CN104749310A - 一种测定卷烟滤嘴中亚硝胺含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种测定卷烟滤嘴中亚硝胺含量的方法，包括提取目标物、涡旋振荡与过滤、标准储备液和标准工作液的配制、超高效液相色谱-串联质谱测定四个主要步骤。本发明与传统的GC-TEA检测方法比较，采用醋酸铵萃取，涡旋振荡，过滤进样的方式，简化了前处理过程，提高了分析灵敏度；与现有的LC-MS/MS方法相比，用涡旋振荡法振荡时间明显短于超声萃取或振荡萃取，提取效率增加，振荡时间缩短了10倍。

Description

一种测定卷烟滤嘴中亚硝胺含量的方法

技术领域

本发明属于卷烟烟气分析技术领域，具体涉及滤嘴中烟气有害成分的检验，特别是卷烟滤嘴中亚硝胺含量的测定方法。

背景技术

烟草特有亚硝胺(TSNAs)主要包括N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)和N-亚硝基新烟碱(NAT)等。国际癌症研究机构(IARC)、Hecht研究团队等，加拿大政府名单中有害成分的毒性评价结果表明，且有足够的证据认为，TSNAs中的NNK对实验室动物有致癌性。近年，国家烟草专卖局组织实施的“卷烟危害性指标体系研究”项目也表明，在卷烟烟气的实际环境下，对人体影响最大的7种有害化学成分指标中，NNK是其中之一。

卷烟滤嘴对烟气中的TSNAs有一定的截留作用，卷烟烟气TSNAs滤嘴截留量可以应用于评价烟气接触风险，因此，检测滤嘴中TSNAs含量具有重要意义。

目前关于TSNAs的检测方法主要有气相色谱-热能分析法(GC-TEA)、气质联用法(GC–MS)和液相色谱串联质谱联用法(LC-MS/MS)。GC-TEA法作为CORESTA推荐的主流烟气中TSNAs的检测方法，使用的最为广泛。但是GC-TEA方法的样品前处理过程复杂，选择性较差。

发明内容

鉴于此，本发明目的在于提供一种前处理相对简单、灵敏度更高、分析速度快的亚硝胺含量检测方法，该方法专用于分析卷烟滤嘴中亚硝胺含量。

为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种测定卷烟滤嘴中亚硝胺含量的方法，包括以下步骤：

步骤a)提取目标物

截取近嘴端滤嘴放入萃取管，加入萃取液和内标；所述萃取管为离心管；

步骤b)涡旋振荡与过滤

将离心管置于涡旋振荡仪，涡旋振荡，静置；吸取上清液经水相滤膜过滤，滤液待测；

步骤c)标准储备液和标准工作液的配制

用甲醇配置TSNAs标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，低温保存；量取储备液用甲醇稀释定容，制得TSNAs工作液；

用甲醇准确配置TSNAs-d₄内标储备液，用内标储备液配制内标工作液，并储存于棕色玻璃瓶中；所有的储备液低温保存，使用前将其恢复到室温；

用萃取液配制不同浓度的TSNAs标准工作溶液；

步骤d)超高效液相色谱-串联质谱测定

吸取配制好的不同浓度的TSNAs标准工作溶液，注入UPLC-MS/MS系统，按内标法以峰面积计算出样品待测液中TSNAs含量。

作为本发明的一个优选实施方式，步骤a)中，滤嘴截取长度为1cm。

作为本发明的一个优选实施方式，步骤a)中，选取5支滤嘴段，加入的100mmol/L的萃取液10mL和10μg/mL的内标30μL。

作为本发明的一个优选实施方式，所述萃取液为醋酸铵水溶液。

作为本发明的一个优选实施方式，步骤b)中，涡旋振荡时间为3min，涡旋振荡转速为2400转/min。

作为本发明的一个优选实施方式，步骤c)中，步骤c)中，避光低温保存是以棕色玻璃瓶为容器，-20℃下保存。

作为本发明的一个具体实施方式，所述步骤d)具体操作为：吸取配制好的不同浓度的TSNAs标准工作溶液，注入UPLC-MS/MS系统，绘制TSNAs的线性回归方程，对纯化稀释后的样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

作为本发明的一个具体实施方式，步骤d)中，UPLC-MS/MS系统的色谱条件：选用色谱柱为Atiantis UPLC BEH Shield RPC18，规格为50mm×2.1mm，1.7um；流动相A：98％甲酸氨水和流动相B：2％甲酸乙腈；梯度洗脱条件为：0～2min，98％A～50％A；2～2.1min，50％A～10％A；2.1～3.5min，10％A～10％A；3.5～3.51min，10％A～98％A；3.51～5.0min，98％A～98％A；流动相流速为0.8mL/min。

