CN101421617A - 结核相关免疫恢复综合征（irs）的诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在结核(TB)感染病人及在HIV(人类免疫缺陷病毒)重叠感染病人中结核相关免疫恢复综合征(TB－IRS)的诊断方法和诊断试剂盒，其包括检测Th1应答的急性增加，该Th1应答是在暴露于称为结核菌素或PPD(纯化蛋白衍生物)的分枝杆菌提取物和16kDa蛋白，而非暴露于来源于结核分枝杆菌的ESAT－6或CFP－10两个抗原后进行检测。

Description

结核相关免疫恢复综合征（IRS）的诊断方法
本发明涉及在结核(TB)感染病人及在HIV(人类免疫缺陷病毒)重叠感染病人中结核相关免疫恢复综合征(Immune RestorationSyndrome associated with tuberculosis，TB-IRS)的诊断方法和诊断试剂盒，其包括检测急性Th1应答，在暴露于称为结核菌素或PPD(纯化蛋白衍生物)的分枝杆菌提取物和/或16kDa蛋白，而非暴露于来源于结核分枝杆菌的ESAT-6或CFP-10抗原后进行检测。
背景技术
免疫恢复综合征(IRS)最初在接受齐多夫定单药治疗的感染鸟分枝杆菌复合菌组(Mycobacterium avium complex)的HIV感染病人中得到描述[1]，在高效抗逆转录病毒治疗(HAART)时代，它在结核患者中发生的频率极高(29％-36％)[2]。IRS也发生在HIV阴性病人起始TB治疗后，尽管频率较低。
经典地，IRS发生在未进行过HAART治疗的结核(TB)和HIV重叠感染病人中，在HIV感染晚期，当两种治疗同时起始或起始两种治疗的间隔时间不长时。通常，临床症状包括发热、淋巴结病、呼吸困难和其它TB的最初症状[2]。有人提出定义IRS的主要标准[3]是任何基础性的机会性事件包括非典型的出现机会性感染(OI)或病人对HAART反应的肿瘤(血浆HIV RNA水平降低大于1log10拷贝/ml)，没有任何其它解释(药物抵抗，其它OI)以及有免疫恢复的证据，最后一项作为次要标准。
然而，IRS引出了三个临床相关的问题：首先，诊断困难，因应区别IRS与治疗失败或抵抗或其它机会性疾病；其次，在有些危及生命的病案中，IRS治疗仍是基于类固醇的试验性治疗，而这在此类免疫妥协的病人中是不易引入的；第三，确定IRS危险度系数有助于临床医生确定治疗策略，即延迟或不引入HAART[4]。
因此，当前仍强烈需要对IRS可靠的诊断试验。IRS的病理生理学仍未完全阐明。已证明在IRS过程中产生急性促炎症反应细胞因子(IL-6)[5、6]，但其来源未知。此外，一个有力的主导性假说认为IRS应与HAART降低血浆病毒载量(VL)后，分枝杆菌特异的T淋巴细胞与记忆性T细胞再循环或增殖的反应有关[7、8]。除了对PPD的DTH皮试恢复之外，这一假说仅是建议，并未证实[9]。相似地在HIV阴性TB感染病人中，假说认为IRS反映了TB特异性Th1免疫的加重。
与本发明相关，我们对HIV和TB重叠感染的病人进行了前瞻性多中心研究。我们发现在IRS过程中，分枝杆菌特异性的(PPD)Th1产生IFN-γ的细胞急剧增加，而检测的CMV-、HIV p24-特异性应答作为对照并未增加。此外，仅有极少的IRS+病人在IRS过程中有ESAT-6特异性应答，尽管应答水平不高；且IRS-病人并不发生急性PPD特异性应答。这些发现与PPD特异性Th1细胞因子如IFN-γ、IL-2、IL-12、IP10、MIG的峰值相关，但我们并未检测Th2细胞因子；也检测了其它炎症趋化因子或细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、RANTES、MCP-1。我们也鉴定出对16kDa蛋白抗原刺激应答的Th1特异性细胞因子的急性释放。
因而，在此我们提供一种新的TB-IRS诊断试验，其包括在HIV和TB重叠感染的病人中以及在仅感染TB的病人中检测对分枝杆菌抗原的Th1应答的急性加重。
发明内容
在第一个实施方案中，本发明的目的在于提供结核分枝杆菌(TB)重叠感染病人中以及仅感染结核的病人中体外诊断免疫恢复综合征(IRS)的方法，包括以下步骤：
a)在培养基中将所述的病人的外周血单核细胞(PBMC)或全血与选自称为PPD(纯化蛋白衍生物)的分枝杆菌提取物的分枝杆菌抗原和/或16kDa蛋白(SEQ ID No.1)共同培养，
