CN102565231B

CN102565231B - 用气相色谱-氮化学发光检测法测定烤烟中的八种生物碱的方法

Info

Publication number: CN102565231B
Application number: CN201210004832.1A
Authority: CN
Inventors: 向章敏; 蔡凯; 耿召良; 周淑平; 张婕
Original assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Current assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Priority date: 2012-01-09
Filing date: 2012-01-09
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2032-01-09
Also published as: CN102565231A

Abstract

本发明公开了一种用气相色谱-氮化学发光检测法测定烤烟中的八种生物碱的方法，包括以下步骤：样品前处理：烟叶粉末加入离心管中，加入NaOH溶液，涡旋振荡后加入体积比为3:1的二氯甲烷/甲醇提取溶剂，振荡提取，离心，取下层有机相清液用针式过滤器过滤后直接进样分析；分析仪器采用气相色谱-氮化学发光检测器对样品中的尼古丁、去甲基烟碱、假木贼碱、新烟草碱、二烯烟碱、麦斯明、2,3-联吡啶和可替宁八种生物碱进行分析，可以一次性分析烤烟中的八种生物碱，具有灵敏度高，选择性好，重复性和准确性都到了较大的提高，且适合于大批量样品的检测分析。

Description

用气相色谱-氮化学发光检测法测定烤烟中的八种生物碱的方法

技术领域

本发明属于烟草中生物碱的检测领域，具体涉及一种用气相色谱-氮化学发光检测法测定烤烟中的八种生物碱的方法。

背景技术

吸烟已经成为危害公众健康最大的因素之一，文献报道，吸烟能潜在增加肺癌的发生率及死亡率。已经被证实，中国大概有一亿吸烟人口(0-29岁)死亡，如果现在中国的吸烟状况持续下去，到2050年死亡人数将会达到每年3百万。烟草生物碱已经被广泛认为与烟草的品质密切相关，且也是高致癌物质-特有亚硝胺的前体物质。烟草及烟气中含有大量相似结构的生物碱，常见的有尼古丁，去甲基烟碱，假木贼碱，新烟草碱，二烯烟碱，麦斯明，2, 3-联吡啶，可替宁等八种生物碱。因此，发展一种简单可靠的分析方法对检测烟草生物碱具有重要的意义。

在过去的20年中，由于气相色谱的高分离能力及氮化学发光检测器的高选择性，NCD已经成为了GC和全二维气相色谱（GC×GC）重要的检测器之一。NCD一般的检测原理为：从色谱柱流出的含氮化合物，在富氧状态下生成一氧化氮后，由真空泵将其送入到有过量臭氧的化学反应池内，臭氧与一氧化氮反应生成二氧化氮，二氧化氮衰减，在1200 nm处发出近红外光，用光电倍增管检测化学反应产生的光的强度，从而得到含氮化合物的信号。反应过程如下图所示：

由于各种痕量含氮化合物需要高选择性的GC检测器，GC-NCD和GC×GC-NCD已经被广泛应用于石油，食品及饮料等行业。

NCD具有很多其它检测器不具有的优点，如它对含氮化合物产生线性等摩尔响应，此外，它与其它化学发光检测器不同，它在无光的背景下产生光子进行检测，不受到其它光源的干扰，使其具有对含氮化合物很高的灵敏度。由于它的高专一性，在检测烟草生物碱时，无需目标分析物与其它的物质之间完全色谱分离也能很好的进行定量。

为了定量检测烟草中的生物碱，GC，LC和HPCE都被广泛的应用。常见的方法有GC-FID，GC-NCD，GC–MS, HPLC-UV, CZE 或MEKC-UV。但是，大多数方法都具有灵敏度和选择性不高的缺点。

本发明针对现有分析技术中存在的不足进行改进，专门设计了一种气相色谱-氮化学发光检测法 (GC-NCD) 测定烤烟中八种生物碱，能对烟草中尼古丁、去甲基烟碱、假木贼碱、新烟草碱、二烯烟碱、麦斯明、2, 3-联吡啶和可替宁八种生物碱进行同时测定。该方法比现有的方法灵敏度更高，准确性更好，分析速度快。

