CN113777190A - 分离、测定花椒提取物及其制品中山椒素含量方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种分离、测定花椒提取物及其制品中山椒素含量方法及应用，所述方法包括：将花椒提取物及其制品用甲醇制成配制溶液和稀释溶液，分别使用液相色谱法进行梯度洗脱，其中，流动相为有机溶剂与磷酸水溶液的混合溶液；梯度洗脱分离后，进入检测器进行检测，使用外标法计算各山椒素的含量。本发明提供的分离及测定花椒提取物及其制品中山椒素含量方法柱压低，基线平稳，各山椒素分离效果良好，且在41分钟内可完成分离，而且能够检测到花椒提取物及其制品中六种山椒麻素的含量，实际操作性强，检测数据准确可靠，用于评价花椒提取物及其制品中山椒素含量更科学、更准确。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种分离、测定花椒提取物及其制品中山椒素含量方法及应用。
背景技术
花椒为中国特有香料，位列十三香之首，作为一种食用香料，具有香料与药用双重价值，能去寒、养胃、调节食品口味的功效，因而深受人们的喜爱。花椒产品的重要核心技术指标就是花椒麻度，但是，现对花椒麻度的称谓表述各异，难以比较并判断花椒及其深加工产品的麻度品质。
目前，国标GB/T30391-2013花椒，无麻度检测方法；国标GB/T38495-2020感官分析花椒麻度评价-斯科维尔指数法，是采用斯科维尔指数法对花椒麻度进行感官评价的方法；中国医药保健品进出口商会团体标准TCCCMHPIE1.31-2018植物提取物-花椒提取物，其特点是对花椒麻素的一种主要成分(如羟基-a-山椒素)进行定量测定，以此代表全部麻味物质，从而推导出花椒麻素含量；中国供销合作社行标GH/T1290-2020花椒及花椒加工产品-花椒酰胺总含量的测定采用紫外分光光度法；中国供销合作社行标GH/T 1142-2017花椒，无麻度检测方法；重庆市地方标准《花椒麻味物质的检测方法高效液相色谱法》DB50/T321-2009，无市售标准物质或参照物，且实验室自制标准品技术困难不易获得，加上无柱温色谱参数，故此方法不具备重现性；四川省地方标准DBS51/008-2019食品安全地方标准-花椒油，采用紫外分光光度法的麻度检验方法，且样品检测范围也不同；中国食品土畜进出口商会团体标准T/CFNA6101-2020花椒，针对花椒原料，采用分光光度法检测得到花椒麻素含量；重庆市地方标准《地理标志产品江津花椒》DB50/T中的高效液相色谱法，其特点是针对花椒原料中5种山椒素的定性定量测定得到花椒麻素含量，其液相色谱条件下5种山椒素的分离效果较好，但流动相甲醇水的柱压偏高，甲醇空白溶液的图谱基线在30分钟后的基线波动较大，故此方法在应用上的普遍适用性欠佳。
总的来说，现有技术公开的花椒麻素的检测方法主要有紫外分光光度法和高效液相色谱法两种，紫外分光光度法检测设备成本较低，方法简易，但检测数据不够准确，适用于企业内部生产环节的质量控制，而高效液相色谱法能够对花椒麻素的多个特征组分展开定性定量测定，检测数据更准确可靠，但是现有的高效液相色谱法不能对花椒麻素的几种主要成分开展定量分析，而是检测其中一种成分(如羟基-a-山椒素)代表全部麻味物质，从而推导出花椒麻素含量，如中国医药保健品进出口商会团体标准《植物提取物花椒提取物》T/CCCMHPIE 1.31-2018、中国供销合作社行业标准《花椒及花椒加工产品花椒酰胺总含量的测定高效液相色谱法》GH/T 1291-2020、重庆市地标《花椒麻味物质的检测方法高效液相色谱法》DB50/T321-2009，这种分析结果是不准确的，不够严谨，不利于对花椒提取物中每一种麻味物质含量的了解，因此，制定一种快速、准确、高效的检测花椒加工产品麻度的方法势在必行。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种分离及测定花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素的含量的方法，该方法可以有效分离出花椒提取物或花椒提取物制品中六种山椒素(羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-ε-山椒素、羟基-γ-异山椒素、γ-山椒素其中的一种或多种)，并进行检测，根据检测峰值使用外标法测定六种山椒素的含量，该方法高效精确，在41分钟内即可完成分离。
分离花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素的方法包括：使用液相色谱法进行梯度洗脱，其中，流动相为流动相A与流动相B的混合溶液，所述流动相A为有机溶剂，所述流动相B为磷酸水溶液，所述梯度洗脱程序为：
