CN111487339B - 一种基于污水中4-吡哆酸的浓度评估区域人口数量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于污水中4‑吡哆酸的浓度评估区域人口的方法，属于环境监测污水流行病学中被评估区域人口数量评估领域。污水样品经固相萃取分离富集处理后，以超高效液相色谱‑质谱联用仪为检测工具，测定污水中4‑吡哆酸的浓度，结合污水进水流量，人体4‑吡哆酸的排出率等参数，估算出实时的被评估区域人口数量。本发明建立了一种基于污水中4‑吡哆酸浓度评估区域人口的方法，能够消除因人口流动等原因导致的区域人口变化，从而获得更准确的人口数据，使基于污水流行病学的环境监测和研究结果更加准确可靠。

Description

一种基于污水中4-吡哆酸的浓度评估区域人口数量的方法
技术领域
本发明属于环境监测污水流行病学研究中的重要组成部分——待评估的区域的人口数量估算领域。具体涉及一种基于污水中内源性生物标记4-吡哆酸物浓度评估区域人口数量的方法。
背景技术
污水流行病学，是基于某地区污水中内源性物质，药品，嗜好品，毒品和其代谢物的含量，通过反算得出目标化合物的浓度，总负荷量和人均负荷量等数据，从而对某一区域或时间段目标化合物所反映的情况如人群健康状况，毒品滥用情况，药物涉及的疾病流行情况以及嗜好品消费情况等进行监测和评估的方法，目前，该法已被世界的各国的环境监测机构广泛使用。相较于传统的流行病学调查方法如问卷调查法、环境监测法、个体监测法等，该发获取结果更客观，实时，准确，且耗费人力，物力以及时间成本较低。
在污水流行病学的反算体系中存在有一个非常重要的不确定性因素，即待评估区域的人口数量。目前常用的人口估算方法有两种：De jure法和De facto法。De jure法基于相关部门给出的人口普查数据直接得出待评估区域的人口数量，该方法较为简单，但由于中国人口众多，人口流动量较大，根据人口普查数据估算的人口数量并不具有实时性，与实际人口数量存在一定的偏差，容易造成基于污水流行病学的环境监测结果的偏差和对实际情况的误判。De facto法则是基于选定的人口生物标记物在污水中的含量，对在采样日被评估的某一区域的人口数量(即产生污水的人口数量)进行估算，该法与De jure法相比，更加客观，实时和准确。可作为人口生物标记物的化合物繁多，各类研究报道所选标记物不也尽相同，但一般认为，人体内源性物质最为合理。但由于人体内源性物质的浓度、污水的环境因素等等诸多原因，大多人体内源性物质无法在污水中稳定存在，严重影响估算结果的准确度，因此急需确定一种适宜的人体内源性物质作为生物标记物，并改进其检测方法，以提高人口估算准确率。
目前国内外在进行污水流行病学研究时，多采用烟草的人体代谢产物可替宁作为生物标记物来估算区域人口数量，但可替宁法中，可替宁人均产生量的计算过程涉及人均每天吸烟数量、烟草中尼古丁的含量、人体对尼古丁的摄取量、尼古丁吸入人体后代谢的比率等等参数，各参数较多采用估算的方式确定，使得人口估算结果易产生偏差。
发明内容
本发明目的旨在采用维生素B6的人体代谢物4-吡哆酸作为生物标记物并基于其在污水样品中的浓度，准确估算实时的待测区域的人口数量，以减少由于人口流动造成的人口数据偏差而导致的基于污水流行病学的环境监测结果的偏差和对实际情况的误判。本发明建立了一种在基于污水中4-吡哆酸的浓度评估区域人口数量的方法，该法基于固相萃取-超高效液相色谱-质谱联用检测技术手段，高效，灵敏，快捷，准确，所得4-吡哆酸浓度用于区域人口数量的估算，相较于人口普查获得数据，更加实时，准确。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种在基于污水中4-吡哆酸的浓度评估区域人口数量的方法，所述方法采用维生素B6的人体代谢物4-吡哆酸作为生物标记物，基于待评估区域污水样品中4-吡哆酸的浓度，评估该区域的人口数量，所述评估区域人口数量的计算公式如下：
