向剂(例如靶向不同抗原的抗体)或抗体和pMHC。在一个实施方式中，纳米结构包含至少两个不同类型的靶向剂。在一个实施方式中，与只包含一个靶向剂的纳米结构相比，包含至少两个靶向剂的纳米结构具有更高的特异性、亲和性和/或亲合力。
本发明的纳米结构的优点在于它可用于高效成像例如医学成像，例如用于身体内部成像以备临床分析和医学干预，或者用于某些器官或组织功能的可视显示。具体来说，可以用多个染料分子标记所述纳米结构以用于高效的医学成像，并且可以选择用于任何成像技术的适合染料，例如用于X射线照相、磁共振成像、超声、内窥镜检查、弹性成像、触觉成像、热成像、医学摄影、断层扫描、核医学功能成像技术、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、脑电图描记术(EEG)、脑磁图描记术(MEG)、心电图描记术(ECG)和/或磁粒子成像。
本文所使用的术语“靶分子”是指靶标的任何分子，例如将被靶向剂结合的化学化合物、肽和抗原、脂质和/或任何其他分子，例如靶标的表面肽、表面蛋白、表面受体、表面抗原和/或表面脂质。在一个实施方式中，所述靶分子是靶标的表面上存在的分子和/或靶标的表面上可接近的分子。在一个实施方式中，靶分子例如抗原是细胞表面结合分子或传感器表面结合分子，例如任何蛋白质、分化簇分子、受体、脂质、离子通道、糖或任何其他细胞表面结合分子或结构。在一个实施方式中，靶分子是抗原。
本文所使用的术语“靶标”是指将要被靶向，例如将要被一个或多个靶向剂结合的任何分子、结构、材料、细胞、抗原和/或表面。在一个实施方式中，所述靶标是细胞、分子、材料和/或表面例如传感器表面、固定化表面或用于测定的任何其他表面。例如，靶标可以是传感器、固定化表面、珠子、层析柱的柱材料、微量滴定板表面、生物素化或链霉亲和素包被的表明和/或用于测定以固定分析物例如细胞的任何其他表明、材料或分子。例如，纳米结构可以被靶向第一靶标以固定所述纳米结构，并靶向与其结合的第二靶标。此类固定化可用于进行测定、选择和/或分选细胞或本领域技术人员已知的任何其他方法或测定。
在一个实施方式中，在本发明的方法的上下文中，术语“提供核酸纳米结构”包括提供组装的核酸纳米结构和/或提供用于核酸纳米结构的建造材料例如支架链和一个或多个装订链。在一个实施方式中，本发明的试剂盒提供了核酸纳米结构。在一个实施方式中，制备本发明的纳米结构的方法包括允许纳米结构自组装和纯化所述自组装的纳米结构的步骤，例如所述方法的步骤i)，即提供核酸纳米结构的步骤包括允许自组装和随后的纯化的步骤。在一个实施方式中，允许自组装包括将至少一个支架链与一个或多个装订链混合，任选地还包括调节离子强度，例如通过添加MgCl2至20mM，和/或还包括使用运行一系列温度的温度方案。在一个实施方式中，所述纯化包括除去剩余的过量装订链，例如通过沉淀如PEG沉淀、过滤和/或液相色谱。在一个实施方式中，自组装和/或允许自组装的步骤包括变性步骤和冷却步骤。在一个实施方式中，变性步骤在50℃至80℃、优选地60℃至70℃、例如约65℃的温度下进行1分钟至45分钟、优选地10至20分钟、例如约15分钟的时间段。在一个实施方式中，冷却步骤在0℃至70℃、优选地20℃至60℃、例如约50℃至58℃的温度下进行。在优选实施方式中，冷却步骤作为逐步冷却来进行，优选地在约58℃至约50℃的温度下进行，每小时降低1℃。本领域技术人员理解，用于自组装的方案取决于纳米结构的设计和/或核酸序列，并且所述方案可以根据用于制备纳米结构的已知方案进行调整。在一个实施方式中，试剂盒包含用于制备纳米结构的方案。在一个实施方式中，纳米结构被配置成具有不包含形成二级结构的序列的支架序列。在一个实施方式中，偶联到靶向剂的核酸序列，优选为偶联到靶向剂的与所述纳米结构的序列互补的核酸序列，被配置成由不形成二级结构的序列组成。在一个实施方式中，所述纳米结构的核酸序列例如支架链和装订链的核酸序列、核酸柄例如DNA柄的核酸序列和/或偶联到靶向剂的核酸，被配置成不形成二级结构。在一个实施方式中，自组装的纳米结构具有一个或多个空位，即可以被偶联到靶向剂的互补核酸序列结合的单链核酸序列。
在一个实施方式中，制备纳米结构的方法包括将靶向剂与所述纳米结构偶联的步骤。在一个实施方式中，术语“偶联”、“结合到”、“附连到”和“偶联”可互换使用。在一个实施方式中，术语“偶联的”、“结合的”、“附连的”和“偶联的”可互换使用。在一个实施方式中，所述将靶向剂与所述纳米结构偶联的步骤包括提供一个或多个靶向剂，优选地每个靶向剂附连有独特的核酸序列，其与所述纳米结构的核酸链例如所述纳米结构的支架链或附连到所述纳米结构的DNA柄链互补。在一个实施方式中，由于附连到靶向剂的核酸序列与所述纳米结构例如偶联位点的核酸序列的互补性，因此这种靶向剂通过所述互补核酸链与所述纳米结构结合，优选地通过所述互补核酸链与所述纳米结构自动结合。在一个实施方式中，当提及“独特的”核酸序列时，这种术语意味着如果纳米结构包含超过一个靶向剂时，所述靶向剂附连有不同的核酸序列。这种“独特的”核酸序列被配置成与特定序列互补和/或与所述纳米结构的特定位置结合。在一个实施方式中，与第一靶向剂偶联的核酸序列不同于与第二靶向剂偶联的核酸序列。
在一个实施方式中，本文所使用的术语“偶联位点”是指位点例如核酸序列，其被配置成通过例如接头和/或互补核酸序列将纳米结构与化合物例如靶向剂和/或染料分子相连。在一个实施方式中，偶联位点是纳米结构、支架链、装订链和/或附连到纳米结构的接头例如DNA柄的一部分。在一个实施方式中，偶联位点是核酸链，例如被配置成与互补核酸链结合的核酸链。在一个实施方式中，第一偶联位点被配置成结合多个染料分子中的至少一个染料分子，例如与染料分子直接结合或与附连到接头的染料分子结合。在一个实施方式中，纳米结构包含一个或多个第一偶联位点。在一个实施方式中，第一偶联位点可以位于所述纳米结构上的超过一个位置处。在一个实施方式中，第二偶联位点被配置成结合一个或多个、优选地至少两个靶向剂，例如与靶向剂直接结合或与附连到接头的靶向剂结合。在一个实施方式中，纳米结构包含一个或多个第二偶联位点。在一个实施方式中，第二偶联位点可以位于所述纳米结构上的超过一个位置处。
标记样品中的靶标的方法
在一个实施方式中，标记方法包括分别使用至少一个、优选地至少两个靶向剂靶向靶标，特别是所述靶标的至少一个、优选地至少两个靶分子。在一个实施方式中，标记方法包括通过附连到纳米结构的多个染料分子、通过纳米结构中编码的DNA条形码和/或通过附连到纳米结构的酶标记所述靶标。在一个实施方式中，所述将样品与纳米结构接触的步骤包括将所述样品与纳米结构接触，所述纳米结构包含一个或多个、优选地至少两个靶向剂和多个染料分子、优选地至少10个染料分子，并任选地还包含DNA条形码和/或与其附连的酶。在一个实施方式中，当将样品与纳米结构接触时，所述样品中的靶标被所述包含多个染料分子和任选的DNA条形码和/或酶的纳米结构标记。在一个实施方式中，定性或定量确定所述样品中的标记的靶标的步骤包括确定从所述染料获得的信号、解码所述DNA条形码和/或确定从所述酶的底物获得的信号。例如，确定从所述染料或底物获得的信号可以包括本领域技术人员已知的任何技术，特别是成像(例如显微术，例如荧光显微术)、比色法或流式细胞术。例如，解码DNA条形码可以包括测序，例如使用qPCR。在一个实施方式中，标记样品中的靶标的方法中的样品是任何组织样品(例如植物组织、动物组织或人体组织)、血液样品、体液样品(例如尿液样品或唾液样品)、分析物、细胞培养物、细胞(例如原核或真核细胞)或本领域技术人员感兴趣的任何其他样品。在一个实施方式中，当提及将要在本发明的任何方法中使用的样品时，这种样品也可用于本发明的任何其他方法中。在一个实施方式中，标记样品中的靶标的方法是组织学或细胞学方法。在一个实施方式中，本发明的标记样品中的靶标的方法包括确定所述样品中标记的靶标，其中所述确定使用流式细胞术、荧光显微术、荧光成像、显微术、比色法和/或测序(例如通过Q-PCR)进行。在一个实施方式中，本发明的标记样品中的靶标的方法包括将样品与本发明的纳米结构、优选为包含有机荧光团的纳米结构接触，任选地还包括例如使用流式细胞术或荧光显微术确定所述样品中的标记的靶标。
在一个实施方式中，本发明的纳米结构被用作染色剂，例如用于组织学或细胞学的染色剂。在一个实施方式中，纳米结构作为染色剂的用途包括将所述纳米结构与样品接触。
在一个实施方式中，本发明的任何方法都包括使用本发明的试剂盒。在一个实施方式中，本发明的试剂盒可用于染色和/或标记样品。在一个实施方式中，所述试剂盒包含缓冲液，优选为TRIS缓冲液、HEPES缓冲液、包含NaCl的缓冲液和/或包含MgCl2的缓冲液。在一个实施方式中，所述试剂盒包含含有至少5mM MgCl2的溶液。在一个实施方式中，所述试剂盒包含用于将DNA链偶联到蛋白质例如抗体的化学品和/或溶液，例如TRIS、HEPES或MgCl2。在一个实施方式中，试剂盒的任何组分例如纳米结构、染料分子、靶向剂、支架链和/或装订链均以溶液形式或冻干形式存在于试剂盒中。例如，试剂盒的某些组分可以以溶液形式存在，并且试剂盒的某些组分可以以冻干形式存在。在一个实施方式中，所述试剂盒包含几种不同靶向剂，例如至少3、4、5或6种不同靶向剂，优选为靶向剂文库，和/或几种不同染料，例如至少3、4、5或6种不同染料，优选为染料文库。在一个实施方式中，试剂盒的用户可以根据其需要，使用几种不同靶向剂中其优选的靶向剂和/或几种不同染料中其优选的染料来定制纳米结构。在一个实施方式中，用户可以使用包含几种靶向剂和/或几种染料的试剂盒来制备具有靶向剂和染料的不同组合的纳米结构。在一个实施方式中，所述试剂盒有利地允许通过提供染料和靶向剂的多于一种特定组合，对样品中的多于一个靶标进行染色。在一个实施方式中，所述试剂盒包含用于纳米结构的组装和/或维护的说明书，例如用于执行本发明的制备纳米结构的方法的说明书。在一个实施方式中，本发明的试剂盒中的支架链和/或多个单链寡核苷酸装订链中的至少一个装订链包含第一偶联位点和/或第二偶联位点。在一个实施方式中，所述试剂盒包含附连有不同接头的不同靶向剂和/或包含附连有不同接头的不同染料分子。在一个实施方式中，本发明的试剂盒包含染料分子修饰的核酸链例如荧光团修饰的DNA链，和/或靶向剂修饰的核酸链例如抗体和/或蛋白质修饰的DNA链。在一个实施方式中，本发明的试剂盒的用途包括执行制备本发明的纳米结构的方法，以例如组装一组纳米结构，其中每个纳米结构具有靶向剂和染料分子的特定组合。