0≤t＜12min，所述流动相B的体积分数为78％-82％，所述流动相A的体积分数为18％-22％,
12≤t＜15min，所述流动相B的体积分数为53％-57％，所述流动相A的体积分数为43％-47％，
15≤t＜20min，所述流动相B的体积分数为58％-62％，所述流动相A的体积分数为38％-42％，
20≤t＜38min，所述流动相B的体积分数为53％-57％，所述流动相A的体积分数为43％-47％，
38≤t＜39min，所述流动相B的体积分数为18％-22％，所述流动相A的体积分数为78％-82％，
t≥39min，所述流动相B的体积分数为78％-82％，所述流动相A的体积分数为18％-22％。
优选地，所述梯度洗脱程序为：
0≤t＜12min，所述流动相B的体积分数为80％，所述流动相A的体积分数为20％,
12≤t＜15min，所述流动相B的体积分数为55％，所述流动相A的体积分数为45％，
15≤t＜20min，所述流动相B的体积分数为60％，所述流动相A的体积分数为40％，
20≤t＜38min，所述流动相B的体积分数为55％，所述流动相A的体积分数为45％，
38≤t＜39min，所述流动相B的体积分数为20％，所述流动相A的体积分数为80％，
t≥39min，所述流动相B的体积分数为80％，所述流动相A的体积分数为20％。
进一步，所述磷酸水溶液优选为体积百分数0.05％-0.15％磷酸水溶液，更优选为体积百分数0.1％的磷酸水溶液。
进一步，所述有机溶剂优选为乙腈。
进一步，所述液相色谱法的柱温优选为35-40℃，更优选为35℃。
进一步，所述液相色谱法的进样流速优选为0.8-1.2mL/min，更优选为1mL/min。
测定花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素含量的包括步骤：(1)使用前任一所述的分离花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素的方法对待测样品进行液相色谱分离；(2)进入检测器进行检测。
进一步，所述检测器的波长优选为254-270nm，更优选为270nm。
进一步，步骤(2)中，检测后使用外标法计算各山椒素的含量。具体地，含量以羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-γ-异山椒素、γ-山椒素六种山椒素计，按以下公式计算：
式中：
X——样品中花椒麻素的含量，单位为克每百克(g/100g)；
∑CA——样品配制溶液A样中相对含量较低待测组分的浓度之和，单位为微克每毫升(μg/mL)；
∑CB——样品稀释溶液B样中相对含量较高待测组分的浓度之和，单位为微克每毫升(μg/mL)；
V——样品经甲醇溶解后的A样定容体积，单位为毫升(mL)；
m——样品的称样量，单位为克(g)；
f——A样变成B样的稀释倍数；
106——单位换算系数；
100——单位换算系数；
在某些实施例中，为了计算的准确性，结果以平行测定结果的算术平均值为准，计算结果保留三位有效数字。
本发明目的在于还提供一种计算花椒提取物或花椒提取物制品中麻素含量的方法，该方法是计算花椒提取物或花椒提取物制品中六种山椒素的总和从而确定花椒提取物或花椒提取物制品中麻素的含量。
所述方法包括以下步骤：(1)配制花椒提取物溶液或花椒提取物制品溶液；(2)使用前述所述测定花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素的含量的方法测定并计算所述花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素含量及其总和，总和即为麻素含量；
步骤(1)中，所述配制花椒提取物溶液的方法包括：取花椒提取物配制成0.002-0.008g/ml浓度的样品A1，然后将样品A1稀释成浓度为0.0002-0.0008g/ml的样品B1；
或花椒提取物制品溶液制备的方法包括：取花椒提取物制品0.2g-0.5g于离心管中，加入甲醇，超声后，离心分层，转移上层甲醇萃取液至10mL容量瓶中，下层加入甲醇再萃取一次，合并萃取液，用甲醇定容至刻度，为样品A2；取样品A2溶液稀释10倍为样品B2；
步骤(2)中，所述样品A1和样品B1分别进样，或所述样品A2和样品B2分别进样，所述山椒素为羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-ε-山椒素、羟基-γ-异山椒素和γ-山椒素，所述麻素含量为所述山椒素总和含量。
