CN109085270B - 一种同时测定人体血浆中多种烟草特有亚硝胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时测定人体血浆中多种烟草特有亚硝胺的方法。具体为：1)采集血样，获取血浆后，进行在线二维SPE处理；所述二维SPE处理采用PRS阳离子交换柱与Resin GP反相萃取柱联用对待测血浆进行富集和纯化；2)：配制具有梯度浓度的亚硝胺溶液；3)将所述标准样品进行LC‑MS/MS分析，以亚硝胺的峰面积与内标峰面积之比对其质量浓度建立线性回归方程；4)计算所述待测血浆中亚硝胺的含量。本发明所述的方法采用的一种全自动在线二维固相萃取样品前处理方式，最大程度地去除基质干扰，降低基质效应，具有富集纯化一步完成、固相萃取柱可多次使用、重现性好、测定效率高等优点。
Description
技术领域
本发明属于血液样本生物标记物检测领域，具体涉及一种基于在线固相萃取-液相色谱-串联质谱同时测定人体血浆中多种烟草特有亚硝胺的方法。
背景技术
烟草特有亚硝胺(TSNAs)是烟草和卷烟烟气中广泛存在的一类强致癌物质，主要包括4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基降烟碱(NNN)、N-亚硝基降新烟草碱(NAT)和N-亚硝基假木贼碱(NAB)。国际癌症组织(IARC)将NNK和NNN归为一级人体致癌物。在啮齿动物中，NNK可导致肺腺癌，在暴露于环境烟气中的非吸烟者中也发现同样的病症。4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁醇(NNAL)是NNK的主要代谢物，并且具有和NNK相似的致癌活性。NNAL可发生葡萄糖苷酸化生成NNAL-葡萄糖苷酸(NNAL-Gluc)解毒。NNAL和NNAL-Gluc的总量称为总NNAL，是吸烟者或烟气环境中非吸烟者暴露于NNK的理想的生物标志物。
目前，已有的TSNAs的烟气接触生物标志物的研究，多为吸烟人群尿液中的研究，而人体尿液由于受饮水量等因素影响较大，虽然可采用肌酐矫正，但测定结果较易波动，研究结论多有分歧。血液中接触生物标志物相比较尿液受饮水量等因素影响较小，更为稳定，且血液较24h尿液更易储存，在生物标志物研究方面具有明显的优势。因此，有必要建立快速准确、灵敏度高、重复性好的人体血液中TSNAs的测定方法，通过血液中TSNAs生物标志物水平评价卷烟TSNAs暴露风险。然而，仅有很少量的研究测定了吸烟人群中血浆中的NNAL，尚未见吸烟人群和非吸烟人群血液中NNK、NNN、NAT和NAB测定方法的报道，且已有的方法需通过离线固相萃取，旋转蒸发等步骤净化富集，步骤多，操作过程繁琐，耗时较长。
发明内容
本发明的目的正是基于上述研究现状而提供的一种基于在线二维固相萃取-液相色谱-串联质谱(online SPE/LC/MS/MS)同时测定人体血浆中多种烟草特有亚硝胺的方法。
所述方法包括如下步骤：
1)待测血浆的制备：采集血样，获取血浆后，进行在线二维SPE处理；所述二维SPE处理采用PRS阳离子交换柱与Resin GP反相萃取柱联用对待测血浆进行富集和纯化；
2)标准样品的制备：配制具有梯度浓度的亚硝胺溶液；
3)绘制标准曲线：将所述标准样品进行LC-MS/MS分析，以亚硝胺的峰面积与内标峰面积之比对其质量浓度建立线性回归方程；
4)计算所述待测血浆中亚硝胺的含量。
其中，所述亚硝胺至少包括NNAL、NAT、NNK、NNN和NAB。
本发明首次建立的非吸烟人群和吸烟人群血浆中NNAL、NAT、NNK、NNN和NAB等5种TSNAs同时测定的方法，填补了人体血浆中NNAL、NAT、NNK、NNN和NAB等5种TSNAs同时测定的空白。该方法采用的一种全自动在线二维固相萃取样品前处理方式，最大程度地去除基质干扰，降低基质效应，具有富集纯化一步完成、固相萃取柱可多次使用、重现性好、测定效率高等优点。