制备纳米结构的方法
在一个实施方式中，制备纳米结构的方法包括将所述核酸纳米结构与一个或多个靶向剂混合的步骤，例如以等摩尔比例或靶向剂过量的方式，任选地还包括将所述混合的核酸纳米结构和靶向剂温育的步骤。在一个实施方式中，制备纳米结构的方法包括将所述核酸纳米结构和任选的靶向剂与多个染料分子混合的步骤，例如以等摩尔比例或染料分子过量的方式，任选地还包括将所述混合的核酸纳米结构、任选的靶向剂和所述染料分子温育的步骤。在一个实施方式中，制备纳米结构的方法包括将所述核酸纳米结构与一个或多个靶向剂和多个染料分子混合的步骤，例如以等摩尔比例或靶向剂和/或染料分子过量的方式，任选地还包括将所述混合物温育的步骤。在一个实施方式中，本发明的方法包括在将核酸纳米结构与靶向剂和/或染料分子混合的步骤之后除去过量的靶向剂、未结合的靶向剂、过量的染料分子和/或未结合的染料分子的步骤，例如通过沉淀例如PEG沉淀、过滤和/或液相色谱。在一个实施方式中，将纳米结构和靶向剂温育的步骤在20℃至50℃、优选地30℃至40℃、例如约37℃的温度下进行1分钟至3小时、优选地30分钟至1.5小时、例如约1小时的时间段。
在一个实施方式中，制备纳米结构的方法包括1)将染料分子和/或靶向剂直接掺入到纳米结构中，和/或2)使用接头例如衔接物链将染料分子和/或靶向剂附连到纳米结构。
1)直接掺入染料例如荧光团或靶向剂可以包括通过将长DNA链(支架链)与多个较短的DNA链(装订链)退火来组装纳米结构。在这个自组装过程之前，可以将装订链(或其子集)用染料例如荧光团(例如非蛋白质有机荧光团)或靶向剂修饰。在所述自组装过程完成后，所述纳米结构包含支架链和染料修饰的装订链或靶向剂修饰的装订链。
2)使用接头例如衔接物链来附连染料例如荧光团或靶向剂。纳米结构例如DNA折纸纳米结构中的装订链可以被设计成具有不与支架互补的部分。因此，组装的纳米结构具有突出的DNA链(即衔接物链和/或DNA柄)，其可以与在纳米结构组装后添加的染料修饰的DNA链或靶向剂修饰的DNA链杂交。例如，将靶向剂用DNA链修饰。这些DNA链与突出的衔接物链或支架链互补。或者，DNA折纸折叠过程中可以省略装订链，由此产生空腔。在折叠过程后可以添加靶向剂修饰的装订链或染料修饰的装订链，以结合在相应的空腔中。在一个实施方式中，偶联位点是突出的核酸链例如衔接物链和/或DNA柄，是纳米结构中的空腔，和/或是纳米结构的单链结合位点。在一个实施方式中，术语“突出的核酸链”、“衔接物链”、“DNA柄”和/或“接头”可互换使用。
在一个实施方式中，在本发明的制备纳米结构的方法中，提供靶向剂包括提供一个或多个靶向剂修饰的DNA链。在一个实施方式中，在本发明的制备纳米结构的方法中，提供多个染料分子包括提供一个或多个染料修饰的DNA链，例如荧光团修饰的DNA链。在一个实施方式中，本发明的制备纳米结构的方法包括将靶向剂修饰的DNA链和染料修饰的DNA链与纳米结构混合的步骤，优选地以等摩尔比例或所述修饰链过量的方式。在一个实施方式中，本发明的制备纳米结构的方法包括除去过量的靶向剂修饰的DNA链和/或染料修饰的DNA链的步骤。
在一个实施方式中，本发明的制备纳米结构的方法包括下述步骤：
i.1.)提供包含至少一个第一偶联位点和至少一个第二偶联位点的核酸纳米结构，和/或
提供至少一个支架链和多个单链寡核苷酸装订链，其中每个装订链与至少一个支架链至少部分互补，并且其中每个所述装订链被配置成在至少一个位置、优选地两个或更多个不同位置中与所述至少一个支架链中的至少一种结合，其中所述至少一个支架链被折叠和/或排布，以便形成所需纳米结构，并且其中所述至少一个支架链和/或多个单链寡核苷酸装订链中的至少一个装订链包含至少一个第一偶联位点，并且其中所述至少一个支架链和/或多个单链寡核苷酸装订链中的至少一个装订链包含至少一个第二偶联位点，
i.2.)提供靶向剂，优选为靶向剂修饰的DNA链，
i.3.)提供多个染料分子，优选为多个染料修饰的DNA链和/或包含多个染料分子的染料修饰的DNA链；
ii.1.)将所述提供的核酸纳米结构和/或所述至少一个支架链和多个单链寡核苷酸装订链与所述靶向剂和所述多个染料分子混合，优选地以等摩尔比例或以所述靶向剂和/或多个染料分子过量的方式，
ii.2.)任选地自组装，
ii.3.)任选地除去过量的靶向剂和/或多个染料分子，
ii.4.)获得包含所述靶向剂和所述多个染料分子的核酸纳米结构。
在一个实施方式中，提供靶向剂包括提供包含接头的靶向剂。在一个实施方式中，提供多个染料分子包括提供多个包含接头的染料分子。在一个实施方式中，附连到多个染料分子中的至少一个染料分子的接头被配置成与第一偶联位点结合。在一个实施方式中，附连到靶向剂的接头被配置成与第二偶联位点结合。
鉴定靶向剂组合的方法
双特异性和多特异性抗体和蛋白作为研究工具和作为新药物形式具有许多应用。例如，双特异性抗体被用作治疗癌症的T细胞衔接物—募集身体的免疫系统以对抗癌症。它们被设计成同时结合两个靶分子(抗原)。然而，对于给定抗原来说，许多不同抗体可以以不同方式和不同强度与同一抗原结合。因此，在研发双特异性抗体时，必须从大量潜在的组合中找到有效的组合。可能的组合的数量随着价数呈指数级增加，并且变得非常大，尤其是对于具有超过两个结合位点的多特异性形式而言。为了找到最佳组合，每一种抗体或蛋白质组合都必须单独设计和生产。这一过程极其费力、昂贵且缓慢，因此会减慢研发速度，尤其是对于具有超过两个价的构建体来说，其中必须测试和评估大量候选者。本发明的鉴定靶向剂组合的方法克服了这些障碍，并且是非常有利的，因为它允许筛选无数靶向剂的组合以寻找具有所需特征、例如唤起所需效果的靶向剂组合。此外，本发明的鉴定靶向剂组合的方法是非常有利的，因为它允许筛选无数靶向剂组合位置，即有效唤起所需效果的空间组织。
在一个实施方式中，在鉴定具有所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合的方法的情形中，样品是细胞样品例如真核或原核细胞样品、细胞培养物样、组织样品、体液样品和/或血液样品。本领域技术人员已知的其他样品例如囊泡系统或珠系统，可用于本发明的鉴定靶向剂组合的方法中。
在一个实施方式中，术语“所需性质”、“所需效果”和/或“所需空间组织”是指本领域技术人员感兴趣的任何特征，例如1)对靶标、优选为受体或配体的亲和性或特异性，2)生物分布特性和/或药代动力学特性，3)细胞应答，4)细胞和/或受体激活，5)细胞和/或受体抑制，6)受体和/或纳米结构内化的激活或抑制，和/或7)细胞的聚集，优选为诱导免疫细胞激活的细胞的聚集，8)表位至细胞表面距离，例如受体高度，和/或9)表位至表位距离，例如受体接近度。在一个实施方式中，在鉴定具有所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合的方法中，使用任何荧光测量例如流式细胞术、荧光显微术或通过微孔板读板器、发光测量、显微术、比色法和/或细胞表面标志物染色，来定性或定量确定对所述样品中的所述纳米结构的响应。在一个实施方式中，分析对所述样品中的所述纳米结构的响应，并通过比较处理过的样品与未处理过的样品的荧光和/或发光强度，比较处理过的样品与未处理过的样品的细胞表面标志物染色，来鉴定具有所需特征的靶向剂组合。在一个实施方式中，当所需效果是受体和/或纳米结构内化的激活或抑制时，将细胞内部的荧光强度与细胞表面上的荧光强度进行比较。在一个实施方式中，本文所使用的术语“所需特征”是指“所需性质”、“所需效果”和/或“所需空间组织”。在一个实施方式中，在鉴定靶向剂组合的方法中分析的所需特征是：
1)对靶的亲和性或特异性，例如使用荧光测量例如流式细胞术、荧光显微术或微孔板读板器测量，其中例如所述特征通过将处理过的(接触过的)样品与未处理的样品(未与纳米结构接触的样品)的荧光强度进行比较来确定；例如，从大量可能的组合中鉴定靶向剂例如抗体或配体的组合，使得所述鉴定的组合可以以提高的特异性或亲和性与靶细胞结合(图6A)；
2)生物分布特性和/或药代动力学特性，例如通过PCR、qPCR和/或测序对样品例如感兴趣的细胞、组织和/或器官进行分析来测量，例如从用带有不同靶向剂组合并且其中所述靶向剂组合通过DNA条形码编码在每个纳米结构中的纳米结构的混合物注射的动物获得、优选地极小侵入性或非侵入性获得的样品。每种靶向剂组合的生物分布可以从每个样品例如器官中相应DNA条形码的存在推断出来；
3)通过受体聚集的细胞应答，例如使用荧光、发光测量、显微术或细胞表面标志物染色来测量，其中例如所述特征通过荧光或发光强度来确定；例如，从大量可能的组合中鉴定靶向剂例如抗体或配体的组合，使得所述鉴定的组合触发(或抑制)所需细胞应答(图6B)；
4)细胞和/或受体激活，例如使用荧光、发光测量、显微术或细胞表面标志物染色来测量，其中例如所述特征通过荧光或发光强度来确定；
5)细胞和/或受体抑制，例如使用荧光、发光测量、显微术或细胞表面标志物染色来测量，其中例如所述特征通过荧光或发光强度来确定；
