CN101571521A - 一种评价添加剂对烟草特有亚硝胺抑制作用的方法 - Google Patents
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Abstract
一种评价添加剂对烟草特有亚硝胺抑制作用的方法，该方法包括以下步骤：a.空白体系反应，即将烟碱与亚硝酸盐按摩尔比1∶1－5混合于缓冲溶液中，在一定条件下反应；b.抑制体系反应，即将烟碱与亚硝酸盐按a步骤相同比例混合，加入一定量添加剂后，按a步骤相同缓冲体系、相同温度及时间进行反应；c.分别萃取分离，并利用GC－TEA法分别测定空白体系与抑制体系中TSNAs含量，比较二者差别，对添加剂的抑制效果进行评价。本发明的突出特点在于：建立了一种快速、准确、科学的评价方法，通过具体测定数据，客观评价各种添加剂对TSNAs生成的抑制作用，从而对拟施加于卷烟的不同添加剂进行初步筛选。
Description
技术领域
本发明涉及烟草减害领域，具体是一种评价添加剂对烟草特有亚硝胺抑制作用的方法，利用该方法可对添加剂降低烟草特有亚硝胺(TSNAs)的效果进行评价，从而对拟施加于卷烟的不同添加剂进行初步筛选。
背景技术
吸烟与健康问题是烟草行业发展过程中面临的主要挑战之一。烟草行业从上世纪70年代就开始重视吸烟与健康问题，80年代以后更是把降低焦油等有害成分作为主要研究课题，进行了多方面的技术攻关，获得了重大进展。
烟气中的主要有害物质有：烟气气相物质中的一氧化碳、氮氧化合物、丙烯醛等醛类、挥发性芳香烃、氢氰酸、挥发性亚硝胺等，烟气粒相物质中的稠环芳烃、酚类、烟碱、亚硝胺(尤其是TSNAs)和一些杂环化合物及微量的放射性元素等。
烟草特有亚硝胺(TSNAs)是一组仅发现于烟草及其制品的致癌物质，主要包括NNN(N-亚硝基降烟碱)、NNK(4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮)、NAT(N-亚硝基新烟草碱)和NAB(N-亚硝基假木贼碱)四种成分，其中NNN和NNK具有显著的致癌作用，而NAB和NAT则无明显致癌作用。研究证明，TSNAs的前体物主要是生物碱和硝酸盐、亚硝酸盐，在收获前的烟草青叶中没有TSNAs存在，它们产生于烟叶收获后的调制和发酵过程以及卷烟燃吸过程中。
目前，报道减少烟草及烟草制品中TSNAs含量的方法主要包括两个方面：(1)除去已经形成的TSNAs。通过吸附技术降低卷烟烟气中TSNAs的报道较多，如添加不同的吸附材料制成不同的复合滤嘴，其中包括活性炭、分子筛、沸石、纳米材料等。(2)抑制TSNAs形成。此类方法在原料方面主要有良种选育、降低施氮水平、改革调制工艺及硝酸盐清除剂的使用等；在配方方面主要有添加对TSNAs生成有抑制作用的添加剂，如一些中草药制剂等。现阶段对此类功能性添加剂抑制TSNAs作用的评价方法较少，主要是通过测定卷烟施加添加剂前后烟气中TSNAs的变化。由于烟草及其制品中TSNAs含量极低，烟气中TSNAs的萃取和富集相当复杂；同时烟草本身化学组成复杂，不同卷烟的组成存在差异，燃烧过程中发生的反应亦相当复杂，这些都造成此种方法繁琐、低效、重现性不理想。
快速准确测定TSNAs是建立评价方法的基础，而TSNAs的测定方法是随着相关仪器的进步一同发展的。早在1964年，Preussmann和Neurath等采用薄层层析(TLC)法分析烟气中的NNN，但该法测定速度慢，灵敏度不高，重现性较差。1982年，Chamberlain用GC-NPD法测定了烟气中的TSNAs，之后各种检测方法不断得到发展，主要有GC-MS、HPLC-荧光检测法、GC-TEA等。2001年，Wagner提出了HPLC/MS/MS检测方法，该法检测限低、灵敏度高、分析时间短、重现性好，但昂贵的价格限制了串连质谱的广泛使用。目前，常用的分析方法是GC-NPD、GC-MS和GC-TEA。NPD是一种对含氮磷原子的有机化合物有着高度选择性的气相色谱检测器，具有较好的灵敏度和稳定性，设备价格较低，但其它含氮化合物会给TSNAs的测定造成很大影响，同时对含量极低的NAB检测结果不十分理想；GC-MS是一种较成熟的分离检测手段，其中质谱对物质有很好的定性分析作用，但限制之一是必须得到每种待测组分的标准物；TEA是一种专一性的检测器，与其它检测器相比灵敏度高但价格昂贵，其工作原理是：当含有N-亚硝基基团的分子进入裂解器后，释放出亚硝酰自由基(NO·)，NO·在消除反应室中被O3氧化而产生激发态的二氧化氮(NO2·)，NO2·衰变回到基态，同时发出特征波长的辐射，辐射强度用一个灵敏的光电倍增管检测，辐射强度与NO2·浓度成正比，从而可以定量检测TSNAs。