CN117947037A - Map2蛋白核酸适配体wqy022及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，更具体地涉及一种MAP2蛋白核酸适配体WQY‑022及其应用。本发明提供的MAP2蛋白核酸适配体对MAP2蛋白具有高度特异性和亲和力，填补了靶向MAP2蛋白的核酸适配体的空白。与抗体相比具有分子量小、灵敏度高、稳定性好、易于合成与改造等优点。本发明提供的MAP2蛋白核酸适配体，可为人类神经相关疾病，尤其是创伤性和非创伤性急性脑损伤患者脑脊液生物标志物的检测与预后分析研究提供了更多有效的检测和治疗途径。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，更具体地涉及一种MAP2蛋白核酸适配体WQY-022及其应用。
背景技术
MAP2蛋白(全称为微管相关蛋白2，Microtubule-associated protein 2)，是一种在神经元和中枢神经系统中高表达并且发挥重要功能的蛋白质，在神经元的发育、形态和功能中起到调节和稳定微管的作用。MAP2蛋白可用作神经系统疾病的标志物或指标，例如神经退行性疾病阿尔茨海默病和癫痫等，中南大学湘雅医院重症医学科发现脑脊液生物标志物泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)、微管相关蛋白(MAP)-2、α-突触核蛋白和过氧化物酶Ⅵ的浓度与入院时格拉斯哥昏迷量表(GCS)评分较低、长期功能预后较差和死亡率增加有关。研究人员还发现MAP2蛋白的突变或异常表达与一些神经系统疾病的发生和发展密切相关。随着MAP2蛋白在神经相关疾病中的表达发生变化，近年来，对MAP2蛋白的研究受到越来越广泛的关注。
核酸适配体(Aptamer)是一段寡核苷酸序列(DNA或RNA)。通常是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX)，从核酸分子文库中人工合成得到的寡核苷酸片段。核酸适配体具有稳定的二级结构，能够和靶标分子特异性结合。核酸适配体的特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适配体可以结合的靶分子有小分子、蛋白、细菌、病毒、细胞和组织等。
在传统的抗原-抗体反应中，蛋白质作为探针分子易受pH、温度等环境因素影响而变性、且合成价格昂贵，而核酸适配体由DNA或RNA构成，比蛋白质体积更小，经SELEX筛选富集后，具有与抗原-抗体反应相媲美的灵敏度，同时合成更容易，并且核酸适配体的稳定性较蛋白质更好。目前国内外未见有关于MAP2蛋白核酸适配体的报道。
发明内容
鉴于上述问题，本申请提供了一种MAP2蛋白核酸适配体WQY-022及其应用，以期填补现有技术缺乏MAP2蛋白核酸适配体的技术空白，同时为MAP2蛋白核酸适配体后续作为分子探针构建生物检测传感器、体外诊断、生物标志物的检测和分析、新药研发等应用提供基础支撑。
为实现上述目的，一方面，本发明提供了一种MAP2蛋白核酸适配体WQY-022，所述MAP2蛋白核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1为TCCAGCACTCCACGCATAACTTCACGGTGCTGGTTTCCGTTTGCGTGGGCTGCGTTGTTATGCGTGCTACCGTGAA。
在一种具体的实施方式中，MAP2蛋白核酸适配体WQY-022的核苷酸序列由SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列经修饰得到。
在一些具体的实施方式中，所述修饰包括以下修饰方法中的至少一种：磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、同位素化和氟化。
另一方面，本发明提供了一种MAP2蛋白核酸适配体的衍生物，所述MAP2蛋白核酸适配体的衍生物包括SEQ ID NO.1所示的MAP2蛋白核酸适配体和标记所述MAP2蛋白核酸适配体的可检测标记物。
标记可以是通过化学键连接或物理吸附。
在一些优选具体的实施方式中，所述可检测标记物包括荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、亲和素、酶、地高辛、纳米发光材料、磁珠、胶体金、有色玻璃、塑料珠、小分子肽和siRNA中的至少一种。