优选地，步骤(1)中，所述配制花椒提取物溶液的方法包括：取花椒提取物配制成0.003-0.005g/ml浓度的样品A1，然后将样品A1稀释成浓度为0.0003-0.0005g/ml的样品B1。
在某些具体实施例中，花椒提取物溶液配制的方法为：取花椒提取物0.1g(精确至0.1mg)于25mL容量瓶中，加适量甲醇，超声2min后，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制溶液为A样；准确移取A样溶液1.0mL至10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，稀释溶液为B样；A样和B样分别过微孔滤膜到进样瓶中，供液相色谱测定。
在某些具体实施例中，花椒提取物制品溶液制备的方法为：取花椒提取物制品0.2g-0.5g(精确至0.1mg)于离心管中，加入甲醇5mL，超声2min后，离心分层，转移上层甲醇萃取液至10mL容量瓶中，下层加入甲醇3mL再萃取一次，合并萃取液，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制溶液为A样；准确移取A样溶液1.0mL至另一个10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，稀释溶液为B样；A样和B样分别过微孔滤膜到进样瓶中，供液相色谱测定。
具体地，步骤(2)中，麻素含量的单位为克每百克(g/100g)表示。相关资料显示：麻素含量单位用质量千分数：毫克每克(mg/g)表示，则样品检测范围内麻素含量的数值范围一般在2-1000(mg/g)之间，例如，检测到的四川德阳超临界花椒提取物的麻素含量为383.4mg/g，江津冷榨花椒提取物的麻素含量为211.3mg/g，花椒提取物制品青花椒麻精(YQ030)的麻素含量为20.96mg/g；而本发明中，麻素含量单位采用质量百分数：克每百克(g/100g)表示，则样品检测范围内麻素含量的数值范围一般在0.2-100(g/100g)之间，例如，检测到的四川德阳超临界花椒提取物的麻素含量为38.3g/100g，江津冷榨花椒提取物的麻素含量为21.1g/100g，花椒提取物制品青花椒麻精(YQ030)的麻素含量为2.10g/100g。比较结果表明，麻素含量单位以质量百分数：克每百克(g/100g)表示更合理。与毫克每克(mg/g)的单位换算关系为：1.0(g/100g)＝10(mg/g)。
具体地，步骤(2)中，由于花椒麻素各组分之间的相对含量普遍相差较大，与其中含量最高的羟基-α-山椒素比较，其它组分的相对含量相差约有一个数量级或两个数量级，因此，样品溶液的配制和稀释方法是能否定量到六种山椒素的关键技术之一。本发明发现，相对含量很低的麻素组分如γ-山椒素、羟基-γ-异山椒素，在配制溶液A样中因其浓度高于B样一个数量级，其特征峰面积的重复性更好。因此，将样品配制溶液A样和稀释溶液B样分别测定不同含量的山椒素，然后加和六种山椒素的浓度，从而通过计算公式得到样品的麻素含量。配制溶液A样中主要定量相对含量较低的麻素组分如羟基-γ-山椒素、γ-山椒素、羟基-γ-异山椒素等，稀释溶液B样中主要定量相对含量较高的麻素组分如羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-ε-山椒素等。为了准确测定六种山椒素物质，将样品配制溶液A样和稀释溶液B样分别测定不同含量的山椒素物质，然后加和A样、B样中六种山椒素的浓度，得到花椒麻素的含量，此方法解决了样品中低含量的山椒素组分不能准确定量的问题。考虑到样品产地不同、各麻素组分含量不同及称样量的不同，配制溶液A样和稀释溶液B样的浓度具体也会不同，因此，分析过程中需要对具体样品作具体分析，从而具体确定六种山椒素分别是在A样中定量还是在B样中定量。A样主要定量相对含量较低的麻素组分，其响应值均应在仪器测定的线性范围之内；B样主要定量相对含量较高的麻素组分，其响应值也均应在仪器测定的线性范围之内。
