CN103468593B - 一株肉桂紫正青霉及其应用 - Google Patents
一株肉桂紫正青霉及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株肉桂柴正青霉及其应用，属于解磷微生物肥料技术领域。该菌株为肉桂柴正青霉（Eupenicillium cinnamopurpureum）WHP-1，保藏编号为CGMCC No.8128。本发明还公开了含有上述菌株的微生物菌剂及其制备方法。实验表明，本发明的肉桂柴正青霉菌株WHP-1具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强、解磷能力强，在植物根际能够快速大量定殖等特点。该菌株的发酵液或菌剂中含有大量解磷菌，对土壤改良有一定的积极作用，其所具有的溶磷功能，对改善土壤结构，增强作物对肥料的吸收率等有积极影响。
Description
技术领域
本发明属于解磷微生物肥料领域。具体而言，本发明涉及一株能够高效解磷真菌肉桂紫正青霉及其用途，以及采用该肉桂紫正青霉制备的菌剂。
背景技术
磷是植物细胞中遗传物质DNA和能量物质ATP的基本构成元素，在植物的整个生命过程中起着重要的作用。磷是植物生长发育的必需元素之一，高能磷酸键是能量的载体，植物的光合作用和体内的生化过程都必须有磷参加。磷既是农业生产的重要物质保证，又是不可再生的矿质资源。我国耕地土壤中全磷的质量分数一般在0.2-1.lg/kg-1(土)之间变动，许多土壤磷素供应不足，因此利用解磷微生物定向地调节土壤磷素状况和提高磷肥利用率是达到作物高产、品质优良的重要途径之一。
肉桂紫正青霉属于子囊菌门，散囊菌纲，散囊菌目，发菌科。解磷真菌在数量和种类上远不及解磷细菌，从同一土壤上分离出来的解磷细菌数目可以是解磷真菌的几倍、几十倍甚至上百倍。然而前人报道解磷真菌的解磷能力一般要强于细菌。真菌溶磷机理非常复杂，有些真菌溶磷主要是质子起作用，有些主要是有机酸起作用，而有些菌株则两种机制都存在，还有些菌株由于生长过程中产生其它的螯合物质，从而导致磷矿粉的溶解。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高效解磷真菌菌株——肉桂紫正青霉WHP-1。本发明的肉桂紫正青霉菌株具有生长速度快、解磷能力强、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
本发明的另一个目的是提供一种采用该肉桂紫正青霉菌株WHP-1制备的能够高效解磷的微生物菌剂。
本发明所提供的菌株为肉桂紫正青霉(Eupenicillium cinnamopurpureum)WHP-1，是从山东沿海湿地土壤中分离获得的，已于2013年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.8128。其具有以下生物学特性：分生孢子梗通常非常简单，偶尔有一个分支不同，分支状的梗基在其末端会分化为两个瓶梗，在孢梗茎上很少会产生2-3个不同的梗基，孢梗茎的长度可变，20-250×1.5-2.5μm，末端能够膨大到5-6μm，梗基存在时为7-25×1.8-2.5μm。分生孢子在宽松的空间下由椭球形稍微变至近球形，孢子壁接近光滑，大小为2.2-3.2×1.8-2.8μm。子囊果是裸囊壳，为棕褐色，粉红色的肉桂棕色，有时为深褐色，其包被由纤细菌丝交织而成，质地从疏松至紧密，球形、近球形或近椭圆形，直径为100-380μm，刚形成的时候非常坚硬，在成熟的6-8周内，菌丝细胞相对短而且较宽，菌丝膨大且弯曲为螺旋状，7-8.5×6-7μm；子囊链生、单生，少数不规则生，球形、近球形或椭圆形，不规则排列，每个通常含8个子囊孢子；子囊孢子球形、近球形或椭圆形，直径0.2-0.5μm，透明、黄色、少数带红色，壁平滑。
本发明肉桂紫正青霉(Eupenicillium cinnamopurpureum)WHP-1的培养方法或繁殖方法包括：
(1)普通培养保存采用PDA培养基，配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂12g，蒸馏水1000mL；
(2)实验室液体培养采用PDB培养基，配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。
(3)固体培养基配方：固料和无机盐溶液，按质量比1：1.8的比例配制。其中所述固料由质量比为85：15的稻糠和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包括3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水。
(4)大量发酵培养配方：同(3)中固体培养基配方。
本发明还提供一种用于高效解磷的微生物菌剂，所述微生物菌剂包括肉桂紫正青霉菌株WHP-1。
本发明也提供了上述肉桂紫正青霉菌株WHP-1或者上述菌剂在为农作物提供可利用的有效磷的用途。
本发明所述的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备所述肉桂紫正青霉菌株WHP-1的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。
所述制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将所述肉桂紫正青霉菌株WHP-1的孢子移植到PDB液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28℃下振荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至大量发酵培养基，于室温28℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。
其中，步骤(1)中的所述PDB液体培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL；
步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的质量比为1：1.8；所述固料由质量比为85：15的稻糠和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包含3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水；
