CN102604926A - 土壤磷素生物活化真菌接种剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种土壤磷素生物活化真菌接种剂及其制备方法。取斜面菌种一支，在25℃条件下培养1-2天；用15mL无菌水洗脱孢子，制备孢子悬浊液，吸取10mL孢子悬浊液接种到100mL PD培养液的三角瓶中，在26℃条件下，震荡培养3-5天，获得液体菌种；将液体菌种按15-20％接种到一级种子PD培养液中，在27℃条件下℃，培养1-2天；将一级种子PD培养液按15-20％接种到二级种子PD培养液获得二级液体菌种；将二级液体菌种与灭菌草碳1∶4吸附然后粉碎得到孢子粉。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种土壤磷素生物活化真菌接种剂的制备方法，具体来说涉及溶磷真菌接种剂的制备方法。
(二)背景技术
磷素是一切生命活动的物质基础，它不仅是生物遗传信息载体DNA的组成元素，更重要的它是生物能量载体ATP的组成元素。磷素供应不足，一切生命都将失去其原有的光辉。在农业生产领域，有效磷供应不足仍是全球作物产量的主要限制因子之一。而从我国情况来看，全国有74％耕地土壤由于土壤磷素固定而缺磷。据报道：自20世纪50年代我国开始施用化学磷肥以来，累积储存在土壤中的难溶性磷已高达6000万吨，因此，破解开发利用土壤难溶性磷技术难题，对提高土壤磷素的利用率，科学地减施磷肥，保障国家粮食生产安全、减少农产品生产过程中对周边生态环境的污染、从源头上预防和防治土壤重金属污染和农业面源污染都具有重要意义。
由于土壤难溶磷的转化是在一定的条件下，以生物活动为中心的生物驱动过程，因此，开发利用土壤中难溶磷不外乎两条途径：
一、发挥植物自身的溶磷潜力，通过基因工程育种技术，选育磷高效利用植物品种来开发利用土壤难溶性磷素资源。这方面研究近年来已成为农作物育种领域的研究热点之一。到目前为止，已经获得植物的溶磷基因，可以说该技术源于理论、技术层面的难题已经破解，其应用、推广的阻力主要源于公众对转基因作物产品安全性的置疑。
二、通过解磷菌将土壤中难溶性磷活化出来。这方面的研究几十年来从未间断过，并且取得了丰硕的成果。自前苏联学者孟金娜(1935)从土壤中分离一株能分解核酸和卵磷脂的解磷巨大芽孢杆菌(Bucillus.megaterium var.phosphaticum)后，于1947年大量生产使用，接种土壤中来提高土壤有效磷含量。我国对解磷菌的研究始于1950年，前东北农科所于1950年从东北黑土和灰化土中分离出能分解有机磷的巨大芽孢杆菌。同年，中国科学院(前林业土壤研究所)从东北黑土中分离出一种假单胞菌(Pseudomonas spp.)也具有分解核酸和卵磷脂的能力。东北农科所将巨大芽孢杆菌制成菌剂在黑钙土和非黑钙土上施用，不同的作物增产幅度不同，平均增产黑钙土为13.5％，非黑钙土为11.7％。
20世纪80年代以后，国内许多单位相继开发出了有多种芽孢杆菌组成的复合解磷菌制剂，但这些菌剂在生产上使用的效果并不理想，主要表现在田间应用效果不稳定。导致其田间应用效果不稳定的主要原因除了这些解磷菌的土壤适应性差外，更主要的是这些解磷制剂使用的菌种都是解磷细菌，而该类菌种的致命缺点在于：在深层液体发酵工厂化生产过程中，由于营养物质的种类和比例、温度、pH值、供氧量、发酵时间等发酵条件的微小变化，都会导致该类菌种不可逆地丢失解磷基因，丧失解磷能力，从而导致其田间应用效果不稳定。