作为本发明的一个优选实施方式，所述甲酸氨水体积分数0.1％，所述甲酸乙腈体积分数0.1％。

作为本发明的一个具体实施方式，步骤d)中，串联质谱检测的条件为：电喷雾离子源，喷雾电压(IS)2.6kV；离子化温度450℃；雾化气流量1000L/Hr；锥孔气流量50L/Hr；碰撞气为氩气，流量0.15ml/min；其余气体为氮气；驻留时间为30msec，正离子MRM模式采集。

与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：

1、与传统的GC-TEA检测方法比较，采用醋酸铵萃取，涡旋振荡，过滤进样的方式，简化了前处理过程，提高了分析灵敏度。

2、与现有的LC-MS/MS方法相比，用涡旋振荡法振荡时间明显短于超声萃取或振荡萃取，提取效率增加，振荡时间缩短了10倍。

3、本发明选取了超高效液相色谱柱，使得柱子的分离度明显提高，分析时间显著缩短，提高检测通量。串联质谱的使用使得方法的选择性和灵敏度提高，更有利于吸烟者滤嘴中低含量TSNAs的测定。

4、本发明使用内标为氘代内标，使用氘代内标定量，有效消除基质干扰和前处理过程中引起的误差。

5、本发明具有操作简便、快速、准确、灵敏度及重复性好的优点。

附图说明

图1是本发明一较佳实施例样品中TSNAs的选择离子流色谱图。

图2是本发明一较佳实施例样品中氘代TSNAs的选择离子流色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实例做进一步描述。

本实施例所用仪器与试剂为：Waters Xevo TQ超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)，配备电喷雾电离源(ESI)；VtexMixer 230VeU振荡器(美国Labnet公司)。

甲酸为HPLC级(浓度为49-51％，德国Sigma公司)；乙腈、甲醇均为色谱纯(美国Thermo-Fisher公司)；TSNAs，TSNAs-d₄(纯度：98％；同位素纯度：99％，Toronto ResearchChemicals Inc.)，水为超纯水。

本发明依次采用醋酸铵水溶液为萃取液，涡旋振荡萃取，氘代内标定量，水相滤膜过滤，UPLC-MS/MS测定等步骤对滤嘴中亚硝胺进行测定，可快速、准确、同时检测出滤嘴中4种TSNAs的含量，即N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)和N-亚硝基新烟碱(NAT)的含量。

1、提取滤嘴中的分析物

取5支收集的滤嘴，量取近嘴端1cm，将截下的滤嘴均匀分成4瓣，放入50mL具塞离心管，加入10mL100mmol/L醋酸铵萃取液，并加入30μL10μg/mL氘代内标，在2400转/分钟的条件下涡旋振荡3min，静置2min。上清液过0.22μm水相滤膜，取5μL滤液引入LC-MS/MS分离分析。

2、LC-MS/MS测定

(1)LC-MS/MS条件：

色谱条件：Atiantis UPLC BEH Shield RPC18(50mm×2.1mm，1.7um，美国Waters公司)；流动相A：98％甲酸氨水(体积分数0.1％)和流动相B：2％甲酸乙腈(体积分数0.1％)初始流动相体系，分析时间为5min，进样量为5μL。梯度洗脱条件：0～2min,98％A～50％A；2～2.1min,50％A～10％A；2.1～3.5min,10％A～10％A；3.5～3.51min,10％A～98％A，3.51～5.0min,98％A～98％A。流动相流速为0.8mL/min。

质谱条件:电喷雾离子源，喷雾电压(IS)2.5kV；离子化温度350℃；雾化气流量1000L/Hr；锥孔气(cone)流量50L/Hr；碰撞气流量为0.15ml/min；碰撞气为氩气，其余气体为氮气；驻留时间为30msec，正离子MRM模式采集，监测离子对及其相应的碰撞能量(CE)见表1。

表1 多反应监测模式下四种烟草特有亚硝胺及其氘代内标的部分质谱参数

*定量离子对。

(2)标准储备液的配制

储备液及工作液的配制：用甲醇准确配制11.00μg/mL NNN，11.20μg/mL NNK，10.14μg/mL NAB，5.00μg/mL NAT标准储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。量取各化合物储备液进行混合，配制得到1μg/mL TSNAs混合标准溶液。

用甲醇配制100μg/mL NNN-d₄，50μg/mL NAT-d₄，100μg/mL NAB-d₄和250μg/mLNNK-d₄的内标储备液，储存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。准确量取的各内标储备液，混合后配成10μg/mL混合内标溶液。

(3)TSNAs含量的测定：

吸取配制好的不同浓度的TSNAs的混合标准工作溶液各5μL，注入LC-MS/MS；TSNAs的线性回归方程见表2，方程中y代表分析物与内标峰面积的比值，x表示滤嘴中目标分析物的浓度。同样的方法检测实际样本，求得实际样本中TSNAs的含量。