b)在培养基中将所述的病人的外周血单核细胞(PBMC)或全血与至少一个来源于结核分枝杆菌的抗原共同培养作为阴性对照，该抗原选自ESAT-6(SEQ ID No.2)、CFP-10(SEQ ID No.3)或85B(SEQID No.4)，以及
c)对比步骤b)中该分枝杆菌抗原，检测步骤a)中对该分枝杆菌抗原的Th1应答水平，
其中与对b)中限定的抗原相比，或与未刺激细胞相比或与非分枝杆菌抗原刺激的对照细胞相比，Th1应答增加超过250％，或在上述比较中，同一个时间点测量的对a)中限定的抗原的Th1应答有强反应性时表示IRS。
在优选实施方案中，步骤a)和步骤b)同时进行。
在本发明的方法的另一优选实施方案中，与未刺激细胞相比或与非分枝杆菌抗原刺激的对照细胞相比，同一个时间点测量的，对步骤b)中限定的该抗原之一的Th1应答或反应性的增加是零或最小。
本试验基于我们下述发现，即在TB-IRS中，特异性对PPD及16kDa蛋白，而不是对其它分枝杆菌抗原诸如ESAT-6、CFP-10或85B，Th1应答有急性增加。此处急性增加应理解为Th1应答与对照细胞相比，典型增加超过250％或者甚至超过背景的量包括在500％到5000％之间或者至少超过250％(例如超过300％、400％或甚至500％)。“零或最小反应性”，应理解为与对照细胞相比，Th1的应答增加不显著，例如低于200％，典型的低于100％或50％。
本领域技术人员可通过用对步骤a)限定的抗原的Th1试验(例如象IFN-γ释放试验一样的细胞因子释放试验)获得的数量测量结果除以对步骤b)限定的抗原获得的数量测量结果或者除以对未刺激细胞或与非分枝杆菌抗原刺激的对照细胞获得的数量测量结果从而计算出上述以％表示的增加。
ESAT-6、85B和CFP-10是从结核分枝杆菌(Mtb)中分离的抗原而PPD由Mtd和BCG两者的提取物组成。(BCG，卡介苗用作抗Mtb的通用疫苗，是本领域熟知的，可从包括位于丹麦哥本哈根的国家血清研究中心市场销售的PPD在内的多种商业来源获得。PPD或结核菌素是从Mtb和BCG混合物中提取蛋白获得，通常用于检测对BCG或Mtb产生的细胞免疫或者Th1应答的存在。例如，可通过ConnaughtLaboratories Limited从大量母料Connaught Tuberculin(CT68)制备的Tubersol
Figure A200680035722D0007142923QIETU
获得。ESAT-6蛋白是主要分泌抗原，从结核分枝杆菌短期培养滤液中纯化出来，如Harboe et al，1996；Sorensen et al，1995所描述的那样)。如此处所述，ESAT-6、CFP-10和85B可从细胞溶解产物中获得并纯化或通过重组技术获得。例如ESAT6可作为重组蛋白从国家血清研究中心获得。
来源于分枝杆菌提取物的结核菌素或PPD(纯化蛋白衍生物)与仅由位于结核分枝杆菌基因组内部基因编码并且不包含于BCG的ESAT-6(early secreted antigenic target 6，早期分泌抗原靶6)、CFP-10(culture filtrate protein 10，培养滤液蛋白10)和85B不同，因为PPD也包含和BCG次代菌株以及和一些没有或低病原性的非结核分枝杆菌菌种共有的其它抗原。
这些抗原的序列也显示在合并于此的序列表中。
当连续测量Th1应答不可行时，所述的试验基于在IRS过程中或紧接其后的单个时间点采集的单个血样，包括通过ELISPOT或任何检测Th1应答的测定法对抗原特异性T细胞进行定量，例如对步骤a)限定的抗原之一而不是步骤b)限定的抗原的产生IFN-γ的分枝杆菌特异的Th1细胞定量。
在此，强反应性定义为结果超过500SFC(ELIS斑点形成细胞)/106PBMC，例如对步骤a)限定的抗原，在减去单独根据细胞获得的平均背景后，SFC超过500、1000或2000或更高时，表示IRS；同时对ESAT-6、CFP-10、85B的SFC为零或最小，如SFC典型地包括在500到0之间/106PBMC。或者对步骤a)限定的抗原与步骤b)限定的抗原Th1应答比为250％或250％以上时，表示IRS。
优选地，单独根据细胞获得的平均背景等于或小于100SFC/106PBMC。
因此，a)抗原SFC除以无抗原SFC得到的百分比给出了表示TB-IRS的阈值，即超过250％，更特异地是超过500％。
