CN102384946B - 通过高效液相色谱法分离测定恩替卡韦及其非对映异构体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学领域，涉及通过高效液相色谱法分离测定恩替卡韦及其非对映异构体的方法。本发明提供了以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水混合溶液为流动相进行线性梯度洗脱的高效液相色谱法分离测定恩替卡韦及其非对映异构体的方法，能准确的分离和测定恩替卡韦及恩替卡韦制剂的各非对映异构体。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及用高效液相色谱法分离测定恩替卡韦及其非对映异构体的方法。
背景技术
恩替卡韦(Entecavir)是一种高效选择性乙肝病毒(HBV)多聚酶抑制剂，由美国公司研制开发上市，用于治疗慢性乙型肝炎。其化学名为：2-氨基-9-[(1S，3R，4S)-4-羟基-3-羟甲基-2-亚甲基环戊基]-1，9-二氢-6H-嘌呤-6-酮一水合物，分子式：C12H15N5O3·H2O，分子量：295.3。恩替卡韦分子中含有3个手性碳原子，在化学合成中会产生8种立体构型不同的光学异构体，其中一个为对映异构体，另外6个为非对映异构体。除恩替卡韦外，其它7个光学异构体被列为恩替卡韦的杂质。本发明将恩替卡韦、恩替卡韦对映异构体及恩替卡韦6个非对映异构体分别简称为ET，ETY-1，ETY-2，ETY-3，ETY-4，ETY-5，ETY-6，ETY-7，其中ET与ETY-1，ETY-2与ETY-3，ETY-4与ETY-5，ETY-6与ETY-7分别两两互为对映异构体，其结构如下：
对于恩替卡韦的7种光学异构体杂质，在生产恩替卡韦的过程中需要进行质量控制。含多个手性碳原子的化合物的光学异构体的分离一直是手性药物质量控制的难点，因此，实现恩替卡韦与其各种异构体的分离测定在恩替卡韦的质量控制方面具有现实意义。其中恩替卡韦与其对映异构体的分离测定已有报道采用正相色谱系统实现其分离。但是，关于恩替卡韦与其非对映异构体的分离测定则至今为止未见文献报道。寻找一种分离测定恩替卡韦及其非对映异构体的方法对于控制恩替卡韦的质量、提高药品的疗效、降低毒副作用迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过高效液相色谱法分离测定恩替卡韦及其非对映异构体的方法。
本发明采用一种反相色谱方法实现恩替卡韦与其非对映异构体的分离，从而达到控制恩替卡韦非对映异构体杂质的目的。
本发明所说的用反相色谱系统分离测定恩替卡韦与其非对映异构体的方法，是采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈-水为流动相，流动相的比例对分离情况及峰形有很大影响，经发明人试验摸索，确定采用线性梯度洗脱的方式，其中初始流动相中乙腈与水的体积比为0∶100～5∶95，最终流动相中乙腈与水的体积比为5∶95～15∶85；；优选为为初始流动相中乙腈与水的体积比为0∶100～5∶95，最终流动相中乙腈与水的体积比为6∶94～12∶88；更优选初始流动相为乙腈∶水0∶100～5∶95，最终流动相为乙腈∶水8∶92～12∶88；进一步优选为初始流动相为乙腈∶水3∶97，最终流动相为乙腈∶水10∶90，分离效果及峰形很好。所述的线性梯度是指在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。
本发明提供的通过反相高效液相色谱法分离检测恩替卡韦及其非对映异构体的方法具体条件如下：
1.色谱条件：色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以乙腈-水为流动相，其中初始流动相中乙腈与水的体积比为0∶100～5∶95，最终流动相中乙腈与水的体积比为5∶95～15∶85；；优选为为初始流动相中乙腈与水的体积比为0∶100～5∶95，最终流动相中乙腈与水的体积比为6∶94～12∶88；更优选初始流动相为乙腈∶水0∶100～5∶95，最终流动相为乙腈∶水8∶92～12∶88；进一步优选为初始流动相为乙腈∶水3∶97，最终流动相为乙腈∶水10∶90；检测波长为210nm～280nm，优选为254nm；柱温为20～45℃，优选为30℃；流动相流速为0.5～2.0ml/min，优选为1.0ml/min。
2.样品溶液的配制：采用溶剂制得含恩替卡韦及其各非对映异构体各0.05～0.5mg/ml的溶液。所述溶剂选自水、甲醇、乙腈，优选为甲醇；浓度优选为0.1mg/ml。
3.测定：将溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图并进行分析。
采用此色谱条件测定恩替卡韦与其非对映异构体的分离度均大于1.5，符合中国药典要求，从而实现了恩替卡韦与其非对映异构体的分离测定。
本发明针对现有技术的不足，建立了专属性强、精密度好、回收率高、操作简单快速的高效液相色谱法，可有效控制恩替卡韦及其制剂的质量，从而保证临床用药的安全性与有效性。
附图说明
图1：恩替卡韦与其非对映异构体分离的图谱(实施例1)
1号峰为ETY-4/ETY-5，2号峰为ETY-2/ETY-3，3号峰为ET，4号峰为ETY-6/ETY-7
图2：恩替卡韦非对映异构体测定的溶剂图谱(实施例1)
1号峰为ETY-2/ETY-3，2号峰为ET
图3：恩替卡韦非对映异构体测定的图谱(实施例1)
图4：恩替卡韦胶囊非对映异构体测定的图谱(实施例2)