本发明“土壤磷素生物活化真菌接种剂”使用的菌种是解磷真菌平阳正青霉的无性系菌株JB201015(Eupenicillium euglaucumanamorph JB201015)，克服了工厂化生产过程中，菌种会不可逆地丧失解磷基因的缺点；在田间应用上，通过拌种的方法，使菌种定植在作物的根际，以作物根际分泌物为碳源、氮源生长、繁殖，通过溶磷真菌的代谢活动，将作物根际土壤中难溶的磷酸盐(PO4 3-)，转化成可溶性磷酸盐(H2PO4 -、HPO4 2-)供作物吸收利用。克服了以往解磷菌土壤适应性差的缺点。
因此在此提出一种方法，能够有效破解开发利用累积储存在中国土壤中的6000万吨难溶性磷的技术难题，为提高中国土壤磷肥的利用率，科学地减施磷肥，保障国家粮食生产安全、减少农产品生产过程中对周边生态环境的污染、从源头上预防和防治土壤重金属污染和农业面源污染提供技术和物质支撑。
(三)发明内容
【要解决的问题】
本发明的目的是提供一种制备土壤磷素生物活化真菌接种剂的方法；
本发明的另一目的是提供一种土壤适应性强、溶磷增产效果明显的土壤真菌接种剂；
本发明的另一目的是提供一种生产过程中不会丧失解磷基因的土壤磷素生物活化真菌接种剂；
本发明的另一个目的是提供一种生产成本低、不需深层发酵、生产周期短的土壤磷素生物活化真菌接种剂。
【技术方案】
一种土壤磷素生物活化真菌接种剂的制备方法，具体包括以下步骤：
A.取保藏号为CGMCC 3.4396的平阳正青霉Eupenicilliumeuglaucum的子囊孢子一接种环，放入无菌水中，利用漩涡混合器震荡1分钟，使子囊孢子均匀地分散在无菌水中，制备成子囊孢子悬液；
B.取0.1ml上述的子囊孢子悬液，均匀涂布在水琼脂平板上；
C.将水琼脂平板置于显微镜下挑取单孢子，以多个点的方式接种于第一选择性培养基平板上，在25-27℃中培养10-15天；
D.挑取在选择性培养基平板上具有清晰溶磷圈菌落的分生孢子，接种到第二选择性培养基平板上，同样在在25-27℃中培养10-15天，然后筛选获得一株具有最大溶磷圈的菌落的分生孢子；
E.将选出的分生孢子在25℃条件下培养1-2天；再用15mL无菌水洗脱孢子，制备成孢子悬浊液，吸取10mL孢子悬浊液接种到100mLPD培养液的三角瓶中，在26℃条件下，震荡培养3-5天，获得液体菌种；
F.将液体菌与一级种子PD培养液种按15-20％(体积)接种到一级种子PD培养液中，在27℃条件下，培养1-2天；
G.再将培养后的一级种子PD培养液与二级种子PD培养液按15-20％(体积)接种到二级种子PD培养液中，在26-27℃条件下发酵3天，获得二级液体菌种；
H.将二级液体菌种与灭菌草碳1∶4(重量)吸附，在27℃的条件下，空气相对湿度大于85％条件下，保湿培养2-5天，干燥粉碎得到孢子粉。
所述第一选择性培养基是由10g/L的葡萄糖、0.5g/L的硫酸铵、0.1g/L的硫酸镁、0.2g/L的氯化钾、0.5g/L的酵母粉、0.002g/L的硫酸亚铁、0.2g/L的氯化钠、5g/L的磷酸氢钙、20g/L琼脂配成，再利用0.1mol/L的盐酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7.0。
所述第二选择性培养基是由10g/L的麦芽糖、0.5g/L的硫酸铵、0.1g/L的硫酸镁、0.2g/L的氯化钾、0.5g/L的酵母粉、0.002g/L的硫酸亚铁、0.2g/L的氯化钠、5g/L的磷酸氢钙、20g/L琼脂配成，再利用0.1mol/L的盐酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7.0。
在步骤A中所述震荡条件为120转/分钟。所获得的液体菌种的菌丝体3×107cfu/ml以上；二级液体菌种的菌丝体3×108cfu/ml以上；灭菌草碳的分生孢子量达到3×109cfu/g。上述步骤D中的步骤可以重复多次，进行多级筛选。
一种根据上述权利要求中的制备方法所制成的土壤磷素生物活化真菌接种剂，其特征在于所述接种剂采用以下步骤制备：