步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。
实验表明，本发明的肉桂紫正青霉菌株WHP-1具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强、解磷能力强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此由该肉桂紫正青霉菌株制备的菌剂具有良好的应用前景。该菌株的发酵液或菌剂中含有大量解磷菌，对土壤改良有一定的积极作用，其所具有的溶磷功能，对改善土壤结构，增强作物对肥料的吸收率等具有积极影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1、肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1的分离与纯化
本发明的肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1是从土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
(1)肉桂紫正青霉菌株的分离：土样的采集，在山东沿海湿地不同地区选取种植不同作物类型的地块，采用5点取样法，分别采集地块四周和中央深度在10-20cm范围内的土壤适量，等量混匀。标明采集地点、时间和采集人。称取1g土样于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，取100μL 10-2、10-3、10-4稀释液涂布于PDA培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取PDA上的不同形态的微生物菌落于PDA上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化青霉菌株，转至PDA试管斜面分别编号保存备用。
(2)高效解磷青霉菌株的筛选
①初筛：采用蒙金娜无机磷固体培养基进行筛选，制备PDA平板，将分离获得的纯菌株在PDA斜面上活化2-3代，然后分别点接种于蒙金娜无机磷固体培养基上，置于30℃培养箱中培养10d，观察有无溶磷圈，并根据溶磷圈直径(D)与菌落直径(d)比值的大小来初步确定解磷能力将有溶磷作用的菌株作好记录备用。
②复筛：根据上述溶磷圈法初筛的结果，选择溶磷效果较好的菌株，利用摇瓶培养基测定其溶磷量，进行盆栽试验和田间试验。
本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效解磷的肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1。实验证明，具有生长速度快、解磷能力强、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。
其中，PDA培养基配方：马铃薯200g(去皮)，葡萄糖20g，琼脂14g，蒸馏水1000mL。解磷菌筛选采用蒙金娜无机磷固体培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO4.7H2O 0.03g，MnSO4.4H2O 0.03g，Ca3(PO3)210g，酵母浸提物0.4g，琼脂20g，去离子水1000mL，pH调至7.0。
2、菌株鉴定
(1)微生物学特性：分生孢子梗通常非常简单，偶尔有一个分支不同，分支状的梗基在其末端会分化为两个瓶梗，在孢梗茎上很少会产生2到3个不同的梗基，孢梗茎的长度可变，20-250×1.5-2.5μm，末端能够膨大到5-6μm，梗基存在时为7-25×1.8-2.5μm。分生孢子在宽松的空间下由椭球形稍微变至近球形，孢子壁接近光滑，大小为2.2-3.2×1.8-2.8μm。子囊果是裸囊壳，为棕褐色，粉红色的肉桂棕色，有时为深褐色，其包被由纤细菌丝交织而成，质地从疏松至紧密，球形、近球形或近椭圆形，直径为100-380μm，刚形成的时候非常坚硬，在成熟的6-8周内，菌丝细胞相对短而且较宽，菌丝膨大且弯曲为螺旋状，7-8.5×6-7μm；子囊链生、单生，少数不规则生，球形、近球形或椭圆形，不规则排列，每个通常含8个子囊孢子；子囊孢子球形、近球形或椭圆形，直径0.2-0.5μm，透明、黄色、少数带红色，壁平滑。
(2)分子生物学特性
该菌株的rDNA基因序列测定结果(ITS-5.8S-ITS2区)如下(SEQ No.1)：
CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTCAGGCCGCCGGGGGCTTCGTGCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGAAGACACCATTGAACGCTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGCGATTAGCTAAATTAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTTGTTGGGTCTACGTCCCCCCGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCATCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTTGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACCCCAACCATTTTCTCAGGTGACCTCGATCAGTACGAGTACC
实施例2
1、肉桂紫正青霉菌株WHP-1发酵过程
PDB培养基配方：马铃薯200g(去皮)，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。
大量固体发酵培养基配方(质量百分含量)：
固料：稻糠85％，麸皮15％；
无机盐溶液：磷酸二氢钾3.5％，硫酸镁0.04％，硫酸铵4％，剩余为水。
固液比为1:1.8(质量比)。
肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1大量固体发酵过程：
①菌种种子液培养：将肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1从试管斜面中挑取少量孢子，移至PDB液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液。