Figure BDA0002461993210000021
进一步的，所述污水样品中4-吡哆酸的浓度通过以下步骤得到：
(1)污水样品的预处理：
从待评估区域污水处理系统采集污水样品，将所述污水样品用浓盐酸调pH至1～3，取25～150mL,加入氘代内标4-吡哆酸-D3,过滤；所述待评估区域污水处理系统例如：处理范围覆盖该区域的污水处理厂，污水泵站，污水蓄水池等。
优选的，所述污水样品为采用自动取样器采集自待评估区域污水处理系统的进水栅格处24小时混合污水样品，将所述24小时混合污水样品用浓盐酸调pH至1～3，取25～150mL,加入氘代内标4-吡哆酸-D3,过滤；
优选的，所述的氘代内标4-吡哆酸-D3的浓度为50～500ng/mL,加入量为50～200μL；
进一步优选的，将24小时混合污水样品用浓盐酸调pH至2，取50mL,加入氘代内标4-吡哆酸-D3,过滤；所述氘代内标4-吡哆酸-D3的浓度为100ng/mL,加入量为100μ；
优选的，所述过滤采用GE Whatman无粘合剂玻璃纤维滤纸GF/CTM过滤。不能及时处理的经预处理样品于-20℃冰箱中储存，临用时解冻。
(2)污水样品的固相萃取：
将步骤(1)中得到经预处理的污水样品，过固相萃取柱上样，上样完成后，甲醇淋洗并将固相萃取柱抽干，氨水-乙腈混合液洗脱，洗脱液于离心浓缩仪中挥干，得残渣备用；
优选的，所述固相萃取柱为MCX柱；
(3)超高效液相色谱-质谱联用仪测定4-吡哆酸浓度：
所述供试品配制方法为：将步骤(2)中的残渣用初始比例流动相(所述初始比例流动相为0.1％甲酸水：乙腈＝95:5)复溶，涡旋，离心，取上清进样；
优选的，将步骤(2)中的残渣用初始比例流动相50～250μL复溶，涡旋时间为1～5min，4～20℃条件下10000～13000rpm离心5～10min，取上清进样,进样量为1～10μL,
进一步优选的，将步骤(2)中的残渣用初始比例流动相100μL复溶，涡旋时间为3min，4℃条件下13000rpm离心5min，取上清进样,进样量为5μL,
超高效液相色谱分离条件：
水相为0.1％甲酸水溶液(A)，有机相为乙腈(B)，采取梯度洗脱程序，流动相流速0.25～0.4mL/min，柱温为35～45℃，色谱柱为C18柱。
质谱条件：
离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，源温度为300℃，毛细管电压为3.5kV,监测方式选择多反应离子监测(MRM)。
(4)污水中样品中4-吡哆酸浓度的计算
根据样品测定分析批中的随行标曲，以及4-吡哆酸和氘代内标4-吡哆酸-D3的色谱峰面积比(内标法)计算污水样品中4-吡哆酸的浓度。
进一步的，步骤(1)中所述的浓盐酸为质量百分比为36％～38％的浓盐酸。
进一步的，步骤(2)中所述氨水-乙腈混合液中，氨水的体积分数为2％～7％；
优选的，氨水的体积分数为5％。
进一步的，步骤(2)所述过固相萃取柱的上样流速为2～10mL/min,所述甲醇体积为2～10ml，所述氨水-乙腈混合液体积为2～10mL，洗脱流速为0.5～5mL/min，离心浓缩仪温度设定为30～60℃；
优选的，上样流速为4mL/min,所述甲醇体积为4ml，所述氨水-乙腈混合液体积为4mL，洗脱流速为1mL/min，离心浓缩仪温度设定为50℃。
优选的，上样流速为4mL/min,所述甲醇体积为4ml，所述氨水-乙腈混合液体积为4mL，洗脱流速为1mL/min，离心浓缩仪温度设定为50℃。
进一步的，步骤(3)超高效液相色谱分离条件中所述的流速为0.3mL/min,色谱柱柱温为40℃。
进一步的，步骤(3)超高效液相色谱分离条件中所述的梯度洗脱程序如下：