本发明进一步提出的，所述待测血浆采用如下方式获得：采集血样后，离心获得待测血浆；然后在所述待测血浆中加入β-葡萄糖醛酸酶，振荡孵育进行酶解；振荡孵育完成后加入内标，再进行离心处理，即可。
血液的采集具体操作可为：采集吸烟者或非吸烟者空腹肘静脉血4mL，置入肝素抗凝管中。血液样本采集后2小时内离心，4℃3000rpm/min离心10分钟，血浆转移至无RNAse的洁净EP管中，-70℃冰箱保存。
本发明进一步提出的，每1mL待测血浆中加入15000～19000units的所述β-葡萄糖醛酸酶，所述振荡孵育的时间为20～30h；
优选为每1mL待测血浆中加入17000～17200units的所述β-葡萄糖醛酸酶，所述振荡孵育的时间为24h。
血液的处理具体操作可为：血样在室温下解冻后，取0.7mL加入0.7mLβ-葡萄糖醛酸酶(12,000units，用磷酸盐缓冲溶液配，pH6.8)，在37℃条件下水浴振荡孵育24h，孵育完成后加入20μL内标，全部转移至
Ultra-4 30k超滤离心管中，在4℃条件下，经14000转/min离心10min后，用0.22μm的针式滤器过滤后，进行online SPE/LC/MS/MS分析。
本发明进一步提出的，所述二维SPE处理采用PRS阳离子交换柱与Resin GP反相萃取柱联用的二维SPE对血液样品进行富集和纯化；包括活化、平衡、上样、洗涤(PRS柱)、转移、洗涤(Resin GP柱)和洗脱等步骤。
所述二维SPE处理包括如下条件：
所述PRS阳离子交换柱和Resin GP反相萃取柱均采用1.8～2.2mL甲醇，以4.8～5.2mL/min的流速进行活化；所述PRS阳离子交换柱采用1.8～2.2mL 2％的甲酸，以4.8～5.2mL/min的流速进行平衡；所述Resin GP反相萃取柱采用1.8～2.2mL 2％的氨水，以4.8～5.2mL/min的流速进行平衡；
采用0.5～1.1mL 2％的甲酸，以0.4～0.8mL/min的流速进行上样；
采用0.8～1.2mL 2％的氨水，以0.6～0.8mL/min的流速将所述待测血浆从PRS阳离子交换柱转移至Resin GP反相萃取柱；
采用0.8～1.2mL 2％的甲酸，以1.8～2.2mL/min的流速对PRS阳离子交换柱进行洗涤；再分别采用0.8～1.2mL 2％的氨水和0.8～1.2mL含有10％甲醇的氨水溶液对ResinGP反相萃取柱进行两步洗涤，洗涤流速为1.8～2.2mL/min；
进样量为：280～320μL；
洗脱时间为2.3～2.7min。
优选的，所述二维SPE处理包括如下条件：
所述PRS阳离子交换柱和Resin GP反相萃取柱均采用2mL甲醇，以5mL/min的流速进行活化；所述PRS阳离子交换柱采用1.8～2.2mL 2％的甲酸，以5mL/min的流速进行平衡；所述Resin GP反相萃取柱采用2mL 2％的氨水，以5mL/min的流速进行平衡；
采用0.5mL 2％甲酸，以0.8mL/min的流速进行上样；
采用0.8mL 2％的氨水，以0.8mL/min的流速；
采用1mL 2％的甲酸，以2mL/min的流速对PRS阳离子交换柱进行洗涤；再分别采用1mL 2％的氨水和1mL含有10％甲醇的氨水溶液对Resin GP反相萃取柱进行两步洗涤，洗涤流速为2mL/min；
进样量为：300μL；
洗脱时间为2.5min。
其中，本发明中试剂的百分比值为体积百分比，溶剂为该试剂常规可溶的试剂，如水；例如2％甲酸为体积百分比为2％的甲酸水溶液。
本发明进一步提出，所述LC-MS/MS分析采用Waters Altlantis T3(2.1×150mm,3μm)色谱柱进行色谱分离，以8～12mmoL/L的乙酸铵水溶液为流动相A相，乙腈为流动相B相，按如下条件进行梯度洗脱：0～4.5min：88％～20％A；4.6～5.0min：20～5％A；5.1～7.0min：5％A；7.1～10.0min：88％A；
