CN103575832A - 在线全二维液相色谱分离系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种在线全二维液相色谱分离系统及方法。该系统包括：数据记录处理系统、进样系统、输液系统、检测系统、由离子交换柱和反相柱串联相通构成的二维色谱柱系统；数据记录处理系统控制进样系统将样品注入离子交换柱后，控制输液系统向二维色谱柱系统按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种pH值的流动相，等度洗脱出不同组分进入反相柱中；在输送每种pH值流动相后，控制输液系统向二维色谱柱系统输送包含水相和有机相的流动相，梯度洗脱出极性不同的化合物；并控制检测系统检测并记录二维色谱柱系统的洗脱物的信号。利用本方案，可以高效分离复杂样品中的不同酸碱度和/或不同极性的两种或两种以上的化合物。

Description

在线全二维液相色谱分离系统及方法

技术领域

本发明涉及液相色谱分离领域，特别涉及一种二维液相色谱分离系统及方法。

背景技术

液相色谱（liquid chromatography，LC）是一种具有高效、快速及应用广泛的现代分离技术，它是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱法的理论和技术，其以高压输送流动相，采用高效固定相及较高灵敏度检测器，发展而成的现代色谱分析方法。其中，液相色谱己经成为有机物质分析的关键技术，其在中药学、生物化学、临床医学、食品检验、石油化工及环境污染监测等领域得到广泛的应用，成为了分析化学家和生物化学家解决各种实际分离、分析难题必不可缺的工具。实际应用中，液相色谱分离多采用一根色谱柱进行分离。

而对于成分较为复杂的混合物，例如：中药、体液等，由于分析要求较高，传统的一维液相色谱分离技术，因分辨率和峰容量低等限制，无法满足分离需要，因此，需要采用二维液相色谱分离技术进行分离。其中，对于样品（例如：成分复杂的混合物）的分离，现有技术中通常所采用的二维液相色谱分离系统包括：（1）离线式二维液相色谱分离系统，其中，样品经过第一维色谱柱分离，收集流分，富集、浓缩后，再进行第二维色谱柱分离；（2）在线式二维液相色谱分离系统，其中，采用特殊装置进行切割（例如六通阀或十通阀等）、两根色谱柱、两套液相泵系统、捕获柱或大体积收集环来富集或储存样品，通过控制该特定装置的切换可以切割所需成分或全部成分，实现部分或所有成分进入第二维色谱柱。

上述方式中，对于离线式二维液相色谱分离系统而言，由于无法将第一维色谱柱所洗脱的化合物直接导入第二维色谱柱中进行后续的分离，使得操作较为复杂、耗时；而对于在线式二维液相色谱分离系统而言，由于需要两套HPLC泵、复杂的环-阀切换接头和控制该系统的特定软件，导致不能在常规的液相色谱分离系统中直接使用，因此，存在系统操作复杂且需要专门的接头等系列问题。

综上可见，目前亟需一种性能优越、设备简易、操作简单，能够在常规的液相色谱分离系统中实现二维液相色谱分离的技术，从而达到高效分离复杂样品中化合物的目的。

发明内容

基于上述问题，本发明实施例公开了一种二维液相分离系统及方法，以达到高效分离复杂样品中的不同酸碱度和/或极性不同的两种或两种以上的化合物的目的。技术方案如下：

第一方面，本发明实施例提供了一种在线全二维液相色谱分离系统，适用复杂样品中化合物的分离，所述复杂样品中包含两种或两种以上不同pKa值和/或不同极性的化合物；所述系统包括：

进样系统，在数据记录处理系统的控制下，将待测试的样品注入二维色谱柱系统；

所述输液系统，在所述数据记录处理系统的控制下，按照设定的洗脱程序，向二维色谱柱系统输送流动相；其中，所输送的流动相包括：预设的至少两种不同pH值的水相和一种由至少一种有机试剂组成的有机相；

所述二维色谱柱系统，由离子交换柱作为第一维色谱柱和反相柱作为第二维色谱柱构成，其中，所述离子交换柱和所述反相柱串联相通；所述数据记录处理系统，控制所述进样系统将待测试的样品注入所述二维色谱柱系统的离子交换柱后，控制所述输液系统向所述二维色谱柱系统按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种包含所述不同pH值的水相的流动相进行等度洗脱，使得各种所述不同pH值的流动相从所述离子交换柱中分别洗脱出不同的组分并进入反相柱中；并在输送每种pH值的流动相之后，控制所述输液系统向所述二维色谱柱系统输送包含水相和所述有机相的流动相进行梯度洗脱，将洗脱到所述反相柱中的化合物按极性大小洗脱分离，所述包含水相和有机相的流动相中有机相的比例是在输送过程中逐渐单向调整到预设范围的；在整个洗脱过程中控制所述检测系统检测并记录所述二维色谱柱系统的洗脱物的信号；