梯度洗脱程序表：
Figure BDA0002461993210000031
Figure BDA0002461993210000041
进一步的，步骤(3)中所述质谱条件中，脱溶剂气温度为250℃，脱溶剂气流速为11L/min，锥孔反吹气流速为5L/min，脱溶剂气体为N2，碰撞气体为N2。
进一步的，步骤(4)中所述随行标曲建立方法为：
系列标准溶液配制：在十万分之一天平上精密称取4-吡哆酸对照品5～50mg，用0.1mol/L～1mol/L的氢氧化钠溶液(超纯水配制)和超纯水溶解对照品，配制成浓度为0.5mg/mL～5mg/mL的一级储备液，取一级储备液，用甲醇稀释为5～10000ng/mL范围内若干个不同浓度的系列标准溶液；
建立随行标曲：各取等体积的上述系列标准溶液，分别加入pH＝2的从待评估区域污水处理系统采集的污水样品中，同时分别加入50～500ng/mL的氘代内标4-吡哆酸-D3溶液，混合均匀，配制成标准曲线样品，按步骤(2)，(3)处理，作为样品测定的随行标曲；
优选的，所述系列标准溶液加入量为50～200μL，所述pH＝2的从待评估区域污水处理系统采集的污水样品加入量为25～125mL，所述氘代内标4-吡哆酸-D3溶液加入量为50～200μL。
本发明的第二个目的是提供4-吡哆酸作为生物标记物在评估区域人口数量中的应用。
进一步的，所述应用包括以下步骤：
(1)污水样品的预处理
从待评估区域污水处理系统采集污水样品，将所述污水样品用浓盐酸调pH至1～3，取25～150mL,加入氘代内标4-吡哆酸-D3,过滤；
优选的，所述污水样品为采用自动取样器采集自待评估区域的污水处理系统进水栅格处24小时混合污水样品，
优选的，所述的氘代内标4-吡哆酸-D3的浓度为50～500ng/mL,所述氘代内标4-吡哆酸-D3加入量为50～200μL；
进一步优选的，将24小时混合污水样品用浓盐酸调pH至2，取50mL,加入氘代内标4-吡哆酸-D3,过滤；所述氘代内标4-吡哆酸-D3的浓度为100ng/mL,加入量为100μ；
优选的，所述过滤采用GE Whatman无粘合剂玻璃纤维滤纸GF/CTM过滤。不能及时处理的样品于-20℃冰箱中储存，临用时解冻。
(2)污水样品的固相萃取
将步骤(1)中得到经预处理的污水样品，过固相萃取柱上样，上样完成后，甲醇淋洗并将固相萃取柱抽干，氨水-乙腈混合液洗脱，洗脱液于离心浓缩仪中挥干，得残渣备用；
优选的，所述固相萃取柱为MCX柱；
(3)超高效液相色谱-质谱联用仪测定4-吡哆酸浓度
所述供试品配制方法为：将步骤(2)中的残渣用初始比例流动相(所述初始比例流动相为0.1％甲酸水：乙腈＝95:5)复溶，涡旋，离心，取上清进样；
优选的，将步骤(2)中的残渣用初始比例流动相50～250μL复溶，涡旋时间为1～5min，4～20℃条件下10000～13000rpm离心5～10min，取上清进样,进样量为1～10μL,
进一步优选的，将所述步骤(2)中的残渣用初始比例流动相100μL复溶，涡旋时间为3min，4℃条件下13000rpm离心5min，取上清进样,进样量为5μL,
超高效液相色谱分离：
水相为0.1％甲酸水溶液(A)，有机相为乙腈(B)，采取梯度洗脱程序，流动相流速0.25～0.4mL/min，柱温为35～45℃，色谱柱为C18柱。
质谱条件：
离子源为电喷雾离子化源(ESI源)，源温度为300℃，毛细管电压为3.5kV,脱溶剂气温度为250℃，脱溶剂气流速为11L/min，锥孔反吹气流速为5L/min，脱溶剂气体为N2，碰撞气体为N2，监测方式选择多反应离子监测(MRM)。
(4)污水中样品中4-吡哆酸浓度的计算
根据样品测定分析批中的随行标曲，以及4-吡哆酸和氘代内标4-吡哆酸-D3的色谱峰面积比(内标法)计算污水样品中的4-吡哆酸含量。
