CN108982721A - 一种超高效亲水色谱快速测定吸烟者尿液中肌酐和尿酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种超高效亲水色谱快速测定吸烟者尿液中肌酐和尿酸的方法，包括如下步骤：(1)标准工作曲线的建立：配制标准工作液，利用超高效亲水色谱分析并建立标准工作曲线；(2)收集尿液样品，并进行前处理；(3)利用超高效亲水色谱对步骤(2)经过前处理后的尿液样品进行检测，根据步骤(1)建立的标准曲线计算吸烟者尿液样品中肌酐和尿酸含量。

Description

一种超高效亲水色谱快速测定吸烟者尿液中肌酐和尿酸的 方法

技术领域

本发明属于烟草烟气暴露生物标记物检测领域，具体涉及一种超高效亲水色谱快速测定吸烟者尿液中肌酐和尿酸的方法。

背景技术

吸烟与健康是当今全球倍受关注的公共卫生研究热点，而科学测量烟草暴露是研究吸烟与健康相关性的基础。尿液样本采集方便，对受试者无侵害性，常作为吸烟与健康研究的生物监测的样品。但志愿者排尿易受到志愿者饮食、喝水等差异的影响，尿液样本的浓度因志愿者不同会有明显差异。但一般来说，普通志愿者24小时尿肌酐的和尿酸排出量是相对恒定，因此可用肌酐和尿酸含量来校正不同志愿者尿液中分析物的浓度。

尿液样品中肌酐和尿酸的检测方法主要有Jaffe法和酶解分光光度法、HPLC法、毛细管电泳法、LC-MS/MS法等。其中HPLC测定是最常用的方法。常规HPLC法测定尿液样品中的尿酸和肌酐常用反相色谱分离，由于尿酸和肌酐极性大，在反相色谱柱上保留时间短，与样品中的杂质充分分离难度大；HPLC-MS法可通过选择离子采集实现高选择性，但仪器成本、运行费用高，且基质效应干扰大。亲水作用色谱(HILIC)是近几年来HPLC领域研究的热点之一，其非常适合用于分离普通反相色谱柱上保留差的大极性化合物。

因此寻找一种可以快速准确测定吸烟者尿液中的肌酐和尿酸的方法，不仅可以有效对烟草生物暴露进行有效评估，还可以对不同尿液样本来对生物标志物的浓度来进行校正，可以弥补烟草暴露相关领域的空白。

发明内容

本发明提供一种超高效亲水色谱快速测定吸烟者尿液中肌酐和尿酸的方法，其有效解决了现有的尿液中肌酐和尿酸的测试方法在反向色谱柱上保留时间短、基质效应打扰大的问题。

一种超高效亲水色谱快速测定吸烟者尿液中肌酐和尿酸的方法，包括如下步骤：

(1)标准工作曲线的建立：配制标准工作液，利用超高效亲水色谱分析并建立标准工作曲线；

(2)收集尿液样品，并进行前处理；

(3)利用超高效亲水色谱对步骤(2)经过前处理后的尿液样品进行检测，根据步骤(1)建立的标准曲线计算吸烟者尿液样品中肌酐和尿酸含量。

上述超高效亲水色谱快速测定吸烟者尿液中肌酐和尿酸的方法，步骤(1)包括如下具体步骤：

准确称取肌酐和尿酸标准品各0.1g，用乙腈溶解并定容至100mL容量瓶中，得到1.0mg/mL的混合标准储备液；使用时分别取5.0、2.5、1.0、0.5、0.1、0.05、0.025mL的该混合标准储备液于10mL的容量瓶中，用乙腈定容到刻度并摇匀，得浓度分别为：500、250、100、50、10、5.0、2.5μg/mL的标准工作液，利用超高效亲水色谱分析并建立标准工作曲线。

上述超高效亲水色谱快速测定吸烟者尿液中肌酐和尿酸的方法，其特征在于，步骤(2)中尿液样品的前处理包括：样品统一采集清晨空腹尿液，每位志愿者收集中间部分15～30mL尿液，尿液样品采集后，立即准确移取1.0mL于萃取瓶中，用50％乙腈定容到10mL，过滤、转移，弃去最初的2-3mL，然后用色谱进样瓶收集1-1.5mL的萃取溶液，待测。

