CN108548872A - 一种达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种达沙替尼中1‑（2‑羟乙基）哌嗪杂质的检测方法，采用手性衍生化试剂N‑A‑（5‑氟‑2,4‑二硝基苯基）‑L‑丙氨酰胺（FDAA）对达沙替尼中的1‑（2‑羟乙基）哌嗪进行柱前衍生化，从而实现采用普通C18色谱柱进行达沙替尼中1‑（2‑羟乙基）哌嗪杂质的分离测定，使其在系统适用性、专属性、精密度、定量限、检测限、线性和范围、准确度和耐用性等方面完全符合中国药典方法验证的指导原则，可用于达沙替尼原料药的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种HPLC法测定达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪的方法，属于药物分析技术领域。
背景技术
达沙替尼（Dasatinib），化学名为：N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺(一水合物)，商品名为SPRYCEL,是由百时美施贵宝公司研发的一种口服酪氨酸激酶抑制剂。达沙替尼是一种针对BCR-ABL的高效的小分子多靶向的第二代酪氨酸激酶抑制剂。它最初是用来作为一种Src激酶家族（比如Fyn，Yes，Src，和Lyk）的抑制剂，但是它依然能够抑制BCR-ABL，Eph A2，血小板生长因子受体和c-Kit，而且，它能够与其他酪氨酸和丝氨酸、苏氨酸激酶（比如丝裂原活化蛋白激酶、受体酪氨酸激酶、盘状结构域受体等）结合。达沙替尼能够有效抑制除了T315I突变的伊马替尼耐受的野生型和BCR-ABL突变细胞株增殖和活性。达沙替尼于2006年6月28日通过美国FDA的优先审批，用于治疗成人所患的甲磺酸伊马替尼（Imatinibmesylate）耐药或不能耐受的所有病期（慢性期、加速期、淋巴细胞急变期）的慢性骨髓性白血病。同时，美国食品药品监督管理局也经正常程序批准达沙替尼治疗成人所患的对其他疗法耐药或不能耐受的费城染色体阳性的急性淋巴细胞性白血病。我国食品药品监督管理局于2011年9月8日批准达沙替尼用于慢性髓性白血病的二线治疗。2017年11月9日，美国食品药品监督管理局批准达沙替尼（dasatinib）治疗处于慢性期的费城染色体阳性（Ph+）、儿童慢性髓系白血病（CML）。
1-(2-羟乙基)哌嗪是合成达沙替尼所用的起始物料，达沙替尼成品中可能存在1-(2-羟乙基)哌嗪，根据ICH指导原则中的质量指导原则部分，需要控制原料药中的杂质。目前还没有文献报道达沙替尼中的1-(2-羟乙基)哌嗪杂质的检测方法，本发明首次提出了了一种达沙替尼中1-(2-羟乙基)哌嗪杂质的检测方法，其采用手性衍生化试剂N-A-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺（FDAA）进行柱前衍生化，实现采用普通C18色谱柱进行达沙替尼中的1-(2-羟乙基)哌嗪杂质的分离测定。
发明内容
本发明的目的是提供一种达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪杂质的检测方法，采用手性衍生化试剂N-A-（5-氟-2,4-二硝基苯基）-L-丙氨酰胺（FDAA）对达沙替尼中的1-（2-羟乙基）哌嗪进行柱前衍生化，从而实现采用普通C18色谱柱进行达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪杂质的分离测定，使其在系统适用性、专属性、精密度、定量限、检测限、线性和范围、准确度和耐用性等方面完全符合中国药典方法验证的指导原则，可用于达沙替尼原料药的质量控制。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪的检测方法，包括以下步骤：
（1）配制溶液，分别配制空白溶液、对照品溶液和供试品溶液；所述空白溶液包括碱性缓冲溶液和N-A-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺溶液(Marfey，s溶液)；所述对照品溶液包括1-(2-羟乙基)哌嗪、缓冲溶液和N-A-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺溶液；所述供试品溶液包括达沙替尼、缓冲溶液和N-A-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺溶液(Marfey，s溶液)；
（2）测定方法：分别将空白溶液、对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱条件如下：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0±0.1mL/min；柱温：30±2℃；进样量：20μl；运行时间：25min；检测波长：340nm；流动相为三乙胺-乙腈体系，进行梯度洗脱。
