CN109402006A - 短短芽孢杆菌液体深层发酵方法及可湿性粉剂制备方法 - Google Patents

短短芽孢杆菌液体深层发酵方法及可湿性粉剂制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种短短芽孢杆菌的液体深层发酵方法，包括将短短芽孢杆菌种子液按体积比为1～5％的接种量接入发酵培养基中进行发酵，直至所得发酵液中90％以上菌体形态为芽孢。本发明还提供一种短短芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，包括将上述发酵液进行离心处理得到浓缩菌液，再将滑石粉、蔗糖、麦芽糊精与上述浓缩菌液混合均匀后进行喷雾干燥，得到干粉菌剂，将十二烷基苯磺酸钠、有机硅、抗坏血酸与上述干粉菌剂混合均匀后在30～50℃下粉碎，过400目筛后得到可湿性粉剂。该方法工艺简单，制备得到的生防短短芽孢杆菌可湿性粉剂对烟草黑胫病有较好的防效，且安全高效、无残留、无毒副作用，能够减少化学农药的使用。

Description

短短芽孢杆菌液体深层发酵方法及可湿性粉剂制备方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种短短芽孢杆菌液体深层发酵方法及可湿性粉剂制备方法。
背景技术
化学农药的大量使用，极易造成农药残留超标，生物富集，不仅污染生态环境，还影响人类的健康。微生物农药，是指应用活体微生物及其代谢产物对农业病虫害进行防治，其具有选择性强，副作用小，对人、畜、农作物和自然环境无害，不易产生抗药性等特点，因此是一种具有广阔前景的绿色农药。目前市场上已经有较为成熟的微生物农药产品，例如苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等。
短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)是应用得最为广泛的革兰氏阳性菌之一。短短芽孢杆菌属之前被归为芽孢杆菌属，后重新进行分类，归为短短芽孢杆菌属。研究表明，短短芽抱杆菌的许多菌株都对病原菌有抑制作用，有的通过和病原菌争夺营养和生态位，另一部分通过分泌抑菌活性物质来抑制病原菌的生长。之外，短短芽孢杆菌能够生产各种各样的抗真菌代谢物，可以控制多种植物病原土传真菌。近年来，短短芽孢杆菌的生物防治已经成为了研究热点。
当前，国内外对芽孢杆菌发酵工艺的研究主要集中在菌种筛选、抑菌效果和发酵产物分析中，缺乏对芽孢杆菌高产芽孢发酵优化研究。如何在保证成本条件下，尽可能提高芽孢产率与回收率与实际应用效果，成为困扰短短芽孢杆菌可湿性粉剂实际工业生产的瓶颈问题。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种短短芽孢杆菌液体深层发酵方法及可湿性粉剂制备方法，其目的是为了提高芽孢产率与回收率与实际应用效果。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种短短芽孢杆菌的液体深层发酵方法，包括：将短短芽孢杆菌种子液按体积比为1～5％的接种量接入发酵培养基中进行发酵，直至所得发酵液中90％以上菌体形态为芽孢；
其中，发酵温度为28～32℃，搅拌速度为160～200r/min，通气量为15～60 m3/h，发酵罐罐压为0.05～0.06Mpa。
进一步地，所述发酵培养基组成为：蔗糖糖蜜10～30g/L、黄豆粉5～15g/L、蛋白胨2～6g/L、MgSO40.5～3.5g/L和CaCO34～8g/L。
进一步地，所述短短芽孢杆菌种子液是由短短芽孢杆菌经菌种活化、一级种子液制备和二级种子液制备得到。
进一步地，所述菌种活化具体为将短短芽孢杆菌接种于营养琼脂培养基上进行培养。
进一步地，所述一级种子液制备具体为将经菌种活化后的菌种接种于含有酵母膏、蛋白胨和葡萄糖的种子培养基中进行摇瓶培养，得到一级种子液。
进一步地，所述二级种子液制备具体为将所述一级种子液接种于含有酵母膏、蛋白胨和葡萄糖的种子培养基中进行搅拌培养。
本发明还提供了一种短短芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将短短芽孢杆菌种子液按体积比为1～5％的接种量接入发酵培养基中进行发酵，直至所得发酵液中90％以上菌体形态为芽孢；
(2)将步骤1)所得发酵液进行离心处理，得到浓缩菌液；