流速：0.3～0.5mL min-1，柱温：40～60℃；进样量：280～320μL；
优选为以10mmoL/L的乙酸铵水溶液为流动相A相；流速：0.4mL min-1，柱温：50℃；进样量：300μL。
本发明进一步提出，所述LC-MS/MS分析采用电喷雾离子源(ESI)正离子扫描模式，检测方式采用多反应监测(MRM)；
其中，电喷雾电压(IS)为4800～5200V；雾化气(gas 1)、辅助加热气(gas 2)、气帘气、碰撞气为氮气，气体流量分别为62～68psi、58～62psi、33～37psi、6～10psi；离子源温度(TEM)为480～520℃；驻留时间：48～52ms；
优选为电喷雾电压：5000V；雾化气、辅助加热气、气帘气、碰撞气为氮气，气体流量分别为65psi、60psi、35psi、8psi；离子源温度：500℃；驻留时间：50ms。
本发明提供一种优选方案，所述方法，包括如下步骤：
1)待测血浆的制备：采集血样后，离心获得待测血浆；然后以每1mL待测血浆中加入15000～19000units的所述β-葡萄糖醛酸酶的量，在所述待测血浆中加入β-葡萄糖醛酸酶，振荡孵育进行酶解20～30h；振荡孵育完成后加入内标，再采用30K超滤离心管离心处理；将离心处理后的血浆进行在线二维SPE处理；所述二维SPE处理采用PRS阳离子交换柱与Resin GP反相萃取柱联用对待测血浆进行富集和纯化；
其中，所述PRS阳离子交换柱和Resin GP反相萃取柱均采用1.8～2.2mL甲醇，以4.8～5.2mL/min的流速进行活化；所述PRS阳离子交换柱采用1.8～2.2mL 2％的甲酸，以4.8～5.2mL/min的流速进行平衡；所述Resin GP反相萃取柱采用1.8～2.2mL 2％的氨水，以4.8～5.2mL/min的流速进行平衡；
采用0.5～1.1mL 2％的甲酸，以0.4～0.8mL/min的流速进行上样；
采用0.8～1.2mL 2％的氨水，以0.6～0.8mL/min的流速将所述待测血浆从PRS阳离子交换柱转移至Resin GP反相萃取柱；
采用0.8～1.2mL 2％的甲酸，以1.8～2.2mL/min的流速对PRS阳离子交换柱进行洗涤；再分别采用0.8～1.2mL 2％的氨水和0.8～1.2mL含有10％甲醇的氨水溶液对ResinGP反相萃取柱进行两步洗涤，洗涤流速为1.8～2.2mL/min；
进样量为：280～320μL；洗脱时间为2.3～2.7min；
2)标准样品的制备：配制具有梯度浓度的亚硝胺溶液；
3)绘制标准曲线：将所述标准样品进行LC-MS/MS分析，以亚硝胺的峰面积与内标峰面积之比对其质量浓度建立线性回归方程；
所述LC-MS/MS分析采用Waters Altlantis T3色谱柱进行色谱分离，以8～12mmoL/L的乙酸铵水溶液为流动相A相，乙腈为流动相B相，按如下条件进行梯度洗脱：0～4.5min：88％～20％A；4.6～5.0min：20～5％A；5.1～7.0min：5％A；7.1～10.0min：88％A；
流速：0.3～0.5mL min-1，柱温：40～60℃；进样量：280～320μL；
所述LC-MS/MS分析采用电喷雾离子源正离子扫描模式，检测方式采用多反应监测；
其中，电喷雾电压为4800～5200V；雾化气、辅助加热气、气帘气、碰撞气为氮气，气体流量分别为62～68psi、58～62psi、33～37psi、6～10psi；离子源温度为480～520℃；驻留时间：48～52ms；
4)计算所述待测血浆中亚硝胺的含量。
通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
(1)本发明所建立的测定人体血浆中5种游离态TSNAs和总TSNAs的全自动在线二维SPE-LC/MS/MS测定方法，首次成功实现了非吸烟者和吸烟者血浆中NNAL、NNK、NAT、NNN和NAB的同时测定，5种TSNAs检出限达到0.04～0.09pg/mL，明显低于已报道的现有血浆中NNAL测定方法的检出限。
