JP6737785B2 - mecC含有メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出するための組成物および方法 - Google Patents
mecC含有メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出するための組成物および方法 Download PDFInfo
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Description
本開示は、例えば、前記mecC核酸配列の一部を増幅してmecC−MRSAを検出するための方法を提供する。mecC−MRSAの様々な亜種のSCCmec核酸配列が利用可能である(例えば、GenBank登録番号FR823292)。具体的には、mecC−MRSA核酸分子標的を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブは本開示の態様により提供される。
米国特許第4,683,202号、4,683,195号、4,800,159号、および4,965,188号には従来のPCR技術が開示されている。PCRは、典型的には、選択された核酸鋳型(例えば、DNAまたはRNA)に結合する2本のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。態様によっては、有益なプライマーは、上記mecC−MRSA核酸配列(例えば、配列番号1、2、4、5、7、8、および9)内に核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、従来の方法により制限消化物から精製してもよく、あるいは合成により生成してもよい。前記プライマーは、増幅の最大効率のためには一本鎖であることが好ましいが、二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーはまず変性して、すなわち、処理して二本鎖を分離する。二本鎖の核酸を変性する方法の1つは加熱である。
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)
本開示は、生体試料または非生体試料中のmecC−MRSAの有無を検出するための方法を提供する。提供されるこれらの方法は、試料の汚染、偽陰性率、および偽陽性率の問題を回避する。上記方法は、複数対のmecC−MRSAプライマーを用いて試料に由来するmecC−MRSA標的核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも1つの循環工程、およびFRET検出工程を行うことを含む。複数の循環工程を好ましくはサーモサイクラーで行う。mecC−MRSAプライマーおよびプローブを用いて上記方法を行って、mecC−MRSAの存在を検出してもよい。ここで、mecC−MRSAの検出は、試料中にmecC−MRSAが存在することを意味する。
本開示の態様はさらに、mecC−MRSAを検出するための製品またはキットを提供する。製品は、好適な梱包材料と共に、mecC−MRSAを検出するのに用いられるプライマーおよびプローブを含む。mecC−MRSAを検出するための代表的なプライマーおよびプローブは、mecC−MRSA標的核酸分子をハイブリダイズすることができる。また、前記キットは、DNAの固定化、ハイブリダイゼーション、および検出に必要な好適に包装された試薬および材料(例えば、固体支持体、緩衝液、酵素、およびDNA標準物質)を含んでいてもよい。プライマーおよびプローブを設計するための方法が本明細書で開示され、増幅し、mecC−MRSA標的核酸分子にハイブリダイズするプライマーおよびプローブの代表的な例が提供される。
MecC-MRSA 遺伝子標的
図1〜3を参照して、参照配列LGA251受託番号FR823292を用いて、オリゴセット#1−8を評価した。
Claims (15)
- 試料中のmecC含有黄色ブドウ球菌(mecC−MRSA)を検出する方法であって、
前記試料を、orfX遺伝子の一部にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーおよびmecC−MRSAオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて、前記試料中にmecC−MRSAが存在する場合に増幅産物を生成することを含む増幅工程を行うこと、
前記増幅産物を1つ以上の検出可能なmecC−MRSAオリゴヌクレオチドプローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を行うこと、および
前記増幅産物の存在が前記試料中にmecC−MRSAが存在することを意味し、前記増幅産物の非存在が前記試料中にmecC−MRSAが存在しないことを意味する場合に前記増幅産物の有無を検出すること、を含み、
ここで、前記mecC−MRSAオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号1、2、3、6、および8からなる群より選択される配列を含み、そしてorfX遺伝子の一部にハイブリダイズする前記オリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号9の配列を含む、前記方法。 - 前記ハイブリダイズ工程は、前記増幅産物を、供与体蛍光部位および対応する受容体蛍光部位で標識されたプローブと接触させることを含み、
前記検出工程は、前記プローブの供与体蛍光部位と受容体蛍光部位の間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の有無を検出することを含み、ここで、前記蛍光の有無は、前記試料中のmecC−MRSAの有無を意味する、請求項1に記載の方法。 - 前記検出可能なmecC−MRSAプローブは、配列番号10またはその相補体の配列を含む請求項1または2の何れか一項に記載の方法。
- 前記増幅は、5’→3’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる、請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- 前記供与体蛍光部位および前記対応する受容体蛍光部位は、前記プローブで互いに8ヌクレオチド以内にある、請求項2〜4の何れか一項に記載の方法。
- 前記受容体蛍光部位はクエンチャーである、請求項2〜5の何れか一項に記載の方法。
- orfX遺伝子の一部にハイブリダイズする前記オリゴヌクレオチドプライマーおよび前記mecC−MRSAオリゴヌクレオチドプライマーは、ヌクレオチドが40個以下である、請求項1〜6の何れか一項に記載の方法。
- 配列番号1、2、3、6、および8からなる群より選択される配列を含む第一のオリゴヌクレオチドプライマー、
orfX遺伝子の一部にハイブリダイズするように構成され、そして配列番号9の配列を含む、第二のオリゴヌクレオチドプライマー、および
前記第一のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第二のオリゴヌクレオチドプライマーによって生成されるアンプリコンにハイブリダイズするように構成され、そして配列番号10又はその相補体の配列を含む第三の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む、mecC含有黄色ブドウ球菌(mecC−MRSA)の核酸を検出するためのキット。 - 前記検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、供与体蛍光部位および対応する受容体蛍光部位を含む、請求項8に記載のキット。
- 前記受容体蛍光部位はクエンチャーである、請求項9に記載のキット。
- ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および前記核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液をさらに含む、請求項8〜10の何れか一項に記載のキット。
- 前記第一のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第二のオリゴヌクレオチドプライマーおよび/または前記オリゴヌクレオチドプローブは、ヌクレオチドが40個以下である、請求項8〜11の何れか一項に記載のキット。
- 配列番号1、2、3、6、および8からなる群より選択される核酸配列を含む、第一オリゴヌクレオチドプライマーと、orfX遺伝子の一部にハイブリダイズするように構成され、そして配列番号9の配列を含む、第二オリゴヌクレオチドプライマーとを含む、前記mecMRSA遺伝子の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーの対。
- 前記第一及び/又は第二オリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項13に記載のオリゴヌクレオチドプライマーの対。
- 前記オリゴヌクレオチドは、40個以下のヌクレオチドを有する、請求項13または14に記載のオリゴヌクレオチドプライマーの対。
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