CN108226535A - 检测粘附分子和细胞因子含量的系统在检测复治肺结核患者治疗效果中的应用 - Google Patents
检测粘附分子和细胞因子含量的系统在检测复治肺结核患者治疗效果中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了检测粘附分子和细胞因子含量的系统在检测复治肺结核患者治疗效果中的应用。本发明公开的粘附分子和细胞因子为CD54、IL–2、IL‑7和IL‑12p。实验证明,复治肺结核患者在治疗后,血清中的粘附分子CD54以及细胞因子IL‑2、IL‑7、IL‑12p在血清中的含量均呈上升趋势。表明,粘附分子CD54以及细胞因子IL‑2、IL‑7、IL‑12p可以作为复治肺结核患者在治疗过程中治疗效果和免疫状态的潜在血清标志物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中,检测粘附分子和细胞因子含量的系统在检测复治肺结核患者治疗效果中的应用。
背景技术
结核病是一种由结核分枝杆菌(M.tb)感染引起的传染病。根据世界卫生组织2016年的报告,有1 040万新的结核病例和140万结核死亡,只有57%的肺结核患者(肺结核)在细菌学检查得到证实。在中国,据报道,每年有20%的患者是初次治疗失败和复发的患者,这被归类为复治肺结核患者。其原因可能是这些患者接受了不合适的化疗,或受到具有较强毒力或耐药性的M.tb株的感染。此外,这些患者可能有严重的免疫缺陷或免疫紊乱。因此,这些患者的免疫学诊断和治疗监测是非常必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何确定复治肺结核患者的治疗效果。
本发明首先提供了检测蛋白质含量的系统的下述任一应用:
A1)在制备检测或辅助检测复治肺结核患者治疗效果产品中的应用;
A2)在制备筛查或辅助筛查复治肺结核患者产品中的应用;
A3)在制备复治肺结核患者预后或辅助预后产品中的应用;
A4)在检测或辅助检测复治肺结核患者治疗效果中的应用;
A5)在筛查或辅助筛查复治肺结核患者中的应用;
A6)在复治肺结核患者预后或辅助预后中的应用;
所述蛋白质为粘附分子CD54以及细胞因子IL–2、IL-7和IL-12p。
上述应用中,所述检测蛋白质含量的系统可为利用现有技术中的方法检测所述蛋白质含量所需的试剂和/或仪器,如CBA Flex Sets(BD,US)和/或CBA Human SolubleProtein Master Buffer Kit(BD,US)。
本发明还提供了下述任一应用:
N1)以所述蛋白质作为复治肺结核患者治疗效果标志物的检测或辅助检测复治肺结核患者治疗效果方法中所用的系统在下述a1)或a2)中的应用:
a1)在制备检测或辅助检测复治肺结核患者治疗效果产品中的应用;
a2)在检测或辅助检测复治肺结核患者治疗效果中的应用;
N2)以所述蛋白质作为复治肺结核患者标志物的筛查或辅助筛查复治肺结核患者方法中所用的系统在下述b1)或b2)中的应用:
b1)在制备筛查或辅助筛查复治肺结核患者产品中的应用;
b2)在筛查或辅助筛查复治肺结核患者中的应用;
N3)以所述蛋白质作为复治肺结核患者预后标志物的复治肺结核患者预后或辅助预后方法中所用的系统在下述c1)或c2)中的应用:
c1)在制备复治肺结核患者预后或辅助预后产品中的应用;
c2)在复治肺结核患者预后或辅助预后中的应用。
本发明还提供了具有m1)、m2)或m3)用途的产品,为检测所述蛋白质含量的系统;
m1)检测或辅助检测复治肺结核患者治疗效果;
m2)筛查或辅助筛查复治肺结核患者;
m3)复治肺结核患者预后或辅助预后。
上文中,所述粘附分子和所述细胞因子含量可为血清中所述粘附分子和所述细胞因子的含量。
具体的,根据所述蛋白质确定复治肺结核患者在治疗过程中治疗效果的具体方法如下:如待测复治肺结核患者在治疗过程中CD54、IL–2、IL-7和IL-12p这四种蛋白质中至少有一个在血清中的含量高于未治疗时,则对所述患者的治疗具有治疗效果;如待测复治肺结核患者在治疗过程中CD54、IL–2、IL-7和IL-12p这四种蛋白质在血清中的含量均不高于未治疗时,则对所述患者的治疗没有治疗效果。
本发明还提供了非诊断目的的复治肺结核患者治疗效果相关分子特征谱的构建方法,所述方法包括:分别对不同复治肺结核患者治疗效果血液中的蛋白质进行定量分析,根据分析结果获得复治肺结核患者治疗效果相关分子特征谱;所述复治肺结核患者治疗效果相关分子特征谱为所述蛋白质。
上述方法中,所述分别对不同复治肺结核患者治疗效果血液中的蛋白质进行定量分析具体可利用CBA Flex Sets(BD,US)和/或CBA Human Soluble Protein MasterBuffer Kit(BD,US)进行。