荧光标记物包括但不限于FAM(羧基荧光素，Carboxy fluorescein)、FITC(异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate)、TET(四氯-6-羧基荧光素，Tetrachlorofluorescein)、HEX(六氯-6-甲基荧光素，Hexachloro fluorescein)、JOE(2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素)、罗丹明类(Rhodamine染料如R110、TAMRA、Texas Red等)、ROX、AlexaFluor染料(如Alexa 350、Alexa 405)、ATTO染料(如ATTO 390、ATTO 425、ATTO 465)、DyLight染料、cyanine染料(如Cy2、Cy3、Cy5.5、Cy7、Cy7.5)、FluoProbes染料、SulfoCy染料、Seta染料、IRIS染料、SeTau染料、SRfluor染料、Square染料。
放射性物质包括例如3H、14C、32P、33P、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。
治疗性物质、生物素、亲和素、酶、地高辛、纳米发光材料、磁珠、胶体金、有色玻璃、塑料珠、小分子肽和siRNA。
本发明还提供了如SEQ ID NO.1所示的MAP2蛋白核酸适配体在神经相关疾病中的检测、分析或研究中的应用。
同时，本发明还提供了如SEQ ID NO.1所示的MAP2蛋白核酸适配体在急性脑损伤患者体液生物标志物中的检测、分析或研究中的应用。
此外，本发明还提供了一种检测试剂盒，包括SEQ ID NO.1所示的MAP2蛋白核酸适配体或标记SEQ ID NO.1所示的MAP2蛋白核酸适配体的可检测标记物。
可检测标记物可以发出号包括光学信号或电学信号等可检测信号，光学信号包括荧光信号、光吸收信号、红外吸收信号、拉曼散射信号或化学发光信号。
本发明还提供一种药物组分，包括SEQ ID NO.1所示的MAP2蛋白核酸适配体或其经过磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、同位素化和氟化中一种修饰方法修饰后的MAP2蛋白核酸适配体，或SEQ ID NO.1所示的MAP2蛋白核酸适配体和标记其上的可检测标记物形成的MAP2蛋白核酸适配体衍生物。
进一步地，本发明还提供一种MAP2蛋白核酸适配体生物传感器，包括将SEQ IDNO.1所示的MAP2蛋白核酸适配体或其经过磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、同位素化和氟化中一种修饰方法修饰后的MAP2蛋白核酸适配体固定于电极、纳米材料或薄膜上的步骤制备得到该生物传感器。
本发明的靶标为MAP2蛋白，采用MB-SELEX(磁珠-指数富集的配体系统进化技术)具体地采用羧基磁珠固定靶标的方法进行筛选得到MAP2蛋白核酸适配体，将其命名为WQY-022，并通过磁珠荧光定量PCR法测得筛到的核酸适配体与MAP2蛋白的亲和力常数KD，约为14.34nM。
WQY-022的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，SEQ ID No.1：TCCAGCACTCCACGCATAACTTCACGGTGCTGGTTTCCGTTTGCGTGGG CTGCGTTGTTATGCGTGCTACCGTGAA。
区别于现有技术，上述技术方案提供的MAP2蛋白核酸适配体对MAP2蛋白具有高度特异性和亲和力，填补了靶向MAP2蛋白的核酸适配体的空白。与抗体相比具有分子量小、灵敏度高、稳定性好、易于合成与改造等优点。本发明提供的MAP2蛋白核酸适配体，可为人类神经相关疾病，尤其是创伤性和非创伤性急性脑损伤患者体液(例如但不限于脑脊液)生物标志物的检测与预后分析研究提供了更多有效的检测和治疗途径。
上述发明内容相关记载仅是本申请技术方案的概述，为了让本领域普通技术人员能够更清楚地了解本申请的技术方案，进而可以依据说明书的文字及附图记载的内容予以实施，并且为了让本申请的上述目的及其它目的、特征和优点能够更易于理解，以下结合本申请的具体实施方式及附图进行说明。