所述空白溶液的配制步骤为：移取稀释液于进样瓶中，依次加入碱性缓冲溶液和N-A-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺溶液(Marfey，s溶液)并盖紧进样瓶，保温，取出后，移取盐酸溶液至进样瓶中，盖紧进样瓶，摇匀；再从上述溶液中移取适量于进样瓶中，加入混合溶液，混匀即得空白溶液；
所述对照品溶液：移取1-(2-羟乙基)哌嗪储备液于进样瓶中，依次加入适量缓冲溶液和N-A-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺溶液(Marfey，s溶液)并盖紧进样瓶，保温，取出后，移取盐酸溶液至进样瓶中，盖紧进样瓶，摇匀；再从上述溶液中移取适量于进样瓶中，加入混合溶液，混合即得对照品溶液；
所述供试品溶液：移取适量达沙替尼样品储备液于进样瓶中，依次加入适量缓冲溶液和N-A-（5-氟-2,4-二硝基苯基）-L-丙氨酰胺溶液（Marfey，s溶液）并盖紧进样瓶，保温，取出后，移取盐酸溶液至进样瓶中，盖紧进样瓶，摇匀；再从上述溶液中移取适量于进样瓶中，加入混合溶液，混合即得供试品溶液；
所述稀释液为甲醇；
所述甲醇为AR及以上级；
所述缓冲溶液为碳酸氢钠溶液；
所述混合溶液由三乙胺和乙腈组成；
所述1-(2-羟乙基)哌嗪储备液是用稀释液甲醇溶解1-(2-羟乙基)哌嗪制得；
所述达沙替尼样品储备液是用稀释液甲醇溶解达沙替尼制得。
所述三乙胺溶液的浓度为0.5%wt；所述三乙胺溶液的pH值为3.0，优选利用磷酸调节三乙胺的pH至3.0；所述色谱柱可为Thermo Acclaim TM C18 ，5μm ,4.6×250 mm。
其中，流动相梯度过程如下：
| 时间（min） | 流动相三乙胺 | 流动相乙腈 |
| 0 | 75 | 25 |
| 15 | 25 | 75 |
| 16 | 75 | 25 |
| 25 | 75 | 25 |
更优选的，本发明所述的测定方法，包括以下步骤：
（1）配制溶液，分别配制空白溶液、对照品溶液和供试品溶液；
所述空白溶液的配制步骤为：准确移取稀释液甲醇50μl于2ml的进样瓶中，加0.5mol/L碳酸氢钠溶液50μl和Marfey，s溶液100μl并盖紧进样瓶，在40℃保温90min，取出后，准确移取40μl的2mol/L盐酸溶液，盖紧进样瓶，摇匀；从上述溶液中准确移取100μl，至2ml进样瓶中，加入400μl混合溶液，混匀即得。
对照品溶液，也即1-（2-羟乙基）哌嗪定位溶液：准确移取1-（2-羟乙基）哌嗪储备液50μl于2ml的进样瓶中后，照空白溶液中自“加0.5mol/L碳酸氢钠溶液50μl”起，依法操作，即得。
供试品溶液，也即达沙替尼定位溶液：准确移取达沙替尼样品储备液50μl于2ml的进样瓶中后，照空白溶液中自“加0.5mol/L碳酸氢钠溶液50μl”起，依法操作，即得。
所述稀释液为甲醇；所述甲醇为AR及以上级；所述1-（2-羟乙基）哌嗪储备液是用稀释液甲醇溶解1-（2-羟乙基）哌嗪制得；所述达沙替尼样品储备液是用稀释液甲醇溶解达沙替尼制得。所述混合溶液由三乙胺和乙腈组成。
（2）测定方法：分别将空白溶液、对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱条件如下：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：20μl；运行时间：25min；检测波长：340nm；流动相：三乙胺-乙腈，进行梯度洗脱。
其中，所述三乙胺溶液的浓度为0.5%wt；所述三乙胺溶液的pH值为3.0，优选利用磷酸调节三乙胺的pH至3.0；所述色谱柱可为Thermo Acclaim TM C18 ，5μm ,4.6×250 mm。
其中，流动相梯度过程如下：
| 时间（min） | 流动相三乙胺 | 流动相乙腈 |
| 0 | 75 | 25 |
| 15 | 25 | 75 |
| 16 | 75 | 25 |
| 25 | 75 | 25 |
其中：RU：供试品溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪的峰面积；RS：5针参比溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪的平均峰面积；CS：参比溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪的浓度（mg/ml）；CU：供试品溶液的浓度（mg/ml）。
所述的达沙替尼1-（2-羟乙基）哌嗪含量的测定方法还包括在检测之前的方法验证，该方法验证为按照正式检测的色谱条件，测定结果为：
有益效果