A.取保藏号为CGMCC 3.4396的平阳正青霉Eupenicilliumeuglaucum的子囊孢子一接种环，放入无菌水中，利用漩涡混合器震荡1分钟，使子囊孢子均匀地分散在无菌水中，制备成子囊孢子悬液；
B.取0.1ml上述的子囊孢子悬液，均匀涂布在水琼脂平板上；
C.将水琼脂平板置于显微镜下挑取单孢子，以多个点的方式接种于第一选择性培养基平板上，在25-27℃中培养10-15天；
D.挑取在选择性培养基平板上具有清晰溶磷圈菌落的分生孢子，接种到第二选择性培养基平板上，同样在在25-27℃中培养10-15天，然后筛选获得一株具有最大溶磷圈的菌落的分生孢子；
E.将选出的分生孢子在25℃条件下培养1-2天；再用15mL无菌水洗脱孢子，制备成孢子悬浊液，吸取10mL孢子悬浊液接种到100mLPD培养液的三角瓶中，在26℃条件下，震荡培养3-5天，获得液体菌种；
F.将液体菌与一级种子PD培养液种按15-20％(体积)接种到一级种子PD培养液中，在27℃条件下，培养1-2天；
G.再将培养后的一级种子PD培养液与二级种子PD培养液按15-20％(体积)接种到二级种子PD培养液中，在26-27℃条件下发酵3天，获得二级液体菌种；
H.将二级液体菌种与灭菌草碳1∶4(重量)吸附，在27℃的条件下，空气相对湿度大于85％条件下，保湿培养2-5天，干燥粉碎得到孢子粉。
所获得的液体菌种的菌丝体3×107cfu/ml以上；二级液体菌种的菌丝体3×108cfu/ml以上；灭菌草碳的分生孢子量达到3×109cfu/g。上述步骤D中的步骤可以重复多次，进行多级筛选。
【有益效果】
具体地说，本发明的优点如下：所述真菌接种剂的土壤适应性强、溶磷增产效果明显；在工厂生产过程中不会丧失解磷基因；该真菌接种剂的生产成本低、不需深层发酵、生产周期短。在作用于植物的根际后，能够活化作物根际土壤中难溶的磷酸盐，供作物吸收利用。
(四)附图说明
图1为接种剂发酵工艺的流程图。
(五)具体实施方式
本发明的土壤磷素生物活化真菌接种剂及其制备方法，使用的菌种是解磷真菌平阳正青霉的无性系菌株JB201015(Eupenicilliumeuglaucum anamorph JB201015)，该菌株克服了工厂化生产过程中，菌种会不可逆地丧失解磷基因的缺点；在田间应用上，通过拌种的方法，使菌种定植在作物的根际，以作物根际分泌物为碳源、氮源生长、繁殖，通过溶磷真菌的代谢活动，将作物根际土壤中难溶的磷酸盐(PO4 3 -)，转化成可溶性磷酸盐(H2PO4 -、HPO4 2-)供作物吸收利用。克服了以往解磷菌土壤适应性差的缺点。
技术原理：
土壤中的磷主要以有机磷和无机磷两种形态存在。在石灰性土壤中，磷主要是以磷酸钙盐形式存在，占无机磷酸盐的60-70％。这些磷酸钙盐主要以Ca(H2PO4)2、CaHPO4·2H2O、CaHPO4、Ca3(PO4)2、Ca4H(PO4)3·2.5H2O、Ca5(PO4)3·OH形式存在。依据其化学性质，土壤钙磷的水溶性依次为：Ca(H2PO4)2＞CaHPO4·2H2O＞CaHPO4＞Ca3(PO4)2＞Ca4H(PO4)3·2.5H2O＞Ca5(PO4)3·OH。石灰性土壤中的钙磷存在形式取决于土壤的pH值和CaCO3的含量。在碱性条件下，施入土壤中的磷肥主要转化成CaHPO4·2H2O和CaHPO4，很少一部分转化成Ca3(PO4)2和Ca4H(PO4)3·2.5H2O，且在连年施用磷肥的条件下，Ca4H(PO4)3·2.5H2O不会形成Ca5(PO4)3·OH，而以Ca4H(PO4)3·2.5H2O的形态存在数年。在pH＜7.3条件下，CaHPO4·2H2O和CaHPO4可以转化成Ca(H2PO4)2被植物利用，降低石灰性土壤的pH值有助于钙磷的活化。