6)受体和/或纳米结构内化的激活或抑制，例如使用荧光、发光测量、显微术或细胞表面标志物染色来测量，其中例如所述特征通过将细胞内部的荧光强度与细胞表面上的荧光强度进行比较来确定；例如，从大量可能的组合中鉴定靶向剂例如抗体或配体的组合，使得所述鉴定的组合具有高(或低)内化率(图6C)；
7)细胞的聚集，优选为诱导免疫细胞激活的细胞的聚集，例如使用发光测量、显微术或细胞表面标志物染色来测量，其中例如所述特征通过将处理过的细胞与未处理的细胞的荧光强度进行比较来确定；例如，从大量可能的组合中鉴定靶向剂例如抗体或配体的组合，使得所述鉴定的组合具有高的细胞募集效率或T细胞激活效率或靶细胞杀伤效率(图6D)；
8)表位至细胞表面距离，例如受体高度，例如使用荧光测量如流式细胞术来测量，其中优选地，所述特征通过荧光强度和结合亲和性来确定；例如从纳米结构的亲和性推断出表位距表面的距离。产生大量具有不同靶向剂至边缘距离的平台变体并测试它们的结合亲和性。从所述结合亲和性和纳米结构的维度，可以推断出表位至表面距离(图6E)；
9)表位至表位距离，例如受体接近度，例如使用荧光测量如流式细胞术来测量，其中优选地，所述特征通过荧光强度和结合亲和性来确定；例如通过测量纳米结构的亲和性推断出两个表位彼此之间的最小或最大距离。产生大量具有不同靶向剂至靶向剂距离例如抗体至抗体距离的平台变体并测试它们的结合亲和性。从所述结合亲和性和平台的尺寸，可以推断出靶向剂至靶向剂距离(图6F)。
在一个实施方式中，本发明的纳米结构和/或在本发明的任何方法、试剂盒和用途中提供的纳米结构包含DNA条形码，例如双链或单链DNA序列。例如，这种DNA条形码是支架链和/或装订链的一部分。在一个实施方式中，这种DNA条形码可以使用测序和/或qPCR定性或定量确定。在一个实施方式中，在本发明的方法或用途中，所述纳米结构包含DNA条形码。在一个实施方式中，本发明的纳米结构包含当与相应底物接触时提供发光的酶。在一个实施方式中，在本发明的方法、试剂盒或用途中，所述纳米结构包含当与相应底物接触时提供发光的酶。DNA条形码的优点在于可以例如在鉴定靶向剂组合的方法中同时分析大量例如超过100个纳米结构，并且可以使用DNA条形码将对纳米结构的相应响应与纳米结构相关联。例如，在鉴定具有所需生物分布特性和/或药代动力学特性的靶向剂组合的方法中，可以将各自具有特定靶向剂组合和特定条形码的几种不同纳米结构于样品接触，并且可以通过鉴定所述DNA条形码，例如通过测序和/或PCR，来鉴定带有具有所需特征、即在所述样品中显示出所需响应的靶向剂组合的纳米结构。
在一个实施方式中，提供至少一个包含靶向剂组合的核酸纳米结构包括用DNA链、优选为被配置成与所述纳米结构结合的DNA链修饰至少两个靶向剂的步骤。在一个实施方式中，提供核酸纳米结构文库包括用DNA链修饰靶向剂以产生靶向剂-DNA偶联物文库的步骤，其中此类靶向剂-DNA偶联物被配置成与所述纳米结构结合。在一个实施方式中，所述鉴定靶向剂组合的方法包括将至少两种靶向剂-DNA偶联物的组合与核酸纳米结构混合并温育的步骤，所述核酸纳米结构包含被配置成被靶向剂-DNA偶联物的DNA链例如突出的衔接物链或单链支架区结合的偶联位点。在一个实施方式中，所述鉴定靶向剂组合的方法任选地包括除去过量的靶向剂-DNA偶联物的步骤。在一个实施方式中，所述方法包括使包含靶向剂组合的纳米结构和/或包含靶向剂组合的核酸纳米结构文库对核酸酶降解或低离子强度条件稳定化。在一个实施方式中，提供至少一个包含靶向剂组合的核酸纳米结构包括提供具有不同靶向剂组合的核酸纳米结构的文库。在一个实施方式中，这种文库中的每个纳米结构包含不同的靶向剂组合。在鉴定靶向剂组合的方法的优选实施方式中，所述靶向剂独立地选自抗体或其抗原结合片段、抗原结合肽、Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、双抗体、单链Fv片段、(scFv)2、四抗体、三抗体、二硫键稳定性Fv(dsFv)、Fc结构域、工程化的Fc结构域、TCR样抗体、MHC、pMHC、受体配体及其片段。在鉴定靶向剂组合的方法的一个实施方式中，所述靶向剂不是适体。
在一个实施方式中，定性或定量确定响应包括在所需测定例如结合强度测定和/或内化测定中使用包含至少两种靶向剂的靶向剂组合的核酸纳米结构。在一个实施方式中，例如在确定对靶的亲和性或特异性时，所述定性或定量确定响应的步骤包括在流式细胞术中确定样品例如细胞的荧光。在一个实施方式中，例如在确定受体和/或纳米结构内化的激活或抑制时，所述定性或定量确定响应的步骤包括对内化的荧光与样品表面例如细胞表面上的荧光进行比较。在一个实施方式中，例如在确定细胞激活例如T细胞激活时，所述定性或定量确定响应的步骤包括确定萤光素酶表达和/或激活标志物例如CD69的染色。在一个实施方式中，所述鉴定靶向剂组合的方法是高通量筛选方法。在一个实施方式中，所述鉴定靶向剂组合的方法包括使用96孔板进行这种方法，其中每个孔测试一种靶向剂组合。在一个实施方式中，本发明的方法例如鉴定靶向剂组合的方法包括定量确定样品例如细胞样品、组织样品、血液样品和/或体液样品中的纳米结构的DNA条形码。在一个实施方式中，所述鉴定靶向剂组合的方法包括通过qPCR或测序定量测量从试验动物获得、优选地极小侵入性或非侵入性获得的器官或血液样品中纳米结构的条形码的出现率。在一个实施方式中，所述鉴定靶向剂组合的方法是在其中同时测试多个靶向剂组合的多重方法。在一个实施方式中，这种多重方法包括使用相应纳米结构的DNA条形码和/或使用特定染料组合例如荧光团组合鉴定特定的靶向剂组合。在一个实施方式中，本发明的方法的优点在于它可以使用多重方式来进行。在一个实施方式中，所述提供至少一个核酸纳米结构的步骤包括提供用DNA条形码或特定染料和/或染料组合标记的纳米结构。在一个实施方式中，在将样品与纳米结构接触的步骤之后并在定性或定量确定响应的步骤之前，通过例如进行清洗步骤除去未结合的纳米结构和/或染料。在一个实施方式中，将样品和/或纳米结构固定化在基底例如载玻片、培养容器和/或孔板上。在一个实施方式中，例如在除去未结合的纳米结构和/或染料之后，使用优选为DNA条形码的测序例如qPCR和/或使用荧光成像例如流式细胞术分析染料和/或染料组合，来定性或定量确定响应。
在一个实施方式中，鉴定了受体高度和/或受体接近度，用于有效设计靶向剂组合，例如抗体或配体。在一个实施方式中，在鉴定具有所需特征的靶向剂组合的方法中，所述所需特征是例如1)对靶的亲和性或特异性，2)生物分布特性和/或药代动力学特性，3)通过受体聚集的细胞应答，4)细胞和/或受体激活，5)细胞和/或受体抑制，6)受体和/或纳米结构内化的激活或抑制，和/或7)细胞的聚集，当测试超过一种包含靶向剂组合的纳米结构时，例如当测试其中每个纳米结构具有特定靶向剂组合的核酸纳米结构文库时，每个测试的靶向剂组合的空间组织是相似或相同的，使得所述测试的包含特定靶向剂组合的纳米结构的响应的定性或定量确定是可比的。
在一个实施方式中，鉴定具有所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合的方法是用于筛选具有各种特定靶向剂组合的纳米结构文库的筛选方法。在一个实施方式中，鉴定具有所需特征的靶向剂组合的步骤d)包括将对具有特定靶向剂组合的纳米结构的响应与对具有另一种特定靶向剂组合的另一种纳米结构的响应进行比较，优选地比较对纳米结构文库的纳米结构的响应，并鉴定具有最佳响应即所需特征的纳米结构。在一个实施方式中，所述纳米结构具有DNA条形码，并且这种DNA条形码用于将所确定的响应与具有特定靶向剂组合的纳米结构相关联。在一个实施方式中，通过使用DNA折纸技术为纳米结构提供了靶向剂的限定空间组织，例如在纳米结构的限定位置处为纳米结构提供了用于靶向剂的偶联位点。在一个实施方式中，“指示”所需特征的响应意味着所述响应的形式、特征、严重性和/或程度指示了靶向剂组合和/或具有特定靶向剂组合的纳米结构是否具有所需特征，例如可以对所述响应进行定性或定量分析，以评估靶向剂组合和/或具有特定靶向剂组合的纳米结构是否具有所需特征以及任选地评估所述所需特征的程度。在一个实施方式中，定性或定量确定响应包括分析所述响应例如靶结合，并确定响应是否存在，任选地例如通过计算指示响应程度的值来进一步确定响应呈现的程度。在一个实施方式中，本发明的鉴定靶向剂组合的方法进一步包括产生具有所述鉴定的靶向剂组合的包含双特异性或多特异性靶向剂的分子、优选双特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段的步骤。
生产包含双特异性或多特异性靶向剂的分子的方法
在一个实施方式中，包含双特异性或多特异性靶向剂的分子涉及包含具有超过一种特异性的靶向剂和/或包含超过一个靶向剂的分子(例如抗体)，例如包含两个靶向不同抗原的Fab片段的双特异性抗体。因此，这种分子包含至少两种特异性，即一种或多种靶向剂的特异性。在一个实施方式中，“双特异性或多特异性”和“双价或多价”可互换使用。在一个实施方式中，生产包含双特异性或多特异性靶向剂的分子的方法包括使用本发明的鉴定靶向剂组合的方法鉴定具有所需特征例如所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合。在一个实施方式中，从本发明的鉴定靶向剂组合的方法获得的信息，即实现所需效果的高效靶向剂组合的信息，被用于生产包含双特异性或多特异性靶向剂的分子。在一个实施方式中，生产包含双特异性或多特异性靶向剂的分子例如双特异性或多特异性抗体的方法包括杂交瘤细胞培养、蛋白质工程、合成生物学或本领域技术人员已知的任何其他技术。在一个实施方式中，从本发明的鉴定靶向剂组合的方法获得的信息，即实现所需效果、优选为提高的靶-细胞亲和性的高效靶向剂组合的信息，被用于产生具有所述组合和细胞毒性特性的功能性DNA纳米结构。这些细胞毒性特性可以通过附连细胞毒性分子和/或通过附连导致免疫细胞介导的靶细胞杀伤的募集免疫细胞的抗体例如抗CD3抗体来实现。
