CN115993418A

CN115993418A - 产乳铁蛋白奶牛群体等级的红外光谱预测模型及构建方法

Info

Publication number: CN115993418A
Application number: CN202310292654.5A
Authority: CN
Inventors: 赵圣国; 王加启; 郑楠; 刘慧敏; 张养东
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2023-03-23
Filing date: 2023-03-23
Publication date: 2023-04-21

Abstract

本发明公开了产乳铁蛋白奶牛群体等级的红外光谱预测模型及构建方法。本发明大规模采集奶牛个体的牛奶样品，通过液相色谱法检测样品乳铁蛋白含量，利用统计分析，划定产乳铁蛋白牛群4个等级；在去除酪蛋白的基础上，以乳清为样品，获得乳清样品近红外图谱并对红外光谱数据利用化学计量学软件进行移动平均平滑法处理以及数据归一化处理；将划定的产乳铁蛋白牛群不同等级与处理后的红外光谱数据进行辨别分析，建立预测每个产乳铁蛋白奶牛群体等级的红外光谱预测模型，其准确性和稳定性良好；通过所构建的红外光谱预测模型，筛选符合高产、超高产等级的奶牛个体大量生产乳铁蛋白，具有成本低、简单易操作、容易实现大规模化筛选等优点。

Description

产乳铁蛋白奶牛群体等级的红外光谱预测模型及构建方法

技术领域

本发明涉及评估奶牛群体产乳铁蛋白等级性能的预测模型，尤其涉及用于产乳铁蛋白奶牛群体等级的红外光谱预测模型及其构建方法和应用，属于产乳铁蛋白奶牛群体等级的预测领域。

背景技术

牛乳中含有丰富的营养物质，包括蛋白质、脂质、乳糖、维生素等。其中蛋白质分为酪蛋白和乳清蛋白，乳清蛋白中含有乳铁蛋白。乳铁蛋白（LF）是一种天然存在于牛奶中的糖蛋白，具有抗菌、抗病毒和抗真菌的作用，对婴幼儿和成年人具有重要生理学功能。富含天然乳铁蛋白的乳制品，市场竞争力强，价格比普通牛奶更有利润空间，已经成为各大乳品企业争相推出的产品。但是，不同奶牛个体牛奶中的乳铁蛋白含量差异很大，从5 mg/L到700 mg/L不等，所以组建乳铁蛋白高产牛群，有助于实现生乳质量分级，实现优质优价，减少混群饲养和挤奶带来的乳铁蛋白含量稀释效应。但是，目前仍缺乏针对牛奶乳铁蛋白含量的奶牛群体等级划分方法，对乳铁蛋白含量高低奶牛群体等级仍未界定。

实现乳铁蛋白高产牛群的方法，最简单的就是用色谱法或者酶联免疫法检测个体奶牛牛奶中乳铁蛋白含量，根据含量高低筛选出乳铁蛋白高产奶牛个体，但是这个方法检测成本高，难以在千头或万头规模化牧场应用。专利文献CN 101271099A（发明名称：筛选高乳铁蛋白LF合成能力泌乳奶牛的方法）提出了一种基于奶牛个体表型数据（如产奶量、泌乳阶段、乳成分）预测牛奶乳铁蛋白含量，进行高乳铁蛋白牛群筛选的方法，该方法简单、成本低，但是存在准确性不足的问题，难以构建符合高标准要求的乳铁蛋白高产牛群。

红外光谱技术是牛奶中乳蛋白、乳脂肪、乳糖等乳成分的重要快速检测方法，被用于乳品的营养品质评价。尽管也有研究利用红外光谱技术检测乳铁蛋白含量，但是由于乳铁蛋白在牛奶中含量低，并且如果乳蛋白含量高，对乳铁蛋白特征光谱干扰大，难以实现乳铁蛋白红外光谱检测方法的高准确性。另外，利用红外光谱技术检测乳铁蛋白含量，仅仅是检测乳铁蛋白含量高低，没有与牛群等级结合，难以准确描述乳铁蛋白牛群等级。

发明内容

本发明的主要目的是提供产乳铁蛋白奶牛群体等级高低的红外光谱预测模型及其构建方法；

本发明的目的之二将构建的产乳铁蛋白奶牛群体等级高低的红外光谱预测模型应用于产乳铁蛋白奶牛群体等级的快速预测。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一方面是提供了产乳铁蛋白奶牛群体等级的红外光谱预测模型，其构建方法包括：