附图说明
附图仅用于示出本申请具体实施方式以及其他相关内容的原理、实现方式、应用、特点以及效果等，并不能认为是对本申请的限制。
在说明书附图中：
图1为本发明具体实施例中采用的固定靶标筛选的流程图；
图2为本发明具体实施方式中MAP2蛋白筛选正反筛保留率计算结果；
图3具体实施方式中蛋白偶联检测结果图；
图4为具体实施方式中DNA序列流过通道三的检测结果；
图5为具体实施方式中DNA序列流过通道四的检测结果；
图6为具体实施方式中通道四差减通道三的检测结果；
图7为MAP2蛋白与DNA序列的结合数值图；
图8为22#DNA序列流过通道三的检测结果图；
图9为22#DNA序列流过通道四的检测结果图；
图10为通道四差减通道三的检测结果图；
图11为22#DNA序列检测KD拟合数据图。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中各个位置出现的“实施例”一词并不一定指代相同的实施例，亦不特别限定其与其它实施例之间的独立性或关联性。原则上，在本申请中，只要不存在技术矛盾或冲突，各实施例中所提到的各项技术特征均可以以任意方式进行组合，以形成相应的可实施的技术方案。
除非另有定义，本文所使用的技术术语的含义与本申请所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中对相关术语的使用只是为了描述具体的实施例，而不是旨在限制本申请。
在本申请的描述中，用语“和/或”是一种用于描述对象之间逻辑关系的表述，表示可以存在三种关系，例如A和/或B，表示：存在A，存在B，以及同时存在A和B这三种情况。另外，本文中字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的逻辑关系。
在本申请中，诸如“第一”和“第二”之类的用语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何实际的数量、主次或顺序等关系。
在没有更多限制的情况下，在本申请中，语句中所使用的“包括”、“包含”、“具有”或者其他类似的表述，意在涵盖非排他性的包含，这些表述并不排除在包括所述要素的过程、方法或者产品中还可以存在另外的要素，从而使得包括一系列要素的过程、方法或者产品中不仅可以包括那些限定的要素，而且还可以包括没有明确列出的其他要素，或者还包括为这种过程、方法或者产品所固有的要素。
与《专利审查指南》中的理解相同，在本申请中，“大于”、“小于”、“超过”等表述理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等表述理解为包括本数。此外，在本申请实施例的描述中“多个”的含义是两个以上(包括两个)，与之类似的与“多”相关的表述亦做此类理解，例如“多组”、“多次”等，除非另有明确具体的限定。
本发明中，术语“MAP2”、“MAP-2”、“Map2”、“Microtubule-associated protein2”、“微管相关蛋白2”表示相同的含义，当出现上述几种表述时，都是指本发明的靶向蛋白，可互换使用。
以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件；实施例中所用的材料、试剂如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
下述实施例中的实验材料情况如下：
1)DynabeadsTMMyOneTM羧酸磁珠(购自Thermo货号:65011)；
2)DPBS缓冲液：(pH 7.2～7.4)：137mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，8mMNa2HPO4，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2；
3)文库：lib18-76nt：两端引物各20个碱基，中间随机区域36个碱基
5'-3'
TCCAGCACTCCACGCATAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTATGCGTGCTACCGTGAA；
4)对应文库qPCRmix；
5)对应文库ePCRmix；
