CN103122325B - 一株空间屎肠球菌lct-ef297 - Google Patents
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Abstract
一种空间菌株屎肠球菌LCT-EF297，更具体的说是一种太空微生物，一种肠球菌属的益生菌，运用空间技术获得。其特征是：革兰氏阳性菌，一种乳酸菌，兼性厌氧，在基因组、转录组和蛋白组学层面对其进行详尽阐明，它没有毒性，产生抑制其他细菌生长的细菌素，可以通过高效的糖酵解途径发酵葡萄糖等碳源产生乳酸等酸性物质(见图1，图1a为LCT-EF297，图1b为对照组)，能够维持肠道酸性环境，抑制病原菌生长，可以具有调节宇航员肠道菌群生态平衡和用于药物、保健品发酵乳食品的生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种空间菌株屎肠球菌LCT-EF297，本发明涉及太空菌株的制备方法、菌株特性及其用途。
背景技术
随着中国航天科技水平的不断提高，我国探索太空的活动日益频繁，预计2020年将建成空间站并配有宇航员的长期驻守，宇航员的健康保障是个至关重要的问题。太空存在强辐射、微重力、高真空、极端温度、弱磁场等特殊环境因素。研究证实太空环境对人体骨骼、血液循环及免疫等系统均造成影响，对寄生于人体的菌群也会产生影响，太空辐射包含粒子流和电磁波，其中的X射线、伽马(Y)射线为电离辐射，可造成遗传基因突变、细胞DNA损伤等，另外微重力可造成微生物在液体的机械力学改变，进而导致细胞的分子生物学性状发生变化。
屎肠球菌(Enterococcus faecium)是一种益生菌，正常寄生于肠道中，革兰氏阳性菌，属乳杆菌目、肠球菌科、肠球菌属，椭圆形或球杆状，无芽孢，无鞭毛。兼性厌氧菌，可通过糖酵解途径发酵葡萄糖等多种碳源产生大量乳酸等酸性物质，降低PH值，维持肠道酸性环境，抑制病原菌生长，还可以通过产生过氧化氢、细菌素等抑菌物质发挥抑菌作用，对肠道菌群平衡具有重要调控作用；另外屎肠球菌是一种乳酸菌，可以发酵葡萄糖产生乳酸，不仅能提高食品的营养价值、改善食品风味、提高食品保藏性，还具有多方面的保健作用，如提高食物消化率和生物价、改善便秘、降低胆固醇水平、改善肝功能、缓解乳糖不耐症、提高免疫力、抗肿瘤等作用。目前认为屎肠 球菌相对于双歧杆菌、乳杆菌等益生菌来说是便于生产和使用的首选菌种。
既往针对该菌生物学特性及用途等研究均局限于地面，对空间环境下屎肠球菌的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种太空益生菌-屎肠球菌LCT-EF297，是一种无毒力、能够产生细菌素并可以通过高效发酵代谢途径利用多种碳源的益生菌，可用于开发生产用于维持宇航员肠道菌群平衡的药品和制作太空健康发酵乳食品。
空间屎肠球菌LCT-EF297，其特征在于：保藏号为CGMCC No.6526。
所述的屎肠球菌LCT-E F297，通过基因组测序可获得全基因组序列，包括15个Scaffold，全基因组序列长2,668,148bp，GC含量38.00％，具有2,639个潜在蛋白编码基因。
通过转录组测序并与地面对照组比较获得差异表达基因2117个，其中37个基因转录下调，2080个基因转录上调；在蛋白质翻译水平与地面对照组比较有差异表达基因53个，其中21个蛋白翻译量增高，其中32个蛋白翻译量下降，p＜0.05。
所述的屎肠球菌LCT-EF297，没有毒力，具有产生细菌素的特征，细菌素抑制病原菌生长，可以维持肠道菌群生态平衡，具有开发药物和保健品的用途。
所述的屎肠球菌LCT-EF297，可以选择糖酵解途径产生乳酸，降低PH，不仅可以抑制病原菌生长，还可用于太空发酵乳食品的生产。
附图说明
图1屎肠球菌LCT-EF297溶血试验
图2屎肠球菌LCT-EF297biolog试验
图3屎肠球菌LCT-EF297和地面对照组的差异基因比较
图4屎肠球菌LCT-EF297的糖酵解通路
具体实施方式
本发明设计方案中采用自制的空间搭载装置进行细菌搭载，依据：HYK-GF15《航天员系统载人运输飞船/目标飞行器舱载产品环境试验技术条件》，该装置通过了冲击、快速减压、震动实验。屎肠球菌接种到样本管中，培养基为LB琼脂半固体培养基，封装入样品包，材料为蓝色美塔斯阻燃布料，代号为20111001。搭载在我国神州八号飞船舱内，于2011年11月1日5时58分发射于酒泉卫星发射中心，共在轨运行397小时，自主飞行高度370km，全程运行1100万公里，获得太空屎肠球菌LCT-EF297菌株。同时设置地面对照组，与试验组培养条件相同，并根据实时卫星传输信息，调节地面对照组温度同于太空试验组。