(5)基于步骤(4)计算得到的污水样品中的4-吡哆酸浓度评估区域人口数量
所述评估污水处理厂覆盖人口数量的计算公式如下：
Figure BDA0002461993210000051
将数据代入计算。其中4-吡哆酸的每日人均排出量据文献记载为900ng(0.9mg)。
进一步的，步骤(1)中所述的浓盐酸为质量百分比为36％～38％的浓盐酸。
进一步的，步骤(2)中所述氨水-乙腈混合液中，氨水的体积分数为2％～7％；
优选的，氨水的体积分数为5％。
进一步的，步骤(2)所述过固相萃取柱的上样流速为2～10mL/min,所述甲醇体积为2～10ml，所述氨水-乙腈混合液体积为2～10mL，洗脱流速为0.5～5mL/min，离心浓缩仪温度设定为30～60℃；
优选的，上样流速为4mL/min,所述甲醇体积为4ml，所述氨水-乙腈混合液体积为4mL，洗脱流速为1mL/min，离心浓缩仪温度设定为50℃。
进一步的，步骤(3)超高效液相色谱分离条件中所述的流动相流速0.3mL/min,色谱柱柱温为40℃，色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(50mm×2.1mm,1.8μm)。
进一步的，步骤(3)超高效液相色谱分离条件中所述的梯度洗脱程序如下：
梯度洗脱程序表：
Figure BDA0002461993210000061
进一步的，步骤(4)中所述随行标曲建立方法为：
系列标准溶液配制：在十万分之一天平上精密称取4-吡哆酸对照品5～50mg，用0.1mol/L～1mol/L的氢氧化钠溶液(超纯水配制)和超纯水溶解对照品，配制成浓度为0.5mg/mL～5mg/mL的一级储备液，取一级储备液，用甲醇稀释为5～10000ng/mL范围内若干个不同浓度的系列标准溶液；
建立随行标曲：各取等体积的上述系列标准溶液，分别加入pH＝2的从待评估区域的污水处理系统采集的污水样品中，同时分别加入50～500ng/mL的氘代内标4-吡哆酸-D3溶液，混合均匀，配制成标准曲线样品，按步骤(2)，(3)处理，作为样品测定的随行标曲；
优选的，所述系列标准溶液加入量为50～200μL，所述pH＝2的从待评估区域污水处理系统采集的污水样品加入量为25～125mL，所述氘代内标4-吡哆酸-D3溶液加入量为50～200μL。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种区域人口数量推算方法，采集待测区域污水处理系统的污水样品(所述污水处理系统例如：处理范围覆盖该区域的污水处理厂、污水泵站、污水蓄水池等)，采用固相萃取-UPLC-MS/MS检测污水样品中的4-吡哆酸含量，通过本发明改进的处理和检测参数，对样品高效富集、分离、净化，提高分析物的回收率，更有效的将分析物与干扰组分分离，减少样品预处理过程，操作简单、省时、省力。超高效液相色谱-质谱联用分离能力强，灵敏度高，分析速度快和自动化程度高，大大提高本发明方法估算结果的准确率，有效减小人口流动对基于污水流行病学的环境监测结果的影响。
本发明基于污水样品中的人体内源性物质4-吡哆酸浓度评估待评估区域的人口数量，4-吡哆酸作为维生素B6的人体代谢产物，其所涉及前处理方法方便快捷；可被分析仪器测定；在污水中的含量较大(>100ng/L)；不易被污水中固体悬浮颗粒或淤泥吸附；在污水中可稳定存在；人体排泄率稳定；且主要由人体排泄产生，受其他环境因素影响较小；符合现行人口生物标记物的筛选标准。相较于人口普查和可替宁法获得的数据，本发明方法能够消除因人口流动等原因导致的区域人口变化，有效反映人口流动情况，更加准确，实时，减小了因被评估区域人口数量不准确造成的污水流行病学研究结果的偏差。
附图说明
图1为4-吡哆酸的标准曲线；
图2为4-吡哆酸的对照品溶液色谱图；
图3为4-吡哆酸在污水样品中的色谱图。
