CN107966514A - 一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法，属于食品检测领域，包括将待测样品溶液与合成辣椒碱标准溶液用液相色谱仪检测峰面积，然后通过计算公式Xi＝(Si/S0)×(C0/f)×d/m，计算得到待测样品中花椒麻素的含量；其中Xi为样品中任一种花椒麻素成分的含量；Si为样品的任一种花椒麻素的峰面积；S0为合成辣椒碱的峰面积；C0为合成辣椒碱的浓度；f为羟基‑α‑山椒素相对于合成辣椒碱的相对响应因子；d为样品的稀释倍数；m为样品的称样量。本发明能够保证检测的稳定性和准确性，解决了花椒麻素标准品不稳定的问题，该方法操作简单，实现了检测方法的标准化。

Description

一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，尤其是一种食品添加剂中有效成分的检测方法，属于食品检测领域。
背景技术
花椒是我国传统的药食两用调味料，为“八大味”之一，其主要成味物质为花椒麻素。花椒麻素是指一些列不饱和酰胺类物质，主要包括羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素，该四种成分的含量能够占据花椒麻素总含量的98％以上。
花椒麻素含量的高低是评价花椒及其制品质量的一个重要指标，但花椒麻素标准品分子结构极其不稳定，与空气接触极易被氧化，暴露空气中短时间内就会损失，制备过程繁琐，目前尚没有商品化的标准品，无法建立标准的检测方法，制约着花椒及相关行业的发展。目前检测方法多采用自己纯化的花椒麻素样品或有值的样品作为对照品，但仍存在纯化过程比较繁琐、有值样品不易保存等问题，检测稳定性和准确性无法得到保证，花椒麻素标准品的稳定性问题仍是目前的技术难题。因此，建立稳定的标准品定量方式、实现花椒麻素含量的准确稳定检测、加快花椒行业的质量评价标准化并促进行业的发展具有重大意义。
专利文献201710024850.9中记载的基于“一测多评”法的花椒麻味物质含量检测方法包括：羟基-β-山椒素标准曲线的建立；待测样品中羟基-β-山椒素的含量测定；使用相对校正因子计算待测样品中羟基-α-山椒素和羟基-γ-山椒素含量。该检测方法使用的是羟基-β-山椒素标准品，因标准品的不稳定性问题，在使用过程中无法保证持续的检测稳定性和准确性。
目前行业内并未从根本上解决如何保证标准品的稳定性问题，也未形成标准化的检测方法，因此制约着整个行业的健康发展。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法，能够保证检测的稳定性和准确性，解决了花椒麻素标准品不稳定的问题，该方法操作简单，实现了检测方法的标准化。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法，其特征在于：将待测样品溶液与合成辣椒碱标准溶液用液相色谱仪检测峰面积，然后通过计算公式Xi＝(Si/S0)×(C0/f)×d/m，计算得到待测样品中花椒麻素的含量；其中Xi为样品中任一种花椒麻素成分的含量；Si为样品的任一种花椒麻素的峰面积；S0为合成辣椒碱的峰面积；C0为合成辣椒碱的浓度；f为羟基-α-山椒素相对于合成辣椒碱的相对响应因子；d为样品的稀释倍数；m为样品的称样量；
检测条件包括色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相为体积比为400:594:6的乙腈、水和冰醋酸；流速为1.5mL/min；柱温为40℃；波长为270nm；进样量为10μL；
所述花椒麻素为羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素中的任一种或几种的混合。
本发明技术方案的进一步改进在于待测样品溶液的制备方法如下：向待测样品中加入甲醇溶液后超声溶解制得浓度为0.05～2.0mg/mL的待测样品溶液。
本发明技术方案的进一步改进在于：羟基-α-山椒素相对于合成辣椒碱相对响应因子通过f＝K1/K0确定，其中K1为羟基-α-山椒素的标准曲线斜率，K0为合成辣椒碱的标准曲线斜率。
本发明技术方案的进一步改进在于羟基-α-山椒素和合成辣椒碱的标准曲线制备方法如下：将羟基-α-山椒素对照品与合成辣椒碱按质量比1:20混合后加甲醇溶液配制成混合标准溶液，逐级稀释为系列浓度的混合标准品溶液，用液相色谱仪检测峰面积，得到羟基-α-山椒素的标准曲线和合成辣椒碱的标准曲线。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述甲醇溶液为含有质量百分比0.1～1.0％的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇。