因此，a)抗原SFC除以b)抗原SFC得到的百分比给出了表示TB-IRS的阈值，即超过250％。
ELISPOT方法可用任何其它检测Th1应答的方法代替，即通过ELISpot测量T细胞产生的其它Th1细胞因子或通过细胞内细胞因子染色法联合流式细胞计量术或荧光显微镜检查和定量法定量T细胞释放的Th1细胞因子。
本试验可选的或同时进行的方法可能包括收集步骤a)和b)中获得的上清液，定量步骤a)和b)中限定的抗原刺激细胞的培养上清液中至少一种Th1特异性细胞因子或IL-2、IL-2R、IL-12p40、IL-15、IL-17、IFN-γ、TNF-α、GMCSF、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、MIG、RANTES、IP-10并与未刺激细胞相比较。
可通过多路夹心免疫测定法或单个细胞因子特异性夹心免疫测定法来进行上述的分析。
在本发明的这些可选的或同时进行的试验的一个特别的方面中，定量至少一种Th1特异性细胞因子包括通过ELISA或RIA定量IFN-γ的产量。
优选地，步骤a)中外周血单核细胞培养约6到72小时。此外，有利地，步骤a)中外周血单核细胞与约1μg/ml所述的“步骤a)”抗原PPD和/或16kDa蛋白共同培养以及单独与约1μg/ml所述的“步骤b)”抗原ESAT-6重组蛋白共同培养。PBMC也可与CFP-10或85B共同培养作为阴性对照。
对照细胞选自无抗原或与非分枝杆菌抗原共同培养的细胞。例如，可用CMV提取物、HIV-1p24、植物血细胞凝集素。单独用培养基培养作为阴性对照来测量背景。
本发明的方法在TB过程中进行，特别是在有结核重叠感染的HIV阳性病人高效抗逆转录病毒治疗(HAART)过程中进行。更特异地，在同时接受或顺次接受HAART和结核治疗的病人中进行。
HAART是本领域熟知的，包括几个联合治疗的方案，即核苷类似物逆转录酶抑制剂(Nucleoside Analog Reverse Transcriptase Inhibitors，NARTIS或NRTIS)、非核苷逆转录酶抑制剂(NonNucleoside ReverseTranscriptase Inhibitors，NNRTIs)、及蛋白酶抑制剂(Protease inhibitors，PIs)或其它抑制HIV进入靶细胞的分子或抑制病毒DNA整合或任何其它能够显著阻止HIV复制和允许CD4 T细胞重建的新的抗病毒分子。
在第二个实施方案中，本发明的目的在于提供实施上述所定义方法的试剂盒。
因而，本发明涉及TB病人或结核(TB)和HIV重叠感染病人中免疫恢复综合征的诊断试剂盒，包括选自称为PPD(纯化蛋白衍生物)的分枝杆菌提取物的分枝杆菌抗原或/和16kDa蛋白(SEQ ID No.1)，以及至少一种选自ESAT-6(SEQ ID No.2)、CFP-10(SEQ ID No.3)或85B(SEQ ID No.4)的与Mtb毒性相关的结核分枝杆菌抗原。例如，该试剂盒包括PPD和ESAT-6或PPD、ESAT-6和CFP-10和/或85B。在另外一个例子中，该试剂盒包括16kDa蛋白和ESAT-6或CFP-10和85B中至少其中一个。
此外，该试剂盒可包括至少一种结合到固体支持物上的Th1免疫应答特异性的抗细胞因子/趋化因子抗体，如抗IFN-γ抗体。该试剂盒的固体支持物可为ELISPOT板和/或ELISA板。
在第三个实施方案中，本发明的目标是使用上述所定义的方法和试剂盒检测在HAART和结核治疗过程中的TB病人或结核(TB)和HIV重叠感染病人中的TB相关免疫恢复综合征(TB-IRS)。
附图说明
图1A-1D：有和无IRS病人的PPD特异性反应性。
左栏表示IRS+病人数据，右栏表示IRS-病人数据。
图1A：在所有IRS+和IRS-病人中40小时PPD(红色)或CMV(青色)刺激PBMC后进行ELISpot IFN-γ测定全部结果，以斑点形成细胞(SFC)/百万PBMC表示。
图1B、1C、1D：一例IRS+病人和一例IRS-病人的代表性结果。
图1B：用PPD、ESAT6(红色)和对照抗原(CMV、HIV1p24)(青色)刺激后IFN-γ ELISpot；图1C、1D：在两例代表性IRS+和IRS-病人中，PPD(红色)、CMV(青色)和培养基本身体外刺激PBMC后，用Luminex测定的产量：图1C：IFN-γ(■)、IL-2(★)、IP-10(▲)及图1D：TNF-α(★)、IL-6(■)、IL-1β(▲)。