具体实施方式
本发明基于固相萃取-UPLC-MS/MS法测得的污水样品中的4-吡哆酸浓度，以10个污水处理厂为例，对各污水处理厂处理范围所覆盖区域的人口数量进行评估。与人口普查获得的数据相比，更为准确且具有实时性，可减少人口流动导致的偏差对污水流行病学实验结果的影响。
本发明的具体实施方法如下：
(1)污水样品的预处理
自动取样器采集河北省10个污水处理厂进水栅格处24小时混合污水样品，质量百分比为36％的浓盐酸调pH至2，定量取50mL,精密加入100ng/mL的氘代内标4-吡哆酸-D3100μL,采用GE Whatman无粘合剂玻璃纤维滤纸GF/CTM过滤。不能及时处理的样品于-20℃冰箱中储存，临用时解冻。
(2)污水样品的固相萃取
将步骤(1)中得到的污水样品，以4mL/min的流速过Waters Prime MCX固相萃取柱上样，上样完成后，用4mL甲醇淋洗并将固相萃取柱抽干，4mL 5％氨水-乙腈混合液作为洗脱液以1m/min的流速洗脱，洗脱液在50℃条件下于离心浓缩仪中挥干，得残渣。
(3)采用Agilent 1290Infinity II UPLC6470 Trip Quad LC-MS超高效液相色谱-质谱联用仪测定4-吡哆酸浓度
供试品溶液配置：精密量取初始比例流动相(0.1％甲酸水：乙腈＝95:5)100μL复溶所得残渣，涡旋3min，4℃条件下13000rpm离心5min，取上清进样,进样量为5μL。
超高效液相色谱分离：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(50mm×2.1mm,1.8μm)
流动相：A：0.1％甲酸水溶液
B：乙腈
表1.UPLC梯度洗脱条件
Figure BDA0002461993210000081
柱温：40℃
进样室温度：4℃
进样量：5μL
质谱条件：
离子源：电喷雾离子化源(ESI源)
监测方式：多反应离子监测(MRM)
离子源温度：300℃
毛细管电压：3.5kV
脱溶剂气温度：250℃
脱溶剂气流速：11L/min
锥孔反吹气流速：5L/min
脱溶剂气体：N2
碰撞气体：N2
4-吡哆酸用于定性定量分析的质谱参数见表2
表2.4-吡哆酸的质谱条件
Figure BDA0002461993210000082
Figure BDA0002461993210000091
(4)方法学验证结果
系列标准溶液配制：在十万分之一天平上精密称取4-吡哆酸对照品20mg，用0.1mol/L氢氧化钠溶液(超纯水配制)和超纯水溶解对照品，配制成浓度为2mg/mL的一级储备液，取一级储备液，用甲醇稀释为25，50，125，250，500，1250，2500ng/mL的系列标准溶液。
取上述25～2500ng/mL系列溶液各取100μL，分别加入50mL从待评估区域的污水处理系统采集的污水样品中(即将混合污水样品经质量百分比为36％的浓盐酸调pH至2，同时加入100μL的100ng/mL的氘代内标4-吡哆酸-D3溶液，混合均匀)，配制成含50～5000ng/L(50，100，250,500，1000，1250，5000ng/L)的4-吡哆酸，200ng/L的氘代内标4-吡哆酸-D3的系列标准曲线样品，按步骤(2)，(3)处理。
以待测物的峰面积与内标峰面积比为横坐标(X)，待测物浓度(ng/L)为纵坐标(Y)，进行回归分析。得线性范围50-5000ng/L,相关系数r为0.9982，定量下限为12.5ng/L。精密度和准确度数据如表3所示。
表3
Figure BDA0002461993210000092
提取回收率和基质效应如表4所示。
表4
Figure BDA0002461993210000093
(5)污水中样品中4-吡哆酸含量的计算