具体地，根据实验室对不同产地花椒提取物样品的麻素成分分析获知，样品中均含有六种山椒麻素，其构成大致相同，但其相对含量普遍相差较大，其中，以羟基-α-山椒素的含量为最高相对含量约占76％，其次是羟基-β-山椒素相对含量约占10％，再次是羟基-ε-山椒素相对含量约占5％，羟基-γ-山椒素相对含量约占4％，γ-山椒素相对含量约占3％，羟基-γ-异山椒素相对含量约占2％。因此，参照花椒麻素各组分的相对含量来配制六种山椒素的混标储备液(总浓度为2.5mg/mL，其中，羟基-ε-山椒素约为0.10mg/mL、羟基-α-山椒素约为1.92mg/mL、羟基-β-山椒素约为0.25mg/mL、羟基-γ-山椒素约为0.10mg/mL、羟基-γ-异山椒素约为0.05mg/mL、γ-山椒素约为0.08mg/mL)，更有利于样品溶液的配制和各麻素组分的定量测定，使得各麻素组分的响应值易于落在各标准工作曲线的线性范围之内。而且从对照品制造商了解到，山椒素混合于甲醇溶液中在-18℃低温避光保存，比高纯单标的稳定性更好，有效期可达2年。因此，除了实验室配制六种山椒素的混标储备液外，建议在确保高纯单标质量条件下可定制甲醇中六种山椒素的混标储备液，可以解决高纯单标因存放稳定性较差而易降解的问题，同时，目前商品定制混标溶液的价格(成都麦德生科技有限公司，1000元/毫升)远远低于购买六个高纯单标的总价(10000元以上)，分析成本可大幅降低。
本发明目的在于还提供一种前任一所述的分离花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素的方法在制备花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素的应用，通过该方法，可以使用制备型液相色谱制备花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素，其中山椒素包括羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-ε-山椒素、羟基-γ-异山椒素、γ-山椒素其中的一种或多种。通过制备型液相色谱可以批量的生产山椒素，作为一种香料应用在食品添加剂或者其他食品制备中。
本发明目的在于还提供一种分离、鉴定花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素的液相色谱流动相，所述山椒素为羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-ε-山椒素、羟基-γ-异山椒素、γ-山椒素其中的一种或多种。
所述液相色谱流动相包括流动相A与流动相B，所述流动相A为有机溶剂，所述流动相B为磷酸水溶液；所述液相色谱流动相中，所述流动相B的体积分数为78％-82％，所述流动相A的体积分数为18％-22％；或所述液相色谱流动相中，所述流动相B的体积分数为53％-57％，所述流动相A的体积分数为43％-47％；或所述液相色谱流动相中，所述流动相B的体积分数为58％-62％，所述流动相A的体积分数为38％-42％；或所述液相色谱流动相中，所述流动相B的体积分数为18％-22％，所述流动相A的体积分数为78％-82％。
优选地，所述液相色谱流动相中，所述流动相B的体积分数为80％，所述流动相A的体积分数为20％；或所述液相色谱流动相中，所述流动相B的体积分数为55％，所述流动相A的体积分数为45％；或所述液相色谱流动相中，所述流动相B的体积分数为60％，所述流动相A的体积分数为40％；或所述液相色谱流动相中，所述流动相B的体积分数为20％，所述流动相A的体积分数为80％。
进一步，所述磷酸水溶液优选为体积百分数0.05％-0.15％磷酸水溶液，更优选为体积百分数0.1％的磷酸水溶液。
进一步，所述有机溶剂优选为乙腈。
本发明中，术语“花椒提取物”为以花椒为原料，经不同工艺制成的提取物。
本发明中，术语“花椒提取物制品”为以花椒提取物和植物油为原料，经加工配制而成的制品。
本发明中，术语“花椒麻素”为花椒中羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-ε-山椒素、羟基-γ-异山椒素、γ-山椒素等多种酰胺类化合物的统称。
本发明中，涉及“质量”“体积”等数值的技术方案，由于操作误差、仪器误差导致的数值波动不在本发明数值记载之中，即是说，由于操作误差、仪器误差导致的数值波动也属于本发明的技术方案。
本发明有益效果在于
本发明提供的分离及测定花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素的含量的方法使用有机溶剂+磷酸水的梯度洗脱程序，柱压低，基线平稳，各山椒素分离效果良好，且在41分钟内可完成分离。
本发明提供的分离及测定花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素的含量的方法，液相色谱条件在不同实验室间仪器分析的普遍适用性强，可广泛推广应用。