1号峰为ETY-2/ETY-3，2号峰为ET
图5：恩替卡韦胶囊非对映异构体测定的空白辅料图谱(实施例2)
图6：恩替卡韦与其非对映异构体分离的图谱(实施例3)
1号峰为ETY-4/ETY-5，2号峰为ETY-2/ETY-3，3号峰为ET，4号峰为ETY-6/ETY-7
图7：恩替卡韦非对映异构体测定的溶剂图谱(实施例3)
1号峰为ETY-2/ETY-3，2号峰为ET
图8：恩替卡韦非对映异构体测定的图谱(实施例3)。
具体实施方式
实施例仅对发明内容做进一步说明，并不限于实施例内容。
实施例1
仪器：DIONEX高效液相色谱仪，P680泵，PDA-100检测器，TCC-100柱温箱；
色谱柱：DIONEX C18色谱柱(4.6*250mm，5μm)；
流动相：
柱温：30℃；
流速：1.0ml/min；
检测波长：254nm。
定位溶液的配制：精密称取恩替卡韦及其非对映异构体(ETY-2，ETY-3，ETY-4，ETY-5，ETY-6，ETY-7)各适量，分别用甲醇溶解并稀释制成0.1mg/ml的溶液；
样品溶液的配制：精密称取恩替卡韦及其非对映异构体ETY-2，ETY-4，ETY-6各适量至同一量瓶中，用甲醇溶解并稀释制成各含0.1mg/ml的溶液。
供试品溶液的配制：精密称取恩替卡韦适量，用甲醇溶解并稀释制成0.1mg/ml的溶液。
测定：取定位溶液各20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果ETY-2与ETY-3，ETY-4与ETY-5，ETY-6与ETY-7分别两两互为对映异构体，两两出峰重合，出峰顺序依次为：ETY-4/ETY-5，ETY-2/ETY-3，ET，ETY-6/ETY-7；取样品溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1，出峰顺序依次为：ETY-4，ETY-2，ET，ETY-6，保留时间分别为：14.550min，15.083min，15.958min，17.942min，恩替卡韦与前后异构体的分离度分别为2.1和4.5。取供试品溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图2，取溶剂甲醇20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图3。面积归一化法测得恩替卡韦的非对映异构体含量为0.06％，达到原料药的要求，本法可以用于恩替卡韦的质量控制。
实施例2
取恩替卡韦胶囊内容物，研细，精密称取适量加甲醇溶解并稀释制得0.1mg/ml的溶液，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取供试品溶液20μl注入高效液相色谱仪，照实施例1的条件进行测定，并同法进行空白辅料试验，结果见图4和图5，结果表明空白辅料无干扰，面积归一化法测得恩替卡韦胶囊的非对映异构体含量为0.06％，本法可以用于恩替卡韦制剂的质量控制。
实施例3
仪器：DIONEX高效液相色谱仪，P680泵，PDA-100检测器，TCC-100柱温箱；
色谱柱：迪马C18色谱柱(4.6*200mm，5μm)；
流动相：
柱温：25℃；
流速：1.5ml/min；
检测波长：254nm。
溶液配制方法及测定法照实施例1进行，样品溶液、供试品溶液及溶剂的图谱分别见图6、7、8。结果面积归一化法测得供试品溶液中恩替卡韦的非对映异构体含量为0.06％，达到原料药的要求，本法可以用于恩替卡韦的质量控制。
Claims (7)
1.通过高效液相色谱法分离测定恩替卡韦及其非对映异构体的方法，其特征在于：色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水混合溶液为流动相进行线性梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：
检测波长为210nm～280nm，柱温为20～45℃，流动相流速为0.5～2.0ml/min；
样品溶液配制方法为采用极性溶剂制得含恩替卡韦及其各非对映异构体各为0.05～0.5mg/ml的溶液，所述极性溶剂选自水、甲醇、乙腈中的一种或多种；
测定方法为将溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图并进行分析；
所述非对映异构体的结构式如下：
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的线性梯度洗脱为初始流动相中乙腈与水的体积比为3:97，最终流动相中乙腈与水的体积比为10：90。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述检测波长为254nm。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于所述柱温为30℃。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于所述流动相流速为1.0ml/min。
6.权利要求1所述的方法，其特征在于所述极性溶剂为甲醇。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于所述样品溶液配制为采用极性溶剂制得含恩替卡韦及其各非对映异构体各0.1mg/ml的溶液。
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