6)SELEX单链制备试剂盒(长短链法)(购自Aptamy，货号：SEP-201903)；
7)ePCR微液滴生成油(购自Aptamy货号：EPO-100)；
8)MAP2蛋白(MCEMETAP2/Methionine aminopeptidase 2蛋白,Human(Sf9,His))；
9)HIS小肽(9个组氨酸)；
10)EDC(0.4M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，购自Sigma-Aldrich，货号：800907)；
11)NHS(0.1M的N-羟基琥珀酰亚胺，购自Sigma-Aldrich，货号：130672)；
12)pH8.51M乙醇胺；
13)引物信息：
实施例1
MAP2蛋白核酸适配体WQY-022及其制备
WQY-022的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，SEQ ID No.1：
TCCAGCACTCCACGCATAACTTCACGGTGCTGGTTTCCGTTTGCGTGGGCTGCGTTGTTATGCGTGCTACCGTGAA。
请参阅图1所示的固定靶标筛选的流程图，方法按如下步骤操作：
1、羧基磁珠固定正筛靶标(MAP2蛋白)和反筛靶标(HIS小肽)
1.1正筛磁珠(MAP2蛋白)制备
1)取50ul羧基磁珠，用200ulH2O清洗4遍，磁铁垂钓磁珠，去上清。
2)取配置好的50ulNHS和50ulEDC，室温缓慢解冻，将NHS加入到EDC中混匀，加入到上步磁珠中。室温摇床孵育25min。(期间如果磁珠聚集需要不定时摇匀)，磁铁垂钓磁珠，去上清，用200ulH2O快速清洗1遍。
3)取30ulMAP2蛋白(浓度为0.33mg/ml)，加入pH3.610mM醋酸钠溶液170ul混匀，加入到上步磁珠中。室温摇床孵育60min。(期间如果磁珠聚集需要不定时摇匀)磁铁垂钓磁珠，去上清，用200ulH2O快速清洗1遍。
4)取100ul1MpH8.5乙醇胺加入到上步磁珠中，室温，摇床孵育25min。(期间如果磁珠聚集需要不定时摇匀)磁铁垂钓磁珠，去上清，用200ulDPBS清洗4遍。清洗完毕，加入50ulDPBS保存磁珠，待用记为MB-MAP2。
1.2反筛磁珠制备(HIS小肽)
1)取50ul羧基磁珠，用200ulH2O清洗4遍，磁铁垂钓磁珠，去上清。
2)取配置好的50ulNHS和50ulEDC，室温缓慢解冻，将NHS加入到EDC中混匀，加入到上步磁珠中。室温摇床孵育25min。(期间如果磁珠聚集需要不定时摇匀)磁铁垂钓磁珠，去上清，用200ulH2O快速清洗1遍。
3)取10ulHIS 9小肽(浓度为1mg/ml)，加入pH为4.510mM醋酸钠缓冲液190ul混匀，加入到上步磁珠中。室温摇床孵育40min。(期间如果磁珠聚集需要不定时摇匀)磁铁垂钓磁珠，去上清。
4)取100ul1MpH8.5乙醇胺加入到上步磁珠中，室温，摇床孵育25min。(期间如果磁珠聚集需要不定时摇匀)磁铁垂钓磁珠，去上清，用200ulDPBS清洗4遍。清洗完毕，加入50ulDPBS保存磁珠，待用记为MB-HIS。
2、磁珠筛选过程(第一轮无反筛，无步骤3)--步骤11))
1)取一支lib18-76bp文库，12000rpm*10min离心，加入280ul DPBS溶解，将文库稀释至终浓度5uM 280ul，分装到PCR管。
2)装有文库的PCR管低转速离心后放入PCR仪进行缓慢变复性，程序为：95℃10min，4℃5min，25℃10min。
3)上步变复性好的文库加入到50ulMB-HIS中,用枪缓慢吹打混匀，室温摇床孵育60min。
4)磁铁垂钓磁珠，用枪头吸走上清记为pool-。
5)用200ulDPBS漂洗磁珠，磁铁垂钓磁珠，上清记为wash1-。
6)用200ulDPBS漂洗磁珠，磁铁垂钓磁珠，上清记为wash2-。
7)用200ulDPBS漂洗磁珠，磁铁垂钓磁珠，上清记为wash3-。
8)用200ulDPBS漂洗磁珠，磁铁垂钓磁珠，上清记为wash4-。
9)用200ulDPBS漂洗磁珠，磁铁垂钓磁珠，上清记为wash5-。
10)用200ulDPBS漂洗磁珠，磁铁垂钓磁珠，上清记为wash6-。
11)向磁珠中加入200ulDPBS沸水浴10min，磁铁垂钓磁珠，上清记为elution byMB-HIS。
12)将pool-加入到50ulMB-MAP2中，用枪缓慢吹打混匀，室温摇床孵育60min。