本发明提供的测定制备花椒提取物或花椒提取物制品中麻素含量的方法，以花椒提取物及其制品为检测对象，用甲醇制成配制溶液A样和稀释溶液B样，采用高效液相色谱法，分别定量羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-ε-山椒素、羟基-γ-异山椒素、γ-山椒素，然后加和A样、B样中六种山椒素得到花椒麻素含量(g/100g)，解决了低含量山椒素物质不能准确定量的问题，而且样品配制中，本领域技术人员可选择性的使用少量甲醇进行样品配制达到相同的分离、测定效果，有利于环保。
本发明提供的分离及测定花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素的含量的方法，能够检测到花椒提取物及其制品中六种山椒麻素的含量，实际操作性强，检测数据准确可靠，用于评价花椒提取物及其制品中山椒素含量更科学、更准确。
附图说明
图1为混标溶液的HPLC色谱图。
图2为样品溶液的HPLC色谱图。
其中，图1中，1为羟基-ε-山椒素(26.331min)，2为羟基-α-山椒素(27.077min)，3为羟基-β-山椒素(27.883min)，4为羟基-γ-山椒素(32.760min)，5为羟基-γ-异山椒素(33.374min)，6为γ-山椒素(40.074min)。
图2中，1为羟基-ε-山椒素，2为羟基-α-山椒素，3为羟基-β-山椒素，4为羟基-γ-山椒素，5为羟基-γ-异山椒素，6为γ-山椒素。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，液相色谱条件为如下表1所示，
表1本发明液相色谱条件
表2本发明流动相梯度洗脱程序表
| 时间(min) | B相(0.1％磷酸水) | A相(乙腈) |
| 0 | 80％ | 20％ |
| 12 | 55％ | 45％ |
| 15 | 60％ | 40％ |
| 20 | 55％ | 45％ |
| 38 | 20％ | 80％ |
| 39 | 80％ | 20％ |
| 41 | 80％ | 20％ |
本发明实施例中，六种山椒素对照品为：羟基-α-山椒素，CAS号83883-10-7，纯度≥98.0％。羟基-β-山椒素，CAS号97465-69-5，纯度≥98.0％。羟基-γ-山椒素，CAS号78886-66-5，纯度≥98.0％。羟基-ε-山椒素，CAS号252193-26-3，纯度≥98.0％。羟基-γ-异山椒素，CAS号127514-62-9，纯度≥98.0％。γ-山椒素，CAS号78886-65-4，纯度≥98.0％。
本发明实施例中，六种山椒素的混标储备液的制备为：分别准确称取六种山椒素对照品各适量(精确至0.1mg)，用甲醇溶解均匀，配制成浓度为2.5mg/mL的混合标准储备液，其中，羟基-ε-山椒素为0.10mg/mL，羟基-α-山椒素为1.92mg/mL、羟基-β-山椒素为0.25mg/mL、羟基-γ-山椒素为0.10mg/mL、羟基-γ-异山椒素为0.05mg/mL、γ-山椒素为0.08mg/mL。置于-18℃冰箱、密封、避光、干燥保存。
本发明实施例中，六种山椒素的混合标准工作液的制备为：将混标储备液加甲醇稀释10倍，配制成浓度为250μg/mL的混合标准使用液，置于-18℃冰箱、密封、避光、储存备用。临用时移取适量混标使用液，用甲醇稀释配制成浓度分别为0μg/mL、15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、125μg/mL、250μg/mL的混合标准工作液。
本发明实施例中，花椒提取物溶液配制的方法为：取花椒提取物0.1g(精确至0.1mg)于25mL容量瓶中，加适量甲醇，超声2min后，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制溶液为A样；准确移取A样溶液1.0mL至10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，稀释溶液为B样；A样和B样分别过微孔滤膜到进样瓶中，供液相色谱测定。
本发明实施例中，花椒提取物制品溶液制备的方法为：取花椒提取物制品0.2g-0.5g(精确至0.1mg)于离心管中，加入甲醇5mL，超声2min后，离心分层，转移上层甲醇萃取液至10mL容量瓶中，下层加入甲醇3mL再萃取一次，合并萃取液，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制溶液为A样；准确移取A样溶液1.0mL至另一个10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，稀释溶液为B样；A样和B样分别过微孔滤膜到进样瓶中，供液相色谱测定。