该发明以购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)的平阳正青霉(编号：3.4396)(Eupenicillium euglaucum)为母本，筛选出一株利用作物根际分泌物生长和产酸能力强的无性系菌株JB201015(Eupenicillium euglaucum anamorph JB201015)，该菌株接种到作物根际土壤中后，可显著降根际土壤的pH值，促进作物根际土壤中难溶的磷酸盐CaHPO4·2H2O和CaHPO4向Ca(H2PO4)2转化，供作物吸收利用。
技术路线：
通过工厂化生产，扩繁平阳正青霉无性系菌株JB201015(Eupenicillium euglaucum anamorph JB201015)的菌丝体并获得其分生孢子，将分生孢子吸附于灭菌载体，制备成孢子粉剂或草碳型粉剂成品(商品)；通过拌种或与营养土混合，将孢子接种在作物的根际，待溶磷孢子萌发后(土温4℃以上)，通过溶磷真菌的代谢活动，活化作物根际土壤中难溶的磷酸盐，供作物吸收利用。
生产制备流程：
取保藏号为CGMCC 3.4396的平阳正青霉Eupenicilliumeuglaucum的子囊孢子一接种环，放入无菌水中，利用漩涡混合器震荡(120转/分钟)1分钟，使子囊孢子均匀地分散在无菌水中，制备成子囊孢子悬液；取0.1ml上述的子囊孢子悬液，均匀涂布在水琼脂平板上；将水琼脂平板置于显微镜下挑取单孢子，以多个点的方式接种于第一选择性培养基平板上，在25-27℃中培养10-15天；挑取在选择性培养基平板上具有清晰溶磷圈菌落的分生孢子，接种到第二选择性培养基平板上，同样在在25-27℃中培养10-15天，然后筛选获得一株具有最大溶磷圈的菌落的分生孢子。
所述第一选择性培养基是由10g/L的葡萄糖、0.5g/L的硫酸铵、0.1g/L的硫酸镁、0.2g/L的氯化钾、0.5g/L的酵母粉、0.002g/L的硫酸亚铁、0.2g/L的氯化钠、5g/L的磷酸氢钙、20g/L琼脂配成，再利用0.1mol/L的盐酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7.0。
所述第二选择性培养基是由10g/L的麦芽糖、0.5g/L的硫酸铵、0.1g/L的硫酸镁、0.2g/L的氯化钾、0.5g/L的酵母粉、0.002g/L的硫酸亚铁、0.2g/L的氯化钠、5g/L的磷酸氢钙、20g/L琼脂配成，再利用0.1mol/L的盐酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7.0。
接着，将选出的分生孢子在22-27℃(优选为25℃)条件下培养1-2天；再用15mL无菌水洗脱孢子，制备成孢子悬浊液，吸取10mL上述孢子悬浊液接种到100mL PD培养液的三角瓶中，在22-27℃(优选为26℃)条件下，震荡培养3-5天，获得液体菌种；将液体菌与一级种子PD培养液种按15-20％(体积)接种到一级种子PD培养液中，在22-30℃(优选为27℃)条件下，培养1-2天。
再将培养后的一级种子PD培养液与二级种子PD培养液按15-20％(体积)接种到二级种子PD培养液中，在26-27℃条件下发酵3天，获得二级液体菌种；将二级液体菌种与灭菌草碳1∶4(重量)吸附，在22-30℃(优选为27℃)的条件下，空气相对湿度大于85％条件下，保湿培养2-5天，干燥粉碎得到孢子粉。
其中上述所获得的液体菌种的菌丝体3×107cfu/ml以上；二级液体菌种的菌丝体3×108cfu/ml以上；灭菌草碳的分生孢子量达到3×109cfu/g以上为优选状态。
菌种的筛选过程可以重复多次，进行多级筛选，以便获得优秀的菌落。
具体实施效果：
