CN102994415B - 一株空间肺炎克雷伯氏菌lct-kp182菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株太空环境下肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的生物学特性、基因组DNA序列、转录组和差异蛋白组学，特别是同地面肺炎克雷伯氏菌比较分析鉴定出的功能序列和分子在阐明空间环境对微生物的作用及用途，可获得全面、准确的空间诱变肺炎克雷伯氏菌菌株突变的基因、差异表达基因和蛋白质。

Description

一株空间肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及太空环境下肺炎克雷伯氏菌的生物学特性、全基因组测序信息、转录组测序以及差异蛋白组学分析。 
背景技术
随着人类不断进行太空探索，太空成为人类活动的新领域，而空间环境十分复杂，如微重力、宇宙辐射、极端温度等，这些因素对空间驻留人员体内及空间站中的细菌生物学性状及致病性都会产生影响，在空间站中已检测出肺炎克雷伯氏菌等多种细菌，空间环境对微生物的作用和机制研究是迫切需要关注的前沿问题。 
克雷伯氏菌是革兰氏阴性杆菌，是一种无动力菌，属于肠杆菌属兼性厌氧菌，包括鼻硬结亚种、鼻炎亚种和肺炎亚种等三个亚种。其中克雷伯氏菌鼻硬结亚种，主要侵犯鼻咽部，常导致慢性肉芽肿性病变，故又称鼻硬结杆菌；臭鼻亚种，主要引起慢性萎缩性鼻炎，有恶臭，因此被称为又称臭鼻杆菌；肺炎亚种，即肺炎杆菌，常存在于人体上呼吸道和肠道中。肺炎克雷伯氏菌是一种无处不在的条件致病菌，寄生在人类的粘膜表面，对人致病性较强，并导致严重的疾病，如败血症，肺炎，尿路感染，软组织感染。近年来随着临床上广谱抗菌药物的大量应用，其检出率和耐药率呈上升趋势。 
随着科学技术的不断发展，近年来的基因组、转录组、蛋白组等组学的研究越来越多，也是揭示各种生命现象和病理生理过程发生的分子机理的较好切入点。通过基因组、转录组测序和蛋白组等方法系统地分析太空环境导致细菌发生变化的机理，研究空间环境对肺炎克雷伯氏菌的作用和机理，有利于了解天空环境下细菌致病性发生变化的机理，以及通过研究空间环境下 细菌发生的改变，为地面上难治性感染的研究提供新的启示。 
发明内容
本发明的一个目的提供空间环境诱变的肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株 
本发明提供的该菌株，其保藏号为CGMCC NO.6521。 
一株肺炎克雷伯氏菌，其特征包括：革兰氏染色阴性，呈单个、短杆状；同地面对照株的抗生素耐受性相比，无明显变化；无生长速度的差异；Biolog反应板上醋竹桃霉素(-)、二甲胺四环素(-)、洁霉素(-)、盐酸胍(-)、硫酸四癸钠(-)、万古霉素(-)、四唑紫(-)、四唑蓝(-)、梭链孢酸(-)。 
所述的肺炎克雷伯氏菌，利用全基因组测序和比较基因组学分析获得基因突变，见表1，空间环境导致LCT-KP182基因组上SNP的变化，包括SNP在基因组上的位置，突变位点及编码蛋白以及注释出的基因。 
表1：空间环境导致LCT-KP182基因组上SNP的变化 
所述的肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株，进行转录组测序鉴定差异表达基因(FDR≤0.001和|log2Ratio|≥2)见附表1。 
所述的肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株，进行差异蛋白组学分析鉴定的差异表达蛋白(蛋白丰度差异倍数超过2倍以上时；经统计检验其p-val ue值小于0.05；三次重复中至少两次重复中达到上述要求)见附表2。 
附图说明
图1肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株革兰氏染色 
图2肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株生理生化鉴定 
图3肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株生长曲线 
图4肺炎克雷伯氏菌LCT-KP214菌株生长曲线 
图5肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株溶血情况 
图6LCT-KP182菌株的GC含量与Depth关联分析图 
图7LCT-KP182菌株和地面对照组LCT-KP214的二维共线性图 
图8LCT-KP182菌株的转录组测序基因覆盖度图 
图9转录组测序鉴定的差异表达基因 
图10差异蛋白组学鉴定的差异表达蛋白质 
附件说明 
附件1LCT-KP182菌株转录组测序分析的差异表达基因信息 
附件2LCT-KP182菌株定量蛋白组学分析的差异表达蛋白信息 
具体实施方式
下述实施实例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 