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术中通过直接测定烟气TSNAs变化来评价添加剂抑制作用，存在过程繁琐、效率低且重现性不理想的缺陷，而专门建立的一种快速准确的评价方法，对添加剂降低TSNAs的效果进行评价，从而对拟施加于卷烟的不同添加剂进行初步筛选。本发明的目的在于评价添加剂对TSNAs生成的抑制作用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明的评价添加剂对烟草特有亚硝胺抑制作用的方法包括以下步骤：
a.空白体系反应，即将烟碱-乙醇溶液与亚硝酸盐-水溶液按烟碱∶亚硝酸盐摩尔比1∶1-5混合于5-50mL pH3-7缓冲溶液中，于50-120℃加热搅拌(搅拌速率为50-100rpm)反应1-10h；
b.抑制体系反应，即将烟碱-乙醇溶液与亚硝酸盐-水溶液按a步骤相同比例混合，加入一定量添加剂后，按a步骤相同缓冲体系、相同温度及时间进行反应；
c.分别萃取分离，并利用GC-TEA法分别测定空白体系与抑制体系中TSNAs含量，比较二者差别，对添加剂的抑制效果进行评价。
在本发明中，所述的烟碱-乙醇溶液中烟碱浓度为0.2-2mmol/L；所述亚硝酸盐-水溶液中亚硝酸盐的浓度(w/w)为5-20％；所用缓冲溶液为柠檬酸-磷酸氢二钠溶液。
所述添加剂的加入量根据卷烟中实际添加量进行折算。
步骤c中的萃取分离过程包括用20mL×3的二氯甲烷萃取反应液，无水硫酸钠干燥；过滤；加入内标后浓缩，定容到1mL；所述内标为N-戊基-3-甲基吡啶基亚硝胺(NNPA)。
在本发明的测定过程中，GC-TEA中毛细管气相色谱条件：色谱柱HP-50+30m×0.53mm×1μm；柱前保护柱1m×0.53mm(空柱管)；程序升温，初始温度150℃，保持2min，2℃/min升至175℃，保持8min，3℃/min升至230℃，30℃/min升至250℃，保持5min；进样口温度230℃；载气为氦气，恒流速10mL/min；进样量3μL，不分流，不分流时间0.75min；吹扫流量50mL/min。
GC-TEA中热能分析仪条件为：热裂解器温度500℃，气相接口温度250℃，氧气流速18mL/min。
在c步骤中，所述测定的TSNAs种类为NNN与NNK。
本发明的突出特点在在于：建立了一种快速、准确、科学的评价方法，对添加剂降低TSNAs的效果进行评价，从而对拟施加于卷烟的不同添加剂进行初步筛选，通过具体测定数据，客观评价各种添加剂对TSNAs生成的抑制作用。
具体实施方案
本发明以下将结合实例作进一步详述，但并不限制本发明。
实例1
将烟碱-乙醇溶液(烟碱浓度为1mmol/L)与亚硝酸盐-水溶液(亚硝酸盐的浓度10％)按烟碱∶亚硝酸盐＝1∶5混合于10mL pH4.6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，于90℃加热搅拌反应3h。用20mL×3的二氯甲烷(色谱纯)萃取反应液，合并二氯甲烷萃取液，无水硫酸钠干燥。过滤。加入100μL内标溶液后浓缩，定容到1mL。采用GC-TEA法(毛细管气相色谱条件：色谱柱HP-50+30m×0.53mm×1μm；柱前保护柱1m×0.53mm(空柱管)；程序升温，初始温度150℃，保持2min，2℃/min升至175℃，保持8min，3℃/min升至230℃，30℃/min升至250℃，保持5min；进样口温度230℃；载气为氦气，恒流速10mL/min；进样量3μL，不分流，不分流时间0.75min；吹扫流量50mL/min。热能分析仪条件：热裂解器温度500℃，气相接口温度250℃，氧气流速18mL/min)测定体系中NNN和NNK的含量。平行实验重复5次。结果表明，模型体系的稳定性较好，测试结果相对标准偏差小于10％。
实例2
将烟碱-乙醇溶液(烟碱浓度为1mmol/L)与亚硝酸盐-水溶液(亚硝酸盐的浓度10％)按烟碱∶亚硝酸盐＝1∶5混合于10mL pH4.6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，于70℃加热搅拌反应5h。用20mL×3的二氯甲烷(色谱纯)萃取反应液，合并二氯甲烷萃取液，无水硫酸钠干燥。过滤。加入内标后浓缩，定容到1mL。采用GC-TEA法测定体系中NNN和NNK的含量。平行实验重复5次。结果表明，模型体系的稳定性较好，测试结果相对标准偏差小于10％。