(3)将滑石粉、蔗糖、麦芽糊精与步骤2)所得浓缩菌液混合均匀后进行喷雾干燥，得到干粉菌剂；
(4)将十二烷基苯磺酸钠、有机硅、抗坏血酸与步骤3)所得干粉菌剂混合均匀后在30～50℃下粉碎，过400目筛后得到可湿性粉剂；
其中，按重量份计，滑石粉为20～30份，蔗糖为1～2份、麦芽糊精为0.5～1.5 份，浓缩菌液为50～80份，十二烷基苯磺酸钠为1～4份，有机硅为0.3～1份，抗坏血酸为0.2～1份。
进一步地，步骤1)中离心处理具体为在6000～6600r/min转速下离心处理。
进一步地，步骤3)中喷雾干燥的进风温度为230℃，出风温度为80～90℃。
进一步地，按重量份计，滑石粉为25份，蔗糖为1.5份，麦芽糊精为1 份，浓缩菌液为60份，十二烷基苯磺酸钠为3份，有机硅为0.5份，抗坏血酸为0.4份。
本发明的上述方案有如下的有益效果：
(1)本发明提供了一种短短芽孢杆菌液体深层发酵方法，其中的发酵培养基的成分直接以蔗糖糖蜜、黄豆粉、蛋白胨作为培养基的碳氮源，原料简单易得，不仅可以降低生产成本，增加经济效益，还可以提高农业资源的综合利用水平。
(2)本发明提供了一种短短芽孢杆菌液体深层发酵方法，其中的短短芽孢杆菌种子液经菌种活化、一级种子液制备和二级种子液制备得到，种子液与培养基的体积比控制在1～5％，发酵过程中温度控制在28℃～32℃，搅拌速度控制在160～200r/min，通气量控制在15～60m3/h，发酵罐罐压控制在0.05～0.06 Mpa，最终得到发酵液中芽孢含量高于4.8×109cfu/mL，芽孢率高于90.6％，解决了传统液体发酵芽孢产率低的问题，本发明生产的短短芽孢杆菌发酵液主要为短短芽孢杆菌芽孢菌体，抗逆性强。
(3)本发明还提供了一种短短芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，该方法工艺简单，室温下，芽孢含量不低于2.1×1010cfu/g，悬浮率76％、润湿时间不高于75s、细度通过率98％，采用多种芽孢保护工艺，使粉剂室温下贮藏100d 存活率达90％。
(4)经试验证实，本发明所述的生防短短芽孢杆菌可湿性粉剂对烟草黑胫病有较好的防效，对烟草黑胫病防效达到65.38％，同时安全高效、无残留、无毒副作用，能够减少化学农药的使用，在生物防治烟草黑胫病中具有重要应用前景。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
实施例1
短短芽孢杆菌可湿性粉剂的制备：
(1)菌种活化：将短短芽孢杆菌划线接种于营养琼脂培养基平板上进行培养，30℃下培养24h，然后挑取单菌落划线转接于营养琼脂斜面，30℃下培养24h后得活化菌种。
(2)摇瓶一级种子液制备：在2个2000mL锥形瓶中分别装入500mL 的含酵母膏5g、蛋白胨1g、葡萄糖1g、pH 7.0±0.1的种子培养基，将步骤 (1)中活化后的菌种用接种环接入摇瓶种子培养基中，培养条件：温度36℃、摇床转速160r/min、培养时间12h。
(3)种子罐二级种子液制备：将步骤(2)中所得的种子液经镜检无杂菌污染后按2％的接种量接入含有酵母膏500g、蛋白胨1000g、葡萄糖1000g、 pH 7.0±0.1的二级种子罐中，培养条件：温度30℃、搅拌速率160r/min、种子罐体积100L、装液量50L、通气量2.5m3/h、罐压0.05Mpa、培养时间12 h。
(4)发酵罐高密度发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液经镜检无杂菌污染后按3％的接种量接入1000L发酵罐中，罐中发酵培养基组成：蔗糖糖蜜 20g/L、黄豆粉10g/L、蛋白胨4g/L、MgSO42.5g/L、CaCO36g/L、发酵罐装液量600L，培养条件：温度30±2℃、搅拌速率180r/min、通气量25m3/h、罐压0.06Mpa，当发酵液中90％以上菌体形态为芽孢时，停止发酵，得发酵液备用，发酵周期为48h。
(5)发酵液离心浓缩：采用碟片式离心机进行离心，转速6600r/min。
(6)按照浓缩菌液60份、滑石粉25份、蔗糖1.5份、麦芽糊精1份比例混合均匀。
(7)将步骤(6)所得混合物进行喷雾干燥得干粉菌剂，喷雾干燥条件：进风温度230℃、出风温度、80～90℃。
(8)将步骤(7)所得干粉菌剂与十二烷基苯磺酸钠3份、有机硅0.5份、抗坏血酸0.4份混匀，在30～50℃温度范围内利用气流粉碎机粉碎，过400目筛，即得可湿性粉剂。