发明内容

本发明的要解决的技术问题是克服现有技术存在灵敏度和选择性不高的缺点，本发明提供一种灵敏度更高，准确性更好，分析速度快，并且能同时分析烟草中尼古丁、去甲基烟碱、假木贼碱、新烟草碱、二烯烟碱、麦斯明、2, 3-联吡啶和可替宁八种生物碱。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

用气相色谱-氮化学发光检测法测定烤烟中的八种生物碱的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）样品前处理：将烟叶粉末加入离心管中，加入NaOH溶液，涡旋振荡后加入体积比为3:1的二氯甲烷/甲醇提取溶剂，振荡提取，离心，取下层有机相清液用针式过滤器过滤后直接进样分析；

（2）分析仪器采用气相色谱-氮化学发光检测器对样品中的尼古丁、去甲基烟碱、假木贼碱、新烟草碱、二烯烟碱、麦斯明、2, 3-联吡啶和可替宁八种生物碱进行分析。

所述的一种用气相色谱-氮化学发光检测法测定烤烟中的八种生物碱的方法，氮化学发光检测器的等离子炬的裂解温度为950^◦C，氧气流量为10 mL/min，氢气流量为4 mL/min。

所述的一种用气相色谱-氮化学发光检测法测定烤烟中的八种生物碱的方法，所述的针式过滤器孔径为0.45μm。

所述的一种用气相色谱-氮化学发光检测法测定烤烟中的八种生物碱的方法，气相色谱分析条件：色谱柱为DB-17毛细管柱，He为载气，流量为1 mL/min，进样量：2µL，进样口温度：250^◦C，分流进样，分流比为10:1，初始温度为110^◦C保持1 min，以4^◦C /min升至180^◦C保持1 min，再以20^◦C /min升至250^◦C保持1 min，共运行26 min，检测器的数据采集频率为25 Hz。

所述的一种用气相色谱-氮化学发光检测法测定烤烟中的八种生物碱的方法，内标化合物选择喹啉标准品。

所述的一种用气相色谱-氮化学发光检测法测定烤烟中的八种生物碱的方法，采用辅助定性柱HP-5柱与定量柱DB-17柱进行双柱定性。

本发明达到的有益效果： 本发明与其他分析烟草中的生物碱方法相比，主要是利用了氮化学发光检测器对烟草中含氮化合物具有高灵敏度和高选择性的原理，一次性分析烤烟中的8种主要生物碱，包括烟碱、降烟碱、假木贼碱、新烟草碱、二烯烟碱、麦斯明、2, 3’-联吡啶和可替宁，且该检测器对烤烟中含量较大的尼古丁无需进行特殊处理，不会产生平头峰，可进行同时检测分析，而在其他检测方法中，一般都需要对烟碱进行单独测定。该方法对于分析烤烟中的八种主要生物碱，具有灵敏度高，选择性好，重复性和准确性都得到了很大的提高，可对烤烟中八中生物碱进行同时检测，且适合于大批量样品的检测分析。

通过工作曲线与最低检测限的测定，相关系数R²均在0.999以上，表明烟草中的8种生物碱在含量范围内，NCD检测器响应与相应8种化合物的浓度呈良好的线性关系。

针对目前烟草中主要生物碱的测定方法，通过与现行公开发明专利(CN102004132A)—一种烟草及烟草制品中生物碱的测定方法相比，本发明的方法表现出较低的检测限，如下表1。

重复性及回收率测定，平均回收率/%为96.4~103.5，相对标准偏差/%为1.0~5.8，具有良好的准确性，精密度和重复性。

采用DB-17与HP-5两种不同极性的毛细管柱进行双柱定性，减少了对分析物的假阳性判定。判定标准为标样与样品中的目标分析物在两根色谱柱上得保留时间偏差都在±0.02 min之内。

附图说明：

图1 为标准样品8种生物碱GC-NCD色谱图其中IS：喹啉；1：烟碱；2：降烟碱；3：麦斯明；4：假木贼碱；5：二烯烟碱；6：新烟草碱；7：2, 3、-联吡啶；8：可替宁。