上述超高效亲水色谱快速测定吸烟者尿液中肌酐和尿酸的方法，步骤(3)中超高效亲水色谱的条件为：

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC液相色谱柱(50×2.1mm,1.7μm)，流动相为70％乙腈(内含0.1％磷酸二氢氨)，流速0.5mL/min，检测波长235nm，进样体积5.0μL，柱温30℃。

本发明中自制的样品前处理萃取瓶的结构示意图如图2所示，其包括瓶身1和瓶盖3，瓶身1内容纳有可沿瓶身1轴向移动的下压套管2，下压套管2与瓶身1的瓶底相靠近的一端间隔设有第一过滤膜4和第二过滤膜6，下压套管2远离瓶底的一端设有瓶盖3，瓶盖3与瓶身1螺纹连接。

本发明优选的实施方案中，第一过滤膜4和第二过滤膜6上放置有填料，填料为干燥剂颗粒、碳吸附颗粒、或硅胶颗粒中的一种或多种。

本发明优选的实施方案中，第一过滤膜4和第二过滤膜6的孔径为0.45μm。

本发明优选的实施方案中，瓶盖3内设有橡胶垫5，橡胶垫5可密封也可开口，取决于进样需求。

本发明中自制的样品前处理萃取瓶的使用过程如下：将待测样品称量后放置于瓶身1中，并添加提取溶剂，然后根据样品前处理需求，在第一过滤膜4和/或第二过滤膜6上放置填料(填料为干燥剂颗粒、碳吸附颗粒、或硅胶颗粒中的一种或多种)，然后利用超声、振荡或加热等方式进行提取处理，提取结束后，打开瓶盖3，将下压套管2压入瓶身2中，使得第一过滤膜4和/或第二过滤膜6浸没在瓶身2的提取溶剂中，从而对测试样品进行过滤和转移，从而完成测试样品的提取、干燥、过滤和转移的一体化操作处理，最后可将待测试样品直接放置到分析仪器上进行检测分析。

本发明具有以下有益效果：

(1)肌酐和尿酸均为大极性化合物，在常规色谱柱不能很好的保留，分离效果差，本发明中利用亲水色谱进行肌酐和尿酸的分离，肌酐和尿酸在亲水色谱柱上有很好的保留，分离效果显著改善，有效避免了尿液中极性杂质的干扰。

(2)本发明中还采用了超高效液相色谱技术，色谱分离时间可缩短至4min；和常规液相色谱相比，分析速度极大提升。

(3)本发明中还有针对性的设计了高效样品前处理的新方法，大大简化了常规分析样品前处理中的操作步骤，样品前处理效率显著提高。

(4)本发明中采用样品采集后立即进行分析，避免了常规分析方法中样品低温冷冻保存的繁琐操作，还避免了样品冷冻、解冻过程中待测成分的损失和分解，分析结果更可靠。

附图说明

图1为尿液中肌酐和尿酸的色谱图；

图2为尿液实际样品中肌酐和尿酸的色谱分离图；

图3为本发明中自制的样品前处理萃取瓶的结构示意图；

其中，附图标记含义如下：

1-瓶身，2-下压套管，3-瓶盖，4-第一过滤膜，5-橡胶垫，6-第二过滤膜。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细地说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

一种超高效亲水色谱快速测定吸烟者尿液中肌酐和尿酸的方法，包括如下步骤：

(1)标准工作曲线的建立：准确称取肌酐和尿酸标准品各0.1g，用乙腈溶解并定容至100mL容量瓶中，得到1.0mg/mL的混合标准储备液；使用时分别取5.0、2.5、1.0、0.5、0.1、0.05、0.025mL的该混合标准储备液于10mL的容量瓶中，用乙腈定容到刻度并摇匀，得浓度分别为：500、250、100、50、10、5.0、2.5μg/mL的标准工作液，利用超高效亲水色谱分析并建立标准工作曲线；

(2)收集尿液样品，并进行前处理：样品统一采集清晨空腹尿液，每位志愿者收集中间部分15～30mL尿液，尿液样品采集后，立即准确移取1.0mL于萃取瓶中，用50％乙腈定容到10mL，过滤、转移，弃去最初的2-3mL，然后用色谱进样瓶收集1-1.5mL的萃取溶液，待测。