将收集样品按上述(1)、(2)、(3)步骤浓缩富集检测，根据样品测定分析批中的随行标曲，以及4-吡哆酸和氘代内标4-吡哆酸-D3的色谱峰面积比(内标法)计算污水样品中的4-吡哆酸含量(如表5.所示)。
所示对照品溶液配制方法为：在十万分之一天平上精密称取4-吡哆酸对照品20mg，用0.1mol/L氢氧化钠溶液(超纯水配制)和超纯水溶解对照品，配制成浓度为2mg/mL的一级储备液，取一级储备液，用甲醇稀释为25，50，125，250，500，1250，2500ng/mL的系列标准溶液。
所述随行标曲通过以下步骤建立：取上述25～2500ng/mL系列溶液各取100μL，分别加入50mL从待评估区域的污水处理系统采集的污水样品中(即将混合污水样品经质量百分比为36％的浓盐酸调pH至2，同时加入100μL的100ng/mL的氘代内标4-吡哆酸-D3溶液，混合均匀)，配制成含4-吡哆酸50～5000ng/L(50，100，250,500，1000，1250，5000ng/L)，氘代内标4-吡哆酸-D3 200ng/L的系列标准曲线样品，按步骤(2)，(3)处理，作为样品测定的随行标曲(图1～3)。
表5.各污水处理厂污水样品检出的4-吡哆酸浓度
Figure BDA0002461993210000101
(6)按上述步骤(5)计算基于污水样品中的4-吡哆酸浓度估算各污水处理厂覆盖区域的人口数量
计算公式：
Figure BDA0002461993210000111
将数据代入计算，结果如表6.所示。其中4-吡哆酸的每日人均排出量为900ng(0.9mg)。
目前，国内外在进行污水流行病学研究时，多采用烟草的人体代谢产物可替宁作为生物标记物来估算区域人口数量，以减少人口流动所带来的的偏差，这一方法取得的结果相对于官方普查数据，能够更准确的反映人口流动情况。因此本发明在具体实施方式中将基于污水中4-吡哆酸浓度估算的区域人口数量和基于污水中可替宁浓度估算的区域人口数量以及官方统计人口进行了比较。
表6.基于污水样品中4-吡哆酸浓度估算的区域人口数量
Figure BDA0002461993210000112
Figure BDA0002461993210000121
结果表明，4-吡哆酸可作为人口生物标记物在污水流行病学相关研究中用于估算区域实时人口，且比官方普查人口数据更能反映人口流动情况。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于污水中4-吡哆酸的浓度评估区域人口数量的方法，其特征在于，所述方法采用维生素B6的人体代谢物4-吡哆酸作为生物标记物，基于待评估区域污水样品中4-吡哆酸的浓度，评估该区域人口数量，所述评估区域人口数量的计算公式如下：
Figure FDA0003383610770000011
所述污水样品中4-吡哆酸的浓度通过以下步骤得到：
(1)污水样品的预处理：
从待评估区域污水处理系统采集污水样品，将所述污水样品用浓盐酸调pH至1～3，取25～150mL,加入氘代内标4-吡哆酸-D3,过滤；
所述污水样品为采用自动取样器采集自待评估区域的污水处理系统的进水栅格处24小时混合污水样品；
所述氘代内标4-吡哆酸-D3的浓度为50～500ng/mL,所述氘代内标4-吡哆酸-D3的加入量为50～200μL；
(2)污水样品的固相萃取：
将步骤(1)得到经预处理的污水样品，过固相萃取柱上样，甲醇淋洗，氨水-乙腈混合液洗脱，洗脱液于离心浓缩仪中挥干，得残渣备用；所述固相萃取柱为MCX柱；
所述氨水-乙腈混合液中，氨水的体积分数为2％～7％；
所述上样流速为2～10mL/min,所述甲醇体积为2～10ml，所述氨水-乙腈混合液体积为2～10mL，洗脱流速为0.5～5mL/min，离心浓缩仪温度设定为30～60℃；
(3)超高效液相色谱-质谱联用仪测定4-吡哆酸浓度：