在一个实施方式中，产生包含双特异性或多特异性靶向剂的分子的方法和/或鉴定靶向剂组合的方法被用于个性化医学。具体而言，使用患者的样品例如血液样品、体液样品和/或组织样品，优选地使用从所述患者极小侵入性或非侵入性获得的样品，鉴定具有针对患者的所需特征的靶向剂组合。随后将包含所述鉴定到的靶向剂组合的纳米结构和/或包含所述鉴定到的靶向剂组合的包含双特异性或多特异性靶向剂的分子施用到所述患者。因此，所述鉴定到的靶向剂组合、包含所述鉴定到的靶向剂组合的纳米结构和/或包含所述鉴定到的靶向剂组合的包含双特异性或多特异性靶向剂的分子被用于预防、治疗和/或诊断疾病例如癌症的方法中，例如用于个性化医学。
筛选样品中具有至少两个靶分子的靶标的方法
在一个实施方式中，筛选样品中具有至少两个靶分子的靶标的方法，包括使用任何方法例如流式细胞术、荧光显微术、荧光成像、显微术、比色法和/或测序例如通过Q-PCR定性或定量确定所述样品中的靶标。在一个实施方式中，筛选样品中的靶标的方法包括将所述纳米结构和/或样品固定化在例如基底上的步骤。在一个实施方式中，所述纳米结构的靶向剂与所述靶标上的相应靶分子结合。在一个实施方式中，当所述纳米结构被固定化时，这种靶向剂与靶标上的靶分子的结合将所述靶标固定化。在一个实施方式中，这种可逆或不可逆的结合和/或固定化可用于FACS分析，例如血液样品、组织样品或细胞培养物样品的FACS分析。在一个实施方式中，本发明的筛选样品中具有至少两个靶分子的靶标的方法包括本发明的标记样品中的靶标的方法。在一个实施方式中，本发明的标记样品中的靶标的方法包括本发明的筛选样品中具有至少两个靶分子的靶标的方法。在一个实施方式中，本发明的鉴定靶向剂组合的方法包括本发明的标记样品中的靶标的方法和/或本发明的筛选样品中具有至少两个靶分子的靶标的方法。在一个实施方式中，本发明的纳米结构、组合物、用途、试剂盒和方法可以以任何组合使用。在一个实施方式中，所述筛选样品的方法包括具有作为pMHC的靶向剂的纳米结构，例如pMHC四聚体样筛选。在一个实施方式中，所述纳米结构包含靶向SARS-CoV2刺突蛋白的靶向剂，并且进行所述筛选方法以鉴定患者样品中与SARS-CoV2结合的细胞，以例如确定患者是否对SARS-CoV2免疫。
在一个实施方式中，筛选样品中具有至少两个靶分子的靶标的方法被用于个性化医学。具体而言，使用患者的样品例如血液样品、体液样品和/或组织样品，优选地使用从所述患者极小侵入性或非侵入性获得的样品，针对相应的靶分子是否存在于患者中来分析靶向剂组合。如果在所述患者的样品中存在这种靶分子组合，则靶向所述靶分子组合、涉及包含所述相应靶向剂组合的纳米结构和/或涉及包含所述靶向剂组合的包含双特异性或多特异性靶向剂的分子的治疗，在所述患者中可能是成功的。在一个实施方式中，在筛选样品的方法中，核酸纳米结构是包含DNA条形码的纳米结构。
在一个实施方式中，术语“本发明的方法”是指本发明的标记样品中的靶标的方法、本发明的制备纳米结构的方法、本发明的鉴定具有所需性质、所需效果和/或所需空间组的靶向剂组合的方法、本发明的生产包含双特异性或多特异性靶向剂的分子的方法和/或本发明的筛选样品中具有至少两个靶分子的靶标的方法。在一个实施方式中，在本发明的特定方法的上下文中提到的实施方式也涉及本发明的其他方法。本文所使用的术语“[本]发明的”、“按照本发明的”、“根据本发明的”等，意指本文中描述和/或提出权利要求的本发明的所有方面和实施方式。在一个实施方式中，当在本发明的试剂盒所包含的纳米结构的上下文中或在本发明的任何方法中提供和/或使用的纳米结构的上下文中提及“纳米结构”时，本发明的纳米结构意味着例如本文所定义的DNA折纸结构。
本文所使用的术语“包含”应当被解释为涵盖“包括”和“由……组成”两者，这两种含义都被具体地意指，因此是根据本发明单独公开的实施方式。当在本文中使用时，“和/或”应被视为具体公开了所述两个指定特征或组分中的每一者，无论是否包含另一者。例如，“A和/或B”应被视为具体公开了(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一种情况，如同每一者在本文中被单独列出。应当理解，除非具体说明，否则本文件中单数冠词“一个”或“所述”的使用并不意味着限制本发明的范围。也就是说，通常“一个”也可以是指超过一个。换句话说，“一个”通常可以被理解为“至少一个”。例如，“靶向剂”还包括多个靶向剂。在一个实施方式中，术语“如上所定义的”是指“如上文任何实施方式中所定义的”。无论何时在本说明书和所附的权利要求中叙述方法步骤，都应该注意，在本文中叙述步骤的顺序可能是偶然的。也就是说，除非另有规定或者除非本领域技术人员清楚，否则所叙述的步骤的顺序也可以不同。例如，当本文件陈述例如方法包括步骤(A)和(B)时，这并不一定意味着步骤(A)先于步骤(B)，而是也可能步骤(A)与步骤(B)同时(至少部分地)进行，或者步骤(B)先于步骤(A)。此外，当步骤(X)被称为先于另一个步骤(Z)时，这并不暗示在步骤(X)和(Z)之间没有步骤。也就是说，步骤(X)先于步骤(Z)可以包括步骤(X)直接在步骤(Z)之前进行的情况，但是也包括步骤(X)在一个或多个步骤例如(Y1)、(Y2)、(Y3)之前进行，然后进行步骤(Z)的情况。当使用诸如“之后”或“之前”的术语时，相应的注意事项也适用。
附图说明
现在通过参考下述附图进一步描述本发明。
下述附图中提到的所有方法如实施例中所详述的来进行。
图1示出了作为抗体DNA折纸构建体的示例性纳米结构的附连依赖性结合。具体而言，a至d示出了制备纳米结构的方法的示意图，例如涉及全尺寸IgG抗体(蓝色)到纳米结构例如DNA折纸砖状物体(DNA-origami brick-like object)上的附连位点的附连策略。a，核酸例如ssDNA(蓝色)与靶向剂例如IgG的偶联反应，从而获得靶向剂-核酸偶联物，b，这种靶向剂-核酸偶联物例如抗体-DNA偶联物与纳米结构上的偶联位点例如互补的突出3’-末端序列(A’)的结合。c，在近端(5’末端附连到IgG)或远端(3’末端附连到IgG)定向中的序列依赖性附连策略。靶向剂-核酸偶联物可以例如通过偶联位点附连到纳米结构上的优选位置，以获得所需空间组织。d，P1至P5指示用于抗CD3 IgG抗体的不同附连位点——每个位置被单独测试。e，在2％琼脂糖凝胶的荧光激光扫描图像上，其中将未修饰的砖(brick)(M)作为参比，(左侧凝胶)在5个不同附连位点处的远端附连中用抗CD3抗体修饰的砖和(右侧凝胶)在5个不同附连位点处的近端附连中用抗CD3抗体修饰的砖进行电泳分离。P、M+A和M分别突出了凝胶的胶孔(pocket)、DNA折纸抗体-偶联物条带和单体条带。黑色箭头指示各个条带。f，在远端(左侧)和近端(右侧)附连处用抗CD3抗体修饰的纳米结构的负染色的TEM显微照片。比例尺，50nm。白色箭头指示附连到砖状物体上的抗CD3 IgG抗体。g，与CD3阳性T细胞白血病细胞(Jurkat)结合的示例性纳米结构(用四种Cy5染料荧光标记)的流式细胞术分析。直方图表示仅细胞(黑色)、未修饰的DNA折纸物体(灰色)、在温育2h后在位置P1处近端(浅蓝色)和远端(蓝色)附连的抗CD3抗体。h，从(g)中所示的直方图确定的不同抗体附连位置(不同颜色)和构型(圆圈：远端；三角形：近端)的实验观察到的荧光中位数随温育时间的变化。实线代表简化结合模型与数据的拟合。示意图标中的彩色球体表示抗CD3抗体的附连位点。i，从由底部图标所指示的根据(h)中的拟合结果计算出的不同位点处近端(三角形)和远端(圆圈)附连的有效解离常数。
图2示出了包含一个或多个靶向剂的示例性多价纳米结构，例如多价抗体DNA折纸砖构建体。a，在2％琼脂糖凝胶的荧光激光扫描图像上，其中将未修饰的砖(0)作为参比、具有在远端附连中多达4个附连的抗CD19抗体的砖进行电泳分离。彩色图标突出了抗CD19IgG抗体的位置和数量。P和M分别突出了凝胶的胶孔和单体条带。b，与CD19阳性前B细胞白血病细胞(Nalm-6)结合的砖状结构(用4种Cy5染料荧光标记)的流式细胞术分析。所述直方图表示仅细胞(x，紫色)、未修饰的DNA折纸物体(0，深蓝色)、在远端附连中具有1个抗CD19抗体(1，蓝色)、2个抗CD19抗体(2m，浅蓝色)、3个抗CD19抗体(3，绿色)和4个抗CD19抗体(4，橙色)。c，左侧：从(b)中所示的直方图确定的不同数量的附连抗CD19抗体(不同颜色并且由抗CD19抗体的数量指示)的实验观察到的荧光中位数(两个独立测量，圆圈和三角形)随温育时间的变化。实线代表简化结合模型与数据的拟合。右侧：在添加竞争物(50倍过量的游离抗CD19抗体)后实验观察到的荧光中位数随温育时间的变化。实线代表指数解离模型与数据的拟合。d，从(c)中的拟合结果计算的解离率随着附连的抗CD19抗体数量的变化。插入图：在添加竞争物后归一化荧光随时间的变化。e，左侧轴：在1h预温育后荧光中位数随时间的变化(蓝色圆圈)。右侧轴：在1h预温育后修饰的DNA折纸物体的内化分数随时间的变化(蓝色正方形)。实线和虚线分别是解离模型(实线)和结合模型(虚线)与数据的拟合。图标指示双抗CD19抗体修饰的砖。
图3示出了用于本发明的方法的示例性双特异性纳米结构，例如用于细胞-细胞募集测定法的双特异性DNA折纸构建体。a，通过双特异性核酸纳米结构的细胞-细胞募集的示意图。灰色截取图像表示分别具有特定表面抗原CD3(橙色)和CD19(蓝色)的T和B细胞的表面。所述细胞通过双抗体修饰的DNA砖状物体(灰色)连接。所述砖分别用抗CD3抗体(左侧)和三个抗CD19抗体(右侧)修饰。b，含有比例为2比1的T和B细胞与荧光标记的双特异性(抗CD3、抗CD19)砖组合的反应混合物的荧光显微镜图像。比例尺，10μm。c，在实验之前进行荧光染色并在不含(左侧)和含有双特异性DNA折纸砖(右侧)的培养基中在37℃下温育1.5h的含有T和B细胞的反应混合物的荧光显微镜图像。比例尺，50μm。d，募集到T细胞的靶细胞(B细胞)的分数随时间的变化。正方形指示与不同浓度的双特异性砖(橙色：5nM。红色：1nM)温育的细胞，圆圈指示与1nM双特异性抗体贝林妥欧单抗(BiTe-Amgen)温育的细胞，三角形指示没有额外募集化合物的温育的细胞。竖直条是指示统计误差的95％Wilson得分置信区间。