实施例1标准曲线的线性范围与检出限验证
将六种山椒素的混合标准工作液分别进样，进行液相色谱测试，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，混标溶液的色谱图如图1所示，羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-γ-异山椒素、γ-山椒素六种山椒素的参考保留时间分别为26.33min、27.08min、27.88min、32.76min、33.37、40.07min。
六种山椒素的标准曲线方程、相关系数和方法检出限见表3。
表3六种山椒素的标准曲线方程、相关系数和检出限
从表3可以得知，六种山椒素在各自的浓度范围内线性关系良好，线性相关系数(R2)均不低于0.99。采用3倍信噪比法计算得到样品溶液中六种山椒素的方法检出限(S/N≥3)分别为：羟基-α-山椒素0.012mg/100g、羟基-β-山椒素0.0014mg/100g、羟基-γ-山椒素0.0040mg/100g、羟基-ε-山椒素0.0068mg/100g、羟基-γ-异山椒素0.0055(mg/100g)、γ-山椒素0.0010mg/100g。
实施例2重复性和精密度验证
取16种不同的样品(花椒提取物及其制品)，配制花椒提取物溶液和花椒提取物制品溶液，分别测定样品中花椒麻素的含量，各样品重复测定10次，测定结果如下表4所示，表明，16组数据的相对标准偏差(变异系数)为0.21％-2.36％，表明本标准方法具有较好的重复性和精密度，能够满足实际检测要求。
表4样品的重复性和精密度实验
实施3回收率验证
取4组不同麻素浓度的样品溶液，各分成两份，一份不加混标液(为甲样)，一份加入混标工作液(为乙样)，乙样中选取混标加入量分别为25.4μg/ml、50.8μg/ml、101.6μg/ml几个浓度进行加标实验，进行液相色谱测试，分别测定加标前甲样和加标后乙样的麻素浓度，每个浓度平行测定3次，取平均值。测定结果如表5所示，表明：混标加入量为25.4μg/mL时，加标回收率为85.8％-114.5％；混标加入量为50.8μg/mL时，加标回收率为86.5％-99.7％；混标加入量为101.6μg/mL时，加标回收率为85.1％-110.71％，表明本标准方法具有良好的回收率，能够满足实际检测要求。
表5样品溶液的加标回收率实验
实施4样品测定
对花椒提取物溶液和花椒提取物制品溶液的配制溶液A样和稀释溶液B样分别使用液相色谱进行测定，根据保留时间定性，按外标法定量，同时做空白实验。A样主要定量相对含量较低的麻素组分，其响应值均应在仪器测定的线性范围之内；B样主要定量相对含量较高的麻素组分，其响应值均应在仪器测定的线性范围之内，超出线性范围的样品溶液调整稀释倍数。样品溶液的HPLC色谱图如图2所示，检测结果如下表6所示，计算得到样品溶液色谱图中各麻素特征峰的分离度分别为：羟基-ε-山椒素1.42、羟基--α-山椒素1.42、羟基-β-山椒素1.42、羟基-γ-山椒素1.59、羟基-γ-异山椒素1.59、γ-山椒素1.36，表明样品图谱中各麻素特征峰的分离效果良好，可满足实际样品的检测要求。
表6样品溶液HPLC谱图2中各麻素特征峰的分离度
| 麻素组分 | 分离度 |
| 羟基-ε-山椒素 | 1.42 |
| 羟基--α-山椒素 | 1.42 |
| 羟基-β-山椒素 | 1.42 |
| 羟基-γ-山椒素 | 1.59 |
| 羟基-γ-异山椒素 | 1.59 |
| γ-山椒素 | 1.36 |
实施例5不同实验室间样品测试
实验室间分别对花椒提取物(冷榨)、青花椒麻精(YQ030)进行液相色谱测试，并计算麻素含量，得到的结果如下表7所示。
表7不同实验室间样品检测比对结果
从表7可以得知，各实验室间对花椒提取物(冷榨)麻素含量的检测误差分别为5.4％、5.4％、0；各实验室间对制品青花椒麻精(YQ030)麻素含量的检测误差分别为0.48％、4.9％、4.4％。结果表明，在重复性条件下各实验室间测得花椒提取物及其制品的麻素含量的绝对差值未超过算数平均值的15％，可满足不同实验室间对实际样品的检测要求。
实施例6不同产地、不同批次样品检测
对不同产地、不同批次部分样品进行液相色谱测定，测定的麻素含量的结果如下表8所示。
表8不同产地、不同批次样品花椒麻素含量的检测结果
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.分离花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素的方法，其特征在于，所述山椒素为羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-ε-山椒素、羟基-γ-异山椒素、γ-山椒素其中的一种或多种；所述方法包括：使用液相色谱法进行梯度洗脱，其中，流动相为流动相A与流动相B的混合溶液，所述流动相A为有机溶剂，所述流动相B为磷酸水溶液，所述梯度洗脱程序为：