本发明还提供了非诊断目的的复治肺结核患者相关分子特征谱的构建方法,所述方法包括:分别对复治肺结核患者和非复治肺结核患者血液中的蛋白质进行定量分析,根据分析结果获得复治肺结核患者相关分子特征谱;所述复治肺结核患者相关分子特征谱为所述蛋白质。
上述方法中,所述分别对复治肺结核患者和非复治肺结核患者血液中的蛋白质进行定量分析具体可利用CBA Flex Sets(BD,US)和/或CBA Human Soluble Protein MasterBuffer Kit(BD,US)进行。
本发明还提供了非诊断目的的复治肺结核患者预后相关分子特征谱的构建方法,所述方法包括:分别对不同预后复治肺结核患者血液中的蛋白质进行定量分析,根据分析结果获得复治肺结核患者预后相关分子特征谱;所述复治肺结核患者预后相关分子特征谱为所述蛋白质。
上述方法中,所述分别对不同预后复治肺结核患者血液中的蛋白质进行定量分析具体可利用CBA Flex Sets(BD,US)和/或CBA Human Soluble Protein Master BufferKit(BD,US)进行。
实验证明,复治肺结核患者在治疗后,血清中的粘附分子CD54和细胞因子IL-2、IL-7和IL-12p在血清中的含量均呈上升趋势。表明,粘附分子CD54以及细胞因子IL-2、IL-7和IL-12p可以作为复治肺结核患者在治疗过程中治疗效果和免疫状态的潜在血清标志物。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
实施例1、用于监测复治肺结核患者治疗疗效的粘附分子和细胞因子
一、研究对象:
结核病组:215例活动性肺结核患者,均来自中国人民解放军第三〇九医院结核病研究所,年龄18~65岁(34.1岁±12.3岁),男女性别比为153:62。所有患者均为复治涂阳肺结核患者,痰涂片阳性。肺结核合并肝病、肾脏疾病、过敏性疾病、自身免疫性疾病、内分泌和代谢、血液、神经系统疾病、恶性肿瘤、HIV/AIDS的患者和长期使用免疫抑制剂的患者被排除在外。结核病患者根据《中国结核病控制计划实施指南》(2008年、卫生部疾病预防控制局、医务司)和《结核病治疗临床指南》(2005年中国医学协会)接受抗结核治疗。在整个研究过程中,215例患者,其中有97人已经完成了4个时间点测量(平均年龄为33.8岁),包括治疗前和治疗6个月数据的测量,利用TB-6m组代表97例患者接受6个月的抗结核化疗后检测结果,TB-0m组代表97例患者在抗结核化疗前的检测结果。
抗结核化疗的方法按照统一化疗方案(3HRZELfx/5HRLfx(异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、左氧氟沙星))中国结核病防治规划实施工作指南(2008年版,卫生部疾病预防局,医政司编)临床诊疗指南结核病分册(2005年,中华医学会编)进行。
健康对照组(Health Control,HC):中国人民解放军第三〇九医院健康体检中心健康体检者30例,年龄28~42岁(均数±SD,38.1±7.3),男女性别比为7:23,均接受了全面的体格检查,没有结核病相关的任何影像学表现或临床症状。
本研究由中国人民解放军第三〇九医院伦理委员会审查批准。参加这项研究的受试者均知情同意。
二、流式细胞术检测血清粘附分子和细胞因子谱
试剂盒:CBA Flex Sets(BD,US),CBA Human Soluble Protein Master BufferKit(BD,US)。
采集各研究对象的外周血血清标本,检测如下18种粘附分子和细胞因子:interleukin-1(IL-1),interleukin-2(IL-2),interleukin-4(IL-4),interleukin-5(IL-5),interleukin-6(IL-6),interleukin-7(IL-7),interleukin-8(IL-8),interleukin-9(IL-9),interleukin-10(IL-10),interleukin-12P70(IL-12P70,IL-12P),interleukin-17(IL-17),interleukin-21(IL-21),CD54(ICAM-1),MIG,CD62E(E-Selectin),TGF-β,IFN-γ和RANTES(CCL5)。
CBA Flex Sets试剂盒提供了18个捕获珠的混合物,涂覆了特定于每个粘附分子和细胞因子的抗体,并具有不同的荧光强度。具体操作流程依据试剂盒说明书进行:首先将涂有18个特定捕获抗体的珠子混合,随后,将20μl的混合捕获珠和50μl的血清样品或标准稀释混合在暗处孵育2h,将20μl藻红蛋白(PE)检测试剂加入到每个试管中,在黑暗中室温培养箱中孵育2h。样品用1ml洗涤缓冲液(200g)洗涤5分钟,离心。将珠粒重悬于100μl增强灵敏度检测试剂中,在黑暗中室温孵育1h,最后加入200μl洗涤缓冲液。在BD FACSCalibur流式细胞仪上检测样品,采集数据,用BD FCAP ArrayTM软件进行数据分析。单个粘附分子或细胞因子浓度由它们的荧光强度指示。细胞因子标准品倍比稀释,构建标准曲线,从而获得每个细胞因子在血清中的蛋白浓度。