13)磁铁垂钓磁珠，去上清。
14)用200ulDPBS漂洗磁珠，磁铁垂钓磁珠，上清记为wash1+。
15)用200ulDPBS漂洗磁珠，磁铁垂钓磁珠，上清记为wash2+。
16)用200ulDPBS漂洗磁珠，磁铁垂钓磁珠，上清记为wash3+。
17)用200ulDPBS漂洗磁珠，磁铁垂钓磁珠，上清记为wash4+。
18)用200ulDPBS漂洗磁珠，磁铁垂钓磁珠，上清记为wash5+。
19)用200ulDPBS漂洗磁珠，磁铁垂钓磁珠，上清记为wash6+。
20)向磁珠中加入200ulDPBS沸水浴10min，磁铁垂钓磁珠，上清记为elution byMB-MAP2。
21)取罗氏8联排PCR管，每孔加入30ul qPCRmix，再分别加入wash和elution各2ul，进行荧光定量PCR。程序如下：95℃2min；95℃0.5min，60℃0.5min，72℃0.5min30cycle。
3、制备单链文库ssDNA
1)将剩下的elution by MB-MAP2全部加入到2ml ePCRmix里，混匀。
2)取制备好的混匀液分装到PCR管中，每管100ul，PCR 25cycles。程序为：95℃2min；95℃0.5min，60℃0.5min，72℃0.5min，25cycles；
3)回收PCR产物。
4)正丁醇浓缩PCR产物。
5)变性PAGE电泳分离单链。
6)正丁醇浓缩ssDNA至100ul左右。
7)微量核酸透析膜3.5KD，DPBS buffer过夜透析ssDNA,微量紫外测定浓度后，标记制备好的ssDNA为pool 1用于下一轮筛选。
4、计算正反筛保留率
根据qPCR结果计算保留率。方法为用已知浓度的文库稀释到不同浓度进行qPCR,然后将浓度与对应的Cq值制作标准曲线，然后根据wash和elution样品的Cq值，代入标准曲线中，计算出分子数。
每一轮筛选得到的与靶标或者反筛靶标结合的文库的分子数与投入的总文库序列数的比例，称之为保留率。六轮筛选的保留率验证结果如图2所示，第6轮筛选的荧光定量PCR曲线上扬，且正筛保留率高过反筛保留率，可以进行高通量测序。
5、多轮筛选
按照如上的操作，总共筛选6轮，筛选的大概流程类似，下表中列出了各轮筛选间的差异。各轮筛选条件如表1所示:
表1第一至六轮筛选条件
6、MAP2蛋白固定靶标筛选获得的各轮文库测序的测序样品制备以及进行高通量测序
6.1实验材料与方法(含样品)
1)制备测序样品的PCRmix，其中正向引物替换成带有不同标签的正向引物，反向引物为不带任何修饰的引物；
2)文库信息：lib18-76bp全长76bp，随机区域36bp；
3)MAP2蛋白固定靶标筛选所得文库；
4)UNIQ-10寡聚核苷酸纯化试剂盒(采购自上海生工生物，货号：B511143)；
5)无水乙醇
6)TE buffer(10mmol/L Tris.HCl；1mmol/L EDTA；pH7.8-8.2)
6.2实验过程和结果
1)将每一轮的文库作为模板，吸取浓度500nM的文库各20ul，分别加入到400μL带有不同barcode的PCRmix中(不同文库对应的不同barcode信息如下表)，进行PCR扩增，程序如下：95度预变性1min，95度变性30s，60度退火30s，72度延伸30s，共扩增20个循环。测序样品文库对应的标签引物信息如表2所示:
表2测序样品文库对应的标签引物信息
| 标签 | 序列 | 轮次 |
| Lib18S031 | ccgttgTCCAGCACTCCACGCATAAC | pool 2 |
| Lib18S032 | ccttttTCCAGCACTCCACGCATAAC | pool 3 |
| Lib18S033 | cgagaaTCCAGCACTCCACGCATAAC | pool 4 |
| Lib18S034 | cgcgacTCCAGCACTCCACGCATAAC | pool 5 |
| Lib18S035 | cgggagTCCAGCACTCCACGCATAAC | pool 6 |
| Lib18S036 | cgtgatTCCAGCACTCCACGCATAAC | 气溶胶 |
2)扩增结束后，进行浓缩和纯化。用上海生工的UNIQ-10寡聚核苷酸纯化试剂盒回收扩增出的双链。先将扩增产物用高盐吸附到柱上，再进行低盐洗脱，清洗和洗脱的详细步骤如下：扩增结束后，所有样品混合分装于15ml离心管中，加入正丁醇浓缩至200uL。