(1)大规模采集奶牛所产的生乳样品，通过液相色谱法检测生乳样品中的乳铁蛋白含量并进行统计分析，根据所产乳铁蛋白含量高低将产乳铁蛋白奶牛群体分为不同等级；

(2)将含有乳铁蛋白的奶样进行处理后获得乳清；

(3)获取乳清样品的近红外图谱，从近红外图谱中获得红外光谱数据；

(4)将红外光谱数据利用化学计量学软件进行移动平均平滑法处理并进行数据归一化处理。

(5)将步骤（1）划定的每个产乳铁蛋白奶牛群体的不同等级与处理后的红外光谱数据进行PLS-DA辨别分析，建立预测每个产乳铁蛋白奶牛群体等级的红外光谱预测模型。

作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤（1）中所述的大规模采集奶牛所产的生乳样品为采集3000头奶牛的生乳样品，每个生乳样品200 ml。

作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤（1）中通过液相色谱法检测生乳样品中的乳铁蛋白含量的液相色谱条件包括：色谱柱为Xbridge Protein BEH C4柱；

流动相A为三氟乙酸溶液，流动相B为三氟乙酸乙腈溶液；

梯度洗脱程序为：

0min，流动相A 95%，流动相B 5%；

6.5min，流动相A 62%，流动相B 38%；

10min，流动相A 62%，流动相B 38%；

12min，流动相A 40%，流动相B 60%；

15min，流动相A 40%，流动相B 60%；

15.5min，流动相A 95%，流动相B 5%；

检测波长：280 nm；流速：1.5 mL/min；柱温：60 ºC；进样量：30 ul。

作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤（1）通过液相色谱法检测生乳样品中的乳铁蛋白含量包括：配制乳铁蛋白标准系列溶液，通过液相色谱测定，以乳铁蛋白峰面积为纵坐标，以标准溶液浓度为横坐标，绘制乳铁蛋白标准曲线，得到乳铁蛋白标准曲线回归方程；将待测的生乳样品通过液相色谱测定并根据乳铁蛋白标准曲线回归方程计算乳铁蛋白含量。

作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤（1）中产乳铁蛋白奶牛群体根据所产乳铁蛋白含量高低分为低产、中产、高产和超高产四个等级；其中,低产等级的标准是生乳中乳铁蛋白含量<40 mg/L；所述中产等级的标准是40 mg/L≤生乳中乳铁蛋白含量＜90mg/L；所述高产等级的标准是90 mg/L≤生乳中乳铁蛋白含量＜140mg/L；所述超高产等级的标准是140 mg/L≤生乳中乳铁蛋白含量。

作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤（2）中将含有乳铁蛋白的奶样进行处理获得乳清的方式优选为：量取50ml奶样，加入冰醋酸将其pH值调到4.60，静置，离心，取上清液进行过滤，获得乳清。

作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤（2）中采用乳成分分析仪获得乳清样品的近红外图谱。

作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤（3）中所获取的近红外图谱的波数范围930～5000 cm^-1。

作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤（4）中将红外光谱数据利用化学计量学软件Unscrambler X10.4进行移动平均平滑法处理并采用A（SDev+B）法进行数据归一化处理。

本发明通过对构建的红外光谱预测模型的质量进行评估，结果发现，所构建的红外光谱预测模型R²值为0.72，均方根误差为25.3，表明本发明所构建的红外光谱预测模型的准确性和稳定性均良好。

本发明利用大规模奶牛个体牛奶样品采集，通过液相色谱法检测乳铁蛋白含量，利用统计分析，划定产乳铁蛋白牛群不同等级；在去除酪蛋白的基础上，以乳清为样品，获得乳清样品近红外图谱并对红外光谱数据利用化学计量学软件进行移动平均平滑法处理以及进行数据归一化处理；将划定的产乳铁蛋白牛群不同等级与处理后的红外光谱数据进行辨别分析，建立预测每个产乳铁蛋白奶牛群体等级的红外光谱预测预测，通过所构建的红外光谱预测模型，筛选符合高产、超高产等级的奶牛个体，从而大量生产乳铁蛋白，具有成本低、简单易操作、容易实现大规模化筛选等优点。

附图说明

图1是乳铁蛋白生产用奶牛群体等级的划分标准。

图2是获取的奶牛生乳乳清的近红外图谱。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1用于评估产乳铁蛋白奶牛群体等级的红外光谱预测模型的构建

一、乳铁蛋白生产用奶牛群体等级的划分

采集3000头奶牛的生乳样品，每个样品200 ml，冻存。

称取每个牛奶样品10 g（精确到0.01g），加入磷酸盐缓冲液I（称取磷酸氢二钠23.85 g，磷酸二氢钠4.99 g，加适量水溶解，用氢氧化钠溶液（10mol/L）调节pH至7.50，定至1 L，混匀）定容至50 mL，混匀，离心15 min，吸取25 mL中间层试液于另一50 mL离心管中，离心15 min。吸取上清液，待净化。