所述检测系统，在所述数据记录处理系统控制下，检测并记录所述二维色谱柱系统的洗脱物的信号。

优选的，所述各种包含所述不同pH值的水相的流动相中，还包含：1%～20%中任一比例的有机相。

优选的，所述离子交换柱和所述反相柱通过两通接头串联。

优选的，所述在线全二维液相色谱分离系统还包括：

柱温箱，在所述数据记录处理系统的控制下，使所述二维色谱柱系统保持恒温。

优选的，所述离子交换柱为强阳离子交换柱或强阴离子交换柱。

优选的，所述反相柱为C18反相柱、C8反相柱或C4反相柱。

优选的，所述检测器包括：质谱仪、紫外检测器、光电二极管阵列检测器、电喷式检测器、蒸发光散射检测器、荧光检测器中的至少一种。

第二方面，本发明实施例还提供了一种在线全二维液相色谱分离方法，适用于本发明实施例所提供的在线全二维液相色谱分离系统，所述方法包括：

数据记录处理系统控制进样系统向二维色谱柱系统中注入待测试的样品；

数据记录处理系统控制所述进样系统将待测试的样品注入所述二维色谱柱系统的离子交换柱后，控制所述输液系统向所述二维色谱柱系统按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种包含所述不同pH值的水相的流动相进行等度洗脱，使得各种所述不同pH值的流动相从所述离子交换柱中分别洗脱出不同的组分并进入反相柱中；

数据记录处理系统在输送每种pH值的流动相之后，控制所述输液系统向所述二维色谱柱系统输送包含水相和所述有机相的流动相进行梯度洗脱，将洗脱到所述反相柱中的化合物按极性大小洗脱分离，所述包含水相和有机相的流动相中有机相的比例是在输送过程中逐渐单向调整到预设范围的；

数据记录处理系统在整个洗脱过程中控制所述检测系统检测并记录所述二维色谱柱系统的洗脱物的信号。

优选的，数据记录处理系统控制所述输液系统向所述二维色谱柱系统按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种包含所述不同pH值的水相的流动相进行等度洗脱，包括：

所述数据记录处理系统控制所述输液系统向所述二维色谱柱系统按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种包含所述不同pH值的水相和第一比例的有机相的流动相等度洗脱；其中，所述第一比例为1%～20%中任一比例。

优选的，所述在线全二维液相色谱分离系统还包括：柱温箱；

所述在线全二维液相色谱分离方法还包括：所述数据记录处理系统控制所述柱温箱，以使所述二维色谱柱系统保持恒温。

本方案所提供的系统，与离线式二维液相色谱分离系统相比，由于可以将第一维色谱柱所洗脱的成分直接导入第二维色谱柱中进行后续的分离，解决了操作繁琐、耗时的问题；并且，与在线式二维液相色谱分离系统相比，无需专门的接头及软件，可以基于常规的液相色谱分离系统的设备和软件，解决了系统操作复杂且需要专门的接头等系列问题。因此，本方案所提供的系统性能优越、设备简易、操作简单，能够在常规的液相色谱分离系统中实现二维液相色谱分离，从而达到了高效分离复杂样品中的不同酸碱度和/或极性不同的两种或两种以上的化合物的目的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为某一元酸中各型体的δ_HA-pH曲线；

图2为本发明实施例所提供的一种在线全二维液相色谱分离系统的结构示意图；

图3为利用本发明实施例所提供的在线全二维液相色谱分离系统进行化合物分离的示意图；

图4为利用本发明实施例所提供的二维液相色谱分离系统分离金铃子散混合标准品溶液中的化合物所得到的色谱图；

图5利用C18反相柱分离金铃子散提取液中的化合物所得到的色谱图；

图6为利用强阳离子交换柱分离金铃子散提取液中的化合物所得到的色谱图；

图7为利用本发明实施例所提供的二维液相色谱分离系统分离金铃子散提取液中的化合物所得到的色谱图；

图8为本发明实施例所提供的一种在线全二维液相色谱分离方法的流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了更好的描述本发明，首先对本发明实施例所提供的在线全二维液相色谱分离系统及方法所基于的原理进行如下说明：

以一元酸在溶液中各型体的分布系数为例：

分布系数（distribution fraction）是指溶液中某型体的平衡浓度在溶质总浓度中所占的分数，又称为分布分数，以δ_i表示，并用下标i说明它所属型体，即：δ_i=[i]/c，其中，符号[]表示某型体的平衡浓度，c表示各型体浓度的总和。并且，分布系数的大小能定量说明溶液中各型体的分布情况，由分布系数可求得溶液中各型体的平衡浓度。设一元弱酸HA的浓度为c（mol/L），在水溶液中达到平衡后， 存在的两种型体分别为[HA]和[A^-]，根据分布系数的定义和离解常数Ka的表达式得：

${\mathrm{\δ}}_{\mathrm{HA}}=\frac{\left[\mathrm{HA}\right]}{C}=\frac{\left[H^{+}\right]}{\left[H^{+}\right]+\mathrm{Ka}}---(1-1)$

${{\mathrm{\δ}}_A}^{-}=\frac{\mathrm{Ka}}{\left[H^{+}\right]+\mathrm{Ka}}---(1-2)$

δ_HA+δ_A ^-=1    (1-3)

从式（1-1）和式（1-2）可知，根据溶液的pH值及化合物离解常数Ka，可以计算该一元弱酸在不同pH溶液中[δ_HA]和[δ_A ^-]的分布系数，据此绘制出如图1所示的型体分布图（δ_HA-pH曲线）。