统计分析:
利用Graphpad Prism5.0软件绘制图形,进行统计分析。中值数及四分位范围(位差)用于描述性统计。采用Mann–Whitney U检验和Wilcoxon秩检验比较不同组间的差异。p值<0.05具有统计学意义。
三、结果
分析215例复治涂阳肺结核患者与30例健康对照者的外周血清中18种细胞因子和粘附分子的含量。
1、复治肺结核患者抗结核化疗期间血清细胞因子和粘附分子的动态变化
与TB-0m组相比,TB-6m组的CD54、IL-2、IL-7和IL-12p在血清中的含量均呈上升趋势(表1)。其中血清中CD54在TB-6m组中的含量显著高于TB-0m组(p<0.05);IL-2和IL-12p在TB-6m组中的含量显著高于健康对照组和TB-0m组(p<0.05);与TB-0m组相比,TB-6m组中IL-7的含量显著升高(p<0.05)。
表1复治肺结核患者治疗过程中细胞因子和粘附分子动态变化情况
注:“显著性分析”列中,6M表示TB-6M,TB表示TB-0m。
通过综合分析,IL–7在TB-6m组的含量与健康对照组无显著差异,且显著高于TB-0m组,CD54和IL-2在整个治疗期间保持上升趋势。
因此,粘附分子CD54与细胞因子IL-2、IL-7和IL-12p可以作为复治肺结核患者在治疗过程中治疗效果和免疫状态的潜在血清标志物。
根据CD54、IL-2、IL-7和IL-12p确定复治肺结核患者在治疗过程中治疗效果的具体方法如下:如待测复治肺结核患者在治疗过程中CD54、IL-2、IL-7和IL-12p这四种蛋白质中至少有一个在血清中的含量高于未治疗时,则对该患者的治疗具有治疗效果;如待测复治肺结核患者在治疗过程中CD54、IL-2、IL-7和IL-12p这四种蛋白质在血清中的含量均不高于未治疗时,则对该患者的治疗没有治疗效果。
Claims (10)
1.检测蛋白质含量的系统的下述任一应用:
A1)在制备检测或辅助检测复治肺结核患者治疗效果产品中的应用;
A2)在制备筛查或辅助筛查复治肺结核患者产品中的应用;
A3)在制备复治肺结核患者预后或辅助预后产品中的应用;
A4)在检测或辅助检测复治肺结核患者治疗效果中的应用;
A5)在筛查或辅助筛查复治肺结核患者中的应用;
A6)在复治肺结核患者预后或辅助预后中的应用;
所述蛋白质为CD54、IL–2、IL-7和IL-12p。
2.以权利要求1中所述蛋白质作为复治肺结核患者治疗效果标志物的检测或辅助检测复治肺结核患者治疗效果方法中所用的系统在下述a1)或a2)中的应用:
a1)在制备检测或辅助检测复治肺结核患者治疗效果产品中的应用;
a2)在检测或辅助检测复治肺结核患者治疗效果中的应用。
3.以权利要求1中所述蛋白质作为复治肺结核患者标志物的筛查或辅助筛查复治肺结核患者方法中所用的系统在下述b1)或b2)中的应用:
b1)在制备筛查或辅助筛查复治肺结核患者产品中的应用;
b2)在筛查或辅助筛查复治肺结核患者中的应用。
4.以权利要求1中所述蛋白质作为复治肺结核患者预后标志物的复治肺结核患者预后或辅助预后方法中所用的系统在下述c1)或c2)中的应用:
c1)在制备复治肺结核患者预后或辅助预后产品中的应用;
c2)在复治肺结核患者预后或辅助预后中的应用。
5.根据权利要求1-4中任一所述应用,其特征在于:权利要求1中所述蛋白质含量为血清中所述蛋白质的含量。
6.具有m1)、m2)或m3)用途的产品,为检测权利要求1中所述蛋白质含量的系统;
m1)检测或辅助检测复治肺结核患者治疗效果;
m2)筛查或辅助筛查复治肺结核患者;
m3)复治肺结核患者预后或辅助预后。
7.根据权利要求6所述产品,其特征在于:权利要求1中所述蛋白质含量为血清中所述蛋白质的含量。
8.复治肺结核患者治疗效果相关分子特征谱的构建方法,包括:分别对不同复治肺结核患者治疗效果血液中的蛋白质进行定量分析,根据分析结果获得复治肺结核患者治疗效果相关分子特征谱;所述复治肺结核患者治疗效果相关分子特征谱为权利要求1中所述蛋白质。
9.复治肺结核患者相关分子特征谱的构建方法,包括:分别对复治肺结核患者和非复治肺结核患者血液中的蛋白质进行定量分析,根据分析结果获得复治肺结核患者相关分子特征谱;所述复治肺结核患者相关分子特征谱为权利要求1中所述蛋白质。
10.复治肺结核患者预后相关分子特征谱的构建方法,包括:分别对不同预后复治肺结核患者血液中的蛋白质进行定量分析,根据分析结果获得复治肺结核患者预后相关分子特征谱;所述复治肺结核患者预后相关分子特征谱为权利要求1中所述蛋白质。
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