净化过程是：肝素亲和柱用10 mL磷酸盐缓冲液II（称取磷酸氢二钠5.96 g，磷酸二氢钠0.96 g，氯化钠5.84 g，加适量水溶解，用氢氧化钠溶（10mol/L）调节pH至7.50，定容至1 L，混匀）活化，准确移取10 mL上清液过柱，用10mL磷酸盐缓冲液II淋洗，用4.5 mL磷酸盐缓冲液III(称取磷酸氢二钠5.96 g，磷酸二氢钠2.50 g，氯化钠119.30 g，加适量水溶解，用氢氧化钠溶液（同上）调节pH至7.50，定容至1L，混匀) 洗脱，收集洗脱液，用磷酸盐缓冲液III定容至5.0 mL，涡旋混匀，过微孔滤膜后待测。

液相色谱参考条件为：色谱柱：Xbridge Protein BEH C4柱（柱长250 mm，柱内径4.6mm，填料粒径3.5 um），或相当的色谱柱。

流动相：A：三氟乙酸溶液（1 mL/L，用水稀释），B：三氟乙酸乙腈溶液（1 mL/L，用乙腈稀释）。梯度洗脱条件如下表1所示：

表1 梯度洗脱条件

检测波长：280 nm。流速：1.5 mL/min。柱温：60 ºC。进样量：30 uL。

液相色谱测定过程为：取标准系列溶液（乳铁蛋白标准系列溶液：准确移取一定量的标准中间溶液（200mg/L），用磷酸盐缓冲液III稀释定容，配制成乳铁蛋白浓度分别为0.0mg/L、20.0 mg/L、40.0mg/L、60.0 mg/L、80.0 mg/L和100.0 mg/L的标准工作溶液，现用现配）和试样溶液上机测定。以乳铁蛋白峰面积为纵坐标，以标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到乳铁蛋白标准曲线回归方程。

试样中乳铁蛋白的质量分数X计，数值以毫克每千克(mg/kg)表示，按下列公式计算：

式中：

c—被测组分曲线计算浓度，单位为毫克每升(mg/L)；

V3—样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；

V1—试样处理液总体积，单位为毫升(mL)；

m—试样质量，单位为克(g)；

V2—样液过柱体积，单位为毫升(mL)；

1000—换算系数。

通过统计分析3000头奶牛乳铁蛋白含量，结果发现：

乳铁蛋白最小值为8 mg/kg，25%分布值为40 mg/L，50%分布值为90 mg/L，75%分布值为平均值140 mg/L，最大值为690 mg/L，标准差为72.00，变异系数63.25%，表明不同奶牛个体间变异较大。

根据乳铁蛋白在0-25%、25%-50%、50%-75%、75%-100%四个区间的分布，设定产乳铁蛋白的奶牛群体等级，产乳铁蛋白的奶牛群体等级设定为四个标准，即：低产（乳铁蛋白<40mg/L）、中产(40 mg/L≤乳铁蛋白＜90mg/L)、高产(90 mg/L≤乳铁蛋白＜140 mg/L)和超高产(140 mg/L≤乳铁蛋白)。

二、红外光谱预测模型的构建

量取50ml奶样，加入适量冰醋酸将其pH值调到4.60，静置30 min。在12000g下离心10min，取上清液进行过滤，获得乳清，采用MilkoScan FT 120乳成分分析仪，获得乳清样品近红外图谱，图谱的波数范围为930～5000 cm^-1。将红外光谱数据，利用化学计量学软件Unscrambler X10.4，进行移动平均平滑法处理，采用A（SDev+B）法进行数据归一化处理。选取80%的样品作为测试集，用于构建模型，将设定的4个乳铁蛋白牛群等级，即；低产（<40mg/L）、中产(≥40 mg/L，＜90 mg/L)、高产(≥90 mg/L，＜140 mg/L)和超高产(≥140 mg/L)，与红外光谱数据进行PLS-DA辨别分析，建立预测每个等级的红外光谱模型。

试验例1用于评估产乳铁蛋白奶牛群体等级的红外光谱预测模型的准确性和稳定性试验

一、试验方法

选取剩余20%样品作为验证集，利用构建好的乳铁蛋白等级红外光谱模型，对样品的乳铁蛋白等级进行预测，作为预测值。将样品预测值与真实值进行比较，计算R²值和均方根误差。

二、试验结果

通过评估模型质量，结果发现，所构建的红外光谱预测模型R²值为0.72，均方根误差为25.3，表明模型的准确性和稳定性均良好。

试验例2用于评估产乳铁蛋白奶牛群体等级的红外光谱预测模型的实际应用评估试验

实际应用中采集规模化牛场奶牛个体的奶样，利用红外光谱仪采集乳清的红外光谱数据，通过实施例1构建的红外光谱评估模型，筛选符合高产、超高产等级的奶牛个体，构建乳铁蛋白高产牛群进行单独饲养管理和挤奶，从而大量生产乳铁蛋白。

经过验证，采用本发明构建的红外光谱预测模型能够准确的评估产乳铁蛋白奶牛群体等级，在产乳铁蛋白奶牛群体等级的实际评估中具有应用价值。

Claims

1.产乳铁蛋白奶牛群体等级的红外光谱预测模型，其特征在于，其构建方法包括：

(1)大规模采集个体奶牛的生乳样品，通过液相色谱法检测生乳样品中的乳铁蛋白含量并进行统计分析，根据所产乳铁蛋白含量高低将产乳铁蛋白奶牛群体分为不同等级；

(2)将含有乳铁蛋白的生乳奶样进行处理后获得乳清；

(4)将红外光谱数据利用化学计量学软件进行移动平均平滑法处理并进行数据归一化处理；

2.根据权利要求1所述的红外光谱预测模型，其特征在于，步骤（1）中所述的大规模采集个体奶牛的生乳样品为采集3000头奶牛的生乳样品，每个生乳样品200 ml。

3.根据权利要求1所述的红外光谱预测模型，其特征在于，步骤（1）中通过液相色谱法检测生乳样品中的乳铁蛋白含量的液相色谱条件包括：色谱柱为Xbridge Protein BEH C4柱；

流动相A为三氟乙酸溶液，流动相B为三氟乙酸乙腈溶液；

梯度洗脱程序如下：

0min，流动相A 95%，流动相B 5%；

6.5min，流动相A 62%，流动相B 38%；

10min，流动相A 62%，流动相B 38%；

12min，流动相A 40%，流动相B 60%；

15min，流动相A 40%，流动相B 60%；

15.5min，流动相A 95%，流动相B 5%。

4.根据权利要求1所述的红外光谱预测模型，其特征在于，步骤（1）中通过液相色谱法检测生乳样品中的乳铁蛋白含量的液相色谱条件包括：检测波长：280 nm；流速：1.5 mL/min；柱温：60 ºC；进样量：30 ul。

5.根据权利要求1所述的红外光谱预测模型，其特征在于，步骤（1）通过液相色谱法检测生乳样品中的乳铁蛋白含量包括：配制乳铁蛋白标准系列溶液，通过液相色谱进行测定，以乳铁蛋白峰面积为纵坐标，以标准溶液浓度为横坐标，绘制乳铁蛋白标准曲线得到乳铁蛋白标准曲线回归方程；将待测的生乳样品通过液相色谱进行测定并根据乳铁蛋白标准曲线回归方程计算乳铁蛋白含量。

6.根据权利要求1所述的红外光谱预测模型，其特征在于，步骤（1）中根据所产生乳中乳铁蛋白含量高低将产乳铁蛋白奶牛群体分为低产、中产、高产和超高产四个等级；其中，低产的标准是：生乳中乳铁蛋白含量<40 mg/L；中产的标准是：40 mg/L≤生乳中乳铁蛋白含量＜90 mg/L；高产的标准是：90 mg/L≤生乳中乳铁蛋白含量＜140 mg/L；超高产的标准是：140 mg/L≤生乳中乳铁蛋白含量。

7.根据权利要求1所述的红外光谱预测模型，其特征在于，步骤（2）中将含有乳铁蛋白的奶样进行处理获得乳清的方法为：量取50ml奶样，加入冰醋酸将其pH值调到4.60，静置，离心，取上清液进行过滤，获得乳清；

步骤（2）中采用乳成分分析仪获得乳清样品的近红外图谱。

8.根据权利要求1所述的红外光谱预测模型，其特征在于，步骤（3）中所获取的近红外图谱的波数范围为930～5000 cm^-1。

9.根据权利要求1所述的红外光谱预测模型，其特征在于，步骤（4）中将红外光谱数据利用化学计量学软件Unscrambler X10.4进行移动平均平滑法处理并采用A（SDev+B）法进行数据归一化处理。

10.权利要求1-9任何一项所述的红外光谱预测模型在预测奶牛群体产乳铁蛋白高低等级中的应用。