本发明技术方案的进一步改进在于甲醇溶液的配制方法为：称取2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，加入50～60℃的甲醇，超声溶解。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述合成辣椒碱的纯度≥97％。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述羟基-α-山椒素的纯度≥95％。
本发明技术方案的进一步改进在于：十八烷基硅烷键合硅胶柱的规格为150×4.6mm，粒径为5μm。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
本发明的一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法，能够保证检测的稳定性和准确性，解决了花椒麻素标准品不稳定的问题，该方法操作简单，实现了检测方法的标准化。
本发明使用合成辣椒碱(又叫香草壬酰胺)作为花椒麻素标准品的替代物。合成辣椒碱，与花椒麻素同属酰胺类物质，具有相同的结构特征，且该物质制备简单、容易获得、性质非常稳定。合成辣椒碱的最大吸收波长为280nm，与花椒麻素的最大吸收波长270nm接近，并且在优选的液相色谱条件下可以与羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素四种花椒麻素成分达到完全分离。羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素色谱峰对于合成辣椒碱色谱峰的相对保留时间分别为0.594、0.636、0.681和1.341，使用其作为花椒麻素标准品替代物时不会与四种花椒麻素成分相互干扰。使用合成辣椒碱作为花椒麻素标准品替代物，既可以克服花椒麻素标准品不稳定的缺陷，又可以达到准确检测的目的。
本发明中羟基-α-山椒素与合成辣椒碱具有稳定的相对响应因子。通过对色谱柱、流动相等液相色谱检测条件的优化，选用十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相为体积比为400:594:6的乙腈、水和冰醋酸，在此条件下，使得合成辣椒碱与四种花椒麻素在液相色谱分离上的出峰位置互不干扰，羟基-α-山椒素与合成辣椒碱呈现相对固定的响应关系，羟基-ε-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素色谱峰与合成辣椒碱的相对响应因子和羟基-α-山椒素与合成辣椒碱的相对响应因子一致，能够通过合成辣椒碱对样品中四种花椒麻素进行准确定量。
本发明中分别使用了2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)和冰醋酸两种稳定剂。在溶解标准品及样品的甲醇溶液中添加了2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，由于2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)具有极强的抗氧化能力，能够在检测过程中减缓羟基-α-山椒素标准品及样品在配制和使用过程中的损失，起到稳定羟基-α-山椒素的作用。液相色谱检测时流动相中添加的冰醋酸，能够更好地维持合成辣椒碱分子结构的稳定性。合成辣椒碱是碱性物质，在流动相中添加酸性冰醋酸后，可以使两种物质分子结构更稳定，从而保证检测的准确性。通过两种稳定剂的添加，能够保证羟基-α-山椒素标准品相对于合成辣椒碱标准品的相对响应因子更加稳定和准确。
本发明中通过增大称样量，能够保证取样的代表性，调整稀释后待测样品浓度至标准曲线浓度范围内，使得样品浓度与峰面积的对应性更加准确，从而能够保证检测的准确性。
本发明分别对羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素四种成分进行定量分析，能够更好地了解花椒提取物中各组成的比例，而现有技术中只能对花椒麻味物质进行总体定量，无法确切知道各组分的组成比例。
附图说明
图1是合成辣椒碱与四种花椒麻素的混合样品的液相色谱图；
图2是羟基-α-山椒素标准曲线；
图3是合成辣椒碱标准曲线；
其中，A、羟基-ε-山椒素，B、羟基-α-山椒素，C、羟基-β-山椒素，D、合成辣椒碱，E、羟基-γ-山椒素。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法，其具体实施步骤如下：
a.将羟基-α-山椒素对照品与合成辣椒碱按质量比1:20混合后，加含有质量百分比0.1～1.0％的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇溶液配制成混合标准溶液；逐级稀释为系列浓度的混合标准品溶液，分别注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，得到羟基-α-山椒素的标准曲线和合成辣椒碱的标准曲线；色谱条件包括仪器为液相色谱仪配备紫外检测器；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，规格为150×4.6mm，粒径为5μm；流动相为体积比为400:594:6的乙腈、水和冰醋酸；流速为1.5mL/min；柱温为40℃；波长为270nm；进样量为10μL；