3)标准抽提步骤按UNIQ-10寡聚核苷酸纯化试剂盒(上海生工B511143)操作回收dsDNA。具体操作如下：
将含有DNA片段的溶液用TE Buffer调整体积到50～100μl，加入10倍体积的Binding Buffer I混匀。(若对含有放射性标记的寡核苷酸片段进行纯化，请将被放射性沾染的Binding Buffer I，Wash Solution，纯化套件，枪头，离心管等做特殊处理，以免污染环境。)
将混合液转移到吸附柱中，室温放置2min，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
向吸附柱中加入500μl Wash Solution，10,000rpm离心1min。(Wash Solution首次使用前请检查溶液是否已加入正确量的无水乙醇。)
重复上述一次。
倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一个收集管中，10,000rpm离心2min。此步绝不可省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验。
将吸附柱放入干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加30～50μl ElutionBuffer，室温静置5min，12,000rpm离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。(Elution Buffer为2.5mM Tris-HCl，pH8.5，可以用TE或水(pH>7.0)代替；将Elution Buffer预热至60℃可以进一步提高得率；请勿使用小于30μl的洗脱液进行洗脱)。
4)使用Illumina-NovaSeq 6000测序系统平台进行高通量测序。
5)测序后得到的RAW data提取到excel文档后，对序列进行分析，挑选出序列进行合成和亲和力检测。
7、MAP2蛋白固定靶标筛选得到的备选DNA序列亲和力检测
7.1实验材料(含样品)
1)MAP2蛋白固定靶标筛选得到的备选DNA序列；
2)CM5传感芯片(采购自Cytiva，货号29149604)；
3)MAP2蛋白(MCE METAP2/Methionine aminopeptidase 2蛋白,Human(Sf9,His))；
4)HIS小肽(9个组氨酸)；
5)EDC(0.4M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，采购自Sigma-Aldrich，货号：800907)；
6)NHS(0.1M的N-羟基琥珀酰亚胺，采购自Sigma-Aldrich，货号：130672)；
7)pH8.51M乙醇胺。
7.2实验过程
1)蛋白偶联：用活化混合溶液进样活化芯片，活化3和4通道，将MAP2蛋白用pH＝3.6，浓度为10mM的醋酸钠水溶液稀释至15ug/ml后进样至通道4，MAP2蛋白偶联量为1794RU；
将HIS小肽用pH＝4.5，浓度为10mM的醋酸钠水溶液稀释至25ug/ml后进样至通道3，HIS小肽偶联量为114RU；
进样完成后，进1M PH8.5乙醇胺试剂封闭3通道和4通道，流速10μL/min，进样10min；
2)MAP2蛋白固定靶标筛选得到的DNA序列用DPBS稀释至2uM后上机检测；具体实验方法及参数设计如表3所示：
表3 MAP2蛋白固定靶标筛选方法和参数
7.3实验结果
蛋白偶联结果、DNA序列流过通道三、DNA序列流过通道四和通道四差减通道三的检测结果分别如图3、图4、图5和图6所示，其中，FC＝3HIS小肽，FC＝4MAP2蛋白。
MAP2蛋白与DNA序列的结合数值如图7和表4所示。
表4 MAP2蛋白与备选DNA序列亲和力检测数据
从图7和表4的结果可知，本发明筛选得到的DNA序列不结合HIS小肽，特异性较好。22#DNA序列与MAP2蛋白具备结合，且结合数值较高，接着对其进行KD检测。1M NaCl再生效果良好。
8、MAP2蛋白与筛选得到的22#DNA序列KD检测
8.1实验材料(含样品)
1)MAP2蛋白固定靶标筛选得到的备选DNA序列；
2)CM5传感芯片(Cytiva货号29149604)；