由以上技术方案可知，本发明所述的检测方法对达沙替尼的1-（2-羟乙基）哌嗪杂质的色谱峰分离度高、具有较高的系统适用性，同时在专属性、精密度、定量限、检测限、准确度、线性和范围和耐用性都符合标准。本发明利用方便快捷的高效液相色谱法，对达沙替尼的1-（2-羟乙基）哌嗪杂质的检测，可用于监测达沙替尼原料药及制剂的质量。本发明首次提出了达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪杂质的检测方法，具有准确度高、精密度高、重现性好、稳定性好、专属性强等特点，同时本发明的测定方法操作简单，所用时间比较短，成本低，耗时短。
附图说明
图1为达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪检测空白溶液的液相色谱图。
图2为达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪检测空白溶液的放大液相色谱图；
图3为达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪检测对照溶液的液相色谱图；
图4为达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪检测对照溶液的放大液相色谱图；
图5为达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪检测供1-（2-羟乙基）哌嗪定位溶液的液相色谱图；
图6为达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪检测供1-（2-羟乙基）哌嗪定位溶液的放大液相色谱图；
图7为达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪检测达沙替尼定位溶液的液相色谱图；
图8为达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪检测达沙替尼定位溶液的放大液相色谱图；
图9为达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪检测选择性溶液的液相色谱图；
图10为达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪检测选择性溶液的放大液相色谱图；
图11为达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪检测供试品溶液的液相色谱图；
图12为达沙替尼中1-（2-羟乙基）哌嗪检测供试品溶液的放大液相色谱图；
图13为1-（2-羟乙基）哌嗪线性关系图。
具体实施方式
下面用具体实施例来进一步解释和说明本发明，但并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
(1)实验材料与仪器条件
仪器：高效液相色谱仪：Agilent 1260；色谱柱：Thermo Acclaim TM C18 ，5μm , 4.6×250 mm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：20μl；运行时间：25min；检测波长：340nm。分别将空白溶液、对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱条件如下：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：20μl；运行时间：25min；检测波长：340nm；流动相：0.5%wt三乙胺（用磷酸调节pH至3）-乙腈，进行梯度洗脱，其梯度如表1。
表1-梯度洗脱条件
| 时间（min） | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 75 | 25 |
| 15 | 25 | 75 |
| 16 | 75 | 25 |
| 25 | 75 | 25 |
（2）实验步骤
实施例2本发明所述检测方法系统适用性试验
系统适用性是通过测定5针对照品溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪峰面积的RSD实现的，要求5针对照品溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪峰面积的RSD≤2.0%。如实施例1所述配制空白溶液、对照品溶液，在实施例1所述色谱条件下，进空白溶液1针，对照品溶液5针，得到色谱图，如图1、图2、图3和图4，根据公式换算结果如下表所示：
表2-系统适用性测定结果
结论为：5针对照品溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪峰面积的RSD为0.9%，符合方案中RSD应小于2.0%的要求。
实施例3本发明所述检测方法专属性试验