黑土：在施肥水平氮(N)200kg/ha，磷(P2O5)80kg/ha，钾(K2O)60kg/ha条件下，孢子粉剂拌种(300g/ha)，玉米增产9-19.8％；减施磷肥1/3，玉米产量10677kg/ha(1ha为10亩)。
白浆土：在施肥水平氮(N)250kg/ha，磷(P2O5)125kg/ha，钾(K2O)90kg/ha条件下，孢子粉剂拌种(300g/ha)，玉米增产9.1-10.2％；减施磷肥1/3，玉米产量12081kg/ha。
工艺控制：
(1)温度——发酵的最适温度一般应控制在26℃左右。
(2)pH值——发酵的最适pH值在6.5左右，有时也可以略高或略低一些，但应避免pH值超过7.0。
(3)溶氧——溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到30％饱和度以下时，产率急剧下降，低于10％饱和度时，则造成不可逆的损害。一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的30％，通风比一般为1∶0.8L/min，搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。
(4)菌丝生长速度——比生长速率不低于0.015h-1。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的一个可行性实施例的具体说明，但是该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更，例如，等变化的等效性实施例，均应包含于本案的专利范围之内。
Claims (10)
1.一种土壤磷素生物活化真菌接种剂的制备方法，具体包括以下步骤：
A.取保藏号为CGMCC 3.4396的平阳正青霉(Eupenicilliumeuglaucum)的子囊孢子一接种环，放入无菌水中，利用漩涡混合器震荡1分钟，使子囊孢子均匀地分散在无菌水中，制备成子囊孢子悬液；
B.取0.1ml上述的子囊孢子悬液，均匀涂布在水琼脂平板上；
C.将水琼脂平板置于显微镜下挑取单孢子，以多个点的方式接种于第一选择性培养基平板上，在25-27℃中培养10-15天；
D.挑取在选择性培养基平板上具有清晰溶磷圈菌落的分生孢子，接种到第二选择性培养基平板上，同样在在25-27℃中培养10-15天，然后筛选出一株具有最大溶磷圈和最大菌落直径的菌落分生孢子；
E.将选出的分生孢子在25℃条件下培养1-2天；再用15mL无菌水洗脱孢子，制备成孢子悬浊液，吸取10mL孢子悬浊液接种到100mLPD培养液的三角瓶中，在26℃条件下，震荡培养3-5天，获得液体菌种；
F.将液体菌与一级种子PD培养液种按15-20％(体积)接种到一级种子PD培养液中，在27℃条件下，培养1-2天；
G.再将培养后的一级种子PD培养液与二级种子PD培养液按15-20％(体积)接种到二级种子PD培养液中，在26-27℃条件下发酵3天，获得二级液体菌种；
H.将二级液体菌种与灭菌草碳1∶4(重量)吸附，在27℃的条件下，空气相对湿度大于85％条件下，保湿培养2-5天，干燥粉碎得到孢子粉。
2.根据权利要求1中的土壤磷素生物活化真菌接种剂的制备方法，其特征在于：所述第一选择性培养基是由10g/L的葡萄糖、0.5g/L的硫酸铵、0.1g/L的硫酸镁、0.2g/L的氯化钾、0.5g/L的酵母粉、0.002g/L的硫酸亚铁、0.2g/L的氯化钠、5g/L的磷酸氢钙、20g/L琼脂配成，再利用0.1mol/L的盐酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7.0。