(2)本发明所建方法血浆样品经阳离子交换柱和反向萃取柱组成的二维SPE处理，能够有效除去血浆中的中的盐、色素、蛋白质以及其它一些比分析物极性强的干扰物质，最大程度降低基质效应，同时实现在线富集，显著提高了方法的灵敏度和准确性，同时该方法采用全自动固相萃取技术在线净化富集血浆样品，自动化操作更加简便，减少人为误差，可实现高通量分析，显著提高了检测效率。
附图说明
图1为本发明在线二维SPE处理-高效液相色谱联用系统示意图；
图2为实施例1中吸烟者血浆中5种TSNAs的MRM色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
NNAL,NNK、NNN、NAT、NAB、NNAL-d3,NNK-d4、NNN-d4、NAT-d4、NAB-d4(纯度>98％，加拿大TRC公司)；超纯水(电导率≥18.2MO.cm)；甲醇、乙腈(LC-MS级，美国Fisher公司)；甲酸铵、甲酸、氨水(HPLC级，美国Sigma-Aldrich公司)；β-葡萄糖醛酸酶(IX-A型来源于大肠杆菌，美国Sigma-Aldrich公司)。BondElut PRS柱(PRS柱)、HySphere C18EC-SE柱(C18EC-SE柱)、Hysphere C18 HD柱(C18HD柱)和HySphere Resin GP柱(Resin GP柱)(荷兰SparkHolland公司)；
Ultra-4 30k离心超滤管(美国Millipore公司)
全自动在线SPE-高效液相色谱联用SymbiosisTM系统(荷兰Spark Holland公司)；API 5500质谱仪(美国Applied Biosystems公司)；TZ-2AG台式往复旋转振荡器(北京沃德仪器公司)；CP2245电子天平(感量0.000 1g，德国Sartorius公司)；13mm×0.22μm亲水PTFE针式滤器(上海安谱科学仪器有限公司)；Milli-Q50超纯水仪(美国Millipore公司)；Eppendorf 5804 R离心机(德国Eppendorf公司)。
实施例1
本实施例一种同时测定人体血浆中多种烟草特有亚硝胺的方法，如图1所示为在线二维SPE处理-高效液相色谱联用系统示意图(洗脱状态)；
所述方法包括如下步骤：
1)采集15名吸烟者空腹肘静脉血4mL，置入肝素抗凝管中。血液样本采集后2小时内离心，4℃3000rpm/min离心10分钟，血浆转移至无RNAse的洁净EP管中，-70℃冰箱保存。血样在室温下解冻后，取0.7mL加入0.7mL β-葡萄糖醛酸酶(12,000units，用磷酸盐缓冲溶液配，pH6.8)，在37℃条件下水浴振荡孵育24h，孵育完成后加入20μL内标，全部转移至
Ultra-4 30K超滤离心管中，在4℃条件下，经14000转/min离心10min后，用0.22μm的针式滤器过滤后，进行在线SPE/LC/MS/MS分析；
2)将步骤1)处理后的血浆进行在线二维SPE处理；所述二维SPE处理采用PRS阳离子交换柱与Resin GP反相萃取柱联用对待测血浆进行富集和纯化；
其中，所述PRS阳离子交换柱和Resin GP反相萃取柱均采用2mL甲醇，以5mL/min的流速进行活化；所述PRS阳离子交换柱采用2mL2％的甲酸，以5mL/min的流速进行平衡；所述Resin GP反相萃取柱采用2mL 2％的氨水，以5mL/min的流速进行平衡；
采用0.5mL 2％的甲酸，以0.8mL/min的流速进行上样；
采用0.8mL 2％的氨水，以0.8mL/min的流速将所述待测血浆从PRS阳离子交换柱转移至Resin GP反相萃取柱；
采用1mL 2％的甲酸，以2mL/min的流速对PRS阳离子交换柱进行洗涤；再分别采用1mL 2％的氨水和1mL含有10％甲醇的氨水溶液对Resin GP反相萃取柱进行两步洗涤，洗涤流速为2mL/min；