方法的专属性是通过研究峰鉴别和选择性而实现的，要求空白溶剂对检测无干扰；达沙替尼定位溶液对检测无干扰；选择性溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪与相邻峰的分离度≥1.5；选择性溶液中，1-（2-羟乙基）哌嗪的回收率应在90.0%~110.0%之间。如实施例1所述配制空白溶液、对照品溶液、1-（2-羟乙基）哌嗪定位溶液、供试品溶液、达沙替尼定位溶液和选择性溶液。
待系统平衡后，进空白溶液1针、1-（2-羟乙基）哌嗪定位溶液1针、达沙替尼定位溶液1针、选择性溶液3针，记录色谱图，如图1、图2、图5、图6、图7、图8、图9和图10，得出专属性检测结果如下。
表3-专属性检测结果
结论：空白溶剂对检测无干扰；达沙替尼定位溶液对检测无干扰；选择性溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪与相邻峰的分离度为1.7，符合方案中分离度≥1.5要求。
表4-专属性选择性测定结果
结论：选择性溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪的回收率为96.5%~104.1%%，符合方案中回收率应在90.0%~110.0%之间要求。
实施例4本发明所述检测方法精密度试验
（1）重复性：精密度的重复性是通过测试6份供试品溶液而实现的，要求6次测定结果之间的RSD应符合可接受标准。如实施例1所述配制达沙替尼样品储备液、空白溶液和供试品溶液。待系统平衡后，进空白溶液1针，6份供试品溶液各1针，记录色谱图，如图1、图2、图11和图12，根据公式换算得出结果如下表所示：
表5-精密度(重复性)测定结果
| 项目 | Precision-1 | Precision-2 | Precision-3 | Precision-4 | Precision-5 | Precision-6 | RSD% |
| 峰面积 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | -- |
| 结果% | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | -- |
结论：6份供试品溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪均未检出，符合方案中6份供试品测定结果的RSD应不大于10.0%要求。
（2）中间精密度：中间精密度是考察不同时间、不同设备、不同检测人员对检测结果的影响，要求5针对照品溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪峰面积的RSD应不大于2.0%；6份供试品溶液测定结果的RSD应不大于10.0%；重复性和中间精密度12次测定结果的RSD应不大于10.0%。如实施例1所示配制1-（2-羟乙基）哌嗪储备液、空白溶液、对照品溶液、达沙替尼样品储备液、供试品溶液和选择性溶液。待系统平衡后，进空白溶液1针，对照品溶液5针，6份供试品溶液各1针，选择性溶液1针，记录色谱图，如图1、图2、图3、图4、图11和图12，得出如下结果：
表6-中间精密度系统适用性测定结果
结论：5针对照品溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪峰面积的RSD为0.8%，符合方案中5针对照品溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪峰面积的RSD≤10.0%的要求。
表7-中间精密度测定结果
| 项目 | IP-1 | IP-2 | IP-3 | IP-4 | IP-5 | IP-6 | RSD% |
| 峰面积 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | -- |
| 结果% | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | -- |
结论：6份供试品溶液1-（2-羟乙基）哌嗪均未检出，符合方案中6份供试品溶液测定结果之间的RSD应不大于10.0%要求。
实施例5本发明所述检测方法的定量限和检测限
待系统平衡后，进空白溶液、6份LOQ溶液、LOD溶液各1针，记录色谱图。
表8-定量限、检测限测定结果
| 溶液名称 | 峰面积 | 浓度μg/ml | S/N | 相当于样品中的含量% |
| LOQ-1 | 3.64 | 0.476 | 11.4 | 0.010 |
| LOD | 1.33 | 0.143 | 2.8 | 0.003 |
表9-1-（2-羟乙基）哌嗪LOQ重复性结果
| 项目 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD（%） |
| 峰面积 | 3.64 | 3.41 | 3.47 | 3.45 | 3.44 | 3.26 | 3.5 |
| S/N | 11.4 | 9.6 | 8.8 | 11.5 | 9.4 | 8.2 | -- |