图2：ELISpot定量PPD和天然16kDa蛋白(左)、ESAT-6(右)特异性细胞(SFC/106PBMC)的回归曲线(n＝37)。
图3：一例IRS+病人抗原特异性细胞数目的动态曲线，通过ELISpot测量，以斑点形成细胞(SFC)/106PBMC表示。TTB＝抗分枝杆菌治疗起始、TIRS＝IRS时间、M3＝HAART开始后3个月。
实施例1：HIV结核重叠感染病人中分枝杆菌特异性Th1细胞诱导IRS。
1-病人和方法
1.1.1 病人
在开始抗TB治疗时，前瞻地选入了29例连续TB-HIV重叠感染未治疗病人。选入标准为：HIV-1感染，以前未进行HAART，CD4计数低于200细胞/mm3，选入前抗TB治疗起始时间最多在一周内且有进行进一步起始HAART的适应症。
当证实结核分枝杆菌感染时(培养阳性或组织学发现)再次确认选入。在起始抗分枝杆菌治疗时(TBK)和HAART(M0)时以及HAART起始后1、3、6、12个月后(M1、3、6、12)对病人进行评价。此外，有IRS(IRS+)的病人在IRS时(TIRS)和20天后评价。IRS定义如下[3]：炎性反应复发(发热、CRP升高)、以前存在的损害增大，或无分枝杆菌抵抗、无阳性培养样品时发生新的损害(淋巴结、胸膜炎)、无其它诊断及对HAART有反应(HIV-RNA减少大于1log拷贝/ml)。在HAART起始后3个月内不出现IRS的病人定义为IRS-。
本研究为圣路易斯医院伦理委员会所接受并且所有病人都签署了征得其同意的文件。
1.1.2 方法
ELISPOT测定定量分枝杆菌特异性Th1细胞
在分枝杆菌提取物(PPD，1μg/ml；国家血清研究所，丹麦哥本哈根)和ESAT-6重组蛋白(1μg/ml，国家血清研究所友好提供，丹麦哥本哈根)刺激40小时后，抗原特异性产生IFN-γ的Th1细胞如[10]所描述的那样通过ELISpot在新鲜外周血单核细胞(PBMC)中进行前瞻性定量。对照包括CMV提取物(Behring)、HIV-1p24(Protein-Sciences)植物血细胞凝集素(Murex)和仅单独的培养基。通过ELISpot reader(Zeiss)进行点计数，数据以斑点形成细胞(SFC)/106PBMC表示。如果在减去单独根据细胞获得的平均背景后超过50SFC/106PBMC，则结果被认为是阳性。
细胞因子/趋化因子产量定量
使用如上相同抗原刺激新鲜PBMC产生细胞因子/趋化因子。在培养2天时收集培养上清液并冷藏保存。对四例病人(3例IRS+和一例IRS-)25个炎性和免疫调剂细胞因子/趋化因子(IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12p40、IL-13、IL-15、IL-17、IFN-γ、IFN-γ、TNF-α、GMCSF、MIP-1a、MlP-1β、MCP-1、MIG、RANTES、IP-10、Eotaxin)通过如[11]所发表的基于流式
Figure A200680035722D00121
计量技术(Luminex 100TM、Clinisciences)的多路夹心免疫测定法(Human 
Figure A200680035722D00122
Biosource)进行定量。通过BiosourceELISA试剂盒对相同上清液中的IFN-γ产量进行定量。
淋巴细胞表型分析
使用标准方法[7]通过四色流式细胞计量术对全血中CD4和CD8T淋巴细胞进行表型分析，使用如下抗体：抗-HLA-DR-FITC(Immunotech)、抗-CD25-PE(Becton Dickinson)、抗-CD4-PerCPCy5(Becton Dickinson)或抗-CD8-PerCP(Becton Dickinson)和抗-CD3-APC(Becton Dickinson)。用FACScalibur(Becton Dickinson)如描述的一样对染色细胞进行分析。
数据分析
在适当的地方用x2和Student t检验进行组间比较。
1.2结果
在病人开始抗-TB治疗时前瞻地选入了29例连续TB-HIV重叠感染未治疗病人。其中10例由于以下原因被排除了：四例未证实结核，五例退出，一例迅速转移到ICU。其它19例在起始HAART后进行跟踪最少3个月。其中七例(39％)在M0后中位数23(12-85)天内经历了IRS。IRS临床表现列在表1中。