3)MAP2蛋白(MCE METAP2/Methionine aminopeptidase 2蛋白,Human(Sf9,His))；
4)HIS小肽(9个组氨酸)；
5)EDC(0.4M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，采购自Sigma-Aldrich，货号：800907)；
6)NHS(0.1M的N-羟基琥珀酰亚胺，采购自Sigma-Aldrich，货号：130672)；
7)pH8.51M乙醇胺；
8)DPBS。
8.2、实验过程
1)蛋白偶联：用活化混合溶液进样活化芯片，活化3和4通道，将MAP2蛋白用pH＝3.6，浓度为10mM的醋酸钠水溶液稀释至10ug/ml后进样至通道4，MAP2蛋白偶联量为2399Ru；将HIS小肽用pH＝4.5，浓度为10mM的醋酸钠水溶液稀释至15ug/ml后进样至通道3，HIS小肽偶联量为88Ru；
进样完成后，进1M pH8.5乙醇胺试剂封闭3通道和4通道，流速10μL/min，进样10min；
2)MAP2蛋白固定靶标筛选得到的22#DNA序列用DPBS稀释至梯度浓度后上机检测；实验参数如表5所示：
表5实验方法及参数
22#DNA序列浓度按下列梯度进行稀释：0uM、0.0078125uM、0.015625uM、0.03125uM、0.0625uM、0.125uM、0.25uM、0.5uM、1uM、2uM。
8.3实验结果
22#DNA序列流过通道三的检测结果如图8所示，22#DNA序列流过通道四的检测结果如图9所示，通道四差减通道三的检测结果如图10所示，22#DNA序列检测KD拟合数据如图11所示(KD≈14.34nM)。
从上述实验结果可知，对照通道HIS小肽偶联88RU,靶标通道MAP2蛋白偶联2399RU，1M NaCl再生效果良好，22#DNA序列KD拟合值为KD≈14.34nM。将22#DNA序列命名为WQY-022。
WQY-022的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，SEQ ID No.1：TCCAGCACTCCACGCATAACTTCACGGTGCTGGTTTCCGTTTGCGTGGG CTGCGTTGTTATGCGTGCTACCGTGAA。
实施例2
合成MAP2蛋白核酸适配体，由SEQ ID No.1所示的如下核苷酸序列经磷酸化修饰得到：TCCAGCACTCCACGCATAACTTCACGGTGCTGGTTTCCGTTTGCGTGGGCTGCGTTGTTATGCGTGCTACCGTGAA。
在其他不同的实施例中，MAP2蛋白核酸适配体，还可由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经甲基化、氨基化、巯基化、同位素化和氟化中的至少一种修饰得到。
实施例3
MAP2蛋白核酸适配体的衍生物，由SEQ ID No.1所示的如下核苷酸序列用可检测标记物标记得到：TCCAGCACTCCACGCATAACTTCACGGTGCTGGTTTCCGTTTGCGTGGGCTGCGTTGTTATGCGTGCTACCGTGAA。上述可检测标记物为荧光标记物。
在其他不同的实施例中，MAP2蛋白核酸适配体的衍生物，由SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列用放射性物质、治疗性物质、生物素、亲和素、酶、地高辛、纳米发光材料、磁珠、胶体金、有色玻璃、塑料珠、小分子肽和siRNA中的至少一种作为可检测标记物标记得到。
实施例4
检测试剂盒，包含由SEQ ID No.1所示的如下核苷酸序列的核酸适配体WQY-022：TCCAGCACTCCACGCATAACTTCACGGTGCTGGTTTCCGTTTGCGTGGGCTGCGTTGTTATGCGTGCTACCGTGAA。
实施例5
检测试剂盒，包含由SEQ ID No.1所示的如下核苷酸序列经磷酸化修饰的核酸适配体WQY-022：TCCAGCACTCCACGCATAACTTCACGGTGCTGGTTTCCGTTTGCGTGGGCTGCGTTGTTATGCGTGCTACCGTGAA。
实施例6
检测试剂盒，包含由SEQ ID No.1所示的如下核苷酸序列经巯基化修饰的核酸适配体WQY-022：TCCAGCACTCCACGCATAACTTCACGGTGCTGGTTTCCGTTTGCGTGGGCTGCGTTGTTATGCGTGCTACCGTGAA。