3.根据权利要求2中的土壤磷素生物活化真菌接种剂的制备方法，其特征在于：所述第二选择性培养基是由10g/L的麦芽糖、0.5g/L的硫酸铵、0.1g/L的硫酸镁、0.2g/L的氯化钾、0.5g/L的酵母粉、0.002g/L的硫酸亚铁、0.2g/L的氯化钠、5g/L的磷酸氢钙、20g/L琼脂配成，再利用0.1mol/L的盐酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7.0。
4.根据权利要求2或3中的土壤磷素生物活化真菌接种剂的制备方法，其特征在于：所获得的液体菌种的菌丝体3×107cfu/ml以上；二级液体菌种的菌丝体3×108cfu/ml以上；灭菌草碳的分生孢子量达到3×109cfu/g。
5.根据权利要求4中的土壤磷素生物活化真菌接种剂的制备方法，其特征在于：上述步骤D中的步骤可以重复多次，进行多级筛选。
6.一种根据上述权利要求中的制备方法所制成的土壤磷素生物活化真菌接种剂，其特征在于所述接种剂采用以下步骤制备：
A.取保藏号为CGMCC 3.4396的平阳正青霉Eupenicilliumeugl aucum的子囊孢子一接种环，放入无菌水中，利用漩涡混合器震荡1分钟，使子囊孢子均匀地分散在无菌水中，制备成子囊孢子悬液；
B.取0.1ml上述的子囊孢子悬液，均匀涂布在水琼脂平板上；
C.将水琼脂平板置于显微镜下挑取单孢子，以多个点的方式接种于第一选择性培养基平板上，在25-27℃中培养10-15天；
D.挑取在选择性培养基平板上具有清晰溶磷圈菌落的分生孢子，接种到第二选择性培养基平板上，同样在在25-27℃中培养10-15天，然后筛选出一株具有最大溶磷圈和菌落直径的分生孢子；
E.将选出的分生孢子在25℃条件下培养1-2天；再用15mL无菌水洗脱孢子，制备成孢子悬浊液，吸取10mL孢子悬浊液接种到100mLPD培养液的三角瓶中，在26℃条件下，震荡培养3-5天，获得液体菌种；
F.将液体菌与一级种子PD培养液种按15-20％(体积)接种到一级种子PD培养液中，在27℃条件下，培养1-2天；
G.再将培养后的一级种子PD培养液与二级种子PD培养液按15-20％(体积)接种到二级种子PD培养液中，在26-27℃条件下发酵3天，获得二级液体菌种；
H.将二级液体菌种与灭菌草碳1∶4(重量)吸附，在27℃的条件下，空气相对湿度大于85％条件下，保湿培养2-5天，干燥粉碎得到孢子粉。
7.根据权利要求6中的土壤磷素生物活化真菌接种剂，其特征在于：所述第一选择性培养基是由10g/L的葡萄糖、0.5g/L的硫酸铵、0.1g/L的硫酸镁、0.2g/L的氯化钾、0.5g/L的酵母粉、0.002g/L的硫酸亚铁、0.2g/L的氯化钠、5g/L的磷酸氢钙、20g/L琼脂配成，再利用0.1mol/L的盐酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7.0。
8.根据权利要求6中的土壤磷素生物活化真菌接种剂，其特征在于：所述第二选择性培养基是由10g/L的麦芽糖、0.5g/L的硫酸铵、0.1g/L的硫酸镁、0.2g/L的氯化钾、0.5g/L的酵母粉、0.002g/L的硫酸亚铁、0.2g/L的氯化钠、5g/L的磷酸氢钙、20g/L琼脂配成，再利用0.1mol/L的盐酸溶液和0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为7.0。
9.根据权利要求6或7中的土壤磷素生物活化真菌接种剂，其特征在于：所获得的液体菌种的菌丝体3×107cfu/ml以上；二级液体菌种的菌丝体3×108cfu/ml以上；灭菌草碳的分生孢子量达到3×109cfu/g。
10.根据权利要求9中的土壤磷素生物活化真菌接种剂，其特征在于：上述步骤D中的步骤可以重复多次，进行多级筛选。
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