表1：
 
病人 年龄 性别 TB部位 CD4/mm3 病毒载量log/ml 到HAART时间(天) HAART ΔCD4M3-M0 IRS临床表现   
1 30 女 胸膜炎 26 4.7 36 拉米夫定、替诺福韦、依法韦仑   86 腹膜炎、输卵管肉芽肿    
2 41 男 肝、淋巴结   9 5.7 15 齐多夫定、拉米夫定、 125 发烧、肝炎      
 
T20
3 43 男 肺 16 5.04 14 齐多夫定、拉米夫定、依法韦仑   15 心包炎
4 32 女 肺、骨髓、淋巴结、肝脏   15 6.5 63 拉米夫定、司他夫定、那非那韦   107 发烧、腹部淋巴结肿大    
5 35 男 肺、淋巴结 115 5.8 40 齐多夫定、拉米夫定、依法韦仑   94 发烧、腹膜炎、腹部淋巴结肿大    
6 32 女 肺 24 5.7 27 胞嘧啶核苷类似物、替诺福韦、依法韦仑   367 发烧、肺泡性肺炎、淋巴结肿大  
7 49 男 粟粒状、肝周淋巴结结     6 5 10 替诺福韦、胞嘧啶核苷类似物、LPV/RTV    14* 发烧、腹痛、淋巴结肿大
A 36 男 淋巴结 15 4.96 39 齐多夫定、拉米夫定、阿巴卡韦   71 无
B 38 男 肺、淋巴结、脾脏   8 5.6 20 齐多夫定、拉米夫定、那非那韦   53 无
C 38 男 肝、淋巴结、肺     22 5.7 27 齐多夫定、拉米夫定、依法韦仑   20 无
D 37 男 肺 32 5.4 14 齐多夫定、拉米夫定、依法韦仑   49 无
E 30 女 肺、肝、脾       43 4.8 61 齐多夫定、拉米夫定、阿巴卡韦   -7 无
F 26 女 腹部淋巴结、iliitis 47 5.0 76 齐多夫定、拉米夫定、LPV/rtv    47 无
G 34 男 腹部淋巴结   131 5.1 50 替诺福韦、拉米夫定、RTV、齐多夫定       80 无
H 31 男 肺 198 5.9 24 齐多夫定、拉米夫定、依法韦仑   -88 无
I 61 男 肺、淋巴结   166 5.5 111 拉米夫定、去羟肌苷、依法韦仑   18 无
J 52 男 肺、肝、脾       219 4.7 53 拉米夫定、阿巴卡韦、 80 无
 
阿巴卡韦、去羟肌苷  
K 35 男 肺 267 5.2 23 齐多夫定、拉米夫定、阿巴卡韦   74 无
L 63 男 淋巴结、肺、泌尿生殖系统   60 5.7 89 齐多夫定、拉米夫定、依法韦仑   354 无
三例病人接受口服类固醇治疗迅速恢复；在IRS时，其中一例暂时性停止了HAART。有IRS(IRS+)和无IRS(IRS-)病人在种族、年龄、性别、结核传播或TBK和M0的之间的时间(分别为27对45天，NS)方面无差异。在IRS+病人中M0时CD4计数中位数较低，虽然不显著(IRS+中位数32/mm3对IRS-60/mm3，p＝0.053)，并且在M3时提高到IRS+107/mm3对IRS-51/mm3(NS)。到达检测不到病毒载量的时间也无差异。
两组中产生IFN-γ的PPD特异性细胞数目在基线(M0)时无差异，但在IRS过程中它们的比例急剧增加，在7例IRS+病人中达到中位数2970SFC/106PBMC(区间616-3744)(图1A和B左栏)。这一爆炸性反应限定于此抗原，并不影响IRS+病人CMV特异性应答。IRS-病人未发生急性PPD特异性应答(中位数430SFC/106PBMC)，除了一例无临床IRS病人在M3急性增加超过1500SFC/106PBMC；因为附着性差HAART此时不再有效。此外，IRS-病人对CMV应答强于IRS+病人(中位数415SFC/106PBMC对150SFC/106PBMC)(图1A和1B)。
比较两种分枝杆菌抗原的反应性，我们发现，与PPD反应性相比，在IRS过程中仅3例IRS+病人有ESAT-6特异性阳性应答，频率为58、142、和318 SFC/106PBMC(图1B)。而且，仅两例无IRS病人，CD4都大于100/mm3，在跟踪过程中能识别ESAT-6抗原(资料未显示)。