b.通过f＝K1/K0确定出羟基-α-山椒素相对于合成辣椒碱相对响应因子，其中K1为羟基-α-山椒素的标准曲线斜率，K0为合成辣椒碱的标准曲线斜率；
c.称取待测样品，加入含有质量百分比0.1～1.0％的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇溶液超声溶解，稀释至待测样品液浓度为0.05～2.0mg/mL，过滤，注入液相色谱仪，以步骤a相同的色谱条件检测峰面积，通过计算公式Xi＝(Si/S0)×(C0/f)×d/m，计算得到待测样品中花椒麻素的含量；其中Xi为样品中任一种花椒麻素成分的含量；Si为样品的任一种花椒麻素的峰面积；S0为合成辣椒碱的峰面积；C0为合成辣椒碱的浓度；f为羟基-α-山椒素相对于合成辣椒碱相对响应因子；d为样品的稀释倍数；m为样品的称样量。
具体地，步骤a、c中含有质量百分比0.1～1.0％的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇溶液的配制方法为：称取2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，加入50～60℃的甲醇，超声溶解。
具体地，花椒麻素为羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素中的任一种或几种的混合。
实施例1
1)含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)甲醇溶液的配制
称取1.25g 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)试剂置于250mL容量瓶中，加入100mL52℃的热甲醇，超声溶解。冷却至室温后，用甲醇定容，得到含有0.5％2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的甲醇溶液。
2)标准样品配制
称取纯度97％的合成辣椒碱标准品200mg，称取纯度95％的羟基-α-山椒素对照品9.68mg，置于同一个100mL容量瓶中，用含有2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的甲醇溶液溶解定容，得到合成辣椒碱与羟基-α-山椒素的混合标准品溶液。此混合标准品溶液的合成辣椒碱浓度为1.94mg/mL，羟基-α-山椒素浓度为0.092mg/mL。
3)标准曲线的建立
使用含有2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的甲醇溶液，采用2倍依次稀释的方式，将混合标准溶液稀释6个浓度水平，得到合成辣椒碱与羟基-α-山椒素的混合标准工作溶液。按照以下色谱条件进样检测并记录峰面积：
仪器：Waters e2695液相色谱仪(配备2489UV/Vis检测器)；
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，150×4.6mm，5μm；
流动相：乙腈:水:冰醋酸＝400:594:6；
流速：1.5mL/min；
柱温：40℃；
波长：270nm；
进样量：10μL。
表1混合标准曲线溶液
分别以羟基-α-山椒素及合成辣椒碱的浓度为X轴，以相应的峰面积为Y轴绘制标准曲线，如图2、3所示。
4)羟基-α-山椒素相对于合成辣椒碱的相对响应因子的计算
f＝K1/K0＝127840263/2461308＝51.94
5)样品中四种花椒麻素含量计算
称取0.1157g花椒提取物样品A置于100mL容量瓶中，加入10mL含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)甲醇溶液超声溶解后稀释1000倍，注入液相色谱仪检测。
合成辣椒碱标准品浓度C0＝0.485mg/mL，峰面积S0＝1201105。
花椒提取物样品中各花椒麻素成分的峰面积如表2所示。
表2花椒提取物样品中各花椒麻素成分的峰面积
羟基-ε-山椒素 羟基-α-山椒素 羟基-β-山椒素 羟基-γ-山椒素
51096 2146280 176699 150494
花椒提取物样品中各花椒麻素成分的含量如表3所示。
表3花椒提取物样品中各花椒麻素成分的含量
羟基-ε-山椒素 羟基-α-山椒素 羟基-β-山椒素 羟基-γ-山椒素 总含量
0.34％ 14.42％ 1.19％ 1.01％ 16.96％
6)不同标准品定量方法检测精密度验证情况
分别以羟基-α-山椒素为标准品，以合成辣椒碱为花椒麻素标准品替代物进行了花椒提取物中花椒麻素检测精密度试验，结果如表4、5所示。
表4以羟基-α-山椒素为标准品的花椒麻素检测精密度
表5以合成辣椒碱为花椒麻素标准品替代物的花椒麻素检测精密度