进样量为：300μL；洗脱时间为2.5min；
2)标准样品的制备：配制具有梯度浓度的亚硝胺溶液；
a)标准储备液：称取一定量的NNAL、NAB、NAT、NNK和NNN标准试剂，分别置于4只棕色容量瓶中，用乙腈配制成标准储备液。该标准储备溶液置于-18℃冰箱内避光保存。
b)混合标准溶液：分别移取一定体积的NNAL、NAB、NAT、NNK和NNN的标准储备液至棕色容量瓶中，用乙腈配制成NNAL、NAB、NAT、NNK和NNN一定浓度的混合标准溶液。该溶液置于-18℃冰箱内避光保存。
c)混合内标溶液：称取一定量的NNAL-d4、NAB-d4、NAT-d4、NNK-d4和NNN-d4，分别置于棕色容量瓶中，用乙腈配制成一定浓度的混合内标溶液。该溶液置于-18℃冰箱内避光保存。
d)标准工作溶液：由混合标准溶液，再分别加入一定量的混合内标溶液，用空白基质溶液配制成8级标准工作溶液，其浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、12.5、25.0、50.0、100.0pg/mL。
3)绘制标准曲线：将所述标准样品进行LC-MS/MS分析，以亚硝胺的峰面积与内标峰面积之比对其质量浓度建立线性回归方程；
所述LC-MS/MS分析采用Waters Altlantis T3色谱柱进行色谱分离，以10mmoL/L的乙酸铵水溶液为流动相A相，乙腈为流动相B相，按如下条件进行梯度洗脱：0～4.5min：88％～20％A；4.6～5.0min：20～5％A；5.1～7.0min：5％A；7.1～10.0min：88％A；
流速：0.4mL min-1，柱温：50℃；进样量：300μL；
所述LC-MS/MS分析采用电喷雾离子源正离子扫描模式，检测方式采用多反应监测；
其中，电喷雾电压为5000V；雾化气、辅助加热气、气帘气、碰撞气为氮气，气体流量分别为65psi、60psi、35psi、8psi；离子源温度为500℃；驻留时间：50ms；
MRM参数见表1：
表1 5种TSNAs的MRM参数①
注：①a定量离子；b定性离子。
在最优的实验条件下，对系列浓度标准溶液进行测定，以TSNAs峰面积与内标峰面积之比(Y)对其质量浓度(X，pg/mL)建立线性回归方程，以3倍信噪比作为检出限，10倍信噪比作为定量限，结果见表2。
表2血浆中5种TSNAs的回归方程、检出限和定量限
4)计算所述待测血浆中亚硝胺的含量。吸烟者血浆中5种TSNAs的测定结果见表3
表3吸烟者血浆中5种TSNAs的测定结果(pg/mL)
| 序号 | NNAL | NNK | NNN | NAT | NAB |
| 1 | 31.67 | 85.90 | 18.83 | 3.13 | 18.35 |
| 2 | 50.52 | 59.81 | 122.75 | 15.20 | 41.32 |
| 3 | 10.11 | 47.89 | 44.18 | 5.20 | 53.53 |
| 4 | 87.31 | 87.84 | 41.68 | 9.04 | 72.24 |
| 5 | 43.47 | 61.40 | 35.20 | 5.45 | 71.33 |
| 6 | 71.14 | 45.44 | 16.96 | 2.51 | 22.13 |
| 7 | 18.53 | 51.49 | 21.04 | 5.40 | 40.08 |
| 8 | 23.15 | 64.88 | 54.66 | 6.75 | 82.51 |
| 9 | 79.25 | 193.38 | 34.39 | 3.38 | 33.66 |
| 10 | 67.94 | 33.77 | 61.92 | 5.17 | 59.82 |
| 11 | 27.53 | 140.92 | 35.95 | 2.00 | 21.08 |
| 12 | 20.77 | 46.65 | 51.20 | 5.41 | 37.93 |