结论：6份LOQ溶液1-（2-羟乙基）哌嗪峰面积的RSD为3.5%，符合方案的6份LOQ溶液1-（2-羟乙基）哌嗪峰面积RSD≤10.0%要求。
实施例6本发明所述检测方法的线性和范围
在LOQ浓度～150%浓度范围内均匀的取6个浓度点，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标画曲线，要求曲线的线性回归系数R2数值应符合可接受标准。如实施例1所述配制1-（2-羟乙基）哌嗪储备液、空白溶液；
线性-LOQ溶液：同实施例5中LOQ溶液的配制；
根据1-（2-羟乙基）哌嗪储备液稀释分别得到2.5μg/ml线性-50%溶液、4μg/ml线性-80%溶液、5μg/ml线性-100%溶液、6μg/ml线性-120%溶液、7.5μg/ml线性-150%溶液。
待系统平衡后，进空白溶液1针、各个浓度下溶液各进样3针，色谱图，得出如下结果：
表10-1-（2-羟乙基）哌嗪线性测定结果
如图13 1-(2-羟乙基)哌嗪线性关系图。
结论：1-（2-羟乙基）哌嗪在0.473μg/ml~7.137μg/ml浓度范围内呈线性，相当于在样品中的含量为0.009%~0.143%，线性回归方程为y=6.83x+0.1527，R2=0.9993，符合方案要求。（标准规定：在LOQ～150%浓度范围内呈线性，要求曲线的线性回归系数R2≥0.99。）
实施例7本发明所述检测方法的准确度
准确度是通过被测组分实测浓度和理论浓度之间的回收率而实现的；要求被测组分在各浓度点的回收率应在90.0%～110.0%之间。如实施例1所述配制供试品溶液、1-（2-羟乙基）哌嗪储备液、对照品溶液。
准确度-LOQ溶液：利用1-（2-羟乙基）哌嗪储备液和达沙替尼样品配制0.5ug/mL1-（2-羟乙基）哌嗪和5mg/mL达沙替尼的混合溶液，照实施例1配制空白溶液中自“加0.5mol/L碳酸氢钠溶液50μl”起，依法操作，即得，同法配制3份。
准确度-50%溶液：利用1-（2-羟乙基）哌嗪储备液和达沙替尼样品配制2.5ug/mL1-（2-羟乙基）哌嗪和5mg/mL达沙替尼的混合溶液，照实施例1配制空白溶液中自“加0.5mol/L碳酸氢钠溶液50μl”起，依法操作，即得，同法配制3份。
准确度-100%溶液：利用1-（2-羟乙基）哌嗪储备液和达沙替尼样品配制5ug/mL1-（2-羟乙基）哌嗪和5mg/mL达沙替尼的混合溶液，照实施例1配制空白溶液中自“加0.5mol/L碳酸氢钠溶液50μl”起，依法操作，即得，同法配制3份。
准确度-150%溶液：利用1-（2-羟乙基）哌嗪储备液和达沙替尼样品配制7.5ug/mL1-（2-羟乙基）哌嗪和5mg/mL达沙替尼的混合溶液，照实施例1配制空白溶液中自“加0.5mol/L碳酸氢钠溶液50μl”起，依法操作，即得，同法配制3份。
待系统平衡后，进空白溶液、对照品溶液、供试品溶液各1针，不同浓度的准确度溶液各进样1针，记录色谱图，得到如表11所示结果。
表11-准确度检测结果
结论：1-（2-羟乙基）哌嗪真实浓度回收率为92.2%~108.7%，符合方案中各组分在各浓度点的回收率应在90.0%～110.0%之间的要求。
实施例8本发明所述检测方法的耐用性
考察对照品溶液和供试品溶液在室温下放置0天、1天、2天后进样，检测结果随时间变化的规律，为检测时对照品溶液和供试品溶液的放置时间提供依据。如实施例1所述配制1-（2-羟乙基）哌嗪储备液、达沙替尼样品储备液、空白溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别于0天，1天，2天配制上述对照品溶液、供试品溶液各1份。待系统平衡后，进空白溶液、对照品溶液0天，1天，2天；供试品溶液0天，1天，2天各1针，记录色谱图，得到如表12所示结果。
表12-溶液稳定性测定结果
结论：与0天相比较，对照品溶液在室温下放置2天内1-（2-羟乙基）哌嗪的回收率为92.7%~100.0%；供试品溶液1-（2-羟乙基）哌嗪测定结果的变化值在限度的20%以内，则对照品溶液和供试品溶液在2天内稳定。而标准规定：与0天相比较，对照品溶液在室温下放置2天内1-（2-羟乙基）哌嗪的回收率应在90.0%~110.0%之间；供试品溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪测定结果的变化值在限度的20%以内，则溶液稳定。
实施例9 本发明所述检测方法的参数变化
参数变化是通过考察各实验条件参数的微小变化后，检测结果应符合规定而实现的，在各个测定参数变动下，要求空白溶液对检测无干扰；选择性溶液中各相邻组分峰间的分离度应≥1.5；各组分的回收率应在70.0%～130.0%之间。如实施例1所述配制达沙替尼样品储备液、1-（2-羟乙基）哌嗪储备液、选择性溶液储备液、色谱柱2-选择性溶液储备液、空白溶液、对照品溶液、供试品溶液、选择性溶液，待系统平衡后，进空白溶液1针，对照品溶液1针，供试品溶液、选择性溶液各1针，记录色谱图，得到如表13所示结果。
表13-参数变化测定结果