(3)利用超高效亲水色谱对步骤(2)经过前处理后的尿液样品进行检测，根据步骤(1)建立的标准曲线计算吸烟者尿液样品中肌酐和尿酸含量；

其中超高效亲水色谱的条件为：

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC液相色谱柱(50×2.1mm,1.7μm)，流动相为70％乙腈(内含0.1％磷酸二氢氨)，流速0.5mL/min，检测波长235nm，进样体积5.0μL，柱温30℃。

通过检测，该吸烟者尿液样品中肌酐的含量为965.8μg/mL，尿酸的含量为232.4μg/mL。

实施例2

以12个吸烟志愿者的尿液为考察对象，按照不同抽烟习惯进行分类：重度抽吸者：25-50支/每人/每天、中度抽吸者：15-25支/每人/每天、轻度抽吸者：5-15支/每人/每天，以及不吸烟者，测定其尿液中的肌酐和尿酸的含量，包括如下步骤：

(1)标准工作曲线的建立同实施例1。

(2)样品统一采集清晨空腹尿液，每位志愿者收集中间部分15～30mL尿液，尿液样品采集后，立即准确移取1.0mL于萃取瓶中，用50％乙腈定容到10mL，过滤、转移，弃去最初的2-3mL，然后用色谱进样瓶收集1-1.5mL的萃取溶液，待测。

(3)超高效亲水色谱的测试方法同实施例1。

分析12名吸烟志愿者尿液中尿酸和肌酐含量，结果见表1，并按文献“YY/T 1207-2013，尿酸测定试剂盒(尿酸酶过氧化物酶偶联法)”和“YY/T 1231-2014，肌酐测定试剂(盒)(肌氨酸氧化酶法)”报道的方法对分析结果进行验证，结果见表1。

表1 12个尿液样品中肌酐和尿酸的测定结果

从表1结果可看出，本方法的测定结果和对照方法测定结果无显著差异，测定结果可靠。

Claims (4)

1.一种超高效亲水色谱快速测定吸烟者尿液中肌酐和尿酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)标准工作曲线的建立：配制标准工作液，利用超高效亲水色谱分析并建立标准工作曲线；

(2)收集尿液样品，并进行前处理；

(3)利用超高效亲水色谱对步骤(2)经过前处理后的尿液样品进行检测，根据步骤(1)建立的标准曲线计算吸烟者尿液样品中肌酐和尿酸含量。

2.根据权利要求1所述的超高效亲水色谱快速测定吸烟者尿液中肌酐和尿酸的方法，其特征在于，步骤(1)包括如下具体步骤：

准确称取肌酐和尿酸标准品各0.1g，用乙腈溶解并定容至100mL容量瓶中，得到1.0mg/mL的混合标准储备液；使用时分别取5.0、2.5、1.0、0.5、0.1、0.05、0.025mL的该混合标准储备液于10mL的容量瓶中，用乙腈定容到刻度并摇匀，得浓度分别为：500、250、100、50、10、5.0、2.5μg/mL的标准工作液，利用超高效亲水色谱分析并建立标准工作曲线。

3.根据权利要求1所述的超高效亲水色谱快速测定吸烟者尿液中肌酐和尿酸的方法，其特征在于，步骤(2)中尿液样品的前处理包括：样品统一采集清晨空腹尿液，每位志愿者收集中间部分15～30mL尿液，尿液样品采集后，立即准确移取1.0mL于萃取瓶中，用50％乙腈定容到10mL，过滤、转移，弃去最初的2-3mL，然后用色谱进样瓶收集1-1.5mL的萃取溶液，待测。

4.根据权利要求1所述的超高效亲水色谱快速测定吸烟者尿液中肌酐和尿酸的方法，其特征在于，步骤(3)中超高效亲水色谱的条件为：

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC液相色谱柱(50×2.1mm,1.7μm)，流动相为70％乙腈(内含0.1％磷酸二氢氨)，流速0.5mL/min，检测波长235nm，进样体积5.0μL，柱温30℃。