0≤t＜12min，所述流动相B的体积分数为78％-82％，所述流动相A的体积分数为18％-22％,12≤t＜15min，所述流动相B的体积分数为53％-57％，所述流动相A的体积分数为43％-47％，15≤t＜20min，所述流动相B的体积分数为58％-62％，所述流动相A的体积分数为38％-42％，20≤t＜38min，所述流动相B的体积分数为53％-57％，所述流动相A的体积分数为43％-47％，38≤t＜39min，所述流动相B的体积分数为18％-22％，所述流动相A的体积分数为78％-82％，t≥39min，所述流动相B的体积分数为78％-82％，所述流动相A的体积分数为18％-22％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸水溶液为体积百分数0.05％-0.15％磷酸水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱法的柱温为35-40℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱法的进样流速为0.8-1.2mL/min。
5.测定花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素含量的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)使用权利要求1-4任一所述的方法对待测样品进行液相色谱分离；(2)进入检测器进行检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测器的波长为254-270nm。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，检测后使用外标法计算含量。
8.测定制备花椒提取物或花椒提取物制品中麻素含量的方法，所述方法包括以下步骤：(1)配制花椒提取物溶液或花椒提取物制品溶液；(2)使用权利要求7所述的方法测定并计算所述花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素含量及其总和，总和即为麻素含量；
步骤(1)中，所述配制花椒提取物溶液的方法包括：取花椒提取物配制成0.002-0.008g/ml浓度的样品A1，然后将样品A1稀释成浓度为0.0002-0.0008g/ml的样品B1；
或花椒提取物制品溶液制备的方法包括：取花椒提取物制品0.2g-0.5g于离心管中，加入甲醇，超声后，离心分层，转移上层甲醇萃取液至10mL容量瓶中，下层加入甲醇再萃取一次，合并萃取液，用甲醇定容至刻度，为样品A2；取样品A2溶液稀释10倍为样品B2；
步骤(2)中，所述样品A1和样品B1分别进样，或所述样品A2和样品B2分别进样，所述山椒素为羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-ε-山椒素、羟基-γ-异山椒素和γ-山椒素，所述麻素含量为所述山椒素总和含量。
9.权利要求1-4任一所述的方法在制备花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素的应用。
10.分离、鉴定花椒提取物或花椒提取物制品中山椒素的液相色谱流动相，其特征在于，所述山椒素为羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、羟基-ε-山椒素、羟基-γ-异山椒素、γ-山椒素其中的一种或多种；所述液相色谱流动相包括流动相A与流动相B，所述流动相A为有机溶剂，所述流动相B为磷酸水溶液；所述液相色谱流动相中，所述流动相B的体积分数为78％-82％，所述流动相A的体积分数为18％-22％；或所述液相色谱流动相中，所述流动相B的体积分数为53％-57％，所述流动相A的体积分数为43％-47％；或所述液相色谱流动相中，所述流动相B的体积分数为58％-62％，所述流动相A的体积分数为38％-42％；或所述液相色谱流动相中，所述流动相B的体积分数为18％-22％，所述流动相A的体积分数为78％-82％。
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