②固体生产菌种的培养：将种子液按10％的比例接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，28℃恒温培养3～5d，中间多次振荡。
③大量固体发酵：将②中固体培养的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，出去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1:6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(28℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9d，即可得到肉桂紫正青霉原粉，其有效活菌数大于2×108cfu/g。
实施例3肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1水稻小区试验
试验材料：肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1的发酵液(步骤①得到的种子液)，具有溶磷的功效，有效活菌数大于2.5×108cfu/ml。
试验时间：2012年6月～2012年11月
试验地点：莒南县筵宾镇杜家庄村
供试作物：临稻16
试验土壤：粘土
试验设计：以不同稀释度(10倍、20倍、30倍)的肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1发酵液拌种水稻种子作为示范，以基质培养基拌种水稻种子作为对照(CK)，每个处理三个平行，小区面积20m2，随机分布。
施肥量与施肥方法：播种前，采用不同稀释度(10倍、20倍、30倍)的肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1发酵液和基质培养基拌种，其他措施同当地，统一浇水、间苗、除草等田间管理措施。
农艺性状及产质量调查：于收获前一天测量全株叶片数、株高、穗长、穗粒数、结实率、千粒重。
表1水稻农艺性状调查表
注：WHP-1是指高效解磷菌肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1
从表1数据可以看出，采用解磷菌肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1发酵液的稀释液拌种的水稻，其农艺性状比用基质培养基拌种的水稻有很明显的优势。
水稻收获后，测量各小区的产量，同时统计不同试验处理方式水稻产量的差异。
表2水稻产量调查表
从表2数据可以看出，采用解磷菌肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1的发酵液拌种的水稻，比用基质培养基拌种的水稻的产量高，其中采用解磷菌肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1发酵液的10倍、20倍和30倍的稀释液拌种，其水稻的产量分别比用基质培养基拌种的对照增加27.2％、20.4％和18.3％。采用解磷菌肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1发酵液的10倍稀释液拌种的水稻产量极显著高于其30倍稀释液和对照，增产效果十分明显。
由于肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1发酵液中含有大量解磷菌，对土壤改良有一定的积极作用，其所具有的溶磷功能，对改善土壤品质，增强作物对肥料的吸收率等有很大的积极影响。
施用肉桂紫正青霉(E.cinnamopurpureum)WHP-1发酵液，对土壤的改良及作物的生长都具有非常大的积极作用。
Claims (6)
1.肉桂紫正青霉(Eupenicillium cinnamopurpureum)菌株WHP-1，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.8128。
2.权利要求1所述的肉桂紫正青霉(Eupenicillium cinnamopurpureum)菌株WHP-1在为农作物提供可利用的有效磷方面的用途。
3.一种微生物菌剂，包括权利要求1所述的肉桂紫正青霉(Eupenicilliumcinnamopurpureum)菌株WHP-1。
4.一种制备权利要求3所述的微生物菌剂的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)制备肉桂紫正青霉菌株WHP-1的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养；
所述步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的质量比为1：1.8；所述固料由质量比为85：15的稻糠和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶液包含3.5％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，4％硫酸铵，剩余为水；所述步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征是，
(1)将肉桂紫正青霉菌株WHP-1的孢子移植到PDB液体培养基中，28℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；所述PDB液体培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28℃下振荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入其质量15倍的无菌水混合，过滤，将滤液按体积比1：6的比例接种至大量发酵培养基，于室温28℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。
6.权利要求3所述的微生物菌剂在为农作物提供可利用的有效磷方面的用途。
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