对屎肠球菌LCT-EF297革兰氏染色观察形态，进行生化反应试验、溶血试验、通过PCR技术进行16srDNA鉴定。采用高通量Illumina测序技术，对屎肠球菌LCT-EF297菌株DNA进行paired-end测序，构建500bp的小片段文库和6000bp大片段的文库，对原始数据进行过滤后运用基因SOAPdenovo组装软件对reads数据进行组装，得到15个scaffold序列，最终组装得到菌株的全基因组序列。屎肠球菌(Enterococcus faecium)LCT-EF297全基因组序列包括15个Scaffold，全基因组序列长2,668,148bp，GC含量38.00％，具有2,639个潜在蛋白编码基因。基因注释主要基于蛋白序列比对。使用BLAST软件将基因的序列与各数据库(包括KEGG、COG、GO、NR、Swissprot、Trembl、VFDB、ARDB、CAZY和RegulonDB 等)进行比对，并手工进行多种相似性搜索，得到对应的基因功能注释信息。
提取屎肠球菌LCT-EF297菌株总RNA，用试剂盒去除rRNA，加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase l合成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina HiSeqTM 2000进行测序。将原始序列数据去除杂质数据后统计rRNA统计、评价Reads在基因组上的分布基因覆盖度、统计基因表达量差异、分析差异表达基因。
从屎肠球菌LCT-EF297样品中提取蛋白，对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后续充分酶解蛋白。用GE公司的2Dquant kit法进行蛋白质的浓度测定，等体积进行SDS(十二烷基磺酸钠)电泳，之后酶解蛋白，用iTRAQ试剂标记肽段，将标记后的肽段进行等量混合后的肽段使用强阳离子交换色谱(Strong Cation ExchangeChoematography，SCX)进行预分离，再进行液相串联质谱(liq uidchromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。对质谱下机的原始文件，进行峰识别，得到峰列表；建立参考数据库，进行肽段及蛋白质的鉴定。
根据测序及注释结果进一步比对屎肠球菌LCT-EF297的毒力基因，包括细胞溶解素激活基因cylA等溶血相关基因，该菌株无毒力基因。另外进行屎肠球菌LCT-EF297溶血试验，没有溶血现象；证实LCT-EF128GL001980基因编码细菌素(bacteriocin)enterocin B；并绘制糖酵解代谢通路，证实屎肠球菌LCT-EF297的糖酵解途径在蛋白和转录两个层面均呈现为高表达。
通过以上实施方案最终达到发明目的，获得一种无毒力、可以产生细菌素、高效糖酵解代谢的屎肠球菌LCT-EF297，该发明可用于维持宇航员肠道菌群平衡和制作太空发酵乳食品。
实施例1、屎肠球菌LCT-EF297的溶血试验
溶血试验采用点种法，将菌株点种于血琼脂培养基上，37℃恒温，倒置培养，结果在屎肠球菌LCT-EF297的菌落周围没有溶血圈，见图1。从图中可以看出，屎肠球菌LCT-EF297没有溶血现象。
实施例2、屎肠球菌LCT-EF297的biolog试验
1)菌悬液制备：取出太空菌株屎肠球菌LCT-EF297和地面对照菌株的斜面，用灭菌竹签蘸取菌种接种在LB液体培养基中(4ml体系)培养24h。然后取2ml菌液6000r/s，离心5min，弃上清培养基，留下离心的菌体。然后用灭菌的生理盐水洗涤菌体，6000r/s，离心5min，再次弃去上清，用Biolog接种液进行悬浮菌体，最后再转至15ml的接种液中，调至浓度约107～108。
2)接种：将以上菌悬液倒到接种皿中，震荡均匀，用12道(或8道)排枪进行加样，每个Biolog板孔加样100ul，共96孔，加完样后，盖上Biolog板盖，放置在37℃下培养，24h进行观察，并记录结果。
3)由图可以看出，LCT-EF297菌株较地面对照组可利用更多的碳源，包括D-山梨醇(D1)、糊精(A2)、甲基丙酮酸(G2)、D-松二糖(A8)和乙酸(H8)，见图2，其中图2a为屎肠球菌LCT-EF297和图2b为地面对照菌株。
4)通过biolog试验证实屎肠球菌LCT-EF297除了可以发酵葡萄糖等，可以利用或发酵包括糊精、山梨醇和松二糖在内的多种碳源，屎肠球菌LCT-EF297是一种利于生产利用的益生菌。
实施例3、屎肠球菌LCT-EF297的基因组、转录组测序和蛋白组学分析
对屎肠球菌LCT-EF297利用高通量Illumina测序技术进行全基因组测序，屎肠球菌LCT-E F297的全基因组序列包括15个Scaffold，全基因组序列长2,668,148bp,GC含量38.00％，具有2,639个潜在蛋白编码基因。
屎肠球菌LCT-EF297在转录水平与地面对照组比较有差异表达基因2117个，其中37个基因转录下调，2080个基因转录上调，FDR≤0.001，|log2Ratio|≥1，见图3，其中红色代表基因上调，绿色代表基因下调。由图3可以看出屎肠球菌LCT-EF297与对照组在转录水平存在显著差异。
屎肠球菌LCT-EF297在蛋白质翻译水平与地面对照组比较有差异表达基因53个，其中21个蛋白翻译量增高，其中32个蛋白翻译量下降，蛋白丰度差异倍数超过1.2倍以上、经统计检验其p-value值小于0.05、三次重复中至少两次重复中达到上述要求。由此证实屎肠球菌LCT-EF297与对照组在蛋白组学方面存在显著差异。
通过上述实验获得了太空菌株屎肠球菌LCT-E F297的全基因组序列、进行了基因功能注释，并在基因组、转录组和蛋白质水平详尽地阐明了该太空菌株的特性。
实施例4、屎肠球菌LCT-EF297的糖酵解代谢通路
屎肠球菌是一种乳酸菌，兼性厌氧，通过糖酵解途径发酵葡萄糖可产生大量乳酸，显著降低人和动物肠道的pH值，在维系肠道菌群的生态平衡中发挥了重要作用。我们试验证实LCT-EF297菌株在太空环境中糖酵解通路上的关键酶在蛋白表达和转录水平均较地面对照组上调，见图4。该发明说明屎肠球菌LCT-EF297糖酵解途径增强，可以发酵产生更多量的乳酸，在维系宇航员肠道菌群生态平衡中发挥重要作用，可见屎肠球菌LCT-EF297可用于生产太空人员调节肠道菌群失调的药物开发，也可以用于太空健康发 酵乳食品的生产应用。
实施例5、屎肠球菌LCT-EF297的毒力基因
屎肠球菌是一种条件致病菌，具有透明质酸酶、等多种致病因子，而且可以形成生物被膜，另外毒力因子还可以通过质粒转移到其他菌株，使致病性在菌种间扩散，甚至从动物播散到人类。我们对太空菌株屎肠球菌LCT-EF297进行溶血试验为阴性结果，该菌株也没有细胞溶解素激活基因cylA、透明质酸酶hyl基因、明胶酶基因gelE、肠球菌表面蛋白基因esp、胶原蛋白粘附素基因ace、聚集物质基因agg和粪肠球菌心内膜炎抗原基因efaA等毒力基因存在。由此可见空间屎肠球菌LCT-EF297是一株没有毒力的益生菌。
实施例6、屎肠球菌LCT-EF297的细菌素表达及核苷酸序列
屎肠球菌还可以产生细菌素等抑菌因子，细菌素是一种蛋白质，能够抑制金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌和大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌等革兰氏阴性菌的生长，在益生菌的抑菌作用中发挥重要作用。屎肠球菌LCT-EF297菌株的LCT-E F128G L001980基因编码细菌素bacteriocin。LCT-EF128GL001980基因序列和其编码的细菌素氨基酸序列如下。
6.1LCT-EF128GL001980基因序列：
＞LCT-EF128GL001980locus＝Scaffold1：1971249：1971464：+
ATGCAAAATGTAAAAGAATTAAGTACGAAAGAGATGAAACAAATTATCGGTGGAGAAAATGATCACAGAATGCCTAATGAGTTAAATAGACCTAACAACTTATCTAAAGGTGGAGCAAAATGTGGTGCTGCAATTGCTGGGGGATTATTTGGAATCCCAAAAGGACCACTAGCATGGGCTGCTGGGTTAGCAAATGTATACTCTAAATGCAACTAA
6.2 LCT-EF128GL001980蛋白氨基酸序列：
＞LCT-EF128GL001980 locus＝Scaffold1：1971249：1971464：+
MQNVKELSTKEMKQIIGGENDHRMPNELNRPNNLSKGGAKCGAAIAGGLFGIPKGPLAWAAGLANVYSKCN
通过太空搭载技术，我们获得空间屎肠球菌LCT-EF297菌株，该菌株没有毒力，是一种益生菌，不仅用于保持宇航员肠道菌群平衡，还可用于太空药物、保健品及健康发酵乳食品的生产。
关于保藏的LCT-EF297菌株的说明
A.菌种的保藏单位名称和地址
名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所
B.交机构保藏的日期
2012年9月5日
C.保藏机构给予的保藏号
CGMCC No.6526
D.分类命名屎肠球菌Enterococcus Faecium
Claims (1)
1. 一种空间屎肠球菌（Enterococcus faecium）LCT-EF297，保藏号为CGMCC No.6526。
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