对四例病人(3例IRS+，1例IRS-)也进行了广泛的蛋白质分析，来通过化学发光评价抗原刺激的PBMC上清液中25种炎性和免疫调节细胞因子/趋化因子的体外产量。在IRS过程中观察到两种不同的模式。第一种，PPD特异性的IFN-γ产生达到高峰与其它PPD特异性的Th-1相关细胞因子/趋化因子(IL-2、IL-12、IP10和MIG)一致(图1C)但未发生Th2细胞因子调节(IL-4、IL-5、IL-13、IL-15)。第二种，未刺激和抗原刺激细胞产生的炎性细胞因子/趋化因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、RANTES和MCP-1)(图1D)达到峰值。此外，在IRS+病人中，PPD特异性细胞因子/趋化因子产生远超过CMV特异性应答，而在IRS-病人中，CMV应答性占优势(图1D右)。
最后，全血四色流式细胞计量术分析CD3+CD4+和CD8+T细胞表明激活标记(HLA-DR、CD25+)的表达在IRS过程中急剧增加，遵守和PPD特异性产生IFN-γ的应答完全相同的动力学(数据未显示)。而如预料中的一样，这些标记在无IRS病人HAART过程中降低了。
1.3 结论
对起始抗TB和HAART治疗的HIV和TB重叠感染病人的连续性前瞻研究的结果提供了第一个证明即IRS确实与TB特异性的Th1应答的加重相关，伴有HAART允许的免疫重建过程中的促炎症反应事件。
众所周知，PPD特异性应答的恢复是HAART免疫重建的特征之一[12-15]。我们的前瞻性研究与其他人的不同点在于清楚的表明IRS描述的急性炎性临床症状同时伴有特别急剧、强烈和可重复的PPD特异性应答动态。这种突然应答仅在一例IRS过程中停止HAART并接受皮质激素的IRS+病人中未出现，而一例IRS-病人尽管没有IRS临床诊断也表现出相似的峰值，但其HAART观察及免疫-病毒学控制差。这些发现以前未被证实可能是由于以前的研究是回顾性研究的特点导致的。
此外，我们在此表明分枝杆菌特异性应答限制于PPD中包含的一些持续性抗原。确实，对分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6的弱应答暗示ESAT-6或者在抗分枝杆菌治疗后不持续，或者不刺激IRS涉及的T细胞。这一发现是诊断的关键，因为基于ESAT-6的新的结核诊断试验[16]可能已经错过这一急性应答。
产生IFN-γ的分枝杆菌特异性T细胞的急剧扩增与其它Th1和促炎症反应细胞因子/趋化因子的急性爆发相关，并且与Stone等人的结果一致[6]，表明IRS+病人中产生高水平的血清(seric？)IL-6。我们在此表明两种现象都与一般报道临床发现的突然发生有关[2]：淋巴结肿大和功能性肉芽肿形成[17]。因此我们提出IRS病理生理学的两个步骤：首先是无Th2平衡的PPD特异性Th1应答的过度恢复，是TB肉芽肿肿大损害的原因，迅速导致急性释放非特异性致炎细胞因子和趋化因子包括系统性炎症综合征。后一个发现支持在重度IRS案例中使用系统性抗炎和/或免疫抑制剂。
这一机制可能可以扩展到在抗TB治疗过程中非HIV病人中经历的相同的异常反应。在一些非HIV病人中，活跃的TB感染过程中丧失了IFN-γ分泌，在抗分枝杆菌治疗过程中重现[18]。这一对产生IFN-γ的去抑制可能特别强烈的与深度免疫抑制病人中免疫应答的恢复同时发生。没有任何已知的因子可以解释为何这一对分枝杆菌抗原的生理应答如此强烈，有时在某些病人中是危及生命的，但调节Th1功能的遗传因子可能决定了IRS的诱因，其严重性已被P.Price提出[19]。
结论是：对一些分枝杆菌抗原的Th1应答的急性加重似乎是导致HIV和TB重叠感染病人中IRS的原因。
实施例2：IRS与特异性对结核菌素(PPD)和16kDa蛋白的爆炸性Th1应答相关。
材料和方法
受试者和病人
CD4细胞计数中位数在基线(TB诊断时间，TTB)为58/mm3的十四例HIV和TB重叠感染的病人(7例IRS+和7例IRS-)，在基线或IRS(或其后)的时间(IRS+病人)，或HAART起始后的1到6个月(IRS-病人)时，接受抗分枝杆菌应答试验。
四例TB和HIV阴性接种BCG疫苗的受试者和一例未注射疫苗的受试者作为对照接受试验。四例HIV阴性但TB阳性的病人和一例HIV阳性但TB阴性的病人也作为对照接受试验。
测定法：
使用两个系列测定法对新鲜和冷冻的外周血单核细胞(PBMC)中产生IFN-γ的抗原特异性Th1细胞进行定量：