具体实施方式：

本发明通过以下具体实例作进一步描述，但并不限制本发明。

含量测定实例：

将烤烟样品在40℃条件下干燥预处理2 h，粉碎并过40目筛，得到烟粉于样品储藏瓶中备用；称取200 mg的烟叶粉末，向其加入250 μg喹啉内标，同时加入含有0.8 mL 5%NaOH溶液的离心试管中，涡旋振荡后加入5 mL 3:1(V/V)的二氯甲烷/甲醇提取溶剂，振荡提取30min，然后在4000 rpm离心5min，取下层有机相清液2mL用0.45μm针式过滤器过滤后直接进样分析。

氮化学发光检测器的等离子炬的裂解温度为950^◦C，氧气流量为10 mL/min，氢气流量为4 mL/min。

气相色谱分析条件：色谱柱为DB-17毛细管柱，He为载气，流量为1 mL/min，进样量：2µL，进样口温度：250 ^◦C，分流进样，分流比为10:1，初始温度为110 ^◦C保持1 min，以4^◦C /min升至180^◦C保持1 min，再以20 ^◦C /min升至250 ^◦C保持1 min，共运行26 min，检测器的数据采集频率为25 Hz；内标化合物选择喹啉标准品。

工作曲线与最低检测限的测定

按照烤烟中所含8种生物碱含量大小，配置相应浓度的标准品，然后稀释成5个浓度梯度的混合标样分别进行GC-NCD分析，并以目标化合物峰面积与内标峰面积的比为纵坐标，目标化合物量与内标量的比值为横坐标进行回归分析，得到回归方程及相关参数，将最低浓度的标准溶液平行测定7次，所得测定结果标准偏差的3倍即为测定方法的最低检测限（LOD），见表2。

注：最低检测限的浓度单位为μg/g, 喹啉内标量250 μg

结果表明，相关系数R²均在0.999以上，表明烟草中的8种生物碱在含量范围内，NCD检测器响应与相应8种化合物的浓度呈良好的线性关系。同时还表现出了NCD具有较好的灵敏度。

重复性及回收率测定：

该方法具有较好的重复性，准确性。通过向烟草中添加两个浓度梯度对方法进行评价，从表3中可以看出，方法达到了严格的定量准确性，精密度和重复性。

双柱定性实验：

为了减少对分析物的假阳性判定，采用不同极性的毛细管柱对烟草中的生物碱进行双柱定性分析。本发明采用DB-17与HP-5两种不同极性的毛细管柱，对分析物的判定标准为：标样与样品中的目标分析物在两根色谱柱上得保留时间偏差都在±0.02 min之内。

实际样品的测定

用上述建立的分析方法对不同品种和不同等级的烤烟进行测定。选取三个不同品种和两个不同部位烤烟样品进行检测分析，测定结果见表5。

Claims

1.一种用气相色谱-氮化学发光检测法测定烤烟中的八种生物碱的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（2）分析仪器采用气相色谱-氮化学发光检测器对样品中的尼古丁、去甲基烟碱、假木贼碱、新烟草碱、二烯烟碱、麦斯明、2, 3-联吡啶和可替宁八种生物碱进行分析；

氮化学发光检测器的等离子炬的裂解温度为950℃，氧气流量为10 mL/min，氢气流量为4 mL/min；气相色谱分析条件：色谱柱为DB-17毛细管柱，He为载气，流量为1 mL/min，进样量：2µL，进样口温度：250℃，分流进样，分流比为10:1，初始温度为110℃保持1 min，以4℃ /min升至180℃保持1 min，再以20℃ /min升至250℃保持1 min，共运行26 min，检测器的数据采集频率为25 Hz；

采用辅助定性柱HP-5柱与定量柱DB-17柱进行双柱定性。

2.根据权利要求1所述的一种用气相色谱-氮化学发光检测法测定烤烟中的八种生物碱的方法，其特征在于：所述的针式过滤器孔径为0.45μm。

3.根据权利要求1所述的一种用气相色谱-氮化学发光检测法测定烤烟中的八种生物碱的方法，其特征在于：内标化合物选择喹啉标准品。