由图1可知，随着溶液pH的升高，δ_HA逐渐减少，而δ_A ^-逐渐增大；在两条曲线的交点处，即δ_HA=δ_A ^-=0.5时，[HA]=[A^-]，溶液的pH=pKa（其中，p为“-lg”，如pH=-lg[H⁺]）；当pH＜pKa时，溶液中HA为主要存在型体；反之，当pH＞pKa时，A^-为主要存在型体，pH＜pKa–2时，δ_HA趋近于1，δ_A ^-接近于零；而当pH＞pKa+2时，δ_A ^-趋近于1。可见，可以通过控制溶液的pH值得到所需要的型体。

本领域技术人员可以理解的是，混合物中含有大量的酸性化合物和碱性化合物，例如：中药、体液等均含有大量的酸性化合物和碱性化合物。而根据分布系数δ与溶液pH的关系，发明人发现，通过串联离子交换柱和反相柱，即可在常规的液相色谱分离系统中实现二维液相色谱分离。其中，需要说明的是，离子交换柱的分离原理为：根据化合物离子与离子交换基团电荷吸引力的差异进行分离；而反相柱的分离原理为：根据化合物在固定相和流动相分配系数的不同进行分离。

基于上述技术原理，下面对本发明实施例所提供的一种在线全二维液相色谱分离系统进行介绍。

需要说明的是，本发明实施例所提供的一种在线全二维液相色谱分离系统适用于复杂样品中的酸性化合物和碱性化合物的分离，该复杂样品中包含两种或两种以上不同pKa值和/或极性不同的化合物，pKa为溶液中游离型型体分布系数和离子型型体分布系数相同时的pH值；其中，该复杂样品指成分复杂的混合物，例如：中药、体液、蛋白质、脂肪、多肽中的至少一种样品。

如图2所示，本发明实施例所提供的一种二维液相色谱分离系统，可以包括：

进样系统（图2中仅示出样品的输送管道以及存放样品的容器230），在数据记录处理系统的控制下，将待测试的样品注入二维色谱柱系统；

输液系统（图2中仅示出水相和有机相的输送管道以及存放水相和有机相的容器240），其在该数据记录处理系统的控制下，按照设定的洗脱程序，向二维色谱柱系统210输送流动相；其中，所输送的流动相包括：至少两种不同pH值的水相和一种由至少一种有机试剂组成的有机相；

该二维色谱柱系统210，由离子交换柱211作为第一维色谱柱和反相柱212作为第二维色谱柱构成，其中，离子交换柱211和反相柱212串联相通；

该数据记录处理系统（图2中未显示），控制进样系统将待测试的样品注入该二维色谱柱系统210的离子交换柱211后，控制输液系统向该二维色谱柱系统210按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种包含不同pH值的水相的流动相进行等度洗脱，使得各种不同pH值的流动相从该离子交换柱211中分别洗脱出不同的组分并进入反相柱212中；并在输送每种pH值流动相之后，控制输液系统向该二维色谱柱系统210输送包含水相和有机相的流动相进行梯度洗脱，将洗脱到该反相柱212中的化合物按极性大小洗脱分离，包含水相和有机相的流动相中有机相的比例是在输送过程中逐渐单向调整到预设范围的；在整个洗脱过程中控制检测系统220检测并记录该二维色谱柱系统210的洗脱物的信号；

检测系统220，其在该数据记录处理系统的控制下，检测并记录二维色谱柱系统210的洗脱物的信号。

其中，本领域技术人员可以理解的是，进样系统、输液系统、检测系统分别通过相应的输送管与二维色谱柱系统210相连，而数据记录处理系统控制进样系统的进样过程，输液系统输送流动相的过程，以及检测系统对二维色谱柱系统所洗脱出的物质的检测过程。

需要说明的是，其中，进样系统、输液系统、检测系统和数据记录处理系统都可以采用现有技术的进样系统、输液系统、检测系统和数据记录处理系统的硬件设备。

其中，图2中所示的容器230用于存放待测试的样品，进样系统将容器230中的待测试的样品注入该二维色谱柱系统中，容器240用于存放至少两种不同pH值的水相和一种由至少一种有机试剂组成的有机相，其中，输液系统在该数据记录处理系统的控制下能够将容器240中的水相和有机相输送至二维色谱柱系统210中。

基于上述的二维液相色谱分离系统，洗脱步骤为：当待测试的样品进入二维色谱柱系统210时，通过改变流动相体系的组成和比例，使一部分化合物保留在离子交换柱211中，一部分化合物洗脱进入到反相柱212；然后通过改变流动相体系的组成和比例，保持离子交换柱211的保留行为不变，使进入反相柱212的化合物在第二维色谱柱中得到二次分离；改变流动相体系的组成和比例，使原先保留在离子交换柱211的化合物，一部分仍然保留在离子交换柱211中，一部分被洗脱下来进入到反相柱212；然后改变流动相体系组成和比例，使洗脱下来的化合物在反相柱212中再次分离；如此反复，直到所有的化合物从离子交换柱211中洗脱下来，并在反相柱212中进行再次分离。

其中，在实际应用中，离子交换柱211和反相柱212可以通过两通接头串联，当然并不局限于此。并且，本领域技术人员可以理解的是，该离子交换柱211可以为强阳离子交换柱或强阴离子交换柱；而该反相柱212可以为C18反相柱、C8反相柱或C4反相柱，当然并不局限于此。

其中，有机相的比例是在输送过程中逐渐单向调整到预设范围，即在一次输送过程中向水相中添加比例单调变化的有机相。具体的，在实际应用中，在洗脱反相柱212中的化合物时，可以预先将所需的水相和有机相放置于不同的容器内，而在数据记录处理系统的控制下，输液系统按照不同的输送速率同时输送水相和有机相，从而实现在一次输送过程中有机相比例单调变化。本领域技术人员可以理解的是，有机相比例单调变化可以包括：有机相比例单调连续变化或有机相比例单调梯度变化；具体而言，有机相比例单调连续变化为有机相比例连续增加，具体变化速率可以根据反相柱特性和/或反相柱中当前所存在化合物的特性确定；而有机相比例单调梯度变化为有机相比例梯度增加，具体梯度变化方式以及变化速率可以根据反相柱特性和/或反相柱中当前所存在化合物特性确定。

需要说明的是，对于强阳离子交换柱而言，由于其只能吸附阳离子化合物，中强碱性化合物和弱碱性化合物的洗脱迟于酸性化合物的洗脱，且pH值较低的流动相中酸性化合物主要以游离型为存在型体，因此，在洗脱过程中可以按照pH值单调增加的顺序依次输送各种包含不同pH值的水相的流动相进行等度洗脱；而对于强阴离子交换柱而言，由于其只能吸附阴离子化合物，中强酸性化合物和弱酸性化合物的洗脱迟于碱性化合物的洗脱，且pH值较高的流动相中碱性化合物主要以游离型为存在型体，因此，在洗脱过程中可以按照pH值单调减小的顺序依次输送各种包含不同pH值的水相的流动相进行等度洗脱。

进一步，需要说明的是，在实际应用中，当离子交换柱211为强阳离子交换柱时，pH值最低的水相的pH值不高于pKa-2；其中，pKa为溶液中游离型型体分布系数和离子型型体分布系数相同时的pH值；并且，洗脱反相柱的流动相通过向pH值最低的水相中添加比例单调变化的有机相获得；在洗脱过程中，依据pH值由低到高的顺序，依次为二维色谱柱系统输送各种包含不同pH值的水相的流动相分别将强阳离子交换柱中的样品中的至少部分化合物洗脱至反相柱中，并且，在输送完每种pH值流动相后，通过向二维色谱柱系统中输送洗脱反相柱的流动相将反相柱中的极性不相同的化合物洗脱，其中，洗脱强阳离子交换柱中所存在的化合物的过程和洗脱反相柱中的极性不相同的化合物的过程交替进行。

而当离子交换柱212为强阴离子交换柱时，pH值最高的水相的pH值不低于pKa+2；其中，pKa为溶液中游离型型体分布系数和离子型型体分布系数相同时的pH值；并且，洗脱反相柱的流动相为通过向pH值最高的水相中添加比例单调变化的有机相获得；在洗脱过程中，依据pH值由高到低的顺序，依次为二维色谱柱系统输送各种包含不同pH值的水相的流动相分别将强阴离子交换柱中的样品中的至少部分化合物洗脱至反相柱中，并且，在输送完每种pH值流动相后，通过向二维色谱柱系统中输送洗脱反相柱的流动相将反相柱中所存在的极性不相同的化合物洗脱，其中，洗脱强阴离子交换柱中所存在的化合物的过程和洗脱反相柱中的极性不相同的化合物的过程交替进行。

需要说明的是，上述关于水相的pH值的具体限定值仅仅作为示例，并不应该构成对本发明实施例的限定，只要保证当前pH值的水相中所能够存在的主要型体为一种化合物的型体即可。

需要说明的是，至少两种不同pH值的水相至少包含一种低pH值的水相和一种高pH的水相。其中，可以使用甲酸、醋酸、少量的三氟乙酸、柠檬酸等中的至少一种试剂配制低pH值的水相；而可以使用氨水、甲酸铵、醋酸铵、三乙胺、其他挥发性胺等中的至少一种试剂配制高pH值的水相，当然并不局限于此。

本领域技术人员可以理解的是，对于不同的样品，可以选用不同的流动相体系，并且，可以根据实际应用场景设定流动相的输送程序。

其中，输液系统可以为一套现有技术已有的液相泵系统，该液相泵的工作原理与现有技术相同，在此不作赘述。

其中，根据待测试的样品性质的不同，可以选用现有技术已有的不同的检测系统，例如，光电二极管阵列检测器，可以获得化合物的色谱图和光谱图，又如质谱仪，不仅可以获得化合物的分子量，而且还能提供化合物离子碎片，辅助化合物结构解析。当然，还可以采用其他检测器，例如：紫外检测器、电喷式检测器、蒸发光散射检测器、荧光检测器；并且，为了获得较全面的信号，在实际应用中至少需要一种检测器，这也是合理的。

需要说明的是，为了保护仪器，在线全二维液相色谱分离系统210所采用的流动相应与离子交换柱211、反相柱212、检测系统220相兼容。例如：当使用质谱仪作为检测系统时，非挥发性盐和高浓度盐不仅会腐蚀、损害质谱仪，还会沉积在喷雾针处，严重影响化合物的电离，导致化合物信号减弱甚至无法被检测，因此，为了避免损害质谱仪，流动相不应该选用含非挥发性盐和高浓度盐的流动相。

本方案所提供的系统，与离线式二维液相色谱分离系统相比，由于可以将第一维色谱柱所洗脱的成分直接导入第二维色谱柱中进行后续的分离，解决了操作繁琐、耗时的问题；并且，与在线式二维液相色谱分离系统相比，无需专门的接头及软件，可以基于常规的液相色谱分离系统的设备和软件，解决了系统操作复杂且需要专门的接头等系列问题。因此，本方案所提供的系统性能优越、设备简易、操作简单，能够在常规的液相色谱分离系统中实现二维液相色谱分离，从而达到了高效分离复杂样品中不同酸碱度和/或不同极性的两种或两种以上的化合物的目的。

进一步的，为了提高洗脱效率，各种包含不同pH值的水相的流动相中，还可以包含：1%～20%中任一比例的有机相，其中，该比例包括1%和20%；此时，数据记录处理系统控制输液系统向二维色谱柱系统210按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种包含不同pH值的水相和第一比例的有机相的流动相进行等度洗脱，使得各种不同pH值的流动相从离子交换柱211中分别洗脱出不同的组分并进入反相柱212中；其中，该第一比例为1%～20%中任一比例。相应的，包含水相和该有机相的流动相中有机相的比例可以不低于该第一比例，以更好地对反相柱212中的化合物进行洗脱。

更进一步的，本领域技术人员可以理解的是，温度会影响化合物的色谱分离，例如，对反相色谱而言，在不同的温度下，化合物在固定相和流动相的分配系数不同，进而导致化合物色谱行为的改变（例如保留时间的改变），因此，为了保证化合物色谱行为的一致性，提高分离结果的准确性，需要使离子交换柱211和反相柱212维持恒温状态。因此，本发明实施例所提供的在线全二维液相色谱分离系统还可以包括：

柱温箱，在数据记录处理系统的控制下，为离子交换柱211和反相柱212提供温度辅助，使离子交换柱211和反相柱212能够保持恒温。

需要说明的是，离子交换柱211和反相柱212放置于柱温箱内，具体的放置方式与现有技术相同，在此不作赘述。

下面结合具体的应用实例对本发明实施例所提供的一种在线全二维液相色谱分离系统进行介绍。

本实施例中，在线全二维液相色谱分离系统可以包括：输液系统、进样系统、二维色谱柱系统、光电二极管阵列检测器和数据记录处理系统。其中，待测试的样品为中药，二维色谱柱系统中的第一维色谱柱为强阳离子交换柱，第二维色谱柱为反相柱，其中，由于强阳离子交换柱只能吸附阳离子化合物，酸性化合物先被洗脱下来，碱性化合物后被洗脱下来。

本实施例所提供的在线全二维液相色谱分离系统中的各个器件的功能以及各个器件之间的关系与上述实施例相似，在此不作赘述。

其中，利用本发明实施例所提供的在线全二维液相色谱分离系统的洗脱过程如下：

将待测试的样品在低pH条件下进样，当样品进入强阳离子交换柱上时，先使用低pH值的流动相洗脱（即通过低pH值流动相平衡），使弱碱性、中强碱性化合物保留在强阳离子交换柱上，酸性化合物被洗脱下来进入反相柱中，然后增加低pH值流动相中有机相的比例，以形成洗脱反相柱当前化合物所需的流动相并输送，将反相柱中极性不相同的酸性化合物洗脱出来并分别输送至光电二极管阵列检测器；再适当增加流动相的pH值（即通过高pH值流动相平衡），使中强碱性化合物保留在强阳离子交换柱上，弱碱性化合物从强阳离子交换柱中洗脱下来进入反相柱，然后，更换成低pH值流动相并逐渐增加有机相的比例，以形成洗脱反相柱当前化合物所需的流动相并输送，将反相柱中极性不相同的弱碱性化合物洗脱出来并分别输送至光电二极管阵列检测器；如此反复，适当增加流动相的pH值，使中强碱性化合物从强阳离子交换柱中洗脱下来并进入到反相柱中，然后更换成低pH值流动相并逐渐增加有机相的比例，以形成洗脱反相柱当前化合物所需的流动相并输送，将反相柱中极性不相同的中强碱性化合物洗脱出来并输送至光电二极管阵列检测器；进一步，由光电二极管阵列检测器检测并记录二维色谱柱系统的洗脱物的信号，具体洗脱流程如图3所示。其中，本领域技术人员可以理解的是，酸性化合物包含大、中、小极性酸性化合物，弱碱化合物和中强碱化合物也包含大、中、小极性碱性化合物，其中，通过改变流动相体系中有机相的比例，可以使大、中、小极性化合物在反相柱中分离。

其中，低pH值的水相可以使用甲酸、醋酸、少量的三氟乙酸、柠檬酸等中的至少一种试剂配制而成；而可以使用氨水、甲酸铵、醋酸铵、三乙胺、其他挥发性胺等中的至少一种试剂配制高pH值的水相，当然，并不局限于此。

其中，本实施例采用一系列不同pH值的流动相进行洗脱而非采用盐梯度洗脱，不仅能够实现样品按pKa进行在线全二维液相色谱分离，而且还可以与反相柱和质谱仪直接相连而不需要预先的洗涤脱盐过程。

可见，通过本发明实施例所提供的上述在线全二维液相色谱分离系统可以高效分离中药中不同极性的酸性化合物和碱性化合物，且性能优越、设备简易、操作简单。

下面以金铃子散为作为复杂样品，第一维色谱柱为强阳离子交换柱，第二维色谱柱为C18反相柱为例，介绍利用本发明实施例所提供的在线全二维液相色谱分离系统进行化合物分离的方法。

金铃子散首见于刘完素《素问病机气宜保命集》第二十：“治热厥心痛，或发或止，久不愈者，当用金铃子散。金铃子，玄胡(各一两)，上为细末，每服三钱，酒调下。”

【方药】金铃子、玄胡各30克。共为细末。

【用法】每次取6～9克，温开水送服。每天2～3次。

【功效】疏肝泻热，通络止痛。

【主治】肝郁化火之痛证。表现为脘、腹、胁肋诸痛，时发时止，口苦，舌质紫暗，苔黄，脉象弦数。金铃子散是治疗肝郁化火而致的胸胁、腹脘、疝气痛、痛经等痛症的代表方剂。

仪器与试剂

Waters ACQUITY UPLC(Waters Corporation,Milford,USA)包括一套输液系统、一个进样系统，一个柱温箱、光电二极管阵列检测器。Milli-Q纯水系统（Millipore,Bedford,MA），Hettich MIKRO 220R离心机，SCIENTZ25-12超声仪（Ningbo,China），三氟乙酸、氨水、三乙胺等试剂购自MREDA（USA），乙腈、甲醇购自Sigma Aldrich(Milwaukee,WI,USA)，以上试剂均为色谱纯。

样品制备

按《素问病机气宜保命集》记载，精密称取川楝子和元胡各9g，置于250mL圆底烧瓶，加入10倍量水，浸泡1h，加热回流两次，每次1h，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩后置于减压干燥箱中干燥，即得金铃子散干膏粉末，精密称取金铃子散干膏粉末1g置于100mL三角瓶中，加入50%甲醇水溶液10mL，超声30min，取上清液14000rpm离心10min，取上清液（即为金铃子散提取液）待用。

分析设备

在线全二维液相色谱分离系统可以包括：输液系统、进样系统、二维色谱柱系统、检测系统和数据记录处理系统，其中，数据记录处理系统控制输液系统、进样系统和检测系统，二维色谱柱系统中的第一维色谱柱为强阳离子交换柱，第二维色谱柱为C18反相柱，流动相体系包括：A：pH2.5的水溶液（包含三氟乙酸、柠檬酸、甲酸、乙酸等的水溶液），B：pH6.37的水溶液（包含甲酸铵、乙酸铵、氨水、三乙胺等的水溶液），C：pH6.79的水溶液（包含甲酸铵、乙酸铵、氨水、三乙胺等的水溶液），D：有机相（包含甲醇、乙腈等）。

其中，在线全二维液相色谱分离系统中的各个器件的功能以及各个器件的关系与上述实施例相似，在此不作赘述。

利用本发明实施例所提供的在线全二维液相色谱分离系统所进行的洗脱过程如下：

在数据记录处理系统的控制下，进样系统将金铃子散提取液注入二维色谱柱系统中；在数据记录处理系统的控制下，输液系统输送A–D（99:1，v/v）溶液构成的流动相等度洗脱二维色谱柱系统1min，使酸性化合物从强阳离子交换柱中被洗脱并进入C18反相柱中，然后，输液系统输送A–D两种溶液组成的流动相，以利用A–D两种溶液组成的流动相进行80min的梯度洗脱（如：有机相比例变化为：1%～95%），使得酸性化合物从C18反相柱中洗脱；然后输液系统输送流动相B–D（99:1，v/v）洗脱二维色谱柱系统5min，使弱碱性化合物从强阳离子交换柱中被洗脱并进入C18反相柱中；输液系统进一步输送A–D两种溶液组成的流动相进行75min的梯度洗脱（如：有机相比例变化为：1%～95%），使得弱碱化合物从C18反相柱中洗脱；最后输液系统输送流动相C–D（80:20，v/v）洗脱二维色谱柱系统5min，使保留在强阳离子交换柱中的中强碱性化合物被洗脱至C18反相柱中；输液系统进一步输送A–D两种溶液组成的流动相进行75min的梯度洗脱（如：有机相比例变化为：20%～95%），使得中强碱性化合物从C18反相柱中洗脱，至此完成整个洗脱过程，在洗脱过程中，检测系统在数据记录处理系统的控制下检测并记录二维色谱柱系统的洗脱物的信号。其中，流速：0.4mL/min，柱温：50℃，波长：254nm。

结果

图4为利用本发明实施例所提供的二维液相色谱分离系统分离金铃子散混合标准品溶液中的化合物所得到的色谱图，图5是利用C18反相柱分离金铃子散提取液中的化合物所得到的色谱图，图6是利用强阳离子交换柱分离金铃子散提取液中的化合物所得到的色谱图，图7是利用本发明实施例所提供的二维液相色谱分离系统分离金铃子散提取液中的化合物所得到的色谱图。其中，图4-7中纵坐标为吸收度单位AU（Absorbance Unit）。如图7所示，酸性化合物、弱碱性化合物、中强碱性化合物按流动相的pH变化以及化合物pKa值顺序出峰（0～80min为酸性化合物，80～160min为弱碱性化合物，160～240min为中强碱性化合物）。

可见，单独使用C18反相柱时，化合物只能按极性大小进行分离，极性相近的酸性化合物和碱性化合物在C18反相柱上分离效果不佳；单独使用强阳离子交换柱时，金铃子散提取液中的化合物基本没有分离，但按化合物pKa值分成三部分；当使用本发明实施例所提供的在线全二维液相色谱分离系统时，金铃子散中大部分化合物都得到良好分离，无论从分离度还是峰容量都比单独使用C18反相柱和强阳离子交换柱高。

可见，通过利用本发明实施例所提供的在线全二维液相色谱分离系统，可以高效分离复杂样品中的酸性化合物和碱性化合物，且能达到简化操作的目的。

基于本发明实施例所提供的在线全二维液相色谱分离系统，本发明实施例还提供了一种在线全二维液相色谱分离方法，如图8所示，可以包括：

S801，数据记录处理系统控制进样系统向二维色谱柱系统210中注入待测试的样品；

当需要分离复杂样品中的酸性化合物和碱性化合物时，数据记录处理系统可以控制进样系统向二维色谱柱系统210中注入待测试的样品。

S802，数据记录处理系统控制输液系统向二维色谱柱系统210按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种包含不同pH值的水相的流动相进行等度洗脱，使得各种不同pH值的流动相从该离子交换柱211中分别洗脱出不同的组分并进入反相柱212中；

其中，控制输液系统向二维色谱柱系统210输送每种pH值的流动相后，离子交换柱211中的一部分化合物（即某一种组分）被洗脱出并进入到反相柱中。

需要说明的是，依据离子交换柱的特性，可以控制输液系统向二维色谱柱系统210按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种包含不同pH值的水相的流动相进行等度洗脱。具体的，对于强阳离子交换柱而言，在洗脱过程中可以按照pH值单调增加的顺序依次输送各种包含不同pH值的水相的流动相进行等度洗脱；而对于强阴离子交换柱而言，在洗脱过程中可以按照pH值单调减小的顺序依次输送各种包含不同pH值的水相的流动相进行等度洗脱。

S803，数据记录处理系统在输送每种pH值流动相后，控制输液系统向该二维色谱柱系统210输送包含水相和有机相的流动相进行梯度洗脱，将洗脱到该反相柱212中的化合物按极性大小洗脱分离，包含水相和有机相的流动相中有机相的比例是在输送过程中逐渐单向调整到预设范围的；

在输送每种pH值流动相之后，在保持离子交换柱211中的保留行为不变的情况下，可以控制输液系统向该二维色谱柱系统210输送包含水相和有机相的流动相进行梯度洗脱，从而将洗脱到该反相柱212中的化合物按极性大小洗脱分离。

其中，有机相的比例是在输送过程中逐渐单向调整到预设范围，即在一次输送过程中向水相中添加比例单调变化的有机相。本领域技术人员可以理解的是，有机相比例单调变化可以包括：有机相比例单调连续变化或有机相比例单调梯度变化；具体而言，有机相比例单调连续变化可以为有机相比例连续增加，具体变化速率可以根据反相柱特性和/或反相柱中当前所存在化合物的特性确定；而有机相比例单调梯度变化可以为有机相比例梯度增加，具体梯度变化方式以及变化速率可以根据反相柱特性和/或反相柱中当前所存在化合物特性确定。

S804，数据记录处理系统在整个洗脱过程中控制该检测系统220检测并记录二维色谱柱系统210的洗脱物的信号。

其中，数据记录处理系统控制检测系统220对反相柱212所洗脱出的极性不相同的化合物检测并记录，从而获得洗脱物的信号。

本实施例中，通过控制输液系统向二维色谱柱系统输送一系列不同pH值的流动相，实现样品的在线全二维液相色谱分离，具体的，当样品进入二维色谱柱系统时，通过控制流动相的pH值实现“分段”（段：具有不同pKa值的化合物组）效果，即实现化合物按“段”分次进入第二维色谱柱；然后，通过改变流动相体系中有机相的比例实现“分离”效果，即实现洗脱下来的化合物在第二维色谱柱中得到分离。可见，通过利用本发明实施例所提供的在线全二维液相色谱分离方法，可以高效分离复杂样品中不同酸碱度和/或极性不同的两种或两种以上的化合物，且达到简化操作的目的。

更进一步的，为了提高洗脱效率，各种包含不同pH值的水相的流动相中，还可以包含：1%～20%中任一比例的有机相，相应的，数据记录处理系统控制输液系统向二维色谱柱系统210按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种包含不同pH值的水相的流动相进行等度洗脱，可以包括：

数据记录处理系统控制输液系统向二维色谱柱系统210按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种包含不同pH值的水相和第一比例的有机相的流动相等度洗脱；其中，该第一比例为1%～20%中的任一比例。相应的，包含水相和该有机相的流动相中有机相的比例可以不低于该第一比例，以更好地对反相柱212中的化合物进行洗脱。

更进一步的，该在线全二维液相色谱分离系统还可以包括：柱温箱；

相应的，本发明实施例所提供的在线全二维液相色谱分离方法，还可以包括：

该数据记录处理系统控制柱温箱为离子交换柱和反相柱提供温度辅助，以使离子交换柱和反相柱温度恒定。

对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

本领域普通技术人员可以理解实现上述方法实施方式中的全部或部分步骤是可以通过程序来指令相关的硬件来完成，所述的程序可以存储于计算机可读取存储介质中，这里所称得的存储介质，如：ROM/RAM、磁碟、光盘等。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种在线全二维液相色谱分离系统，其特征在于，适用复杂样品中化合物的分离，所述复杂样品中包含两种或两种以上不同pKa值和/或不同极性的化合物；所述系统包括：

进样系统，在数据记录处理系统的控制下，将待测试的样品注入二维色谱柱系统；

所述输液系统，在所述数据记录处理系统的控制下，按照设定的洗脱程序，向二维色谱柱系统输送流动相；其中，所输送的流动相包括：预设的至少两种不同pH值的水相和一种由至少一种有机试剂组成的有机相；

所述二维色谱柱系统，由离子交换柱作为第一维色谱柱和反相柱作为第二维色谱柱构成，其中，所述离子交换柱和所述反相柱串联相通；所述数据记录处理系统，控制所述进样系统将待测试的样品注入所述二维色谱柱系统的离子交换柱后，控制所述输液系统向所述二维色谱柱系统按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种包含所述不同pH值的水相的流动相进行等度洗脱，使得各种所述不同pH值的流动相从所述离子交换柱中分别洗脱出不同的组分并进入反相柱中；并在输送每种pH值的流动相之后，控制所述输液系统向所述二维色谱柱系统输送包含水相和所述有机相的流动相进行梯度洗脱，将洗脱到所述反相柱中的化合物按极性大小洗脱分离，所述包含水相和有机相的流动相中有机相的比例是在输送过程中逐渐单向调整到预设范围的；在整个洗脱过程中控制所述检测系统检测并记录所述二维色谱柱系统的洗脱物的信号；

所述检测系统，在所述数据记录处理系统控制下，检测并记录所述二维色谱柱系统的洗脱物的信号。

2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述各种包含所述不同pH值的水相的流动相中，还包含：1%～20%中任一比例的有机相。

3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述离子交换柱和所述反相柱通过两通接头串联。

4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，还包括：

柱温箱，在所述数据记录处理系统的控制下，使所述二维色谱柱系统保持恒温。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的系统，其特征在于，所述离子交换柱为强阳离子交换柱或强阴离子交换柱。

6.根据权利要求1-4任意一项所述的系统，其特征在于，所述反相柱为C18反相柱、C8反相柱或C4反相柱。

7.根据权利要求1-4任意一项所述的系统，其特征在于，所述检测器包括：质谱仪、紫外检测器、光电二极管阵列检测器、电喷式检测器、蒸发光散射检测器、荧光检测器中的至少一种。

8.一种在线全二维液相色谱分离方法，其特征在于，适用于权利要求1所述的在线全二维液相色谱分离系统，所述方法包括：

数据记录处理系统控制进样系统向二维色谱柱系统中注入待测试的样品；

数据记录处理系统控制所述进样系统将待测试的样品注入所述二维色谱柱系统的离子交换柱后，控制所述输液系统向所述二维色谱柱系统按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种包含所述不同pH值的水相的流动相进行等度洗脱，使得各种所述不同pH值的流动相从所述离子交换柱中分别洗脱出不同的组分并进入反相柱中；

数据记录处理系统在输送每种pH值的流动相之后，控制所述输液系统向所述二维色谱柱系统输送包含水相和所述有机相的流动相进行梯度洗脱，将洗脱到所述反相柱中的化合物按极性大小洗脱分离，所述包含水相和有机相的流动相中有机相的比例是在输送过程中逐渐单向调整到预设范围的；

数据记录处理系统在整个洗脱过程中控制所述检测系统检测并记录所述二维色谱柱系统的洗脱物的信号。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，数据记录处理系统控制所述输液系统向所述二维色谱柱系统按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种包含所述不同pH值的水相的流动相进行等度洗脱，包括：

所述数据记录处理系统控制所述输液系统向所述二维色谱柱系统按照pH值单调增大或减小的顺序依次输送各种包含所述不同pH值的水相和第一比例的有机相的流动相等度洗脱；其中，所述第一比例为1%～20%中任一比例。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述在线全二维液相色谱分离系统还包括：柱温箱；

所述方法还包括：所述数据记录处理系统控制所述柱温箱，以使所述二维色谱柱系统保持恒温。

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