| 13 | 14.79 | 25.50 | 28.27 | 2.63 | 24.97 |
| 14 | 36.32 | 151.27 | 59.70 | 10.16 | 94.61 |
| 15 | 46.85 | 103.13 | 44.73 | 7.17 | 63.66 |
本发明方法加标回收率和重复性：
取吸烟者血浆样品分别按照低、中、高三种水平加入NNAL、NNK、NNN、NAT和NAB标准品，每个添加水平重复测定5个样品，计算回收率，结果见表4。分别在样品处理当日不同时间点和不同处理天数进样分析(n＝5)，计算日内和日间精密度。日间精密度分析时，每次进样结束后，将样品溶液更换密封垫密封，并于-70℃储存，以减少挥发和便于下次进样检测，精密度结果见表4。
表4血浆中5种TSNAs的加标回收率和精密度
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种同时测定人体血浆中多种烟草特有亚硝胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）待测血浆的制备：采集血样后，离心获得待测血浆；然后以每1mL待测血浆中加入17000~17200 units的β-葡萄糖醛酸酶的量，在所述待测血浆中加入β-葡萄糖醛酸酶，振荡孵育进行酶解24h；振荡孵育完成后加入内标，再采用30K超滤离心管离心处理；将离心处理后的血浆进行在线二维SPE处理；所述二维SPE处理采用PRS阳离子交换柱与Resin GP反相萃取柱联用对待测血浆进行富集和纯化；所述β-葡萄糖醛酸酶为IX-A型，来源于大肠杆菌；所述二维SPE处理包括如下条件：
所述PRS阳离子交换柱和Resin GP反相萃取柱均采用2mL甲醇，以5 mL/min的流速进行活化；所述PRS阳离子交换柱采用1.8~2.2mL 2%的甲酸，以5 mL/min的流速进行平衡；所述Resin GP反相萃取柱采用2mL 2%的氨水，以5 mL/min的流速进行平衡；
采用0.5mL 2%甲酸，以0.8mL/min的流速进行上样；
采用0.8mL 2%的氨水，以0.8 mL/min的流速将所述待测血浆从PRS阳离子交换柱转移至Resin GP反相萃取柱；
采用1mL 2%的甲酸，以2mL/min的流速对PRS阳离子交换柱进行洗涤；再分别采用1mL2%的氨水和1mL含有10%甲醇的氨水溶液对Resin GP反相萃取柱进行两步洗涤，洗涤流速为2mL/min；
进样量为：300μL；
洗脱时间为2.5 min；
2）标准样品的制备：配制具有梯度浓度的亚硝胺溶液；所述亚硝胺包括NNAL、NAT、NNK、NNN和NAB；
3）绘制标准曲线：将所述标准样品进行LC-MS/MS分析，以亚硝胺的峰面积与内标峰面积之比对其质量浓度建立线性回归方程；
所述LC-MS/MS分析采用Waters Altlantis T3，2.1×150mm ,3μm色谱柱进行色谱分离，以10 mmoL/L的乙酸铵水溶液为流动相A相，乙腈为流动相B相，按如下条件进行梯度洗脱：0~4.5 min：88%~20% A；4.6~5.0 min：20~5% A；5.1~7.0 min：5% A；7.1~10.0 min：88%A；
流速：0.4 mL min-1，柱温：50℃；进样量：300μL；
所述LC-MS/MS分析采用电喷雾离子源正离子扫描模式，检测方式采用多反应监测；
其中，电喷雾电压为4800~5200V；雾化气、辅助加热气、气帘气、碰撞气为氮气，气体流量分别为62~68psi、58~62psi、33~37psi、6~10psi；离子源温度为480~520℃；驻留时间：48~52ms；
4）计算所述待测血浆中亚硝胺的含量。
2.权利要求1所述方法在人体血液中NNAL、NAT、NNK、NNN和NAB的同时检测中的应用。
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