实例3
将烟碱-乙醇溶液(烟碱浓度为1mmol/L)与亚硝酸盐-水溶液(亚硝酸盐的浓度10％)按烟碱∶亚硝酸盐＝1∶5混合于40mL pH4.6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，在未加入和加入维生素C(溶于柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)或丙二醇的情况下，分别于90℃加热搅拌反应3h。用20mL×3的二氯甲烷(色谱纯)萃取反应液，合并二氯甲烷萃取液，无水硫酸钠干燥。过滤。加入内标后浓缩，定容到1mL。采用GC-TEA法分别测定空白体系与抑制体系中NNN和NNK的含量，考察维生素C或丙二醇的抑制效果。结果表明，维生素C对TSNAs的生成具有抑制作用，对NNN和NNK的抑制率分别为59.2％和64.9％；而丙二醇对TSNAs的生成无明显抑制作用。
实例4
将烟碱-乙醇溶液(烟碱浓度为1mmol/L)与亚硝酸盐-水溶液(亚硝酸盐的浓度10％)按烟碱∶亚硝酸盐＝1∶3混合于30mL pH3.6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，在未加入和加入丙二醇的情况下，分别于70℃加热搅拌反应5h。用20mL×3的二氯甲烷(色谱纯)萃取反应液，合并二氯甲烷萃取液，无水硫酸钠干燥。过滤。加入内标后浓缩，定容到1mL。采用GC-TEA法分别测定空白体系与抑制体系中NNN和NNK的含量，考察丙二醇的抑制效果。结果表明，丙二醇对TSNAs的生成无明显抑制作用。
Claims (10)
1、一种评价添加剂对烟草特有亚硝胺抑制作用的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
a.空白体系反应，即将烟碱-乙醇溶液与亚硝酸盐-水溶液按烟碱∶亚硝酸盐摩尔比1∶1-5混合于5-50mL pH3-7缓冲溶液中，于50-120℃加热搅拌反应1-10h；
b.抑制体系反应，即将烟碱-乙醇溶液与亚硝酸盐-水溶液按a步骤相同比例混合，加入一定量添加剂后，按a步骤相同缓冲体系、相同温度及时间进行反应；
c.分别萃取分离，并利用GC-TEA法分别测定空白体系与抑制体系中烟草特有亚硝胺含量，比较二者差别，对添加剂的抑制效果进行评价。
2、根据权利要求1所述的评价添加剂对烟草特有亚硝胺抑制作用的方法，其特征在于：烟碱-乙醇溶液中烟碱浓度为0.2-2mmol/L。
3、根据权利要求1所述的评价添加剂对烟草特有亚硝胺抑制作用的方法，其特征在于：亚硝酸盐-水溶液中亚硝酸盐的浓度(w/w)为5-20％。
4、根据权利要求1所述的评价添加剂对烟草特有亚硝胺抑制作用的方法，其特征在于：缓冲溶液为柠檬酸-磷酸氢二钠溶液。
5、根据权利要求1所述的评价添加剂对烟草特有亚硝胺抑制作用的方法，其特征在于：萃取分离过程包括用20mL×3的二氯甲烷萃取反应液，无水硫酸钠干燥；过滤；加入内标后浓缩，定容到1mL。
6、根据权利要求5所述的评价添加剂对烟草特有亚硝胺抑制作用的方法，其特征在于：所述内标为N-戊基-3-甲基吡啶基亚硝胺。
7、根据权利要求1所述的评价添加剂对烟草特有亚硝胺抑制作用的方法，其特征在于：步骤c中所述GC-TEA法中毛细管气相色谱条件：色谱柱HP-50+30m×0.53mm×1μm；柱前保护柱1m×0.53mm(空柱管)；程序升温，初始温度150℃，保持2min，2℃/min升至175℃，保持8min，3℃/min升至230℃，30℃/min升至250℃，保持5min；进样口温度230℃；载气为氦气，恒流速10mL/min；进样量3μL，不分流，不分流时间0.75min；吹扫流量50mL/min。
8、根据权利要求1所述的评价添加剂对烟草特有亚硝胺抑制作用的方法，其特征在于：步骤c中所述GC-TEA法中热能分析仪条件为：热裂解器温度500℃，气相接口温度250℃，氧气流速18mL/min。
9、根据权利要求1所述的评价添加剂对烟草特有亚硝胺抑制作用的方法，其特征在于：所述添加剂的加入量根据卷烟中实际添加量进行折算。
10、根据权利要求1所述的评价添加剂对烟草特有亚硝胺抑制作用的方法，其特征在于：步骤c中所述测定的烟草特有亚硝胺种类为NNN与NNK。
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