■ELISpot，如描述的那样(Martinez V，JID2005)，用包括植物凝集素(Murex)的对照抗原和单独的培养基刺激40小时后，进行ELISpot。使用ELISpot reader(Zeiss)进行点计数，数据以斑点形成细胞(SFC)/106PBMC表示。如果在减去单独根据细胞获得的平均背景后超过50SFC/106PBMC，则结果被认为是阳性。
■在使用或不使用PPD(10μg/ml)、天然16kDa蛋白刺激16小时后，测量产生IFN-γ的细胞内细胞因子染色(ICS)。
通过brefeldine A阻断分泌，染色用FACSCalibur分析。
抗原：
分枝杆菌提取物(PPD，1μg/ml；国家血清研究所，丹麦哥本哈根)，ESAT-6重组蛋白(1μg/ml，科罗拉多州立大学研究所友好提供，美国科罗拉多州)。天然16kDa蛋白由ICSU友好提供。由ICSU(USA)友好提供的下列抗原也进行了检验：重组Acrl(HSPX)，天然38kDa，重组Ara-和Man-LAM(分别为5、20、5、20和20μg/ml)。在最适浓度下检验了Acr2、TB10.4、TB10.3、Apa、重组PhosI(Claude Leclerc友好提供，巴黎巴斯德研究所)。使用商业化的T-spot TB
Figure A200680035722D0007142923QIETU
试验按制造商推荐检验了RD1、CFP10抗原(Oxford Immunotech，牛津，ChapmanA，AIDS2002)。
对十四条合成10个氨基酸跨16kDa蛋白序列的20-mer重叠邻接肽(overlapping neighboring peptides)(Genepep
Figure A200680035722D0007142923QIETU
)，其纯度至少80％且经过HPLC验证过同质性，进行单独检验或用最适浓度建库。
结果
鉴别IRS靶抗原
为精确限定结核菌素制剂中哪些是IRS识别的抗原及为可靠的诊断测定奠定基础，使用ELISpot IFN-γ探索了此结核菌素特异性应答的靶抗原(结果见表2)。
表2：以斑点形成细胞(SFC)/106PBMC表示的ELISpot IFN-γ抗原特异性T细胞定量
ND＝未做，Npos＝阳性结果/检验的数目，TTB＝抗分枝杆菌治疗起始，1IRS+和IRS-数据间非参数Mann Whitney检验(SFC/106PBMC)。*p<0.05，§p＝0.07
Figure A200680035722D00181
Figure A200680035722D00182
首先，我们发现在所有接受试验的受试者中，甚至在因HIV感染而有高免疫妥协的受试者中，通过ELISpot定量的PPD和天然16kDa蛋白特异性应答间有高相关性(图2)。对于其它抗原没有发现这种高相关性。
在IRS时，如对PPD的观察，16kDa特异性应答在受试的IRS+病人中显示急剧上升(图3)，比IRS-病人中显著升高(表2)。对于其它检验的抗原特别是RD1抗原(ESAT-6和CFP-10)没发现这种现象。
IRS中结核菌素和16kDa特异性T细胞表型分析
在IRS时，14％的PPD和16kDa特异性细胞是CD8+，80％是CD4+，代表了多达35％的总CD4。这些CD4T细胞是活化的(100％是HLA-DR+)，共同产生IFN-α但不产生IL-2，且是效应记忆细胞(84％是CD45RA-CD27-)。
结论
我们的结果证明IRS与PPD和天然16kDa特异性Th1细胞应答两者都相关，但与对其它TB抗原的T细胞应答无关。这些发现暗示IRS是由于效应记忆CD4细胞对TB抗原而不是分泌抗原或其它与活动性结核有关的抗原从休眠期爆炸性再活化导致的。该应答可被天然蛋白及16kDa免疫显性肽诱导。因此这些结果提供了独特的IRS免疫诊断工具，允许鉴别TB复发和IRS。
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<400>4
Figure A200680035722Q00233

Claims (20)

1、一种在结核分枝杆菌(TB)重叠感染病人中以及仅感染TB的病人中体外诊断免疫恢复综合征(IRS)的方法，包括以下步骤：
a)在培养基中将所述的病人的外周血单核细胞(PBMC)或全血与选自称为PPD(纯化蛋白衍生物)的分枝杆菌提取物的分枝杆菌抗原和/或16kDa蛋白(SEQ ID No.1)共同培养；