图4示出了不同抗体DNA折纸构建体的T细胞激活和杀伤测定。a，通过双特异性DNA折纸砖(DNA-origami brick)进行的T细胞激活测定的示意图。灰色截取图像分别表示具有特定表面抗原CD3(橙色)和CD19(蓝色)的T和B细胞的表面。在与CD3抗原结合后，细胞通过抗体修饰的砖状物体(灰色)连接。所述T细胞被基因修饰，并在CD3受体激活后产生萤光素酶(T细胞的黄色变化)。在(b)至(c)中评估了T细胞的发光。b，通过多特异性DNA折纸物体进行的T细胞激活。T细胞激活随着不同反应物的终浓度的函数变化。插入图指示了不同的纳米结构。c，通过不同长度的多特异性DNA折纸物体进行的T细胞激活。T细胞激活随着不同反应物的终浓度的函数变化。插入图指示了分别在砖状物体的左侧和右侧上用抗CD19(左侧)和一个抗CD3(右侧)IgG抗体修饰的砖的长度。砖的长度分别为S＝25nm，M＝65nm，L＝125nm。d，在使用如左侧表中所指示的带有至多一个抗CD3 Fab片段和至多三个抗CD19 Fab片段的纳米结构24h后，T细胞介导的CD19阳性CellTrace染色的B细胞(NALM6)的杀伤。死亡的靶细胞的数量使用流式细胞术测量，并通过首先在CelttTrace荧光信号的基础上门选Nalm6靶细胞来计算。死亡的和活的靶细胞在FCS-SSC散点图上作为不同的群体被鉴定。e，用抗CD69和抗CD8抗体对PBMC进行染色并在相应的荧光通道中对它们进行门选，获得的激活CD8+T细胞的分数。
图5示出了鉴定靶向剂组合的示例性方法，即使用核酸纳米结构作为附连各种靶向剂组合的平台，105种独特靶向剂组合例如抗体组合的生产和功能性筛选。a，来自四个抗体-DNA偶联物文库(A、B、C、D)的多特异性砖-抗体变体的生产的示意图(符号指示抗体类型，颜色指示细胞类型)。抗体携带带有具有序列A、B、C或D的DNA柄(具体取决于文库)，并且所述序列与砖物体上的偶联位点例如DNA柄(中央)互补。例如，核酸纳米结构带有4个DNA柄。靶向剂-纳米结构变体例如抗体-砖变体通过将来自文库的相应靶向剂例如抗体与核酸纳米结构例如砖状物体混合来产生。变体用它们的抗体组合来命名(示例性组合参见底部中央)。b，琼脂糖凝胶的激光扫描图像，在所述凝胶上将与不同抗体组合(如符号所指示)温育的105种砖进行电泳。P，胶孔；C，组装的构建体。c，100pM、1000pM和10pM纳米结构浓度下105种不同靶向剂-纳米结构变体的相对T细胞激活。d，分选的具有最大激活的砖变体的相对T细胞激活。
图6示出了本发明的鉴定靶向剂组合、优选地用于筛选靶向剂组合的方法的示例性实施方式。(A)具有两个附连的靶向剂例如抗体的核酸纳米结构与靶标例如靶细胞或脱靶细胞例如旁邻细胞的结合的示意图。靶标上的靶分子例如靶细胞上的抗原的模式，只有在所述模式与DNA折纸平台上的相应靶向剂例如抗体匹配的情况下才被特异性识别。使用本文提出的方法，高效产生了大量可能的靶向剂组合例如抗体组合，并将它们针对靶标和旁邻细胞进行筛选。因此，本发明的方法允许确定具有所需特征的靶向剂组合，例如具有最高靶亲和性和最低非靶亲和性的组合。(B)附连有结合到细胞表面抗原(例如受体)的靶向剂的核酸纳米结构的示意图。通过包含至少两种靶向剂的靶向剂组合的核酸纳米结构，使细胞表面抗原紧密接近，即聚集。细胞表面抗原(或受体)的聚集导致细胞内信号级联，其可能导致细胞死亡、激活、增殖、基因网络激活等。使用本文提出的方法，高效产生了大量可能的靶向剂组合例如抗体组合，并筛选所需的细胞信号响应。(C)附连有结合到细胞表面分子的靶向剂的核酸纳米结构的示意图。细胞表面分子或其组合以不同的速率内化。在这个实例中，左侧的靶向剂组合导致平台的内化，而右侧描绘的组合阻止内化。使用本文提出的方法，可以高效产生大量可能的靶向剂组合例如抗体组合，并测试它们的内化速率。(D)附连有靶向剂和两种细胞类型的核酸纳米结构的示意图。两个靶标例如靶细胞(底部)和免疫细胞(顶部)可以通过DNA折纸-抗体平台连接。根据靶细胞和免疫细胞抗体，可以产生不同的细胞募集和免疫细胞激活响应。使用本文提出的方法，可以高效产生大量可能的靶向剂组合(对于靶标和免疫细胞两者来说)，并测试它们的免疫细胞募集或免疫细胞激活或免疫细胞介导的杀伤效率。(E)在距纳米结构边缘不同距离处附连有靶向剂的核酸纳米结构的示意图。如果靶向剂被附连到接近边缘，与抗原的二价结合是可能的。如果抗体被附连到中心，则与抗原的二价结合是不可能的。使用本文提出的方法，高效产生了大量可能的靶向剂至边缘距离，例如抗体至边缘距离，并测试它们的结合亲和性。因此可以从所述结合亲和性推断表位至细胞表面距离。(F)在不同抗体距离处附连有靶向剂的核酸纳米结构的示意图。如果靶向剂被附连得紧密接近，则与抗原的二价结合是不可能的。如果靶向剂被附连得更加分开，则与抗原的二价结合是可能的。使用本文提出的方法，高效产生了大量可能的靶向剂至靶向剂距离，例如抗体至抗体距离，并测试它们的结合亲和性，由此推断最小或最大抗原距离。
图7示出了本发明的包含至少一个靶向剂和多个染料分子的示例性纳米结构。(左侧)靶向剂例如IgG抗体和染料分子例如荧光染料(球形)。(右侧)示例性核酸纳米结构(圆柱体)例如DNA折纸平台，其具有9个靶向剂和60个染料分子(球形)。本发明的纳米结构的优点在于靶标和/或靶分子可以被特异性标记，并且获得更高的亮度用于优异的成像，特别是高效荧光成像例如荧光显微镜。
图8示出了本发明的示例性纳米结构，例如多价且明亮的靶向细胞的DNA折纸-抗体平台。a，在2％琼脂糖凝胶的荧光激光扫描图像上，其中将具有两个Cy5染料(左侧)和23个Cy5染料(右侧)的未修饰的DNA折纸平台进行电泳分离。b，CD19阳性NALM6细胞与DNA折纸-抗体平台温育的流式细胞术实验的细胞荧光强度中位数。平台具有2个或23个Cy5染料，并携带或不携带两个抗CD19 Fab片段。c，CD19阳性NALM6细胞与DNA折纸-抗体平台温育的荧光显微术图像。平台具有2个或23个Cy5染料。图像使用相同的曝光设置和亮度级别获取，以相同的灰度显示。本发明的纳米结构允许靶标的明亮染色和/或标记，用于高效荧光成像。
下面参考实施例，提供所述实施例是为了说明而不是限制本发明。
实施例
实施例1：结果
将全尺寸IgG抗体(例如抗CD19和抗CD3抗体)合理放置在DNA折纸物体上的设计位点处的稳健可靠策略是更复杂的多价细胞装置的先决条件。发明人用25个碱基的NHS酯激活的单链DNA柄(A)共价修饰抗体，其中所述NHS酯优选与抗体表面上的赖氨酸残基反应(图1a)，并使用离子交换色谱纯化DNA-抗体偶联物。作为抗体载体平台，发明人使用了先前描述的纳米结构，例如砖状DNA折纸物。发明人将单链DNA柄(A’)放置在DNA砖表面上的不同位置处。这些突出的DNA柄用作抗体附连位点(图1b)，并且可以被设计者包括在折叠反应中。最后，砖-抗体构建体依靠突出链A’与互补的抗体偶联的链A的DNA-DNA杂交进行自组装。通过使用其中NHS酯修饰位于5’或3’末端的抗体修饰链，发明人可以分别以远端或近端取向附连抗体(图1c)。
发明人测试了砖上的五个不同抗体位置，以研究该位置对细胞结合行为的影响。所述位置的选择覆盖了广泛的3D可及性，范围从角处的螺旋界面(P1)到砖底面上的凹陷部的中间(P5)(图1c)。对于每个位置P1至P5来说，发明人筛选了远端和近端抗体取向，并通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA-抗体偶联物与砖状结构的附连效率(图1e)。与未修饰的砖物体相比，全尺寸IgG抗CD3抗体(～180kDa)与～5MDa砖的附连导致明显的迁移差异(图1e)。发明人还可以观察到近端和远端附连变体之间以及不同附连位点之间的明显迁移差异。迁移速度的差异可以通过抗体-砖物体的流体动力学半径的变化来解释。对条带横截面轮廓(bands’cross-sectional profiles)的分析显示，总偶联产率高达95％(例如P1d或P5p)。这些结果与P1位置的TEM数据一致。单粒子检查表明远端附连策略的灵活性增加(图1d)。
对于10种不同的荧光标记的砖变体，分析了抗CD3抗体与Jurkat细胞(一种源自急性成淋巴细胞性白血病患者的悬浮细胞系，在其细胞表面表达CD3蛋白复合物)的细胞表面上的CD-3抗原之间的结合亲和性(如图1e中所分析)。为此，发明人进行了砖-细胞温育的流式细胞术实验，并为每个变体计算了门选的Jurkat细胞的荧光中位数(图1g)。发明人还校正了在凝胶电泳中观察到的抗体附连产率变化的结合曲线。与具有抗CD3抗体的砖相比，没有抗CD3抗体的砖样品显示出较少的与CD3阳性细胞的结合，因此表明特异性抗体-抗原介导的结合(图1g、h)。对于所有附连位置来说，与具有近端构型的抗体的砖相比，具有远端构型的抗体的DNA折纸砖(DNA-origami brick)显示出提高的结合亲和性(图1h)。此外，当只比较远端或近端构型时，结合亲和性随着附连位点而发生显著变化。例如，在螺旋界面角的附连导致最高的细胞结合亲和性，而在底面处凹陷部内的附连导致最低的细胞结合。这些观察结果可以通过附连位点(P1至P5)处抗体的可及性差异以及远端构型与近端构型相比可及性的增加来解释。因此，抗体的可及性越好，细胞结合亲和性就越高。结合亲和性的差异也与迁移速度的变化一致，因为较高的可及性对应于较小的迁移速度。通过用简化的结合模型拟合结合曲线，发明人能够评估无限温育时间的结合常数。这允许我们定量比较不同位置的亲和性，揭示出一个数量级的差异。