供试品配制方法为：将步骤(2)中的残渣用初始比例流动相复溶，涡旋，离心，取上清进样，进样量为1～10μL；
超高效液相色谱分离条件：
水相为0.1％甲酸水溶液，有机相为乙腈，采取梯度洗脱程序，流动相流速0.25～0.4mL/min，色谱柱柱温为35～45℃，色谱柱为C18柱；所述的梯度洗脱程序如下：
梯度洗脱程序表：
Figure FDA0003383610770000012
Figure FDA0003383610770000021
质谱条件：
离子源为电喷雾离子化源，源温度为300℃，毛细管电压为3.5kV,监测方式选择多反应离子监测；
脱溶剂气温度为250℃，脱溶剂气流速为11L/min，锥孔反吹气流速为5L/min，脱溶剂气体为N2，碰撞气体为N2；
(4)污水样品中4-吡哆酸浓度的计算：
根据样品测定分析批中的随行标曲，以及4-吡哆酸和氘代内标4-吡哆酸-D3的色谱峰面积比计算污水样品中4-吡哆酸的浓度；
步骤(4)中所述随行标曲建立方法为：
系列标准溶液配制：在十万分之一天平上精密称取4-吡哆酸对照品5～50mg，用0.1mol/L～1mol/L的氢氧化钠溶液和超纯水溶解对照品，配制成浓度为0.5mg/mL～5mg/mL的一级储备液，取一级储备液，用甲醇稀释为5～10000ng/mL范围内若干个不同浓度的系列标准溶液；
建立随行标曲：各取等体积的上述系列标准溶液，分别加入pH＝2的从待评估区域的污水处理系统采集的污水样品中，同时分别加入50～500ng/mL的氘代内标4-吡哆酸-D3溶液，混合均匀，配制成标准曲线样品，按步骤(2)，(3)处理，作为样品测定的随行标曲。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中将24小时混合污水样品用浓盐酸调pH至2，取50mL,加入氘代内标4-吡哆酸-D3,过滤；所述氘代内标4-吡哆酸-D3的浓度为100ng/mL,加入量为100μ。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的浓盐酸为质量百分比为36％～38％的浓盐酸。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述氨水-乙腈混合液中，氨水的体积分数为5％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述上样流速为4mL/min,所述甲醇体积为4ml，所述氨水-乙腈混合液体积为4mL，洗脱流速为1mL/min，离心浓缩仪温度设定为50℃。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)为将步骤(2)中的残渣用初始比例流动相50～250μL复溶，涡旋时间为1～5min，4～20℃条件下10000～13000rpm离心5～10min，取上清进样。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)为将所述步骤(2)中的残渣用初始比例流动相100μL复溶，涡旋时间为3min，4℃条件下13000rpm离心5min，取上清进样,进样量为5μL。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)超高效液相色谱分离条件中所述的流动相流速为0.3mL/min,色谱柱柱温为40℃。
9.如权利要求1述的方法，其特征在于，步骤(4)所述随行标曲建立步骤中所述系列标准溶液加入量为50～200μL，所述pH＝2的从待评估区域污水处理系统采集的污水样品加入量为25～125mL，所述氘代内标4-吡哆酸-D3溶液加入量为50～200μL。
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