| 参数 | 对照品溶液峰面积 | 供试品溶液峰面积 | 选择性溶液峰面积 | 空白溶液有无干扰 | 分离度 | 回收率% |
| 柱箱起始温32℃ | 37.71 | 0 | 38.46 | 无干扰 | 1.9 | 102.0 |
| 柱箱起始温28℃ | 39.35 | 0 | 39.18 | 无干扰 | 1.7 | 99.6 |
| 流速1.1ml/min | 31.05 | 0 | 33.13 | 无干扰 | 1.7 | 106.7 |
| 流速0.9ml/min | 42.06 | 0 | 41.93 | 无干扰 | 1.9 | 99.7 |
| 色谱柱2 | 34.29 | 0 | 36.91 | 无干扰 | 1.7 | 107.6 |
| 中间条件（流速1.0ml/min，柱箱起始温度30℃） | 36.29 | 0 | 36.24 | 无干扰 | 1.7 | 99.9 |
结论：空白溶液对检测无干扰；供试品溶液对检测无干扰；选择性溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪与相邻峰的分离度均≥1.5；各参数变化下的回收率为99.6%~107.6%，符合方案要求。（标准规定：空白溶液对检测无干扰；供试品溶液对检测无干扰；选择性溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪与相邻峰的分离度≥1.5；选择性溶液中1-（2-羟乙基）哌嗪的回收率在90%~110%之间。）
注：（1）色谱柱2：以中间精密度系统适用性第一针对照品溶液作为对照品溶液，中间精密度第一针供试品溶液作为供试品溶液，中间精密度项下选择性溶液作为选择性溶液。
以上实施例仅为本发明的优选实施方案，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种达沙替尼中1-(2-羟乙基)哌嗪的检测方法，包括以下步骤：
（1）配制溶液，分别配制空白溶液、对照品溶液和供试品溶液；所述空白溶液包括碱性缓冲溶液和N-A-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺溶液；所述对照品溶液包括1-（2-羟乙基）哌嗪、缓冲溶液和N-A-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺溶液；所述供试品溶液包括达沙替尼、缓冲溶液和N-A-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺溶液；
（2）测定方法：分别将空白溶液、对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图,色谱条件如下:色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0±0.1mL/min；柱温：30±2℃；进样量：20μl；运行时间：25min；检测波长：340nm；流动相为三乙胺-乙腈体系，进行梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述空白溶液的配制步骤为：移取稀释液于进样瓶中，依次加入碱性缓冲溶液和N-A-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺溶液并盖紧进样瓶，保温，取出后，移取盐酸溶液至进样瓶中，盖紧进样瓶，摇匀；再将上述溶液移取至进样瓶中，加入混合溶液，混匀即得空白溶液；
所述对照品溶液：移取1-(2-羟乙基)哌嗪储备液于进样瓶中，依次加入缓冲溶液和N-A-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺溶液并盖紧进样瓶，保温，取出后，移取盐酸溶液至进样瓶中，盖紧进样瓶，摇匀；再将上述溶液移取至进样瓶中，加入混合溶液，混合即得对照品溶液；
所述供试品溶液：移取适量达沙替尼样品储备液于进样瓶中，依次加入适量缓冲溶液和N-A-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙氨酰胺并盖紧进样瓶，保温，取出后，移取盐酸溶液至进样瓶中，盖紧进样瓶，摇匀；再从上述溶液中移取适量于进样瓶中，加入混合溶液，混合即得供试品溶液；
所述稀释液为甲醇；
所述甲醇为AR及以上级；
所述缓冲溶液为碳酸氢钠溶液；
所述混合溶液由三乙胺和乙腈组成；
所述1-(2-羟乙基)哌嗪储备液是用稀释液甲醇溶解1-(2-羟乙基)哌嗪制得；
所述达沙替尼样品储备液是用稀释液甲醇溶解达沙替尼制得；
其中，所述三乙胺溶液的浓度为0.5%wt；所述三乙胺溶液的pH值为3.0，优选利用磷酸调节三乙胺的pH至3.0;所述色谱柱可为Thermo AcclaimTM C18,5μm, 4.6×250mm；
所述流动相梯度过程如下：
。
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