实施例2：多价DNA折纸结合物
标准的IgG抗体最多可以结合两个抗原。为了利用这些构建体的多价效应，发明人将多个IgG抗体安装在同一DNA折纸砖上。发明人的初步发现表明，在远端构型的DNA砖的角处实现了最高的结合亲和性。因此，发明人将多达四个抗CD19抗体以远端构型分布到螺旋界面的四个角(图2a)。这些构建体的凝胶电泳揭示了与未修饰的砖的条带相比迁移更慢的清晰条带，并且其迁移速度随着附连的抗体的数量而降低(图2a)。因此，发明人将这些条带分配给具有一到四个正确附连的抗体的DNA折纸砖。发明人通过截面轮廓分析计算出抗体附连产率对于具有一个抗体的砖来说为97％，对于具有四个抗CD19抗体的砖来说为88％(图2a)。有时，发明人还在具有设计数量为两个、三个和四个附连的抗体的砖样品的目标泳道下方的凝胶图像中看到较低分子量的条带。通过一个抗体计算得到的结合效率，发明人因此将这些条带归因于不携带所有设计的抗体的粒子。
发明人使用NALM-6细胞(一种源自急性成淋巴细胞性白血病患者的表达抗原CD19的悬浮细胞系)，来研究多价K10-PEG5k稳定化的砖构建体的结合特性。发明人对使用NALM-6细胞和用多达四个抗CD19抗体荧光标记的DNA砖的温育进行流式细胞术分析。结合的物体的量随着附连的抗体的数量而增加。与仅含细胞的样品相比，无抗体的砖物体引起荧光信号的轻微增加。然而，具有一个抗体的砖变体显示出比未修饰的砖物体高得多的荧光信号(图2b)。通过附连两个抗CD19抗体，发明人再次观察到荧光信号的增加。对于具有三个或四个附连的抗体的砖变体来说，这种差异变小(图2b)。温育4h后，发明人观察到在具有一个附连的抗体的变体和具有四个附连的抗体的变体之间的结合增加了十倍(图2c，左)。预计DNA折纸砖上的抗体数量将提高结合率，因为具有更多抗体的物体的有效抗体浓度更大。因此，很难直接推断砖是否结合了超过一个抗原。为了测试这种多价结合，发明人向每个样品中添加了比砖过量50倍的游离的未修饰的抗CD19抗体(图2c，右)。游离抗体应阻断脱离的砖重新结合。因此，允许发明人直接观察砖的脱离过程。砖的脱离速率随着安装在砖上的抗CD19抗体的数量而降低。为了量化砖的解离率，发明人对未结合的数据进行了指数衰减模型拟合(图2d)。发现只带有一个抗CD19抗体的砖的解离率最高，而有四个抗体的砖的解离率最低，有两个或三个抗体的砖的解离率中等。发明人因此得出结论，砖可以用不止一个抗体结合到细胞表面。尽管一个附连的抗体的解离率高，但发明人在去除砖四小时后仍观察到残留的荧光信号。该信号可能指向与细胞表面的非特异性相互作用或指向荧光标记的砖的细胞摄取。为了研究这些假设，发明人进行了内化测定。简而言之，发明人在砖上包括了突出的荧光单链。在携带猝灭剂分子的互补链杂交后，荧光被猝灭。由于猝灭剂链不能穿透到细胞中，因此猝灭的荧光量对应于细胞表面的砖物体的分数。四个小时后，大约20％的被修饰的砖已被细胞摄取(图2e)。细胞摄取可以解释先前测量的残余荧光信号。
人工双特异性抗体
受T细胞募集双特异性抗体的启发，发明人设计了一种DNA折纸砖变体，其可以携带针对T细胞的抗CD3抗体和针对B细胞的抗CD19抗体(图3a)。通过使用两组互补序列作为分别用于抗CD3抗体和抗CD19抗体的DNA柄，将抗体以远端构型附连到砖的相对侧的角处。发明人使用具有一个抗CD3抗体和三个抗CD19抗体的荧光标记的K10-PEG5k稳定化的砖变体来测试T细胞(Jurkat)向B细胞(NALM-6)的募集，其中效应细胞与靶细胞比例为2:1。与双特异性砖温育的细胞的荧光显微镜成像显示了细胞二聚体和更高级细胞簇的形成(图3b)。所有细胞二聚体和簇均显示出对应于荧光标记的DNA砖的共定位的荧光信号。所述荧光信号主要位于两个或更多个相连的细胞之间的界面处(图3b)，支持砖诱导的细胞-细胞募集过程。
为了更详细地了解募集过程并区分靶细胞和效应细胞，发明人用不同的荧光细胞染色剂对两种细胞类型(NALM-6细胞和Jurkat细胞)进行染色，并将它们与非荧光砖变体一起温育(图3c)。发明人使用具有一个抗CD3抗体和三个抗CD19抗体的砖来促进与CD19阳性靶细胞的结合。作为参比，发明人使用了可商购的抗CD3-抗-CD19双特异性抗体贝林妥欧单抗以及不含额外募集剂的样品。在不同时间点，发明人收集温育的荧光显微镜图像，并对与至少一个效应细胞(Jurkat细胞)处于一个簇中的靶细胞(NALM-6细胞)的数量进行计数(图3c和d)。对于所有样品来说，簇中靶细胞的比例随着时间的推移而增加，在1.5h时达到最大值，然后在20h时降低到随机细胞-细胞聚集。然而，具有双特异性砖的样品与没有砖的样品相比在细胞簇中的靶细胞比例增加(分别为70％相比于30％)。与双特异性T细胞衔接物贝林妥欧单抗相比，人工T细胞衔接物在温育后的前4小时内显示出更快的聚集效应。发明人将这种行为归因于与BiTe构建体相比，多特异性砖具有更强的结合亲和性。发明人测试了两种砖浓度(1nM和5nM)，但没有观察到聚集效率的差异。
实施例3：使用多特异性DNA折纸T细胞衔接物的T细胞募集和激活
发明人的双特异性构建体能够将T细胞募集到CD19阳性B细胞。接下来，发明人希望研究其构建体是否也能够在募集时激活T细胞。为此，发明人使用基因修饰的T细胞，其在激活时表达萤光素酶。T细胞激活的程度可以通过测量添加萤光素酶底物后的发光来读出。发明人使用的抗CD3 IgG抗体可以与CD3受体的ε链结合，因此应该激活T细胞(图4a)。
发明人首先测试了K10-PEG5k稳定化的DNA折纸砖的尺寸是否影响T细胞激活。为此，发明人构建了砖状物体的三种不同变体。这三个物体具有相同的蜂窝几何形状的48个dsDNA螺旋的横截面，但长度不同。最短的砖长度为25nm(S-砖)，中间变体长度为60nm(M-砖)，最长的变体长度为125nm(L-砖)(图4b)。发明人将两个抗CD19抗体和一个抗CD3抗体安装到这些砖上。在温育6h后，激活测定在100pM或更高的砖浓度下产生激活信号。三种构建体的T细胞激活相似，在低的砖浓度下，较长构建体(L和M)的激活略高。总体而言，对于发明人测试的距离来说，发明人没有观察到强烈的长度依赖性。因此，发明人使用60nm长的砖变体继续进行研究。如上所述，抗体砖构建体的细胞结合亲和性可以使用附连的抗体的数量来调节。发明人假设提高对靶细胞(CD19阳性B细胞)的亲和性可能是有益的，因为T细胞与靶细胞相比通常过量存在(典型的效应细胞与靶细胞比例为例如5:1或10:1)。因此，发明人比较了具有不同CD19价的砖物体的T细胞激活效率。正如预期，不具有抗体或具有一个抗CD19抗体的砖不会引起T细胞激活(图4c)。具有一个远端附连的抗CD3抗体的砖在等于和高于80pM砖浓度下激活T细胞。然而，在砖携带抗CD3抗体和抗CD19抗体两者后，在300pM砖浓度下T细胞激活提高4倍。可以通过增加靶细胞抗体的数量来进一步增强T细胞激活，使T细胞能够在20pM的砖浓度下激活。使用超过两个靶向B细胞的抗CD19抗体并不提高所产生的T细胞激活。
双特异性抗体贝林妥欧单抗的作用机制依赖于在靶细胞处募集和激活细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)。因此，发明人测试了双特异性K10-PEG5k稳定化的DNA折纸构建体是否能够诱导T细胞介导的靶细胞(NALM-6细胞)杀伤。发明人制备了具有三个抗CD19 Fab片段和一个抗CD3 Fab片段的双特异性砖变体。作为对照，发明人还创造了单特异性变体(仅一个抗CD3抗体和仅三个种抗CD19抗体)以及不具有抗体的砖。对靶细胞进行荧光染色，以在流式细胞术实验中将它们与外周血单个核细胞区分开来。在37℃下在完全细胞培养基中温育24h后，在与双特异性砖变体的温育中几乎所有靶细胞都被杀死(图4d)。相比之下，与仅细胞的对照相比，单特异性砖和对照在最高1nM下没有显示出靶细胞杀伤，并且在10nM下仅显示出轻微增加的细胞死亡。此外，发明人使用抗CD8抗体来检测CD8+T细胞，并使用抗CD69抗体来量化T细胞激活水平(图1e)。同样，双特异性砖变体显示出强的T细胞激活，而对于仅抗CD3抗体的变体来说，单特异性变体的T细胞激活仅在10nM下增加。这些结果表明双特异性DNA折纸砖引起了靶向T细胞介导的的B细胞群体杀伤。
用于多特异性抗体的生产和筛选的DNA砖(DNA-brick)平台
为了证明DNA折纸砖抗体平台方法的能力，发明人产生了105种独特的多特异性人工抗体，并测试了它们的T细胞激活能力。人工抗体结合效应细胞和靶细胞两者上的不同抗原及其组合。发明人使用具有四个不同结合位点的DNA砖。每个结合位点带有具有独特序列的DNA柄(图5a)。对于DNA砖上的每个结合位点，发明人产生了带有互补DNA柄的抗体-DNA偶联物的文库。因此，通过将DNA砖与相应的抗体混合产生了独特的多特异性抗体-DNA变体。这种方法允许发明人产生了105种独特的多特异性抗体砖变体。对于效应T细胞，发明人选择测试了选自抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD137抗体和无抗体的七种组合。对于靶B细胞，发明人选择测试选自抗CD19抗体、抗CD22抗体、抗CLL1抗体、抗CD123抗体和无抗体的15种组合。发明人使用凝胶电泳分析了105种不同的组合(图5b)。和以前一样，在抗体与砖物体结合后，观察到迁移距离的变化。完全组装的多变体砖的产率略有变化，但接近100％。最后，发明人使用NALM6 B细胞和在激活时表达萤光素酶的基因修饰的T细胞，在T细胞激活测定中测试了所述105种不同变体。由于发明人对由募集的B细胞对T细胞引起的激活感兴趣，因此发明人减去了仅携带针对T细胞的抗体的变体的荧光，以获得相对T细胞激活(图5c)。T细胞仅在抗CD3抗体存在时才被激活。对于具有额外的抗CD3、抗CD137或抗CD28抗体的变体，也观察到共刺激。此外，针对CD19抗原的B细胞抗体显示出最强的相对激活。这种方法允许发明人根据所有抗体组合激活T细胞的能力对它们进行排序(图5d)。最强的激活通过抗CD3抗体、抗CD28抗体和两个抗CD19抗体或一个抗CD119抗体和一个抗CD22抗体的组合来实现。