(4)该方法的线性范围和检出限

本实施例以空白烤烟基质配制标准曲线，分别移取1μg/mL标准储备液0μL，10μL，20μL,50μL,200μL和500μL于6个10mL棕色容量瓶中，每个容量瓶移入30μL10μg/mL氘代内标工作液，用甲醇定容至10mL。各标准工作溶液的浓度分别为0ng/mL，1ng/mL，2ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL和50ng/mL。对各标样峰面积与内标的峰面积的比值(y)和其浓度(x)进行线性回归分析，得到标准曲线，结果见表2。各种化合物线性关系良好(相关系数r²≥0.99),可以满足定量分析的需要。以3倍信噪比确定方法的检出限,详见表2。

表2 TSNAs的线性范围、相关系数、检测限及保留时间

(5)本发明方法的重复性和加标回收率：

在滤嘴样品萃取过程中添加一定量的TSNAs标准溶液，然后提取、测定，计算回收率。本实验选用高、中、低3种不同浓度的加标回收实验来考察方法的准确度，除了较低含量的NAB在加入量为10.1ng时的回收率为84.9％之外，其它点的回收率都在90％-105％之间。方法的精密度以回收率的相对标准偏差(RSD)来评价，对同一样品平行测定5次，3种化合物回收率的RSD范围为3.1％～7.7％，结果见表3。

表3 滤嘴中TSNAs的回收率和精密度(n＝5)

本实施例样品中TSNAs的选择离子流色谱图如图1所示，样品中氘代TSNAs的选择离子流色谱图如图2所示。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种测定卷烟滤嘴中亚硝胺含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a)提取目标物

截取近嘴端滤嘴放入萃取管，加入萃取液和内标；所述萃取管为离心管；

步骤b)涡旋振荡与过滤

将离心管置于涡旋振荡仪，涡旋振荡，静置；吸取上清液经水相滤膜过滤，滤液待测；

步骤c)标准储备液和标准工作液的配制

用甲醇配置TSNAs标准储备液，避光低温保存；量取储备液用甲醇稀释定容，制得TSNAs工作液；

用甲醇准确配置TSNAs-d4内标储备液，用内标储备液配制内标工作液，避光低温保存，使用前将其恢复到室温；

用萃取液配制不同浓度的TSNAs标准工作溶液；

步骤d)超高效液相色谱-串联质谱测定

吸取配制好的不同浓度的TSNAs标准工作溶液，注入UPLC-MS/MS系统，按内标法以峰面积计算出样品待测液中TSNAs含量。

2.根据权利要求1所述的测定卷烟滤嘴中亚硝胺含量的方法，其特征在于，步骤a)中，滤嘴截取长度为1cm。

3.根据权利要求2所述的测定卷烟滤嘴中亚硝胺含量的方法，其特征在于，步骤a)中，选取5只滤嘴段，加入的100mmol/L的萃取液10mL和10μg/mL的内标30μL。

4.根据权利要求1或3所述的测定卷烟滤嘴中亚硝胺含量的方法，其特征在于，所述萃取液为醋酸铵水溶液。

5.根据权利要求1所述的测定卷烟滤嘴中亚硝胺含量的方法，其特征在于，步骤b)中，涡旋振荡时间为3min，涡旋振荡转速为2400转/min。

6.根据权利要求1所述的测定卷烟滤嘴中亚硝胺含量的方法，其特征在于，步骤c)中，避光低温保存是以棕色玻璃瓶为容器，-20℃下保存。

7.根据权利要求1所述的测定卷烟滤嘴中亚硝胺含量的方法，其特征在于，所述步骤d)具体操作为：吸取配制好的不同浓度的TSNAs标准工作溶液，注入UPLC-MS/MS系统，绘制TSNAs的线性回归方程，对纯化稀释后的样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

8.根据权利要求1或7所述的测定卷烟滤嘴中亚硝胺含量的方法，其特征在于，步骤d)中，UPLC-MS/MS系统的色谱条件：选用色谱柱为Atiantis UPLC BEH Shield RPC18，规格为50mm×2.1mm，1.7um；流动相A：98％甲酸氨水和流动相B：2％甲酸乙腈；梯度洗脱条件为：0～2min,98％A～50％A；2～2.1min,50％A～10％A；2.1～3.5min,10％A～10％A；3.5～3.51min,10％A～98％A，3.51～5.0min,98％A～98％A；流动相流速为0.8mL/min。

9.根据权利要求8所述的测定卷烟滤嘴中亚硝胺含量的方法，其特征在于，所述甲酸氨水体积分数0.1％，所述甲酸乙腈体积分数0.1％。

10.根据权利要求8所述的测定卷烟滤嘴中亚硝胺含量的方法，其特征在于，步骤d)中，串联质谱检测的条件为：电喷雾离子源，喷雾电压(IS)2.6kV；离子化温度450℃；雾化气流量1000L/Hr；锥孔气流量50L/Hr；碰撞气为氩气，流量0.15ml/min；其余气体为氮气；驻留时间为30msec，正离子MRM模式采集。