b)在培养基中将所述的病人的外周血单核细胞(PBMC)或全血与至少一种来源于结核分枝杆菌的抗原共同培养作为阴性对照，该抗原选自ESAT-6(SEQ ID No.2)、CFP-10(SEQ ID No.3)或85B(SEQID No.4)；以及
c)对比步骤b)中该分枝杆菌抗原，检测步骤a)中对该分枝杆菌抗原的Th1应答水平，
其中与对b)中限定的抗原相比，或与未刺激细胞相比或与非分枝杆菌抗原刺激的对照细胞相比，Th1应答增加超过250％，或在上述比较中，同一个时间点测量的对a)中限定的抗原的Th1应答有强反应性时表示IRS。
2、根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)包括通过ELISPOT测定法或细胞内细胞因子染色法联合流式细胞计量术或荧光显微镜检查和定量法对抗原特异性T细胞进行定量。
3、根据权利要求2所述的方法，其中包括定量分枝杆菌特异性产生IFN-γ的Th1细胞。
4、根据权利要求2或3所述的方法，其中结果超过500SFC(斑点形成细胞)/106PBMC，例如减去单独根据细胞获得的平均背景后，SFC超过500、1000或2000，表示IRS；而同时对ESAT-6、CFP-10、85B的SFC为零或最小，如SFC典型的低于500/106PBMC或低于400或300。
5、根据权利要求1到4中任意一项所述的方法，其中步骤b)包括收集培养上清液及定量至少一种Th1特异性细胞因子或趋化因子，包括IL-2、IL-2R、IL-12p40、IL-15、IL-17、IFN-γ、TNF-α、GMCSF、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、MIG、RANTES、IP-10。
6、根据权利要求5所述的方法，其通过多路夹心免疫测定法或单个细胞因子特异性夹心免疫测定法来进行。
7、根据权利要求5所述的方法，其中IFN-γ产量通过ELISA定量。
8、根据权利要求1到7中任意一项所述的方法，其中步骤a)中外周血单核细胞培养约6小时到72小时。
9、根据权利要求1到8中任意一项所述的方法，其中步骤a)中外周血单核细胞与约1μg/ml的PPD和/或约1μg/ml16kDa蛋白共同培养以及单独与约1μg/ml的ESAT-6重组蛋白共同培养。
10、根据权利要求1到9中任意一项所述的方法，其中步骤a)中外周血单核细胞与约1μg/ml的PPD和/或约1μg/ml16kDa蛋白共同培养以及单独与CFP-10和/或85B共同培养。
11、根据权利要求1到10中任意一项所述的方法，其中对照细胞选自与CMV提取物、HIV-1 p24、植物血细胞凝集素和仅培养基本身共同培养的细胞。
12、根据权利要求1到11中任意一项所述的方法，其在有结核重叠感染的HIV阳性病人的高效抗逆转录病毒治疗(HAART)过程中进行。
13、根据权利要求1到12中任意一项所述的方法，其在同时或顺次接受HAART和结核治疗的病人中进行。
14、根据权利要求1到11中任意一项所述的方法，其在仅感染结核的病人中进行。
15、一种用于在结核病人或结核(TB)和HIV重叠感染病人中免疫恢复综合征的诊断试剂盒，包括选自称为PPD(纯化蛋白衍生物)的分枝杆菌提取物和16kDa蛋白(SEQ ID No.1)的分枝杆菌抗原，以及至少一种选自ESAT-6(SEQ ID No.2)、CFP-10(SEQ ID No.3)或85B(SEQ ID No.4)的来源于结核分枝杆菌的抗原。
16、根据权利要求15所述的诊断试剂盒，其进一步包括至少一种结合到固体支持物上的Th1免疫应答特异性的抗细胞因子/趋化因子抗体，如抗IFN-γ抗体。
17、根据权利要求16所述的诊断试剂盒，其中固体支持物为ELISPOT板。
18、根据权利要求16所述的诊断试剂盒，其中固体支持物为ELISA板。
19、根据权利要求15到18中任意一项所述的试剂盒在结核病人或结核(TB)及HIV重叠感染病人的HAART及结核治疗过程中检测同结核相关的免疫恢复综合征(TB-IRS)中的用途。
20、根据权利要求15到18的任意一项所述的试剂盒在仅感染结核的病人中检测免疫恢复综合征(TB-IRS)中的用途。
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