参考文献
在本说明书、权利要求书和/或附图中公开的本发明的特征可以单独地或以其任何组合的方式，作为用于以各种形式实现本发明的材料。
Claims (16)
1.一种核酸纳米结构，其包含一个或多个、优选地至少两个靶向剂和多个染料分子、优选地至少10个染料分子、更优选地至少20个染料分子、甚至更优选地至少30个染料分子。
2.根据权利要求1所述的核酸纳米结构，其中所述一个或多个靶向剂独立地选自抗体或其抗原结合片段、抗原结合肽、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、单链Fv片段、(scFv)2、四抗体、三抗体、二硫键稳定性Fv(dsFv)、Fc结构域、工程化Fc结构域、DNA适体、RNA适体、肽核酸(PNA)、多肽、肽、糖蛋白、肽模拟物、anticalin、Affilin、Affimer、Affitin、Alphabody、纳米抗体、DARPin、受体配体、受体、T细胞受体(TCR)样抗体、MHC、pMHC、受体结构域及其片段，
优选独立地选自抗体或其抗原结合片段、抗原结合肽、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、单链Fv片段、(scFv)2、四抗体、三抗体、二硫键稳定性Fv(dsFv)、Fc结构域、工程化Fc结构域、TCR样抗体、MHC、pMHC、受体配体及其片段。
3.根据权利要求1或2所述的核酸纳米结构，其中所述染料分子独立地选自有机荧光团，例如花青染料、Alexa Fluor染料、Atto染料和FITC；量子点；荧光蛋白，例如GFP、YFP、RFP、APC和EGFP；核酸染料，例如Hoechst、DAPI、SYTOX Blue、色霉素A3、光神霉素、YOYO-1、溴化乙锭、吖啶橙、SYTOX Green、TOTO-1、碘化丙啶、LDS 751和7-AAD；呫吨衍生物，例如荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、曙红和德克萨斯红；花青衍生物，例如花青、吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫杂羰花青和部花青；方酸菁衍生物和环取代的方酸菁，例如Seta和Square染料；萘衍生物；香豆素衍生物；噁二唑衍生物，例如吡啶并噁唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑；蒽衍生物，例如DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK Orange；芘衍生物，例如级联蓝；噁嗪衍生物，例如尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫和噁嗪170；吖啶衍生物，例如二氨基吖啶、吖啶橙和吖啶黄；芳基次甲基衍生物，例如金胺、结晶紫和孔雀绿；四吡咯衍生物，例如卟吩、酞菁和胆红素；和二吡咯亚甲基衍生物，例如BODIPY、aza-BODIPY。
4.根据前述权利要求中任一项所述的纳米结构，其中所述一个或多个、优选地至少两个靶向剂以距所述纳米结构表面3nm至15nm、优选地7nm至9nm的距离和/或以距所述纳米结构的角<5nm、优选地<2nm的距离附连到所述纳米结构，例如通过接头附连。
5.一种组合物，优选为药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的核酸纳米结构，任选地还包含药学上可接受的赋形剂。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的纳米结构或根据权利要求5所述的组合物，其用于医学，优选地用于医学成像。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的纳米结构或根据权利要求5所述的组合物，其用于预防、治疗和/或诊断疾病的方法，所述疾病选自增殖性疾病如癌症、血管疾病、肌肉骨骼障碍、免疫障碍如自身免疫疾病、传染性障碍例如病毒性疾病如人免疫缺陷病毒(HIV)感染、代谢障碍和/或糖尿病。
8.一种标记样品中的靶标的方法，优选为标记样品中的靶标的体外和/或离体方法，包括下述步骤：
i)提供样品，
ii)将所述样品与权利要求1-4中任一项所定义的纳米结构接触，
iii)任选地，定性或定量确定所述样品中的标记的靶标，其中优选地所述确定使用流式细胞术、显微术例如荧光显微术、荧光成像、比色法和/或测序例如qPCR来进行。
9.权利要求1-4中任一项所述的纳米结构作为染色剂，优选地作为体外和/或离体染色剂，例如作为体外和/或离体细胞染色剂的用途。
10.一种试剂盒，其包含：
i)权利要求1-4中任一项所定义的纳米结构；
ii)纳米结构，其包含至少一个第一偶联位点和至少一个第二偶联位点，其中所述第一偶联位点被配置成结合多个染料分子、优选地至少10个染料分子、更优选地至少20个染料分子中的至少一个染料分子，并且其中所述第二偶联位点被配置成结合一个或多个、优选地至少两个靶向剂，
多个染料分子，其被配置成结合到所述第一偶联位点，
一个或多个、优选地至少两个靶向剂，其被配置成结合到所述第二偶联位点；和/或
iii)至少一个支架链和多个单链寡核苷酸装订链，其中每个装订链与至少一个支架链至少部分互补，并且其中每个所述装订链被配置成在至少一个位置、优选地在两个或更多个不同位置与所述至少一个支架链中的至少一者结合，其中所述至少一个支架链被折叠和/或排布，以便形成所需纳米结构，
还包含多个染料分子，其被配置成结合到支架链或装订链的至少一个第一偶联位点，和
至少一个靶向剂，其被配置成结合到支架链或装订链的至少一个第二偶联位点。
11.一种制备权利要求1-4中任一项所述的纳米结构的方法，包括下述步骤：
i)提供核酸纳米结构、靶向剂和多个染料分子，
ii)获得包含所述靶向剂和所述多个染料分子的核酸纳米结构，优选地通过所述纳米结构的自组装获得。
12.一种鉴定具有所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合的方法，其中所述方法包括下述步骤：
a)提供至少一个核酸纳米结构、优选核酸纳米结构文库，其中所述纳米结构包含至少两种靶向剂的靶向剂组合，
其中任选地，所述至少两种靶向剂具有规定的空间组织，
b)将样品、优选细胞与所述纳米结构接触，
c)定性或定量确定所述样品中对所述纳米结构的响应，其中所述响应指示了所述所需性质、所需效果和/或所需空间组织，
d)通过鉴定包含具有所述所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合的纳米结构，来鉴定具有所述所需性质、所需效果和/或所需空间组织的靶向剂组合，
其中所述所需性质是
1)对靶标、优选受体或配体的亲和性或特异性，
2)生物分布特性和/或药代动力学特性，
其中所述所需效果是
3)通过受体聚集的细胞应答，
4)细胞和/或受体激活，
5)细胞和/或受体抑制，
6)受体和/或纳米结构内化的激活或抑制，和/或
7)细胞的聚集，优选为诱导免疫细胞激活的细胞的聚集，
和/或其中所述所需空间组织是
8)表位至细胞表面距离，例如受体高度，和/或
9)表位至表位距离，例如受体接近度。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述纳米结构还包含至少一个染料分子，和/或其中所述纳米结构是权利要求1至4中任一项所述的纳米结构。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述步骤c)中定性或定量确定响应使用任何荧光测量例如流式细胞术、荧光显微术或通过微孔板读板器、发光测量、显微术、比色测量和/或细胞表面标志物染色来进行。
15.一种生产包含双特异性或多特异性靶向剂的分子、优选双特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段的方法，包括下述步骤：
i)执行权利要求12-14中任一项所定义的鉴定靶向剂组合的方法，和
ii)生产具有在所述鉴定靶向剂组合的方法的步骤d)中鉴定到的靶向剂组合的包含双特异性或多特异性靶向剂的分子、优选双特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段。
16.一种筛选样品中具有至少两个靶分子的靶标的方法，包括下述步骤：
1)提供包含至少两种靶向剂的靶向剂组合的核酸纳米结构，
其中任选地，所述纳米结构还包含至少一个染料分子和/或所述纳米结构是权利要求1至4中任一项所述的纳米结构，
2)将所述纳米结构与待测试具有至少两个靶分子的靶标的样品接触，
3)定性或定量确定所述样品中的靶标。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP21167874.3 | 2021-04-12 | ||
| EP21167874.3A EP4075140A1 (en) | 2021-04-12 | 2021-04-12 | Nucleic acid origami platforms and their uses |