最终发酵液中芽孢数达4.8×109cfu/mL以上，产孢率达90.6％以上。室温下，可湿性粉剂中芽孢含量不低于2.1×1010cfu/g，悬浮率76％、润湿时间不高于75s、细度通过率98％，室温下贮藏100d存活率达90％以上。
实施例2
短短芽孢杆菌可湿性粉剂的制备：
(1)菌种活化同实施例1。
(2)摇瓶一级种子液制备同实施例1。
(3)种子罐二级种子液制备同实施例1。
(4)发酵罐高密度发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液经镜检无杂菌污染后按1％的接种量接入1000L发酵罐中，罐中发酵培养基组成：蔗糖糖蜜10g/L、黄豆粉5g/L、蛋白胨2g/L、MgSO40.5g/L、CaCO34g/L、发酵罐装液量500L，培养条件：温度30±2℃、搅拌速率160r/min、通气量15m3/h、罐压0.05Mpa，当发酵液中90％以上菌体形态为芽孢时，停止发酵，得发酵液备用，发酵周期为48h。
(5)发酵液离心浓缩：采用碟片式离心机离心，转速6000r/min。
(6)按照浓缩菌液50份、滑石粉20份、蔗糖1份、麦芽糊精0.5份比例混合均匀。
(7)将步骤(6)所得混合物进行喷雾干燥得干粉菌剂，喷雾干燥条件：进风温度230℃、出风温度、80-90℃。
(8)将步骤(7)所得干粉菌剂与十二烷基苯磺酸钠1份、有机硅0.3份、抗坏血酸0.2份混匀，在30-50℃温度范围内利用气流粉碎机粉碎，过400目筛，即得可湿性粉剂。
最终发酵液中芽孢数达4.8×109cfu/mL以上，产孢率达90.6％以上。室温下，可湿性粉剂中芽孢含量不低于2.1×1010cfu/g，悬浮率76％、润湿时间不高于75s、细度通过率98％，室温下贮藏100d存活率达90％以上。
实施例3
短短芽孢杆菌可湿性粉剂的制备：
(1)菌种活化：同实施例1。
(2)摇瓶一级种子液制备：同实施例1。
(3)种子罐二级种子液制备：同实施例1。
(4)发酵罐高密度发酵培养：将步骤(3)中所得的种子液经镜检无杂菌污染后按5％的接种量接入1000L发酵罐中，罐中发酵培养基组成：蔗糖糖蜜 30g/L、黄豆粉15g/L、蛋白胨6g/L、MgSO43.5g/L、CaCO38g/L、发酵罐装液量700L，培养条件：温度30±2℃、搅拌速率200r/min、通气量25m3/h、罐压0.06Mpa，当发酵液中90％以上菌体形态为芽孢时，停止发酵，得发酵液备用，发酵周期为48h。
(5)发酵液离心浓缩：采用碟片式离心机离心，转速6600r/min。
(6)按照浓缩菌液80份、滑石粉30份、蔗糖2份、麦芽糊精1.5份比例混合均匀。
(7)将步骤(6)所得混合物进行喷雾干燥得干粉菌剂，喷雾干燥条件：进风温度230℃、出风温度80-90℃。
(8)将步骤(7)所得干粉菌剂与十二烷基苯磺酸钠4份、有机硅1份、抗坏血酸1份混匀，在30-50℃温度范围内利用气流粉碎机粉碎，过400目筛，即得可湿性粉剂。
最终发酵液中芽孢数达4.8×109cfu/mL以上，产孢率达90.6％以上。室温下，可湿性粉剂中芽孢含量不低于2.1×1010cfu/g，悬浮率76％、润湿时间不高于75s、细度通过率98％，室温下贮藏100d存活率达90％以上。
实施例4
短短芽孢杆菌可湿性粉剂防治烟草黑胫病大田试验：
1、实验地点：湖南浏阳洞阳镇烟草黑胫病高发病区烟田；
2、试验方法:
试验分9区，每区66平米，每个组做三个平行试验区；
试验设置：
试验组：烟草移栽时，取实施例1所得可湿性粉剂100倍稀释液喷施，在烟草移栽移栽40天后用短短芽孢杆菌可湿性粉剂200倍液喷施一次，并用短短芽孢杆菌可湿性粉剂1000倍稀释液灌根一次，在移栽70、90天后进行相同的处理；
对照组1：烟草移栽时，利用常规化学药剂(甲霜灵锰锌)喷施，在烟草移栽移栽40天后用化学药剂喷施一次，在移栽70、90天后进行相同的处理；
对照组2：即空白对照组(CK)，与试验组相同操作，不加短短芽孢杆菌可湿性粉剂，以清水做对照。
最后在烟草成熟期统计调查结果。
病情分级标准如下：
0级，全株无病；
1级，茎部病斑不超过茎围的三分之一，或三分之一以下叶片凋萎；
3级，茎部病斑环绕茎围三分之一至二分之一，或三分之一至二分之一叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑；