下述实施实例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 
实施实例一：肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的革兰氏染色 
取50ul样品离心，弃上清，加入无菌水50ul，吸取20ul于载玻片上进行固定；初染，吸取革兰氏染色I(结晶紫)2滴于载玻片样品上进行初染1min，然后用自来水冲洗染液；媒染，吸取革兰氏染色II(碘液)2滴覆盖涂面染约1min，然后用自来水冲洗染液，用吸水纸吸取涂面上的水分；脱色，吸取革兰氏染色III(酒精)2滴滴在涂面上约30s，用水冲洗载玻片，用吸水纸吸取涂面上的水分；复染，吸取革兰氏染色IV(番红)2滴滴在涂面上约1min，用水冲洗载玻片，用吸水纸吸取涂面上的水分；观察，先用 显微镜低倍镜找到目标视野，然后再用油镜(100×)进行观察，判定并记录结果、拍照，见图1，从图中可看出LCT-KP182菌株革兰氏染色阴性，呈单个、短杆状。 
实施实例二：肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的抗生素敏感性检测 
配制LB固体培养基25L，灭完菌后倒1500个平板，晾干，备用；菌悬液的制备，取出这些单菌的斜面，并准备盛有1ml无菌生理盐水的1.5ml离心管，用灭菌的竹签从斜面上蘸取适量菌种于1.5ml离心管中，混匀，调菌浓度约107～108；稀释涂布，吸取备好的菌悬液100μl进行涂布，尽可能地涂布均匀，每株单菌涂6个平板，每涂完一株菌，就进行下一步(粘贴药敏片)；粘贴药敏片，选择抗生素进行药敏试验，以筛选出抗药性突变的菌株；贴完药敏片后，将平板放置在37℃下培养18～24h；观察结果，将平板培养18～24h，取出观察平板上药敏片的抑菌情况，并记录抑菌圈的大小(直径cm)，其中药敏片直径约为0.6cm。肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182同地面对照LCT-KP214菌株相比，其抑菌圈无明显变化。 
实施实例三：肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的生理生化鉴定实验 
菌悬液制备，取出菌株的斜面，用灭菌竹签蘸取菌种接种在LB液体培养基中(4ml体系)，培养24h。然后取2ml菌液6000r/s离心5min，弃上清培养基，留下离心的菌体，然后用灭菌的生理盐水洗涤菌体，6000r/s离心5min，再次弃去上清，再用Biolog接种液进行悬浮菌体，最后再转至15ml的接种液中。调至浓度约107～108；接种，将以上菌悬液倒至接种皿中，震荡均匀，用12道(或8道)排枪进行加样，每个Biolog板孔加样100ul，共96孔，加完样后，盖上Biolog板盖，放置在37℃下培养，24h和48h进行观察，并记录结果，见图2和表2，可看出醋竹桃霉素(-)、二甲胺四环素(-)、洁霉素(-)、盐酸胍(-)、硫酸四癸钠(-)、万古霉素(-)、四唑紫(-)、四唑 蓝(-)、梭链孢酸(-)。 
表2：LCT-KP182菌株的生理生化鉴定结果 
编号 底物 LCT-KP182菌株 地面对照茵株
C11 夫西地酸   - -    
D9 D-丝氨酸 +/- +
D10 醋竹桃霉素   -   +
D12 二甲胺四环素   -   +
E10 林克霉素   -   +
E11 盐酸胍   -   +
E12 硫酸四癸钠   -   +
F10 万古霉素   -   +
F11 四唑紫    -   +
F12 四唑蓝    -   +
实施实例四：肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的生长曲线 
活化菌株，在15ml试管(4ml培养基)中培养1d，然后接种至100孔蜂窝板中，在Bioscreen中进行生长曲线的测定，测定24h，读取数据；将每株菌所得到的OD值进行平均值的计算，然后再做曲线，见图3和图4，LCT-182菌株同对照菌株LCT-KP214相比无差异。 
实施实例五：肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的溶血实验 
采用点种法将LCT-KP182菌株点种于血琼脂培养基上，每个血平板上同时包含太空条件下LCT-KP182菌株和地面对照菌株；37℃，倒置培养24-48h后观察溶血结果，见图5，LCT-KP182菌株出现溶血现象，周围有一透亮的溶血环。 
实施实例六：LCT-KP182菌株的基因组测序和比较基因组分析 
培养肺炎克雷伯氏菌并提取基因组DNA，首先采用超声法将检测合格的DNA样品随机打断，得到一系列DNA片段，经T4DNA聚合酶、Klenow 
DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶等处理后，回收目的片段，得到测序文 库，利用Illumina的Genome Analyzer ll测序；测序结束后得到的reads，经过滤处理后进行组装和分析；采用Glimmer3.0软件注释基因并分析SNP、lnd el、基因重排和结构变异等。发现的SNP改变基因见表1，lndel分析未发现明显变化。测序的质控即GC含量与Depth关联分析统计图见图6，其中横坐标是GC含量，纵坐标是平均深度。以500bp为窗口无重复的计算其GC含量和平均深度，该散点图近似于泊松分布，即测序过程中GC无明显偏向性。共线性及重排分析见图7的二维共线性图，图中横轴是参考序列基因组，纵轴是所测基因组，颜色较浅的水平或垂直的直线表示各个Scaffold之间的分割，红色线条表示所测基因组的核酸序列在正链，蓝色表示所测基因组的核酸序列在负链。 
实施实例七：肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的转录组测序分析 
提取肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株总RNA后，用试剂盒去除rRNA后。加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase l合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeqTM2000进行测序。将原始序列数据去除杂质数据后统计rRNA统计、评价Reads在基因组上的分布基因覆盖度、统计基因表达量差异、分析差异表达基因等，见表3、表4、图8和图9，差异表达基因详见附表1，满足FDR≤0.001和|log2Ratio|≥2条件的上调基因14个，下调基因27个，图8为基因测序覆盖度指每个基因被reads覆盖的百分比，其值等于基因中uniq ue mappi ng reads覆盖的碱基数跟基因编码区所有碱基数的比值。 
表3：样品LCT-KP182和参考基因组比对的统计结果 
表4：样品LCT-KP182和参考基因比对的统计结果 
上述表格各列含义如下： 
实施实例八：肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182菌株的差异蛋白组学分析 
从肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182样品中提取蛋白；对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后续充分酶解蛋白；用GE公司的2D quant kit法进行蛋白质的浓度测定；等体积进行SDS(十二烷基磺酸钠)电泳；酶解蛋白；用iTRAQ试剂标记肽段；将标记后的肽段进行等量混合；对混合后的肽段使用强阳离子交换色谱(Strong Cation ExchangeChoematography，SCX)进行预分离；进行液相串联质谱(liquidchromatography coupied with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。对质谱下机的原始文件，进行峰识别，得到峰列表；建立参考数据库，进行肽段及蛋白质的鉴定；最后比较各蛋白在各样品之间的相对含量的关系，从而获得一些感兴趣的重要蛋白，上调和下调的蛋白分子见下附表2，上调下调蛋白统计见图10，统计的依据为蛋白丰度差异倍数超过2倍以上时；经统计检验其p-value值小于0.05；三次重复中至少两次重复中满足上述要求，结果显示2个蛋白表达增高，6个蛋白表达量下降。 
关于保藏的LCT-KP182菌株的说明 
A.菌种的保藏单位名称和地址 
名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所 
B.交机构保藏的日期 
2012年9月5日 
C.保藏机构给予的保藏号 
CGMCC No.6521 
D.菌株分类命名：肺炎克雷伯氏菌Klebsiella peneumoniae 
附件1 
附件2 

Claims (1)

1.一种肺炎克雷伯氏菌LCT-KP182，其保藏号为：CGMCC NO.6521，其特征在于：革兰氏染色阴性，呈单个、短杆状；同地面对照株的抗生素耐受性相比，无明显变化；无生长速度的差异；生理生化特性鉴定上，醋竹桃霉素(-)、二甲胺四环素(-)、洁霉素(-)、盐酸胍(-)、硫酸四癸钠(-)、万古霉素(-)、四唑紫(-)、四唑蓝(-)、梭链孢酸(-)。
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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"微重力对病原菌毒力和抗生素敏感性影响的研究进展";方向群;《航天医学与医学工程》;20120630;第25卷(第3期);220-224页 *
"空间环境对13株微生物生物学特性的影响";谢琼;《中华医院感染学杂志》;20041231;第14卷(第11期);摘要，正文1221页左栏1段-1223页右栏1段，表2 *

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