在其他不同的实施例中，该检测试剂盒还可包含由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经甲基化、氨基化、同位素化和氟化中的至少一种修饰得到。
实施例7
药物组分，包含由SEQ ID No.1所示的如下核苷酸序列的核酸适配体WQY-022：TCCAGCACTCCACGCATAACTTCACGGTGCTGGTTTCCGTTTGCGTGGG CTGCGTTGTTATGCGTGCTACCGTGAA。
实施例8
药物组分，包含由SEQ ID No.1所示的如下核苷酸序列经巯基化修饰得到的核酸适配体WQY-022：TCCAGCACTCCACGCATAACTTCACGGTGCTGGTTTCCGTTTGCGTGGGCTGCGTTGTTATGCGTGCTACCGTGAA。
实施例9
药物组分，包含由SEQ ID No.1所示的如下核苷酸序列经氟化修饰得到的核酸适配体WQY-022：TCCAGCACTCCACGCATAACTTCACGGTGCTGGTTTCCGTTTGCGTGGGCTGCGTTGTTATGCGTGCTACCGTGAA。
在其他不同的实施例中，该药物组分还可包含由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经磷酸化、甲基化、氨基化和同位素化中的至少一种修饰得到。
实施例10
一种MAP2蛋白核酸适配体生物传感器，包括将由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列MAP2蛋白核酸适配体WQY-022固定于电极、纳米材料或薄膜上的步骤制备得到。
实施例11
一种MAP2蛋白核酸适配体生物传感器，包括将由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经修饰得到的MAP2蛋白核酸适配体固定于电极、纳米材料或薄膜上的步骤制备得到。
将MAP2蛋白核酸适配体WQY-022应用于神经相关疾病中的检测、分析或研究。特别是在急性脑损伤患者脑脊液生物标志物中的检测、分析或研究中的应用。以便为相关疾病治疗的新药研发、指导早期干预以改善预后等发挥积极作用。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (10)
1.一种MAP2蛋白核酸适配体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种MAP2蛋白核酸适配体，其特征在于，其核苷酸序列由权利要求1所述的MAP2蛋白核酸适配体的核苷酸序列经修饰得到。
3.根据权利要求2所述的MAP2蛋白核酸适配体，其特征在于，所述修饰包括以下修饰方法中的至少一种：磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、同位素化和氟化。
4.一种MAP2蛋白核酸适配体的衍生物，其特征在于，包括权利要求1所述的MAP2蛋白核酸适配体和标记所述MAP2蛋白核酸适配体的可检测标记物。
5.根据权利要求4所述的衍生物，其特征在于，所述可检测标记物包括荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、亲和素、酶、地高辛、纳米发光材料、磁珠、胶体金、有色玻璃、塑料珠、小分子肽和siRNA中的至少一种。
6.如权利要求1所述的MAP2蛋白核酸适配体在神经相关疾病中的检测、分析或研究中的应用。
7.如权利要求1所述的MAP2蛋白核酸适配体在急性脑损伤患者体液生物标志物中的检测、分析或研究中的应用。
8.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的MAP2蛋白核酸适配体。
9.一种药物组分，其特征在于，包括权利要求1或2所述的MAP2蛋白核酸适配体，或权利要求4所述的MAP2蛋白核酸适配体的衍生物。
10.一种MAP2蛋白核酸适配体生物传感器，其特征在于，包括将权利要求1或2所述的MAP2蛋白核酸适配体固定于电极、纳米材料或薄膜上的步骤制备得到。
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