5级，茎部病斑超过茎围的二分之一，但未全部环绕茎围，或二分之一至三分之二叶片凋萎；
7级，茎部病斑全部环绕茎围，或三分之二以上叶片凋萎.烟草农艺性状调查统计参照《中华人民共和国烟草行业标准——烟草农艺性状》。病情指数和相对防效由如下公式计算：
式中，N表示发病株数，M表示调查总株数。
病情指数＝∑(i×Ni)/(I×M)×100％
式中，I表示病情代表值，Ni表示i病情下发病株数目，I表示最高病情代表值，M表示调查总株数。
相对防效(％)＝[(CK病情指数-处理病情指数)/CK病情指数]×100
3、试验结果：
由烟草成熟期调查结果显示(表1)，短短芽孢杆菌可湿性粉剂对烟草黑胫病的防治效果达到65.38％与化学药剂效果相近，因此短短芽孢杆菌可湿性粉剂具有防病的效果，且由于其具有安全高效，无残留，无毒副作用，能够减少化学农药的使用，因此在生物防治烟草黑胫病中具有重要应用前景。
表1不同处理对烟草黑胫病的防治效果：
处理 病情指数 相对防效
试验组 2.15 65.38
对照组1 2.33 62.48
对照组2 6.21 —
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种短短芽孢杆菌的液体深层发酵方法，其特征在于，将短短芽孢杆菌种子液按体积比为1～5％的接种量接入发酵培养基中进行发酵，直至所得发酵液中90％以上菌体形态为芽孢；
其中，发酵温度为28～32℃，搅拌速度为160～200r/min，通气量为15～60m3/h，发酵罐罐压为0.05～0.06Mpa。
2.如权利要求1所述短短芽孢杆菌的液体深层发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：蔗糖糖蜜10～30g/L、黄豆粉5～15g/L、蛋白胨2～6g/L、MgSO40.5～3.5g/L和CaCO34～8g/L。
3.如权利要求1所述短短芽孢杆菌的液体深层发酵方法，其特征在于，所述短短芽孢杆菌种子液是由短短芽孢杆菌经菌种活化、一级种子液制备和二级种子液制备得到。
4.如权利要求3所述短短芽孢杆菌的液体深层发酵方法，其特征在于，所述菌种活化具体为将短短芽孢杆菌接种于营养琼脂培养基上进行培养，得到活化后菌种。
5.如权利要求4所述短短芽孢杆菌的液体深层发酵方法，其特征在于，所述一级种子液制备具体为将所述活化后菌种接种于含有酵母膏、蛋白胨和葡萄糖的种子培养基中进行摇瓶培养，得到一级种子液。
6.如权利要求5所述短短芽孢杆菌的液体深层发酵方法，其特征在于，所述二级种子液制备具体为将所述一级种子液接种于含有酵母膏、蛋白胨和葡萄糖的种子培养基中进行搅拌培养。
7.一种短短芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将短短芽孢杆菌种子液按体积比为1～5％的接种量接入发酵培养基中进行发酵，直至所得发酵液中90％以上菌体形态为芽孢；
(2)将步骤1)所得发酵液进行离心处理，得到浓缩菌液；
(3)将滑石粉、蔗糖、麦芽糊精与步骤2)所得浓缩菌液混合均匀后进行喷雾干燥，得到干粉菌剂；
(4)将十二烷基苯磺酸钠、有机硅、抗坏血酸与步骤3)所得干粉菌剂混合均匀后在30～50℃下粉碎，过400目筛后得到可湿性粉剂；
其中，按重量份计，滑石粉为20～30份，蔗糖为1～2份、麦芽糊精为0.5～1.5份，浓缩菌液为50～80份，十二烷基苯磺酸钠为1～4份，有机硅为0.3～1份，抗坏血酸为0.2～1份。
8.如权利要求5所述短短芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，步骤1)中离心处理具体为在转速为6000～6600r/min下进行处理。
9.如权利要求5所述短短芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，步骤3)中喷雾干燥的进风温度为230℃，出风温度为80～90℃。
10.如权利要求5所述短短芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，按重量份计，滑石粉为25份，蔗糖为1.5份，麦芽糊精为1份，浓缩菌液为60份，十二烷基苯磺酸钠为3份，有机硅为0.5份，抗坏血酸为0.4份。
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