使用羟基-α-山椒素为标准品进行检测，会由于标准品的衰减造成日间检测结果会越来越高，无法保证检测准确性，检测结果会平均每天偏高约1％水平。而使用合成辣椒碱作为标准品替代物，通过引进相对响应因子的方式进行计算，可以消除羟基-α-山椒素的标准品衰减问题带来的检测值偏高问题，从而保证检测结果的持续稳定性和准确性。
实施例2
1)含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)甲醇溶液的配制
称取0.25g 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)试剂置于250mL容量瓶中，加入100mL50℃的热甲醇，超声溶解。冷却至室温后，用甲醇定容，得到含有0.1％2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的甲醇溶液。
2)标准样品配制
称取纯度98％的合成辣椒碱标准品200mg，称取纯度97％的羟基-α-山椒素对照品9.48mg，置于同一个100mL容量瓶中，用含有2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的甲醇溶液溶解定容，得到合成辣椒碱与羟基-α-山椒素的混合标准品溶液。此混合标准品溶液的合成辣椒碱浓度为1.96mg/mL，羟基-α-山椒素浓度为0.092mg/mL。
3)标准曲线的建立
使用含有2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的甲醇溶液，采用2倍依次稀释的方式，将混合标准溶液稀释6个浓度水平，得到合成辣椒碱与羟基-α-山椒素的混合标准工作溶液。按照以下色谱条件进样检测并记录峰面积：
仪器：Waters e2695液相色谱仪(配备2489UV/Vis检测器)；
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，150×4.6mm，5μm；
流动相：乙腈:水:冰醋酸＝400:594:6；
流速：1.5mL/min；
柱温：40℃；
波长：270nm；
进样量：10μL。
表6混合标准曲线溶液数据
分别以羟基-α-山椒素及合成辣椒碱的浓度为X轴，以相应的峰面积为Y轴绘制标准曲线。
4)羟基-α-山椒素相对于合成辣椒碱的相对响应因子的计算
f＝K1/K0＝12565904/2469997＝51.65
5)样品中四种花椒麻素含量计算
称取0.2157g花椒提取物样品B置于100mL容量瓶中，加入10mL含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)甲醇溶液超声溶解后稀释2000倍，注入液相色谱仪检测。
合成辣椒标准品浓度C0＝0.490mg/mL，峰面积S0＝1210791。
花椒提取物样品中各花椒麻素成分的峰面积如表7所示。
表7花椒提取物样品中各花椒麻素成分的峰面积
羟基-ε-山椒素 羟基-α-山椒素 羟基-β-山椒素 羟基-γ-山椒素
63482 4097932 194984 304827
花椒提取物样品中各花椒麻素成分的含量如表8所示。
表8花椒提取物样品中各花椒麻素成分的含量
羟基-ε-山椒素 羟基-α-山椒素 羟基-β-山椒素 羟基-γ-山椒素 总含量
0.46％ 29.77％ 1.42％ 2.21％ 33.86％
实施例3
1)含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)甲醇溶液的配制
称取2.5g 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)试剂置于250mL容量瓶中，加入100mL60℃的热甲醇，超声溶解。冷却至室温后，用甲醇定容，得到含有1.0％2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的甲醇溶液。
2)标准样品配制
称取纯度98％的合成辣椒碱标准品195mg，称取纯度98％的羟基-α-山椒素对照品9mg，置于同一个100mL容量瓶中，用含有2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的甲醇溶液溶解定容，得到合成辣椒碱与羟基-α-山椒素的混合标准品溶液。此混合标准品溶液的合成辣椒碱浓度为1.91mg/mL，羟基-α-山椒素浓度为0.088mg/mL。
3)标准曲线的建立
使用含有2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的甲醇溶液，采用2倍依次稀释的方式，将混合标准溶液稀释6个浓度水平，得到合成辣椒碱与羟基-α-山椒素的混合标准工作溶液。按照以下色谱条件进样检测并记录峰面积：
仪器：Waters e2695液相色谱仪(配备2489UV/Vis检测器)；
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，150×4.6mm，5μm；