| PCT/EP2022/059779 WO2022218994A1 (en) | 2021-04-12 | 2022-04-12 | Nucleic acid origami platforms and their uses |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117500531A true CN117500531A (zh) | 2024-02-02 |
Family
ID=75477949
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202280041300.7A Pending CN117500531A (zh) | 2021-04-12 | 2022-04-12 | 核酸折纸平台及其用途 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240226344A1 (zh) |
| EP (2) | EP4075140A1 (zh) |
| CN (1) | CN117500531A (zh) |
| WO (1) | WO2022218994A1 (zh) |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150017201A1 (en) * | 2013-03-15 | 2015-01-15 | Regents Of The University Of Minnesota | Novel nicotine dna vaccines |
| US20210145972A1 (en) * | 2017-05-26 | 2021-05-20 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Nanostructure with a nucleic acid scaffold and virus-binding peptide moieties |
| CN107397960A (zh) * | 2017-07-18 | 2017-11-28 | 中国科学院上海应用物理研究所 | 一种脑靶向制剂及其制备方法和应用 |
| WO2019109707A1 (en) * | 2017-12-07 | 2019-06-13 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Dna nanorobot and methods of use thereof |
| WO2020102624A1 (en) * | 2018-11-15 | 2020-05-22 | Ohio State Innovation Foundation | Dna-cage erasable labels for fluorescence-based pathology |
| US20220195016A1 (en) * | 2019-04-18 | 2022-06-23 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Biological and synthetic molecules inhibiting respiratory syncytial virus infection |
-
2021
- 2021-04-12 EP EP21167874.3A patent/EP4075140A1/en not_active Withdrawn
-
2022
- 2022-04-12 WO PCT/EP2022/059779 patent/WO2022218994A1/en active Application Filing
- 2022-04-12 US US18/286,003 patent/US20240226344A1/en active Pending
- 2022-04-12 EP EP22722272.6A patent/EP4323771A1/en active Pending
- 2022-04-12 CN CN202280041300.7A patent/CN117500531A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4323771A1 (en) | 2024-02-21 |
| US20240226344A1 (en) | 2024-07-11 |
| WO2022218994A1 (en) | 2022-10-20 |
| EP4075140A1 (en) | 2022-10-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9765341B2 (en) | DNA origami devices | |
| Ku et al. | Nucleic acid aptamers: an emerging tool for biotechnology and biomedical sensing | |
| Fouz et al. | Bright fluorescent nanotags from bottlebrush polymers with DNA-tipped bristles | |
| KR102557419B1 (ko) | 단백질-단백질 상호작용의 초해상도 영상화 | |
| US9310372B2 (en) | Method for the selection of specific affinity binders by homogeneous noncompetitive assay | |
| US20230314445A1 (en) | Methods for identification of antigen-binding molecules | |
| KR20150080417A (ko) | 링커를 통해 연결된 동일한 표적 물질에 결합하는 항체 및 앱타머를 포함하는 집게 분자 및 이의 용도 | |
| EP3149167B1 (en) | Aptamer targeting mage-a3 peptide and uses thereof | |
| JP2023082150A (ja) | 二重特異性および多重特異性生物学的物質の区画化されたアッセイ | |
| Kim et al. | Split-enzyme immunoassay to monitor EGFR-HER2 heterodimerization on cell surfaces | |
| Fryer et al. | Gigavalent display of proteins on monodisperse polyacrylamide hydrogels as a versatile modular platform for functional assays and protein engineering | |
| WO2018164262A1 (ja) | 治療有効性の予測方法 | |
| CN117500531A (zh) | 核酸折纸平台及其用途 | |
| Li et al. | Construction of a Mass-Tagged Oligo Probe Set for Revealing Protein Ratiometric Relationship Associated with EGFR–HER2 Heterodimerization in Living Cells | |
| US20130130349A1 (en) | Cooperative and dynamic assembly of affinity complexes | |
| WO2022148491A1 (zh) | 一种可组装蛋白原件及其用途 | |
| US20220218841A1 (en) | Polynucleotide-linked bioconjugates and methods of making and using | |
| KR20230124692A (ko) | 조건부 세포 커넥터 | |
| CN109943572B (zh) | 生产抗体片段的方法 | |
| US20180171287A1 (en) | Methods of Measuring Cell Purity for Making Quality Control Determinations and Related Compositions | |
| EP3655548A1 (en) | Methods and compositions for viral nano-fish | |
| Brinza | Beyond the Cycle: Investigating the Sequencing, Binding Affinity, and Utility of Aptamers Selected with CE-SELEX | |
| Kiriako | Understanding the roles of avidity in biological systems | |
| Dynan et al. | Understanding and re-engineering nucleoprotein machines to cure human disease | |
| JP2004503214A (ja) | 細胞結合核酸分子（アプタマー） |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |