CN103875893A - 多菌种复合微生物饲料添加剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及饲料添加剂领域，具体公开了一种多菌种复合微生物饲料添加剂及其制备方法。所述多菌种复合微生物饲料添加剂包括芽孢杆菌26%-32%、粪肠球菌15%-18%、酿酒酵母0.2%-0.3%、益生元10.8%-17.2%、硫酸盐4.7%-8.5%、碘化钾0.2%-0.4%、亚硒酸钠0.2%-0.3%、石粉32%-35%；所述原料依序经液体深层发酵、固定封闭发酵形成复合微生物饲料添加剂。本发明可使肠道中的有害菌落减少，有效发挥调理保健、提高饲料利用率、防病促长、减少抗生素等药物使用，提高畜禽产品品质的功效，减少腐败物质生成，减轻排泄物臭味，改善养殖环境。

Description

多菌种复合微生物饲料添加剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及饲料添加剂领域，具体涉及一种多菌种复合微生物饲料添加剂及其制备方法。

背景技术

食品安全已成为一个世界性的挑战和全球重要的公共卫生问题，动物源食品的安全是全世界关注的焦点，而抗生素和化学药物残留问题是影响动物源食品安全的重要因素之一。饲用抗生素虽能预防动物下痢等疾病，促进动物生长，提高养殖业经济效益，但是动物长期、过量或违规使用饲用抗生素后，导致养殖产品药物残留，通过食物链被人体吸收产生严重不良后果，同时引起耐药菌株扩散，对动物、人和生态环境造成危害，引起动物菌群失调，抑制动物的免疫力，继发二次感染。

我国畜牧产品品质差，安全问题十分突出，与动物饲料中滥用抗生素、合成药品与激素有直接关系。我国的畜牧食品，在卫生质量方面不能与国际接轨，既给中国消费者带来安全威胁，还在进口国受到了不断遏制。尽管我国是世界上肉类生产大国，但是肉类出口量仅占生产量的0.9%-1.2%。近年来，我国畜禽产品药物残留的发生率多达40%～60%，每年因残留超标而致进口国拒收、退货、索赔、终止合同的事件时有发生，在经济上和政治上都造成不良影响。

饲用抗生素对人类健康和生存环境造成的不良后果，已引起各级政府及广大消费者的极大关注，市场上要求“无抗养殖产品”的呼声也越来越高。然而，饲料中不添加抗生素时，动物拉稀、下痢严重，发病甚至死亡率高，养殖动物生产性能严重下降。发达国家对饲料卫生安全、药残危害十分重视，早在1996年瑞士就开始限制部分抗生素用作饲料添加剂，欧盟于2006年全面禁止在饲料中添加抗生素。美国、日本等国也不断加强对饲用抗生素的限制。为了确保我国动物源食品的质量安全，保障人民身体健康，提高我国畜禽产品在国际市场中的竞争力，扩大畜禽产品的出口，同时保证我国养殖业的可持续健康发展，开发生产安全高效的新型饲用抗生素替代产品迫在眉睫。

微生物饲料添加剂是指能改善动物胃肠道微生物生态平衡，有益于动物健康和生产性能发挥的一类饲料添加剂。微生物饲料添加剂作为一种可供直接饲喂的微生物添加剂，在提高机体免疫力，预防疾病，提高生产性能和改善养殖环境的作用得到越来越多畜牧业从业者的认可。

当前，饲料企业和规模化养殖企业对微生物饲料添加剂的使用越来越普遍，使用效果也得到充分肯定。微生物饲料添加剂的主要客户对象是广大规模化养殖企业、养殖户和中小型饲料厂，这种新型的生物制剂正以其独特的功能影响着日益发展的畜牧业，随着微生态学研究的进一步深入以及人们对绿色、安全和环保意识的不断增强，微生物饲料添加剂的应用前景非常广阔。

目前，国内微生物饲料添加剂产业处于起步发展阶段，从事活性微生物饲料添加剂开发应用的企业大约有400家左右，获得农业部生产批文的约有140多家。国内微生物饲料添加剂年销售额大约在20亿人民币，销售额在1亿元以上的不足5家，产品年销售额在3,000万元以上不过几十家，大多数企业的年销售额在1,000万元以下。根据目前国内饲料年生产总量和猪、禽、反刍和水产动物的养殖总量来计算，国内微生物饲料添加剂的市场容量在200亿元至250亿元之间，目前市场推广普及率约为10%，市场空间极大，产业发展前景十分广阔。

开发多菌种多菌种复合微生物饲料添加剂意义重大：①符合国家法律法规，与国家产业政策导向一致；②有利于防疫和环境保护；③有利于多生产安全、健康、无污的优质食品，提高出口产品的竞争力，激活国内市场，改善供需平衡关系，让广大国民能有更多机会吃上放心肉；④也有利于节约资源，减少某些矿物元素的使用量（如磷、铜、锌等），促进粮食及其副产品的转化增值；⑤有利于开发利用一些本地资源（如稻谷、小麦、麸皮、菜粕、棉粕等），带动农民增收致富；⑥有利于壮大龙头企业，充分发挥龙头企业的技术及产品优势，带动养殖业产业化发展，适应国内畜牧业对安全优质饲料的需要。有利于促进我国畜牧业经济效益、社会效益、生态效益的同步增长，有利于构建和谐社会，加快建设社会主义新农村的进程，具有重大的现实意义和深远的历史意义。

发明内容

本发明提供一种多菌种复合微生物饲料添加剂，其使肠道中的有害菌落减少，有效发挥调理保健、提高饲料利用率、防病促长、减少抗生素等药物使用，提高畜禽产品品质的功效，减少腐败物质生成，减轻排泄物臭味，改善养殖环境。

本发明还提供一种多菌种复合微生物饲料添加剂的制备方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种多菌种复合微生物饲料添加剂，其包括如下重量比例的组分：

芽孢杆菌26%-32%、粪肠球菌15%-18%、酿酒酵母0.2%-0.3%、益生元10.8%-17.2%、硫酸盐4.7%-8.5%、碘化钾0.2%-0.4%、亚硒酸钠0.2%-0.3%、石粉32%-35%。

优选地，所述多菌种复合微生物饲料添加剂，其包括如下重量比例的组分：

芽孢杆菌26%-32%、粪肠球菌15%-18%、酿酒酵母0.2%-0.3%、甘露寡糖7%-9%、小肽制剂2%-4%、维生素1.8%-4.2%、硫酸盐4.7%-8.5%、碘化钾0.2%-0.4%、亚硒酸钠0.2%-0.3%、石粉32%-35%。

优选地，所述多菌种复合微生物饲料添加剂，其包括如下重量比例的组分：

芽孢杆菌29.2%、粪肠球菌16.3%、酿酒酵母0.23%、甘露寡糖8%、小肽制剂3%、维生素3%、硫酸盐6.08%、碘化钾0.27%、亚硒酸钠0.22%、石粉33.7%。

优选地，所述多菌种复合微生物饲料添加剂，其包括如下重量比例的组分：

地衣芽孢杆菌11.5%-13.5%、侧孢芽孢杆菌5.5%-7.5%、枯草芽孢杆菌9%-11%、粪肠球菌15%-18%、酿酒酵母0.2%-0.3%、甘露寡糖7%-9%、小肽制剂2%-4%、维生素A 1%-2%、维生素D 0.5%-1.5%、维生素E 0.3%-0.7%、硫酸铜0.4%-0.9%、硫酸锌1%-2%、硫酸亚铁2%-3%、硫酸锰1%-2%、硫酸钴0.3%-0.6%、碘化钾0.2%-0.4%、亚硒酸钠0.2%-0.3%、石粉32%-35%。

优选地，所述多菌种复合微生物饲料添加剂，其包括如下重量比例的组分：

400亿/克的地衣芽孢杆菌11.5%-13.5%、150亿/克的侧孢芽孢杆菌5.5%-7.5%、300亿/克的枯草芽孢杆菌9%-11%、30亿/克的粪肠球菌15%-18%、200亿/克的酿酒酵母0.2%-0.3%、95%的甘露寡糖7%-9%、95%的小肽制剂2%-4%、50万IU/g的维生素A 1%-2%、50万IU/g的维生素D 0.5%-1.5%、50%的维生素E 0.3%-0.7%、98%的硫酸铜0.4%-0.9%、98%的硫酸锌1%-2%、98%的硫酸亚铁2%-3%、98%的硫酸锰1%-2%、5%的硫酸钴0.3%-0.6%、5%的碘化钾0.2%-0.4%、5%的亚硒酸钠0.2%-0.3%、98%的石粉32%-35%。

优选地，所述多菌种复合微生物饲料添加剂，其包括如下重量比例的组分：

     地衣芽孢杆菌12.5%、侧孢芽孢杆菌6.7%、枯草芽孢杆菌10%、粪肠球菌16.3%、酿酒酵母0.23%、甘露寡糖8%、小肽制剂3%、维生素A 1.5%、维生素D 1%、维生素E 0.5%、硫酸铜0.5%、硫酸锌1.3%、硫酸亚铁2.5%、硫酸锰1.3%、硫酸钴0.48%、碘化钾0.27%、亚硒酸钠0.22%、石粉33.7%%。

优选地，所述多菌种复合微生物饲料添加剂，其包括如下重量比例的组分：

    400亿/克的地衣芽孢杆菌12.5%、150亿/克的侧孢芽孢杆菌6.7%、300亿/克的枯草芽孢杆菌10%、30亿/克的粪肠球菌16.3%、200亿/克的酿酒酵母0.23%、95%的甘露寡糖8%、95%的小肽制剂3%、50万IU/g的维生素A 1.5%、50万IU/g的维生素D 1%、50%的维生素E 0.5%、98%的硫酸铜0.5%、98%的硫酸锌1.3%、98%的硫酸亚铁2.5%、98%的硫酸锰1.3%、5%的硫酸钴0.48%、5%的碘化钾0.27%、5%的亚硒酸钠0.22%、98%的石粉33.7%。

优选地，所述侧孢芽孢杆菌制剂的制备方法为：菌种——试管斜面菌种培养——摇瓶菌种培养——种子罐深层液体发酵培养——封闭式固体发酵箱培养——侧孢芽孢杆菌制剂半成品——检测合格。

本发明还提供一种多菌种复合微生物饲料添加剂的制备方法，是利用权利要求1-7任一项所述原料依序经液体深层发酵、固定封闭发酵形成。

优选地，所述液体深层发酵的培养条件为：30-32℃培养18-24h；所述固定封闭发酵培养条件为：30-31℃培养36-40h。

本发明所述的多菌种复合微生物饲料添加剂，其有益效果为：

本项目产品应用于畜禽养殖和水产养殖，在进入动物肠道后能迅速活化、繁殖并形成优势的有益菌群，使肠道中的有害菌落减少，有效发挥调理保健、提高饲料利用率、防病促长、减少抗生素等药物使用及提高畜禽产品品质的功效，具体是：

1）抑制病原菌，改善肠道功能。菌种通过竞争和拮抗作用，抑制和阻止病原菌在肠道繁殖，使养殖动物不发病或少发病，同时促进乳酸类菌等有益微生物的繁殖，改善肠道的消化吸收功能，提高饲料利用率，促进养殖动物生长，提高经济效益。

2）调节机体微生态平衡。本项目产品通过促进有益微生物的繁殖，调节并维持养殖物体内的微生态平衡，增强生理机能，使机体始终保持最佳生理状态，从而有效地减少或消除各种应激状态下的不良反应，改善养殖物健康状况。

3）通过有益微生物活动，提高肠道消化功能，有效减少腐败物质生成，减轻排泄物臭味，改善了养殖环境。

附图说明      

 图1为所述多菌种复合微生物饲料添加剂的制备工艺流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

本发明所述的多菌种复合微生物饲料添加剂，是芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌以及益生元配合在一起形成的。其包括如下重量份的组分：芽孢杆菌26%-32%、粪肠球菌15%-18%、酿酒酵母0.2%-0.3%、益生元10.8%-17.2%、硫酸盐4.7%-8.5%、碘化钾0.2%-0.4%、亚硒酸钠0.2%-0.3%、石粉32%-35%。将上述原料经液体深层发酵、固定封闭发酵制得。

实施例1：

本发明所述多菌种复合微生物饲料添加剂，其包括如下重量比例的组分：

芽孢杆菌29.2%、粪肠球菌16.3%、酿酒酵母0.23%、甘露寡糖8%、小肽制剂3%、维生素3%、硫酸盐6.08%、碘化钾0.27%、亚硒酸钠0.22%、石粉33.7%。

如附图1所示，将上述原料依序经液体深层发酵、固定封闭发酵制成所述的多菌种复合微生物饲料添加剂。所述液体深层发酵的培养条件为：30-32℃培养18-24h；所述固定封闭发酵培养条件为：30-31℃培养36-40h。

实施例2：

本发明所述多菌种复合微生物饲料添加剂，其包括如下重量比例的组分：

地衣芽孢杆菌12.5%、侧孢芽孢杆菌6.7%、枯草芽孢杆菌10%、粪肠球菌16.3%、酿酒酵母0.23%、甘露寡糖8%、小肽制剂3%、维生素A 1.5%、维生素D 1%、维生素E 0.5%、硫酸铜0.5%、硫酸锌1.3%、硫酸亚铁2.5%、硫酸锰1.3%、硫酸钴0.48%、碘化钾0.27%、亚硒酸钠0.22%、石粉33.7%。      

如附图1所示，将上述原料依序经液体深层发酵、固定封闭发酵制成所述的多菌种复合微生物饲料添加剂。所述液体深层发酵的培养条件为：30-32℃培养18-24h；所述固定封闭发酵培养条件为：30-31℃培养36-40h。

实施例3：

本发明所述多菌种复合微生物饲料添加剂，其包括如下重量比例的组分：

400亿/克的地衣芽孢杆菌12.5%、150亿/克的侧孢芽孢杆菌6.7%、300亿/克的枯草芽孢杆菌10%、30亿/克的粪肠球菌16.3%、200亿/克的酿酒酵母0.23%、95%的甘露寡糖8%、95%的小肽制剂3%、50万IU/g的维生素A 1.5%、50万IU/g的维生素D 1%、50%的维生素E 0.5%、98%的硫酸铜0.5%、98%的硫酸锌1.3%、98%的硫酸亚铁2.5%、98%的硫酸锰1.3%、5%的硫酸钴0.48%、5%的碘化钾0.27%、5%的亚硒酸钠0.22%、98%的石粉33.7%。如附图1所示，将上述原料依序经液体深层发酵、固定封闭发酵制成所述的多菌种复合微生物饲料添加剂。所述液体深层发酵的培养条件为：30-32℃培养18-24h；所述固定封闭发酵培养条件为：30-31℃培养36-40h。

配方如表一。

 

实施例4：

本发明所述多菌种复合微生物饲料添加剂，其包括如下重量比例的组分：

400亿/克的地衣芽孢杆菌11.5%、150亿/克的侧孢芽孢杆菌7.5%、300亿/克的枯草芽孢杆菌9%、30亿/克的粪肠球菌18%、200亿/克的酿酒酵母0.2%、95%的甘露寡糖7%、95%的小肽制剂2%、50万IU/g的维生素A 1%、50万IU/g的维生素D 1.5%、50%的维生素E 0.7%、98%的硫酸铜0.4%、98%的硫酸锌1%、98%的硫酸亚铁2%、98%的硫酸锰2%、5%的硫酸钴0.6%、5%的碘化钾0.4%、5%的亚硒酸钠0.2%、98%的石粉35%。

如附图1所示，将上述原料依序经液体深层发酵、固定封闭发酵制成所述的多菌种复合微生物饲料添加剂。所述液体深层发酵的培养条件为：30-32℃培养18-24h；所述固定封闭发酵培养条件为：30-31℃培养36-40h。

实施例5：

本发明所述多菌种复合微生物饲料添加剂，其包括如下重量比例的组分：

400亿/克的地衣芽孢杆菌13.5%、150亿/克的侧孢芽孢杆菌5.5%、300亿/克的枯草芽孢杆菌11%、30亿/克的粪肠球菌15%、200亿/克的酿酒酵母0.3%、95%的甘露寡糖9%、95%的小肽制剂4%、50万IU/g的维生素A 2%、50万IU/g的维生素D 0.5%、50%的维生素E 0.5%、98%的硫酸铜0.9%、98%的硫酸锌2%、98%的硫酸亚铁2%、98%的硫酸锰1%、5%的硫酸钴0.3%、5%的碘化钾0.2%、5%的亚硒酸钠0.3%、98%的石粉32%。

如附图1所示，将上述原料依序经液体深层发酵、固定封闭发酵制成所述的多菌种复合微生物饲料添加剂。所述液体深层发酵的培养条件为：30-32℃培养18-24h；所述固定封闭发酵培养条件为：30-31℃培养36-40h。

以上实施例1-5中，从发酵结果来看，侧孢芽孢杆菌WY9701 菌株、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母和乳酸菌都有较高的活菌数，枯草芽抱杆菌较低达到了9.79x10⁸cfu/ml。 

本发明采用全封闭自控式固体发酵设备，采用先进的“液体深层+固体封闭” 连续发酵及后处理工艺，实现固体发酵的整个过程中对培养基成分、配方、温度、湿度、通风、PH值等环境条件进行自动化检测、电子显示、自动控制，不仅大幅度提高产品产量，而且保证了产品质量。

侧孢芽孢杆菌WY9701 菌株、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌组合，并佐以益生元联合应用，显著提高产品的功效。

主要技术指标：

1）有效活菌数总菌数200亿CFU/克；杂菌率≤5%；PH值为6.0-9.5；水分≤10%；细度（通过孔径0.18mm的标准筛）≥90%，刺激圈≥20mm，抑菌率≥50%。无毒。

试验证明，使用本项目可产品减少3-5%的饲料用量和30-50%发病率，用于预防疾病和促进生长的抗生素等药物成本降低30%以上，降低50%以上的氨气、吲哚等有害气体的浓度，N、P 排放减少5-10%。

以上实施例1-5中，各菌种特性为：

侧孢芽孢杆菌WY9701

1、形态学特性：

形状及排列：菌体杆状，端稍细，单生成对、成堆；芽孢呈椭圆形，（1～1.2）×（2.5～3）μm，附着于芽孢一侧有独木舟形体，芽孢在纺锤形孢囊中侧生、中生。

运动及鞭毛：能运动。

2、生理特性

（1）明胶穿刺培养：液化：阳性；液化速度：慢，弱。

（2）淀粉水解：阴性。

（3）与氧的关系：有氧、无氧均能生长。

（4）酪蛋白水解：阳性。

（5）酪氨酸水解：阴性。

（6）二羟丙酮的形成：阴性。

3、培养学特性

4、与温度的关系

培养基：J-肉汁；PH值：7.3~7.5

最高温度：47℃；

最适温度：31~33℃；

耐受温度：80℃，10分钟。

5、菌种发酵过程中代谢产物及其特性：

（1）产生抑菌物质。侧孢芽孢杆菌发酵过程中分泌了一些广谱的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗支原体的多肽类物质，为一种胞外蛋白酶，能够抑制土壤中病原菌的生长，如烟草花叶病菌、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌等。而且该抑菌物质在高温条件下性质稳定；在碱性条件下比酸性条件下稳定；对胰蛋白酶和蛋白酶 K不敏感，活性比较稳定。

（2）侧孢芽孢杆菌具有解磷、解钾、固氮等多种生物学功能，能产生杀虫蛋白抑菌物质。研究表明侧孢芽孢杆菌能够降解水胺硫磷等高毒性农药残留物质，菌株降解水胺硫磷产生O，O ’—二甲氧基硫代磷酰胺酯和水杨酸异丙酯等中间产物，O，O’—二甲氧基硫代磷酰胺酯可进一步分解成无机磷、硫化物、 氨气等产物；水杨酸异丙酯降解为水杨酰胺、水杨酸及其它有机酸， 进一步降解为二氧化碳和水，毒性显著降低。

（3）侧孢芽孢杆菌生长过程中能够分泌生长因子及SOD酶，促进植物根系的生长。

6、菌剂技术参数：有效活菌数≥120亿/克。

地衣芽孢杆菌

1、形态学特征

菌体杆状，1.5～3.0×0.6～0.8μm，无荚膜，不成链，染色均匀，能运动。革兰氏染色阳性。

芽孢为椭圆至柱形，中生或次端生，1.0～1.5×0.6～0.9μm。

2、培养特征

琼脂斜面	生长旺盛，粗糙，不透明，粘着，扩展，有毛状枝条。
		葡萄糖琼脂斜面	生长丰厚，有皱纹，表面有试挤出的小滴或粘液状囊，沿接种线有毛状枝条。
葡萄糖硝酸盐琼脂斜面	生长慢，有毛状枝条，暗白色至褐红色。
		豆芽汁琼脂斜面	生长较弱，褐色至浅红色，有挤出的小滴。
肉汁琼脂平板	菌落大，扩展，表面粗糙或具皱纹，有毛状枝条，暗白色
		明胶平板	生成宽的水解区带。
牛奶平板	有狭窄的水解酪素区带
		马铃薯块	生长稠密，扩展，皱褶、疣状，有挤出的小滴，粉红色。马铃薯内部红色至紫色。
肉汁	清，具有厚的皱褶的坚硬的膜。
		NaCl肉汁	在5～8%NaCl肉汤中生长良好。

3、生理特征：

（1）明胶穿刺：快速的呈漏斗状至层状液化。

（2）淀粉水解：阳性。

（3）V.P.试验：阳性

（4）柠檬酸盐：利用。

（5）硝酸盐还原：阳性。

（6）卵磷脂酶试验：阴性。

（7）氮源利用：能利用铵盐为氮源。

（8）碳水化合物利用：由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、蔗糖和甘露醇产酸但不产气。

（9）最适生长温度：30～45℃。

4、菌剂发酵过程中代谢产物及其特性研究

地衣芽孢杆菌所产生的抗菌物质主要是一些蛋白类抗菌物质(几丁质酶、抗菌蛋白、多肽类)，地衣芽孢杆菌可产生苯乙酸一类的抗菌物质。抗菌物质抑制植物病原菌的途径有：作用于病原菌的细胞壁、细胞膜；与膜相关的受体蛋白相互作用；作用于能量代谢系统；提高植物的抗病力。地衣芽孢杆菌对植物的真菌性病害有较好的抑制效果。如烟草黑胫病、番茄灰霉病、棉花枯萎和黄萎病等。

5、   菌剂技术参数：有效活菌数≥400亿/克。

枯草芽孢杆菌

1、菌株特性：

枯草芽孢杆菌，是枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。

枯草芽孢杆菌理化特性：专性好氧，不具凝乳作用，过氧化氢实验、硝酸盐还原实验、苯丙氨酸脱氨酶实验阴性；分解葡萄糖产酸不产气，能分解阿拉伯糖、甘露醇、明胶、淀粉。

2、培养学特性：

细菌固体培养基具有对设备条件要求低、耗能低、繁殖率高的特点。适合枯草芽孢杆菌生长的培养基：营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、固体培养基。

 培养方法：将芽孢杆菌菌种在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上，然后在恒温箱内37℃培养24 h，即可见到一层白色圆整、边缘光滑的枯草芽孢杆菌菌落。将固体培养基上已培养好的芽孢杆菌无菌接种到5 ml营养肉汤培养基中摇匀，37℃摇床内培养24 h，然后接种到100 ml的豆浆中，37℃振荡培养24 h备用。

3、菌种选育：

1）紫外诱变

   取培养至对数生长期的枯草芽孢杆菌菌液离心，取沉淀收集细胞，用无菌生理盐水洗涤2次。玻璃珠震荡15min。分别取10ml菌悬浮于5个直径9cm的无菌培养皿中，摇匀。无菌条件下在30W，60CM的紫外灯下打开培养皿分别照射60s、90 s、120 s、150 s、180 s.不同诱变时间处理的菌悬浮液各取1 ml加入液体种子培养基中37℃黑暗条件下培养24h。

2）诱变菌株筛选

   培养24 h的枯草芽孢杆菌吸取1 ml于装有9 ml无菌水的试管中，摇匀；再从中吸取1 ml菌悬液，重复上个步骤，直至稀释到10-4。用异步培养法挑选高产单菌落。即将稀释到10-5的菌悬浮液涂布平板，然后将其倒扣于装有一层氯仿的培养皿盖熏蒸50 min，让菌落固定在固体培养基表面。移去培养皿盖，让平板中的氯仿挥发40 min。再取0.5 ml107~108cfu/ml 的大肠杆菌菌悬浮液涂布在此平板上。待平板晾干后37℃培养72 h。取所有平板中抑制圈最大的单菌落扩大培养。

酿酒酵母

酿酒酵母属于真菌，兼性厌氧的一类微生物。酿酒酵母在人或动物胃肠道中所占比例较小，但其有丰富的营养物质。酿酒酵母菌体蛋白占干物质的32%~75%，酿酒酵母细胞中含有20多种氨基酸，4.5%~8.5%的核糖核酸和多种维生素，其中B族维生素含量极其丰富。酿酒酵母细胞壁主要成分有甘露寡糖(6. 6%)、β-葡聚糖(57%)、糖蛋白22%，还有少量的其他蛋白质、几丁质、脂类和灰分等。

酿酒酵母细胞内还有丰富的酶类，如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、植酸酶、葡聚糖酶及几丁质酶等，这些酶可以协同肠道内酶类分解营养物质，提高动物的消化能力，提高饲料报酬。植酸酶可以使植物中的有机磷得到有效利用，减少粪便中有机磷的排放，减少了对环境的污染。此外，酿酒酵母还是生产单细胞蛋白的主要微生物类群。大量试验表明，饲喂酵母菌蛋白饲养效果明显。

乳酸菌（粪肠球菌）

粪肠球菌为兼性厌氧菌，是动物肠道中的优势菌种。粪肠球菌能发酵碳水化合物产乳酸，降低肠道pH值，抑制肠道腐败菌的生长，促进肠道微生态平衡，防止动物肠道菌群区系紊乱，还能分解蛋白质为小肽、合成B族维生素等功效。它也能增强巨噬细胞的活性，促进动物的免疫反应，提高抗体水平。粪肠球菌的生理特性有如下几点：

1)粪肠球菌分泌的乳酸为L型乳酸，又称为自然乳酸，可全被动物吸收利用。乳酸杆菌分泌的乳酸L型和D型都有，但D型则不能被动物吸收利用。在动物的肠道里，粪肠球菌可在肠内形成生物薄膜附着在肠道粘膜上，可以在肠道内发育、生长、繁殖，繁殖时问很短，19min分裂一次。粪肠球菌还可把部分蛋白质分解成酰胺和氨基酸，把大部分的碳水化合物的无氮浸出物转化为乳酸，而且能使饲料里的纤维变软，所以饲料的转化吸收率就比较高。粪肠球菌分解的这些特殊营养成分弥补了常规饵料的营养缺陷，对各种养殖动物幼体起到了十分重要的营养强化和促生长作用。

2)粪肠球菌产生的抗菌物质大多是肽或蛋白质，被称为细菌素。粪肠球菌可分泌两类细菌素，一类仅只是对相关的菌有抑制作用，抗菌谱较窄，可阻碍病原微生物接触肠粘膜细胞；另一类具有广谱抗菌活性，它们对致病菌如：沙门氏菌、致贺氏病和假单孢菌都有很好的抑制作用。所以，长期在饲料中添加粪肠球菌可以减少养殖动物肠炎等疾病的发生。粪肠球菌在生长和代谢过程中产生对养殖动物有益的营养物质，如乳酸、氨基酸、维生素、酶及抑菌物质。在畜禽养殖过程中，添加了粪肠球菌不仅有利于提高饲料的消化率，同时也相应降低了排泄物中的氨态氮的浓度，减少了排泄物的不消化物，改善了饲养环境，减少了污染，既有防腐作用又增加饲料的风味，促进养殖动物的食欲。

3)由于饲料中饼粕、麦麸等农副产品中的植酸磷含量较高，对钙等矿物质元素利用造成影响，而在粪肠球菌的生理作用下通过催化、水解等反应分泌出的L-乳酸，它可以对钙质合成L-乳酸钙，促进养殖动物对钙质的吸收。所以饲料中添加粪肠球菌可减少养殖中有机物和矿物质排泄量，有效地减少水质污染。

益生元的功能作用

1）甘露寡糖

甘露寡糖是由β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖如魔芋粉、瓜儿豆胶、槐豆胶等植物多糖制得的，由2-10个单糖（甘露糖、葡萄糖和半乳糖）分子通过β-1,4-D-甘露吡喃糖苷键连接而成的直链或支链低度聚合糖。

甘露寡糖含有大量不能被消化酶切断的化学键，在小肠中几乎不能被消化利用，某些对动物体有害的微生物如大肠杆菌、沙门氏菌等，以葡萄糖作为主要的能源，而有益菌如双歧杆菌、乳酸杆菌等则是以寡糖为主要能源。因此，在饲料中添加甘露寡糖有助于肠道有益菌的增殖。甘露寡糖进入消化道后段经浓缩才能被动物消化道菌群中的有益菌选择性发酵利用，以有机酸、CH4  、CO2  、H2的形式释放或参与代谢，提供能量。同时，发酵产生的酸性物质会使整个肠道的pH值下降，能抑制有害菌的生长。

甘露寡糖还能够促进免疫器官的发育，具有激发或增强机体免疫的功能。甘露寡糖作为益生元添加到饲料中，可以促进乳酸菌等有益菌的增殖，形成优势菌群，调节肠道平衡，抑制胃肠道疾病，促进动物生长。

2）免疫肽

肽是指氨基酸彼此以肽键(酰胺键)相互连接的化合物，含有少量(2-6个)氨基酸残基的肽称为小肽或寡肽。小肽通常指的是2肽(di-peptide)与3肽(tri-peptide)。动物在生长发育过程中，必须需要一定数量的小肽(Peptides)。肽不仅是机体蛋白质代谢的底物，而且还具有重要的生理活性作用。

1. 小肽的营养作用

提高氨基酸利用率 ：促进蛋白质的合成，大鼠肌细胞、牛乳腺表皮细胞以及羊肌源性卫星细胞均能有效利用含蛋氨酸的小肽，作为氨基酸的来源，用于合成蛋白质和细胞增殖。

提高矿物元素的利用率：据研究报道，在蛋鸡日粮中添加小肽制品后，血浆中Fe²⁺、Zn²⁺的含量显著高于对照组，蛋壳强度提高。

提高生产性能：在蛋鸡基础日粮中添加小肽后，其产蛋量和饲料转化率显著提高。

其他影响因素：小肽能阻碍脂肪的吸收，并能促进“脂质代谢”，因此，在保证摄入足够量的肽的基础上，可将饲料其他能量组分减至最低。小肽能刺激消化酶的分泌，促进小肠的蠕动，增加小肠的吸收功能，降低肠道疾病的发病率。

小肽的生理活性作用

参与机体的免疫调节，提高免疫机能；降低血压的功能；其他生理活性作用：小肽能促进利用可溶性发酵糖和淀粉的微生物生长。β-酪蛋白降解产生的某些小肽片段能够刺激细胞DNA的合成，并能促进细胞的增殖，α-酪蛋白降解产生的某些小肽片段具有类阿片肽的功能。

维生素

维生素A是一种脂溶性维生素，具有以下生理功能。

1）维持正常视觉功能。

2）维护上皮组织细胞的健康和促进免疫球蛋白的合成。

维生素A可参与糖蛋白的合成，这对于上皮的正常形成、发育与维持十分重要。当维生素A不足或缺乏时，可导致糖蛋白合成中间体的异常，削弱了防止细菌侵袭的天然屏障（结构），而易于感染。免疫球蛋白是一种糖蛋白，所以维生素A能促进该蛋白的合成，对于机体免疫功能有重要影响，缺乏时，细胞免疫呈现下降。

3）维持骨骼正常生长发育。

维生素A促进蛋白质的生物合成和骨细胞的分化。当其缺乏时，成骨细胞与破骨细胞间平衡被破坏，或由于成骨活动增强而使骨质过度增殖，或使已形成的骨质不吸收。

4）促进生长与生殖。

维生素A有助于细胞增殖与生长。动物缺乏维生素A时，明显出现生长停滞，可能与动物食欲降低及蛋白利用率下降有关。

维生素D

维生素D是一种脂溶性维生素，和钙、磷的吸收利用有密切关系，只有在维生素D的参与下，钙和磷才能在构成骨骼和牙齿等组织的过程中发挥作用，否则即使钙、磷含量丰富，比例恰当，其利用率也大为减低。因为维生素D能促进钙在肠道中的吸收，阻抑血液中的钙离子从大肠壁排出，从而维持正常的血钙水平，并促使钙在骨骼中沉积。同时，维生素D有阻滞钙从肾脏排出，并将其贮备于体内的作用。长期缺乏维生素D可阻碍钙、磷的吸收和代谢，引起骨质钙化不全，使养殖动物发生骨骼无机盐溶解而患软骨症。

维生素E

维生素E是一种脂溶性维生素， 作为一种抗氧化剂，被广泛应用于饲料生产中。近年来，国内外大量研究成果表明，维生素E在保持畜禽体液免疫和细胞免疫反应中，起着十分重要的作用。

维生素E提高畜禽免疫效果的机制，主要是抗氧化作用。它通过保护细胞膜及细胞器膜免受氧化破坏，维持细胞及细胞器的完整与稳定，使之接种免疫后产生正常的免疫应答。另一重要机制是维生素E可以作为免疫调节物来调节促细胞生长素等多种成分的合成。

维生素E还与动物的繁殖机能密切相关，具有促进性腺发育，促成受孕和防止流产等作用。

以上实施例1-5中，菌种分离与鉴定方法为（以饲用酵母菌为例）：

采集精品猪场肥猪新鲜猪粪及酿酒糟，用于分离培养具有除臭功能和抗逆性强的饲用酵母菌。缓冲液和常用试剂的配置：

1)裂解液(1OomM Tris，30mM EDTA，0.5%SDS，pH8.O)。

2)醋酸钾(5mol/L)。

3)醋酸钠(3mol/L)。

4)TE缓冲液:高压灭菌。

5)50 X TAE储备液:称取242g Tris碱溶于750mL双蒸水中，加入57.lmL HAC、l00mL 0.5 M EDTA，加水定容至1000mL。

6)琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液:0.2mol/L EDTA、30%甘油、0.25%二甲苯青、0.25%溴酚兰。

7)EB贮存液(10mg/mL):在10mL双蒸水中溶解100mgEB。

培养基：

1)LB培养基:胰蛋白1g9，酵母提取物5g，NaCl 10g；pH7.2-7.4，加水定容至1000mL，灭菌30min。

2)牛肉膏蛋白陈培养基:牛肉膏5.0g；蛋白陈10.09;NaC15g;p7.2一7.4，加水定容至100OmL121℃灭菌30min。

3)马丁氏培养基。

4)马铃薯PDA培养基。

5)麦芽汁培养基:葡萄糖109;蛋白陈5g;酵母膏3g;麦芽汁粉3g，加水定容至1OO0ml，3Omin灭菌。

6)WL营养培养基。

样品中酵母菌的分离及鉴定：

1)分离:采用稀释平板分离法，称取待测样品10g左右，放入装有无菌90ml并加入玻璃珠的离心管中，置于摇床震荡20min，使微生物细胞分散，静置即成稀释液；再用1支无菌吸管吸取稀释液lmL移入装有9mL无菌水试管中，吹吸3次，让稀释液充分混合，即成0.1倍稀释液；再换1支无菌吸管吸0.1倍稀释液1mL移入装有9mL无菌水的试管中，即成0.01倍稀释液。取合适倍数的稀释液lmL加入到孟加拉红培养基中，静30分钟后倒置放于28℃恒温培养箱中，培养三天。

2)纯化培养:划线纯化法。灭菌PDA培养基，倒平板，挑取单菌落如图方法划线，28摄氏度倒置培养三天，如此工作重复三次，以得到纯菌体。

3)酵母菌总DNA的提取：根据提取酵母菌的方法进行酵母菌总DNA的提取。

4)酵母菌26r DNA D1/D2区的PCR扩增；

5)序列测定：将PCR扩增后所得产物使用凝胶回收试剂盒进行纯化后，送样进行测序。测序结果利用BLAsT工具，将所测菌株的 265 rDNA的D1/D2区序列，与GenBank核酸数据库中的序列进行同源性分析，比较供试菌株的目的基因序列与已知酵母菌相应序列的相似程度。

利用265 rDNA基因D1/D2区序列分析法对分离出的8株酵母菌进行了鉴定，对其中的5株饲用酵母菌进行了保种。对其中的一株酿酒酵母的生物特性进行了初步的试验，证明该菌株有良好的抗逆性，可以作为微生态制剂的研制菌株。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种多菌种复合微生物饲料添加剂，其特征在于：包括如下重量比例的组分：

芽孢杆菌26%-32%、粪肠球菌15%-18%、酿酒酵母0.2%-0.3%、益生元10.8%-17.2%、硫酸盐4.7%-8.5%、碘化钾0.2%-0.4%、亚硒酸钠0.2%-0.3%、石粉32%-35%。

2.根据权利要求1所述的多菌种复合微生物饲料添加剂，其特征在于：包括如下重量比例的组分：

芽孢杆菌26%-32%、粪肠球菌15%-18%、酿酒酵母0.2%-0.3%、甘露寡糖7%-9%、小肽制剂2%-4%、维生素1.8%-4.2%、硫酸盐4.7%-8.5%、碘化钾0.2%-0.4%、亚硒酸钠0.2%-0.3%、石粉32%-35%。

3.根据权利要求1所述的多菌种复合微生物饲料添加剂，其特征在于：包括如下重量比例的组分：

芽孢杆菌29.2%、粪肠球菌16.3%、酿酒酵母0.23%、甘露寡糖8%、小肽制剂3%、维生素3%、硫酸盐6.08%、碘化钾0.27%、亚硒酸钠0.22%、石粉33.7%。

4.根据权利要求1所述的多菌种复合微生物饲料添加剂，其特征在于：包括如下重量比例的组分：

地衣芽孢杆菌11.5%-13.5%、侧孢芽孢杆菌5.5%-7.5%、枯草芽孢杆菌9%-11%、粪肠球菌15%-18%、酿酒酵母0.2%-0.3%、甘露寡糖7%-9%、小肽制剂2%-4%、维生素A 1%-2%、维生素D 0.5%-1.5%、维生素E 0.3%-0.7%、硫酸铜0.4%-0.9%、硫酸锌1%-2%、硫酸亚铁2%-3%、硫酸锰1%-2%、硫酸钴0.3%-0.6%、碘化钾0.2%-0.4%、亚硒酸钠0.2%-0.3%、石粉32%-35%。

5.根据权利要求4所述的多菌种复合微生物饲料添加剂，其特征在于：包括如下重量比例的组分：

400亿/克的地衣芽孢杆菌11.5%-13.5%、150亿/克的侧孢芽孢杆菌5.5%-7.5%、300亿/克的枯草芽孢杆菌9%-11%、30亿/克的粪肠球菌15%-18%、200亿/克的酿酒酵母0.2%-0.3%、95%的甘露寡糖7%-9%、95%的小肽制剂2%-4%、50万IU/g的维生素A 1%-2%、50万IU/g的维生素D 0.5%-1.5%、50%的维生素E 0.3%-0.7%、98%的硫酸铜0.4%-0.9%、98%的硫酸锌1%-2%、98%的硫酸亚铁2%-3%、98%的硫酸锰1%-2%、5%的硫酸钴0.3%-0.6%、5%的碘化钾0.2%-0.4%、5%的亚硒酸钠0.2%-0.3%、98%的石粉32%-35%。

6.根据权利要求3所述的多菌种复合微生物饲料添加剂，其特征在于：包括如下重量比例的组分：

     地衣芽孢杆菌12.5%、侧孢芽孢杆菌6.7%、枯草芽孢杆菌10%、粪肠球菌16.3%、酿酒酵母0.23%、甘露寡糖8%、小肽制剂3%、维生素A 1.5%、维生素D 1%、维生素E 0.5%、硫酸铜0.5%、硫酸锌1.3%、硫酸亚铁2.5%、硫酸锰1.3%、硫酸钴0.48%、碘化钾0.27%、亚硒酸钠0.22%、石粉33.7%。

7.根据权利要求6所述的多菌种复合微生物饲料添加剂，其特征在于：包括如下重量比例的组分：

     400亿/克的地衣芽孢杆菌12.5%、150亿/克的侧孢芽孢杆菌6.7%、300亿/克的枯草芽孢杆菌10%、30亿/克的粪肠球菌16.3%、200亿/克的酿酒酵母0.23%、95%的甘露寡糖8%、95%的小肽制剂3%、50万IU/g的维生素A 1.5%、50万IU/g的维生素D 1%、50%的维生素E 0.5%、98%的硫酸铜0.5%、98%的硫酸锌1.3%、98%的硫酸亚铁2.5%、98%的硫酸锰1.3%、5%的硫酸钴0.48%、5%的碘化钾0.27%、5%的亚硒酸钠0.22%、98%的石粉33.7%。

8.根据权利要求4-6任一项所述的多菌种复合微生物饲料添加剂，其特征在于，所述侧孢芽孢杆菌制剂的制备方法为：菌种——试管斜面菌种培养——摇瓶菌种培养——种子罐深层液体发酵培养——封闭式固体发酵箱培养——侧孢芽孢杆菌制剂半成品——检测合格。

9.一种复合微生物饲料添加剂的制备方法，其特征在于： 利用权利要求1-7任一项所述原料依序经液体深层发酵、固定封闭发酵形成。

10.根据权利要求9所述的多菌种复合微生物饲料添加剂的制备产方法，其特征在于，所述液体深层发酵的培养条件为：30-32℃培养18-24h；所述固定封闭发酵培养条件为：30-31℃培养36-40h。