流动相：乙腈:水:冰醋酸＝400:594:6；
流速：1.5mL/min；
柱温：40℃；
波长：270nm；
进样量：10μL。
表9混合标准曲线溶液数据
分别以羟基-α-山椒素及合成辣椒碱的浓度为X轴，以相应的峰面积为Y轴绘制标准曲线。
4)羟基-α-山椒素相对于合成辣椒碱的相对响应因子的计算
f＝K1/K0＝127578879/2468370＝51.69
5)样品中四种花椒麻素含量计算
称取0.1557g花椒提取物样品C置于100mL容量瓶中，加入10mL含2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)甲醇溶液超声溶解后稀释1000倍，注入液相色谱仪检测。
合成辣椒标准品浓度C0＝0.4778mg/mL，峰面积S0＝1184154。
花椒提取物样品中各花椒麻素成分的峰面积如表10所示。
表10花椒提取物样品中各花椒麻素成分的峰面积
羟基-ε-山椒素 羟基-α-山椒素 羟基-β-山椒素 羟基-γ-山椒素
116176 3754220 417385 26942
花椒提取物样品中各花椒麻素成分的含量如表11所示。
表11花椒提取物样品中各花椒麻素成分的含量
羟基-ε-山椒素 羟基-α-山椒素 羟基-β-山椒素 羟基-γ-山椒素 总含量
0.58％ 18.82％ 2.09％ 0.14％ 21.63％

Claims (9)

1.一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法，其特征在于：将待测样品溶液与合成辣椒碱标准溶液用液相色谱仪检测峰面积，然后通过计算公式Xi＝(Si/S0)×(C0/f)×d/m，计算得到待测样品中花椒麻素的含量；其中Xi为样品中任一种花椒麻素成分的含量；Si为样品的任一种花椒麻素的峰面积；S0为合成辣椒碱的峰面积；C0为合成辣椒碱的浓度；f为羟基-α-山椒素相对于合成辣椒碱的相对响应因子；d为样品的稀释倍数；m为样品的称样量；
检测条件包括色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相为体积比为400:594:6的乙腈、水和冰醋酸；流速为1.5mL/min；柱温为40℃；波长为270nm；进样量为10μL；
所述花椒麻素为羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素中的任一种或几种的混合。
2.根据权利要求1所述的一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法，其特征在于待测样品溶液的制备方法如下：向待测样品中加入甲醇溶液后超声溶解制得浓度为0.05～2.0mg/mL的待测样品溶液。
3.根据权利要求1所述的一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法，其特征在于：羟基-α-山椒素相对于合成辣椒碱的相对响应因子通过f＝K1/K0确定，其中K1为羟基-α-山椒素的标准曲线斜率，K0为合成辣椒碱的标准曲线斜率。
4.根据权利要求3所述的一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法，其特征在于羟基-α-山椒素和合成辣椒碱的标准曲线制备方法如下：将羟基-α-山椒素对照品与合成辣椒碱按质量比1:20混合后加甲醇溶液配制成混合标准溶液，逐级稀释为系列浓度的混合标准品溶液，用液相色谱仪检测峰面积，得到羟基-α-山椒素的标准曲线和合成辣椒碱的标准曲线。
5.根据权利要求2或4任一项所述的一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法，其特征在于：所述甲醇溶液为含有质量百分比0.1～1.0％的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的甲醇。
6.根据权利要求5所述的一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法，其特征在于甲醇溶液的配制方法为：称取2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，加入50～60℃的甲醇，超声溶解。
7.根据权利要求1或3或4任一项所述的一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法，其特征在于：所述合成辣椒碱的纯度≥97％。
8.根据权利要求1或3或4任一项所述的一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法，其特征在于：所述羟基-α-山椒素的纯度≥95％。
9.根据权利要求1所述的一种花椒提取物中花椒麻素含量的检测方法，其特征在于：十八烷基硅烷键合硅胶柱的规格为150×4.6mm，粒径为5μm。
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